Summary
Deze methode beschrijft een op lectine gebaseerde in vitro sedimentatietest om de bindingsaffiniteit van glucaanfosfatase en amylopectine te kwantificeren. Deze co-sedimentatietest is betrouwbaar voor het meten van glucaanfosfatasesubstraatbinding en kan worden toegepast op verschillende opgeloste glucaansubstraten.
Abstract
Glucaanfosfatasen behoren tot de grotere familie van dual specificity phosfatases (DSP) die glucaansubstraten defosforyleren, zoals glycogeen bij dieren en zetmeel in planten. De kristalstructuren van glucaanfosfatase met modelglucaansubstraten onthullen verschillende glucaanbindende interfaces gemaakt van DSP- en koolhydraatbindende domeinen. Kwantitatieve metingen van glucaan-glucaanfosfatase-interacties met fysiologisch relevante substraten zijn echter fundamenteel voor het biologische begrip van de glucaanfosfatasefamilie van enzymen en de regulatie van het energiemetabolisme. Dit manuscript rapporteert een op Concanavaline A (ConA) gebaseerde in vitro sedimentatietest die is ontworpen om de substraatbindingsaffiniteit van glucaanfosfatasen tegen verschillende glucaansubstraten te detecteren. Als proof of concept werd de dissociatieconstante (KD) van glucaanfosfatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) en amylopectine bepaald. De karakterisering van SEX4-mutanten en andere leden van de glucaanfosfatasefamilie van enzymen toont verder het nut van deze test aan om de differentiële binding van eiwit-koolhydraatinteracties te beoordelen. Deze gegevens tonen de geschiktheid van deze test aan om een breed scala aan zetmeel- en glycogeeninteragerende eiwitten te karakteriseren.
Introduction
Glucaanfosfatasen zijn leden van een functioneel diverse onderfamilie van duale specificiteitsfosfatasen (DSP's) binnen de eiwit tyrosinefosfatase (PTP) superfamilie1. Ze zijn gevonden in de meeste levensvormen, waaronder sterk uiteenlopende fotosynthetische organismen, mensen, gewervelde dieren en sommige ongewervelde dieren en protisten 2,3,4. Planten bevatten drie bekende glucaanfosfatasen: Starch Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) en Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Planten zonder glucaanfosfatasen vertonen een verminderde snelheid van tijdelijke zetmeelafbraak en ophoping van zetmeel in de bladeren 8,9. Laforin is de stichtende van de glucaanfosfatasefamilie die glycogeen defosforyleert bij gewervelde dieren en mensen 3,10. De mutaties van laforine resulteren in neurodegeneratieve ziekte van Lafora, een fatale autosomaal recessieve vorm van epilepsie11. Glucaanfosfatasen zijn nodig voor het glycogeen- en zetmeelmetabolisme en zijn naar voren gekomen als belangrijke enzymen voor het moduleren van het zetmeelgehalte in planten en de behandeling van neurodegeneratieve ziekte van Lafora12,13. Recente röntgenkristallografiestudies op glucaanfosfatasen met modelglucaansubstraten hebben licht geworpen op substraatbinding en het katalytische mechanisme van glucaandefosforylering14,15,16,17. Het huidige begrip van hoe glucaanfosfatasen binden aan hun fysiologische substraten is echter onvolledig.
Zetmeel is een onoplosbaar polymeer van glucose gemaakt van 80% -90% amylopectine en 10% -20% amylose18. De substraten voor plantaardige glucaanfosfatasen zijn gefosforyleerde koolhydraatmoleculen, zoals glycogeen- en zetmeelkorrels. De gefosforyleerde glucosylresiduen zijn aanwezig in een verhouding van 1:600 fosfaat:glucosylresidu. Interessant is dat de fosfaten alleen aanwezig zijn op de amylopectinemoleculen19. De belangrijkste plant glucaanfosfatase SEX4 werkt op de zetmeelkorrel om amylopectinemoleculen te defosforyleren. De röntgenkristalstructuur van SEX4 in combinatie met structuurgeleide mutagenesestudies heeft de unieke substraatspecificiteiten van SEX4 aangetoond voor verschillende posities binnen een glucaanstructuur15. We hebben onlangs aangetoond dat de biologisch relevante activiteit van SEX4 alleen kan worden waargenomen wanneer het inwerkt op de opgeloste amylopectinesubstraten20. Het begrijpen van glucaan-SEX4-interacties is echter moeilijk gebleken vanwege de structurele complexiteit van het substraat, bredere bindingsspecificaties en lage bindingsaffiniteiten tussen het eiwit en zijn substraten. Deze problemen hebben het vermogen belemmerd om methoden te gebruiken die vaak worden gebruikt in eiwit-ligandinteracties, zoals isothermische titratiecalorimetrie (ITC), nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) -gebaseerde assays.
Interessant is dat veel van ons begrip van koolhydraat-eiwitinteracties afkomstig is van het bestuderen van lectines. Concanavalin A (ConA) is een peulvrucht lectine familie van eiwitten oorspronkelijk geëxtraheerd uit de jack boon. ConA bindt koolhydraten met een hoge specificiteit, wat voordelig is voor het gebruik ervan in toepassingen voor het richten en afleveren van geneesmiddelen. De binding van ConA aan een verscheidenheid aan substraten die niet-reducerend α-D-mannosyl en α-D-glucosyl bevatten, is uitgebreid bestudeerd19,20. In de handel verkrijgbare ConA-gebonden Sepharose-kralen worden vaak gebruikt om glycoproteïnen en glycolipiden te zuiveren21. ConA bindt aan deze glucanen via C3-, C4- en C6-hydroxylgroepen van de glucoseresiduen. ConA-Sepharose kralen zijn ook met succes gebruikt om de binding van glycogeen-eiwit en zetmeel-eiwit interacties te meten22,23. In deze studie gebruikten we ConA-Sepharose-kralen om een bindingstest te ontwikkelen om de bindingsspecificiteiten van glucaanfosfatase-amylopectine-interacties te meten.
Eerder werd een op ConA gebaseerde sedimentatietest gebruikt om het bindingsvermogen van glucaanfosfatasesubstraat te beoordelen14,20,24. In deze studie werd dezelfde strategie gebruikt om een nieuwe methode te ontwikkelen om de bindingsaffiniteit van glucaan-glucaanfosfatase en koolhydraatinteracties te bepalen. Deze methode heeft ook een voordeel voor het onderzoeken van verschillende opgeloste koolhydraat-eiwitinteracties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van ConA-Sepharose kralen
- Maak 250 ml van een bindingsbuffer met 67 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl 2 en 0,2 mM CaCl2. Pas de pH aan met behulp van 1 M NaOH-oplossing.
- Pipetteer 250 μL ConA-Sepharose kraalsuspensie in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Centrifugeer de inhoud bij 10.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
OPMERKING: 250 μL ConA-Sepharose-kralen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml is nodig voor elke amylopectineconcentratie die voor de test wordt gebruikt. - Voeg 750 μL van de bindingsbuffer toe aan elke buis met 250 μL ConA-Sepharose kralen. Centrifugeer de buizen op 10.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C. Verwijder het supernatant. Herhaal deze stap 2x om ervoor te zorgen dat de kralen op de juiste manier worden gewassen en in evenwicht worden gebracht met de bindbuffer.
2. Bereiding van amylopectine-oplossingen
- Maak een stamoplossing van 10 mg/ml aardappelamylopectine. Amylopectine is onoplosbaar in water en kan worden opgelost door warmte. Om op te lossen, voegt u 0,1 g aardappelamylopectine toe aan 10 ml gedestilleerd water. Verwarm de suspensie in een waterbad op 80 °C gedurende 1 uur of totdat de oplossing niet langer troebel is.
- Laat de oplossing terugkeren naar kamertemperatuur (RT), met herhaalde vortexing om klonteren te voorkomen.
- Alcohol-alkalische behandeling is een alternatieve methode om amylopectine substraten op te lossen. Volg de onderstaande stappen om met deze methode op te lossen.
- Suspensie 0,5 g amylopectinesubstraat in 5 ml 20% ethanol en 5 ml 2 M NaOH. Roer de inhoud krachtig gedurende 15-20 minuten bij RT.
- Voeg vervolgens 10 ml water toe en stel de pH van de oplossing in op 6,5 door 2 M HCl toe te voegen. Breng het volume van de resulterende oplossing met gedestilleerd water op 50 ml om een amylopectine-oplossing van 10 mg / ml te maken.
- Verdun de 10 mg/ml opgeloste amylopectineoplossing om een reeks van 2 ml verdunde amylopectine-oplossingen te maken. Voer bijvoorbeeld halve verdunningen van 10 mg / ml uit om een reeks amylopectineconcentraties te bereiden (5 mg / ml, 2, 5 mg / ml, 1, 25 mg / ml, 0, 625 mg / ml, 0, 3125 mg / ml, 0, 156 mg / ml, 0, 0, 078 mg / ml, 0, 039 mg / ml, 0, 0, 019 mg / ml en 0 mg / ml).
3. Bereiding van ConA-Sepharose: amylopectine kralen
- Voeg 250 μL van elke verdunde amylopectineoplossing toe aan microcentrifugebuizen van 1,5 ml die 250 μL ConA-Sepharose-kralen bevatten die vooraf in bindingsbuffer zijn uitgebalanceerd. Meng de inhoud goed door elkaar. Label de buisjes met de bijbehorende amylopectineconcentratie.
- Incubeer de inhoud op een draaiend wiel bij 4 °C gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Er is geen verandering in het ConA-Sepharose:amylopectine gebonden complex in de loop van de tijd na 20 min. De incubatietijd van 30 minuten werd gekozen door verschillende incubatietijden van 10 minuten tot 1 uur om ervoor te zorgen dat het evenwicht werd bereikt. - Centrifugeer de buizen op 10.000 x g gedurende 1 minuut. Verzamel het supernatant in een nieuw gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 ml. Bewaar deze bovennatuurlijke fracties om D-glucosetest12 uit te voeren (zure hydrolyse van amylopectine gevolgd door UV-bepaling van glucose via enzymatische assay). Deze stap is nodig om ervoor te zorgen dat alle amylopectine aan de kralen is gebonden.
- Voeg 750 μL bindingsbuffer toe aan de ConA-Sepharose:amylopectine kralen. Centrifugeer de buizen op 10.000 x g gedurende 1 minuut. Gooi het supernatant weg om eventuele ongebonden amylopectinemoleculen te verwijderen.
- Herhaal stap 3.4 om ervoor te zorgen dat u voldoende wordt gewassen. Elke buis bevat nu ConA-Sepharose kralen gebonden aan verschillende hoeveelheden amylopectine substraten.
4. Sex4 incuberen met ConA-Sepharose: amylopectine kralen
- Meng 250 μL ConA-Sepharose:amylopectine beads met 100 μL van de bindingsbuffer die 10 μg SEX4-eiwit, 10 mM dithiothreitol (DTT) en 10 μM proteaseremmercocktail (PIC) bevat. Merk op dat het totale volume in elke buis 350 μL is.
OPMERKING: Een proteaseremmercocktail wordt toegevoegd als voorzorgsmaatregel om onnodige SEX4-degradatie te voorkomen. Dit is een optionele stap. In deze test wordt het recombinante eiwit Arabidopsis thaliana SEX4 (AtSEX4) gebruikt. Het gezuiverde eiwit bevat een N-terminale histidine-tag die nodig is voor het detecteren van het eiwit via chemiluminescentie. Gedetailleerde informatie over glucaanfosfatasezuiveringen is beschreven in eerdere publicaties14,20,24. - Incubeer het eiwit en ConA-Sepharose:amylopectine kraal suspensie bij 4 °C gedurende 45 minuten met zachte rotatie.
OPMERKING: De incubatietijd van 45 minuten wordt gekozen om ervoor te zorgen dat het evenwicht voor het complex wordt bereikt. - Centrifugeer de buizen op 10.000 x g gedurende 1 minuut. Pipetteer 50 μL van het supernatant voorzichtig met behulp van een gel-laadpunt in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. Voeg 20 μL 4x SDS-PAGE-kleurstof en 10 μL water toe aan elke buis met 50 μL van de verzamelde bovennatuurlijke fracties. Verwarm de monsters gedurende 10 minuten op 95 °C. Sla deze voorbeelden op voor het uitvoeren van de SDS-PAGE-gels. Zorg ervoor dat 10 nieuwe buizen met het label "supernatant (S)" de overeenkomstige substraatconcentraties hebben.
- Voeg 750 μL van de bindingsbuffer toe aan de ConA-Sepharose:amylopectin: SEX4 kralen om ongebonden eiwit uit de kralen te verwijderen. Centrifugeer de buizen op 10.000 x g gedurende 1 minuut. Herhaal deze stap nog een keer om een goede wasbeurt te garanderen. Gooi het supernatant weg.
- Voeg 20 μL 4x SDS-PAGE kleurstof en 80 μL gedestilleerd water toe aan de buisjes met gewassen ConA-Sepharose:amylopectin:SEX4 kralen. Verwarm de monsters gedurende 10 minuten op 95 °C en centrifugeer gedurende 1 minuut op 10.000 x g .
- Gooi de pellet weg en bewaar het supernatant voor het uitvoeren van de SDS-PAGE-gels. Pipetteer 80 μL van het supernatant in nieuwe buisjes en label ze als "pellet (P)".
5. SDS-PAGE gels draaien
- Laad 40 μL van de ongebonden eiwitmonsters (gemaakt in stap 2.3, gelabeld S) in 4% -12% prefab polyacrylamide-gelputten van de laagste substraatconcentratie tot de hoogste, maar houd de eerste rijstrook vrij om de eiwitmoleculaire gewichtsmarker te laden. Gebruik een tweede gel om 10 gebonden eiwitmonsters te laden die zijn gemaakt in stap 2.5 (gelabeld als P).
- Voeg vers bereide 1x SDS-PAGE lopende buffer toe aan beide kamers van het apparaat. Laat de gel gedurende 35 minuten op 150 V lopen of totdat de kleurstofvoorkant de bodem van de gel bereikt.
- Verwijder de loopgel uit het apparaat en verwijder de afstandhouders en glasplaten. Gebruik de gescheiden gel om een western blot-analyse uit te voeren.
6. Western blotting voor chemiluminescentiedetectie14,15
OPMERKING: Deze methode kan eenvoudig worden aangepast / aangepast, afhankelijk van de westerse blottingapparatuur die gebruikers in hun laboratoria hebben.
- Maak 1 l transferbuffer met 5,8 g Tris-base, 2,9 g glycine, 0,37 g SDS en 200 ml methanol.
- Breng de grootte-gescheiden eiwitten van de polyacrylamidegel over naar een nitrocellulosemembraan. Monteer kort de sponzen, filtreerpapier, gel en nitrocellulosemembraan volgens het westerse transferprotocol14,15. Draai op 70 V gedurende 1 uur.
- Om niet-specifieke eiwitbinding te voorkomen, incubeert u het nitrocellulosemembraan met de eiwitoplossing van 1% -5% runderserumalbumine (BSA) of melkeiwit in 50 ml TBST-buffer (20 mM Tris [pH 7,5], 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) gedurende 1 uur. Was het membraan 3x met behulp van TBST-buffer om eventuele niet-gebonden blokkerende oplossing te verwijderen.
- Incubeer het membraan met een mierikswortelperoxidase (HRP)-gekoppeld antilichaam specifiek voor His-tagged eiwit gedurende 1 uur. Was het membraan 3x in TBST-buffer om eventuele ongebonden antilichamen te verwijderen. Gebruik een 1:2.000 verdunning van antilichamen tegen TBST voor optimale reproduceerbaarheid en gevoeligheid.
- Het HRP-enzymgebonden antilichaam bindt specifiek aan de histidine-tag van het SEX4-eiwit, dat een band oplevert in aanwezigheid van chemiluminescentiereagentia. Maak voor digitale beeldvorming een oplossing van gelijke delen chemiluminescente substraatoplossingen (elk 750 μL) in een buis van 1,5 ml. Incubeer het membraan gedurende ten minste 5 minuten in de oplossing.
- Plaats het membraaneiwit met de zijkant naar beneden op de vlekscanner en voer de acquisitiesoftware uit om het eiwit in zowel de pellet- als de bovennatuurlijke fractie te kwantificeren.
7. Data-analyse
- Voer de kwantitatieve signaalmetingen uit met behulp van de acquisitiesoftware met de blotscanner. Normaliseer alle kwantitatieve metingen in de supernatant- en pelletfracties tot het totale eiwit dat geladen is.
OPMERKING: De software maakt het mogelijk om de intensiteit van elke eiwitband in de supernatant en pelletfracties te kwantificeren. - Plot in het verzadigingsbindingsexperiment het percentage eiwitgebonden versus amylopectineconcentratie. Pas de gegevens aan op Y = Bmax x X / (K D + X), met behulp van data-analysesoftware om KD te berekenen.
OPMERKING: Bmax is de maximale specifieke binding, de Y-as is het percentage eiwitgebonden, de en X-as is de amylopectineconcentratie.
Figuur 1: Overzicht van de ConA-Sepharose sedimentatie assay workflow. (A) Bereiding van ConA-Sepharose kralen. (B) Incubatie met amylopectinesubstraat. (C) Incubatie met SEX4-eiwit. (D) Scheiding van gebonden en ongebonden eiwitfracties door centrifugatie. (E) Scheiding van eiwitten door middel van SDS-PAGE. (F) Western-blot analyse. (G) Chemiluminescentiedetectie van His-tagged SEX4-eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een van de belangrijkste kenmerken van de glucaanfosfatasefamilie van eiwitten is hun vermogen om te binden aan glucaansubstraten. Eerst werd de bindingscapaciteit van SEX4 aan ConA-Sepharose:amylopectine beads geanalyseerd met behulp van SDS-PAGE (Figuur 2A). Runderserumalbumine (BSA) diende als een negatieve controle om niet-specifieke binding van eiwitten aan de ConA-Sepharose: amylopectine-kralen te detecteren. De SDS-PAGE analyse van eiwitten toonde de aanwezigheid van SEX4-eiwit in de pelletfractie en BSA in de bovennatuurlijke fractie. W278A, een bekende SEX4-mutant met een aanzienlijk verminderd glucaanbindend vermogen, werd ook opgenomen in de test. De W278A-mutant verscheen in de bovennatuurlijke fractie, wat het nut en de specificiteit van deze test aangeeft voor het detecteren van het glucaanbindingsvermogen van SEX4-eiwitten. Terwijl SDS-PAGE de SEX4-eiwitten visualiseerde, was er bezorgdheid over de gevoeligheid en het gebruik van kleine glucaanfosfatasen; Het ConA-lectine-eiwit kan bijvoorbeeld mogelijk interfereren met het detecteren van kleine eiwitten zoals LSF2. Om te testen of deze methode alleen de glucaanfosfatasen kon detecteren, werd een western blot uitgevoerd met behulp van een antilichaam dat specifiek is voor de N-terminale histidine-tag. Er was inderdaad een significante toename in de detectie van SEX4 en de methode is specifiek voor het detecteren van glucaanfosfatasen met een N-terminale histidinetag (figuur 2B). Kwantitatieve meting van ligand-eiwitinteractie-experimenten vereist het uitvoeren van essentiële controles voor het vaststellen van de juiste ligand- en eiwitconcentraties. Daarom werd de co-sedimentatietest vervolgens getest bij drie verschillende SEX4-concentraties (figuur 2C-E). Terwijl 2 μg SEX4 voldoende is om te visualiseren via chemiluminescentiedetectie, zorgt het gebruik van 5 of 10 μg SEX4 voor een nauwkeurigere detectie van de gedeeltelijke binding. De SEX4-binding tegen verschillende amylopectineconcentraties (0,5 mg / ml, 1,0 mg / ml en 5 mg / ml) werd ook getest. Deze resultaten wijzen ook op een verhoogde SEX4-binding met verhoogde amylopectineconcentratie, met verzadigde binding bij 5 mg / ml amylopectine.
Om de bindingsaffiniteit van amylopectine en SEX4 wild-type eiwit te bepalen, werd 10 μg SEX4 geïncubeerd met amylopectine (tot 5 mg / ml) en werd de binding bij elke concentratie bepaald (figuur 3A). De aanpassing van procentuele eiwitgebonden gegevens aan het specifieke, one-site bindingsmodel gaf een KD van 1,03 ± 0,23 mg / ml (figuur 3B). Er is geen kristalstructuur van SEX4 wild-type eiwit beschikbaar; in plaats daarvan onthult de kristalstructuur van de katalytisch inactieve SEX4 C198S-mutant de bindingsinterface van SEX4, gemaakt van DSP- en koolhydraatbindende molecuul (CBM) -domeinen. De bindingsaffiniteit van SEX4 C198S en amylopectine-interactie werd bepaald met een KD van 0,11 ± 0,05 mg/ml voor C198S-mutante eiwitten; een ~ 10 keer verhoogde de bindingsaffiniteit in vergelijking met SEX4 wild-type eiwit. Hoewel het exacte mechanisme van de verhoogde binding van C198S niet wordt begrepen, is het intrigerend om te zien hoe een eenpuntsmutatie van SEX4 resulteert in een significante toename van het glucaanbindingsvermogen.
Vervolgens werd de toepasbaarheid van deze methode voor het meten van de binding van laforine, LSF2, maïs (Zea mays) SEX4 en aardappel (Solanum tuberosum) SEX4 tegen aardappelamylopectine beoordeeld. Met behulp van het hier gepresenteerde protocol toonden de resultaten aan dat laforine, LSF2 en SEX4 van agronomisch belangrijke gewassen ook differentieel binden aan amylopectine, wat verschillende bindingsmechanismen voor elk eiwit suggereert (figuur 4A, B). Gezamenlijk onthulden deze bevindingen een succesvolle methodeontwikkeling voor de bepaling van substraatbinding van glucaanfosfatase met amylopectinesubstraten.
Figuur 2: Visualisatie van pellet (P) en supernatant (S) SEX4 fracties en optimalisatie van de assay parameters. (A) Visualisatie van 5 μg SEX4-eiwit (34 kDa) in de pellet- en supernatantfracties met behulp van SDS-PAGE- en Coomassie-kleuring. De eiwitbanden bij 25 kDa en lager zijn voor het ConA-eiwit dat aan Sepharose-kralen is bevestigd. (B) Visualisatie van SEX4-eiwitten in de pellet en bovennatuurlijke fracties via westerse analyse. 5 μg SEX4-eiwit werd gedetecteerd via een antilichaam dat was ontwikkeld voor de histidine-tag. (C-E) De westerse analyse werd uitgevoerd met behulp van verschillende hoeveelheden SEX4-eiwit (2 μg, 5 μg en 10 μg) en amylopectineconcentraties (0,5 mg / ml, 1,0 mg / ml en 5,0 mg / ml). Een volume van 250 μL kralen en een incubatietijd van 30 minuten werden gebruikt voor alle experimenten om evenwichtsbinding te garanderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kwantitatieve in vitro sedimentatietest . (A) Representatieve gegevens over de depletie van supernatanten en de geleidelijke toename van het pelletsignaal van SEX4 wild-type eiwit naarmate de amylopectineconcentratie steeg van 0 mg/ml tot 5 mg/ml. (B) Het percentage SEX4 wild-type eiwit gebonden tegen verschillende hoeveelheden amylopectine geïmmobiliseerd op ConA-Sepharose kralen. De kralen werden gedurende 1 minuut gepelletiseerd op 10.000 x g en zowel het supernatant als de pelleteiwitten werden gescheiden door SDS-PAGE, gedetecteerd door westerse analyse en gekwantificeerd om het gebonden percentage te meten. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD van drie replicaties. (C) Representatieve gegevens over supernatantdepletie en de geleidelijke toename van het pelletsignaal van SEX4 C198S-eiwit naarmate de amylopectineconcentratie steeg van 0 mg / ml tot 5 mg / ml. (D) Het percentage SEX4 C198S-eiwit gebonden tegen verschillende hoeveelheden amylopectine geïmmobiliseerd op ConA-Sepharose-kralen. De kralen werden gedurende 1 minuut gepelletiseerd op 10.000 x g en zowel het supernatant als de pelleteiwitten werden gescheiden door SDS-PAGE, gedetecteerd door westerse analyse en gekwantificeerd om het gebonden percentage te meten. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD van drie replicaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Substraatbinding van SEX4 orthologen, laforine, LSF2 tegen opgeloste amylopectine. (A) Representatieve binding van elk eiwit met 5 mg/ml amylopectine geïmmobiliseerd in ConA-Sepharose kralen. (B) Het percentage gebonden eiwit werd berekend met behulp van de genormaliseerde chemiluminescentiesignalen verkregen voor drie onafhankelijke experimenten. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD van drie replicaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie toont de succesvolle ontwikkeling van een nieuwe in vitro sedimentatietest waarmee de bindingsaffiniteit van glucaan-glucaanfosfatase-interacties kan worden bepaald. Het testontwerp maakt gebruik van de specifieke binding van lectine ConA aan glucanen via de hydroxylresiduen van glucose om indirect opgeloste koolhydraatsubstraten op Sepharose-kralen te vangen. Dit maakt de scheiding van gebonden en ongebonden eiwitfracties via centrifugatie en bepaling van de bindingsaffiniteit van opgeloste glucaansubstraten en glucaanfosfatasen mogelijk. Alle geteste glucaanfosfatasen bleken specifiek te binden aan amylopectine, zonder detecteerbare binding aan ConA-Sepharose-kralen in afwezigheid van amylopectine.
Het experiment werd uitgevoerd om de bindingsaffiniteit te meten met een kleine, vaste hoeveelheid SEX4-eiwit en een reeks amylopectineconcentraties die aan ConA-Sepharose-kralen zijn bevestigd. Een teveel aan ConA-Sepharose kralen werd gebruikt om de hoogste amylopectineconcentratie aan kralen te binden. De volledige binding van amylopectine werd getest via een glucosetest. Het protocol dat in het manuscript wordt gepresenteerd, maakt gebruik van kwantitatieve sedimentatie om gebonden en ongebonden eiwitfracties te scheiden, evenals gel-elektroforese en westerse analyse om de hoeveelheid SEX4 in het supernatant te meten in vergelijking met de hoeveelheid gebonden aan de ConA-Sepharose: amylopectine-kralen. Het kwantificeren van de pelletfractie vereist minimale wassing om het bindingsevenwicht niet te verstoren. Om onderschatting van de pelletfractie te voorkomen, is het in plaats van de pellet te onderzoeken voldoende om de concentratie van vrije SEX4 in het supernatant te meten en het verschil van het gebonden SEX4:amylopectinecomplex te berekenen.
De hier beschreven in vitro sedimentatietest bepaalde de differentiële bindingsaffiniteit van SEX4 wild-type eiwit. Interessant is dat de bepaalde bindingsaffiniteit van SEX4 wild-type eiwit met behulp van de ontwikkelde in vitro sedimentatietest binnen het hogere bereik valt van de gerapporteerde waarde bepaald met een gelverschuivingstest25. De bindingstest moet gevoelig zijn voor lagere substraatconcentraties en eenvoudig, terwijl de gelverschuivingstest vereist dat individuele inheemse gels worden gemaakt in de aanwezigheid van verschillende hoeveelheden glucaansubstraten. Deze tijdrovende methode beperkt het aantal concentraties dat kan worden getest en een beperkt substraatconcentratiebereik kan worden getest. In plaats daarvan is de monstervoorbereiding snel en betrouwbaar met onze in vitro sedimentatietest. Het vergelijken van SEX4 wild-type eiwit en SEX4 C198S mutant onthult een tienvoudig bindingsaffiniteitsverschil. In dit opzicht is deze test gevoelig om de binding van SEX4-mutante eiwitten kwantitatief en kwalitatief te bepalen.
Eiwit-koolhydraat interacties zijn van vitaal belang voor veel belangrijke biologische processen, waaronder katalyse, celsignalering en herkenning. Ze krijgen ook steeds meer aandacht vanwege hun belangrijke rol in de farmaceutische en voedingsmiddelenindustrie. Röntgenkristallografie wordt veel gebruikt om eiwitstructuren op atomair niveau te verkrijgen. De structurele heterogeniteit en flexibiliteit van koolhydraatsubstraten maken het echter moeilijker om koolhydraatgebonden eiwitstructuren te verkrijgen. Onlangs zijn cryo-EM en nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie ook gebruikt om de structuren van koolhydraatbindende eiwittente bepalen 26. Ondanks de vele vooruitgang in structurele technieken met hoge resolutie, is het een uitdaging om structuren van koolhydraat-eiwitcomplexen te verkrijgen. Als gevolg hiervan is slechts een beperkt aantal eiwit-koolhydraat complexe structuren experimenteel opgelost. Bovendien bieden kristalstructuren alleen een momentopname van een eiwit bij een bepaalde conformatie, en niet de dynamische aard van substraatbinding. Als alternatief worden verschillende biofysische technieken, waaronder isothermische titratiecalorimetrie (ITC) en oppervlakteplasmonresonantie (SPR), gebruikt om eiwit-koolhydraatinteracties te meten27. Deze methoden zijn echter ook niet zonder beperkingen. Een belangrijke uitdaging bij het bepalen van eiwit-koolhydraat interacties is hun relatief zwakke interacties in vergelijking met andere eiwit-ligand interacties. De interacties binnen het bereik van hoog micromolair tot laag micromolair bereik verminderen de bruikbaarheid van ITC en SPR aanzienlijk. Indirecte methoden, zoals gel shift en pull-down assays, hebben veel aandacht gekregen voor het bepalen van interacties die moeilijk te beoordelen zijn met andere methoden25. Daarom is deze bindingstest een breed toepasbare benadering voor gevoelige metingen van eiwit- en oplosbare koolhydraatinteracties.
Glycogeen en zetmeel zijn belangrijke koolhydraatopslagmoleculen gemaakt van vertakte polymeren van glucose. Het vertakkingspatroon, de flexibiliteit en de aanwezigheid van verschillende microdomeinen in het zetmeel en glycogeen vereisen interagerende eiwitten om unieke substraatbindingsmechanismen aan te nemen. Veel begrip van substraatherkenningsmechanismen van SEX4 is afkomstig van röntgenkristallografische studies in combinatie met structuurgeleide mutagenese. Om zetmeel te defosforyleren, moet SEX4 interageren met significant verschillende microdomeinen van de zetmeelkorrel om fosfaten te lokaliseren voor positiespecifieke defosforylering. Experimenteel blijft het een uitdaging om de bindingsaffiniteiten van glucaanfosfatasen te bepalen, gezien de zwakke interacties tussen het eiwit en de glucanen en de structurele flexibiliteit en heterogeniteit van koolhydraten. Dit manuscript presenteert een methode om bindingsaffiniteiten van glucaanfosfatase-koolhydraatinteracties te bepalen met behulp van een op Concanavaline A (ConA) gebaseerde in vitro sedimentatietest. Glucaanfosfatasen gebruiken verschillende mechanismen om koolhydraten te binden, te lokaliseren en te defosforyleren. Eerder werd ITC gebruikt om de bindingsaffiniteit van laforine- en lineaire oligosaccharideketens te meten. Geen enkele studie heeft echter de bindingsaffiniteiten van glucaanfosfatasen met hun fysiologische substraten aangetoond via directe technieken zoals ITC en SPR. Om het nut van deze test voor het bepalen van de substraatbinding van glucaanfosfatasen beter te begrijpen, werd de binding van laforine, LSF2 en SEX4 tegen amylopectine beoordeeld. Toekomstige studies kunnen worden gedaan om experimenteel de bindingsaffiniteit van alle glucaanfosfatasen en hun fysiologisch relevante glucaansubstraten te bepalen. Een van de kritische stappen van de methode is het bepalen van de optimale incubatietijd en het substraatconcentratiebereik voor de test. Elke glucaanfosfatase bindt anders met het substraat en de methode is geoptimaliseerd voor SEX4. Het is belangrijk om initiële optimalisatie-experimenten uit te voeren om deze parameters te achterhalen. Een andere beperking is het gebruik van histidine gelabeld eiwit voor de test. Als er echter antilichamen aanwezig zijn voor het onderzoekseiwit, kan de methode eenvoudig worden geoptimaliseerd voor elk glucaan-interagerend eiwit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de National Science Foundation award MCB-2012074. De auteurs bedanken Dr. Craig W. Vander Kooi van de University of Florida Department of Biochemistry and Molecular Biology voor waardevolle discussies en ondersteuning. De auteurs bedanken ook Dr. Matthew S. Gentry van de University of Florida Department of Biochemistry and Molecular Biology voor zijn steun. We willen Dr. Sara Lagalwar, voorzitter van het Skidmore College Neuroscience-programma, bedanken voor het feit dat ze ons in staat heeft gesteld om de LICOR C-digit blot-scanner te gebruiken voor western blot-beeldvorming.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP | Therm Fisher Scientific | MA1-21315-HRP | |
| Biorad gel electrophoresis and Western blot kit | Biorad | 1703930 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 208291 | |
| C-Digit blot scanner | LICOR | 3600-00 | Blot scanner |
| Complete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| Concanavalin A-sepharose beads | Sigma-Aldrich | C9017 | This product contains in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol |
| Centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | Version 8.0 | Data analysis software |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H8651 | |
| Image Studio | LICOR | 3600-501 | Acquisition Software |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | PI28312 | |
| Potato amylopectin | Sigma-Aldrich | A8515 | |
| Precast SDSPAGE Gels | Genscript | M00653S | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | MP1TWEEN201 | |
| Westernsure premium chemiluminescence substrate | LI-COR | 926-95000 |
References
- Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism. The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).
- Gentry, M. S., et al. The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease. The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).
- Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates. The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).
- Gentry, M. S., Pace, R. M. Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism. BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).
- Niittyla, T., et al. Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).
- Kotting, O., et al. STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana. The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).
- Comparot-Moss, S., et al. A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves. Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).
- Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).
- Kotting, O., et al. Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase. Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).
- Tagliabracci, V. S., et al. Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).
- Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).
- Brewer, M. K., et al. Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion. Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).
- Santelia, D., Zeeman, S. C. Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications. Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).
- Raththagala, M., et al. Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease. Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).
- Meekins, D. A., et al. Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).
- Vander Kooi, C. W., et al. Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).
- Meekins, D. A., et al. Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation. The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C. Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth. Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).
- Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. Phosphorus in rice and other starches. Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).
- Mak, C. A., et al. Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4. Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).
- Campbell, K. P., MacLennan, D. H. Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum. The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).
- Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein. The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).
- Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction. Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).
- Meekins, D. A., et al. Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates. The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).
- Wilkens, C., et al. Plant α-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose. FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).
- Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).
- Doyle, M. L. Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).
