Summary
この方法は、グルカンホスファターゼとアミロペクチンの結合親和性を定量化するためのレクチンベースの in vitro 沈降アッセイを記載する。この共沈降アッセイは、グルカンホスファターゼ基質結合の測定に信頼性が高く、さまざまな可溶化グルカン基質に適用できます。
Abstract
グルカンホスファターゼは、動物のグリコーゲンや植物のデンプンなどのグルカン基質を脱リン酸化する二重特異性ホスファターゼ(DSP)のより大きなファミリーに属します。モデルグルカン基質を有するグルカンホスファターゼの結晶構造は、DSPと糖鎖結合ドメインからなる明確なグルカン結合界面を明らかにする。しかし、グルカン-グルカンホスファターゼと生理学的に関連する基質との相互作用の定量的測定は、グルカンホスファターゼファミリーの酵素の生物学的理解とエネルギー代謝の調節にとって基本的なものです。この原稿は、異なるグルカン基質に対するグルカンホスファターゼの基質結合親和性を検出するために設計されたConcanavalin A(ConA)ベースのin vitro沈降アッセイを報告しています。概念実証として、グルカンホスファターゼシロイヌナズナデンプン過剰4(SEX4)とアミロペクチンの解離定数(KD)を測定しました。SEX4変異体およびグルカンホスファターゼファミリーの酵素の他のメンバーの特性評価は、タンパク質-炭水化物相互作用の差次的結合を評価するためのこのアッセイの有用性をさらに実証しています。これらのデータは、広範囲のデンプンおよびグリコーゲン相互作用タンパク質の特性評価に対するこのアッセイの適合性を実証する。
Introduction
グルカンホスファターゼは、タンパク質チロシンホスファターゼ(PTP)スーパーファミリー1内の二重特異性ホスファターゼ(DSP)の機能的に多様なサブファミリーのメンバーです。それらは、広く異なる光合成生物、人間、脊椎動物、および一部の無脊椎動物や原生生物を含むほとんどの生命体で発見されています2,3,4。植物には、デンプン過剰4(SEX4)、ライクセックスフォー1(LSF1)、およびライクセックスフォー2(LSF2)5,6,7の3つの既知のグルカンホスファターゼが含まれています。グルカンホスファターゼを欠く植物は、一時的なデンプンの分解と葉のデンプンの蓄積の速度が低下します8,9。ラフォリンは、脊椎動物およびヒトのグリコーゲンを脱リン酸化するグルカンホスファターゼファミリーの創設メンバーです3,10。ラフォリンの変異は、てんかんの致命的な常染色体劣性形態である神経変性ラフォラ病をもたらします11。グルカンホスファターゼはグリコーゲンとデンプンの代謝に必要であり、植物のデンプン含有量を調節し、神経変性ラフォラ病を治療するための重要な酵素として浮上しています12,13。モデルグルカン基質を用いたグルカンホスファターゼに関する最近のX線結晶構造解析研究は、基質結合とグルカン脱リン酸化の触媒機構を明らかにしています14,15,16,17。しかし、グルカンホスファターゼがそれらの生理学的基質にどのように結合するかについての現在の理解は不完全である。
デンプンは、80%〜90%のアミロペクチンと10%〜20%のアミロースからなるグルコースの不溶性ポリマーです18。植物グルカンホスファターゼの基質は、グリコーゲンやデンプン顆粒などのリン酸化炭水化物分子です。リン酸化グルコシル残基は、1:600のリン酸:グルコシル残基比で存在します。興味深いことに、リン酸塩はアミロペクチン分子19上にのみ存在する。主な植物グルカンホスファターゼSEX4は、デンプン顆粒に作用してアミロペクチン分子を脱リン酸化します。構造誘導突然変異誘発研究と組み合わせたSEX4のX線結晶構造は、グルカン構造内のさまざまな位置に対するSEX4のユニークな基質特異性を実証しました15。我々は最近、SEX4の生物学的に関連する活性は、その可溶化アミロペクチン基質20に作用するときにのみ観察できることを示した。しかし、グルカン-SEX4相互作用を理解することは、基質の構造の複雑さ、より広い結合特異性、およびタンパク質とその基質間の結合親和性が低いため、困難であることが証明されています。これらの問題により、等温滴定熱量測定(ITC)、核磁気共鳴(NMR)分光法、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)ベースのアッセイなど、タンパク質-リガンド相互作用で一般的に使用される方法を利用する能力が妨げられてきました。
興味深いことに、炭水化物とタンパク質の相互作用に関する私たちの理解の多くは、レクチンの研究から来ています。コンカナバリンA(ConA)は、もともとジャックビーンから抽出されたタンパク質のマメ科レクチンファミリーです。ConAは炭水化物に高い特異性で結合するため、薬物の標的化および送達用途での使用に有利です。非還元性α-D-マンノシルおよびα-D-グルコシルを含む様々な基質へのConAの結合は、広く研究されている19,20。市販のConA結合セファロースビーズは、糖タンパク質および糖脂質を精製するために一般的に使用されている21。ConAは、グルコース残基のC3、C4、およびC6ヒドロキシル基を介してこれらのグルカンに結合します。ConA-セファロースビーズは、グリコーゲン-タンパク質およびデンプン-タンパク質相互作用の結合を測定するためにも成功裏に使用されています22,23。本研究では、ConA-Sepharoseビーズを用いて、グルカンホスファターゼ-アミロペクチン相互作用の結合特異性を測定するための結合アッセイを開発しました。
以前は、グルカンホスファターゼ基質結合能を評価するためにConAベースの沈降アッセイが使用されていました14、20、24。この研究では、同じ戦略を使用して、グルカン-グルカンホスファターゼと炭水化物相互作用の結合親和性を決定するための新しい方法を開発しました。この方法は、様々な可溶化糖質-タンパク質相互作用を調べるための利点もある。
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Protocol
1. ConA-セファロースビーズの調製
- 67 mM HEPES (pH 7.5)、10 mM MgCl 2、および 0.2 mM CaCl2 を含む結合バッファー 250 mL を作製します。1 M NaOH溶液を使用してpHを調整します。
- 250 μLのConA-セファロースビーズ懸濁液を1.5 mLのマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。内容物を10,000 x g で4°Cで30秒間遠心分離します。 上清を捨てる。
注:アッセイに使用するアミロペクチン濃度ごとに、1.5 mLマイクロ遠心チューブに250 μLのConA-セファロースビーズが必要です。 - 250 μLのConA-セファロースビーズを含む各チューブに750 μLの結合バッファーを追加します。チューブを10,000 x g で4°Cで1分間遠心分離します。 上清を除去する。このステップを2回繰り返して、ビーズが適切に洗浄され、結合バッファーで平衡化されていることを確認します。
2.アミロペクチン溶液の調製
- 10 mg/mLポテトアミロペクチンの原液を作ります。アミロペクチンは水不溶性であり、熱によって可溶化することができる。可溶化するには、0.1 gのジャガイモアミロペクチンを10 mLの蒸留水に加えます。懸濁液を水浴中で80°Cで1時間、または溶液が濁らなくなるまで加熱する。
- 溶液を室温(RT)に戻して、凝集を避けるためにボルテックスを繰り返します。
- アルコールアルカリ処理は、アミロペクチン基質を可溶化するための代替方法です。この方法を使用して可溶化するには、以下の手順に従います。
- 0.5 gのアミロペクチン基質を5 mLの20%エタノールおよび5 mLの2 M NaOHに懸濁します。内容物をRTで15〜20分間激しく攪拌します。
- 次に、10 mLの水を加え、2 M HClを加えて溶液のpHを6.5に調整し、得られた溶液の容量を蒸留水で50 mLにして、10 mg/mLのアミロペクチン溶液を作ります。
- 10 mg/mLの可溶化アミロペクチン溶液を希釈して、一連の2 mLの希釈アミロペクチン溶液を作ります。例えば、10 mg/mLの半希釈を行い、一連のアミロペクチン濃度(5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL、0.156 mg/mL、0.078 mg/mL、0.039 mg/mL、0.019 mg/mL、0 mg/mL)を調製します。
3. ConA-セファロースの調製:アミロペクチンビーズ
- 希釈した各アミロペクチン溶液250 μLを、結合バッファーで事前に平衡化した250 μLのConA-セファロースビーズを含む1.5 mLマイクロ遠心チューブに加えます。内容をよく混ぜます。対応するアミロペクチン濃度でチューブにラベルを付けます。
- 内容物を回転ホイール上で4°Cで30分間インキュベートします。
注:ConA-セファロース:アミロペクチン結合複合体は、20分後に経時的に変化はありません。.30分のインキュベーション時間は、平衡に達することを保証するために、インキュベーション時間を10分から1時間に変更することによって選択されました。 - チューブを10,000 x g で1分間遠心分離します。新しくラベル付けした1.5 mLマイクロ遠心チューブに上清を収集します。これらの上清画分を保存して、D−グルコースアッセイ12 (アミロペクチンの酸加水分解とそれに続く酵素アッセイ による グルコースのUV定量)を行う。このステップは、すべてのアミロペクチンがビーズに結合していることを確認するために必要です。
- 750 μLの結合バッファーをConA-セファロース:アミロペクチンビーズに加えます。チューブを10,000 x g で1分間遠心分離します。上清を捨てて、結合していないアミロペクチン分子を除去します。
- 手順3.4を繰り返して、十分に洗浄します。各チューブには、さまざまな量のアミロペクチン基質に結合したConA-セファロースビーズが含まれています。
4. SEX4をConA-セファロース:アミロペクチンビーズでインキュベートする
- 250 μLのConA-セファロース:アミロペクチンビーズを、10 μgのSEX4タンパク質、10 mMジチオスレイトール(DTT)、および10 μMのプロテアーゼ阻害剤カクテル(PIC)を含む100 μLの結合バッファーと混合します。各チューブの総容量は350μLであることに注意してください。
注:プロテアーゼ阻害剤カクテルは、不必要なSEX4分解を回避するための予防措置として追加されます。これはオプションの手順です。このアッセイでは、組換えタンパク質シロイヌナズナSEX4(AtSEX4)が使用される。精製されたタンパク質は、化学発光を介してタンパク質を検出するために必要なN末端ヒスチジンタグを含有する。グルカンホスファターゼ精製に関する詳細な情報は、以前の刊行物14、20、24に記載されている。 - タンパク質とConA-セファロース:アミロペクチンビーズ懸濁液を4°Cで45分間、穏やかな回転でインキュベートします。
注:45分のインキュベーション時間は、複合体の平衡に達することを確実にするために選択されます。 - チューブを10,000 x g で1分間遠心分離します。ゲルローディングチップを使用して上清50 μLを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに注意深くピペットで入れます。20 μLの4x SDS-PAGE色素と10 μLの水を、50 μLの上清画分を含む各チューブに加えます。サンプルを95°Cで10分間加熱します。SDS-PAGEゲルを実行するためにこれらのサンプルを保存してください。「上清(S)」とラベル付けされた10本の新しいチューブが対応する基質濃度を持っていることを確認してください。
- 750 μLの結合バッファーをConA-セファロース:アミロペクチン:SEX4ビーズに加えて、ビーズから未結合タンパク質を除去します。チューブを10,000 x g で1分間遠心分離します。この手順をもう一度繰り返して、適切に洗浄します。上清を捨てる。
- 洗浄したConA-セファロース:アミロペクチン:SEX4ビーズを含むチューブに20 μLの4x SDS-PAGE色素と80 μLの蒸留水を加えます。サンプルを95°Cで10分間加熱し、10,000 x g で1分間遠心分離します。
- ペレットを廃棄し、SDS-PAGEゲルを実行するための上清を保存します。上清80 μLを新しいチューブにピペットで入れ、「ペレット(P)」とラベル付けします。
5. SDS-PAGEゲルの実行
- 40 μLの未結合タンパク質サンプル(ステップ2.3で作成、ラベルS)を4%〜12%のプレキャストポリアクリルアミドゲルウェルに最低基質濃度から最高濃度までロードしますが、最初のレーンはタンパク質分子量マーカーをロードするために自由に保ちます。2番目のゲルを使用して、ステップ2.5で作成した10個の結合タンパク質サンプル(Pとラベル付け)をロードします。
- 新たに調製した1x SDS-PAGEランニングバッファーを装置の両方のチャンバーに追加します。ゲルを150 Vで35分間、または色素前面がゲルの底に達するまで実行します。
- 装置からランゲルを取り外し、スペーサーとガラス板を取り外します。分離したゲルを使用して、ウェスタンブロット分析を実行します。
6. 化学発光検出のためのウェスタンブロッティング14,15
注:この方法は、ユーザーがラボで使用しているウェスタンブロッティング装置に応じて簡単に変更/適合できます。
- 5.8 gのトリス塩基、2.9 gのグリシン、0.37 gのSDS、および200 mLのメタノールを含む1 Lの転写バッファーを作成します。
- サイズ分離したタンパク質をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース膜に移します。スポンジ、ろ紙、ゲル、およびニトロセルロース膜をウェスタン転写プロトコル14,15に従って簡単に組み立てます。70 Vで1時間運転します。
- 非特異的タンパク質結合を防ぐために、1%〜5%ウシ血清アルブミン(BSA)または乳タンパク質のタンパク質溶液を含むニトロセルロース膜を50 mLのTBSTバッファー(20 mM Tris [pH 7.5]、150 mM NaCl、0.1%トゥイーン20)中で1時間インキュベートします。TBSTバッファーを使用してメンブレンを3回洗浄し、未結合のブロッキング溶液を除去します。
- Hisタグ付きタンパク質に特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗体でメンブレンを1時間インキュベートします。メンブレンをTBSTバッファーで3倍洗浄し、未結合の抗体を除去します。最適な再現性と感度を得るために、TBSTに対する抗体の1:2,000希釈を使用してください。
- HRP酵素結合抗体は、SEX4タンパク質のヒスチジンタグに特異的に結合し、化学発光試薬の存在下でバンドを生成します。デジタルイメージングの場合は、等量の化学発光基質溶液(各750 μL)を1.5 mLチューブに入れた溶液を作ります。メンブレンを溶液中で少なくとも5分間インキュベートします。
- 膜タンパク質面を下にしてブロットスキャナーに置き、取得ソフトウェアを実行して、ペレット画分と上清画分の両方のタンパク質を定量します。
7.データ分析
- ブロットスキャナーで取得ソフトウェアを使用して定量信号測定を実行します。上清およびペレット画分中のすべての定量的測定値を、負荷された総タンパク質に正規化します。
注:このソフトウェアでは、上清およびペレット画分中の各タンパク質バンドの強度を定量化することができます。 - 飽和結合実験において、タンパク質結合対アミロペクチン濃度のパーセンテージをプロットする。データ分析ソフトウェアを使用してKDを計算し、データをY = Bmax x X/(KD + X)に適合させます。
注:Bmaxは最大特異的結合であり、Y軸は結合したタンパク質の割合であり、X軸はアミロペクチン濃度である。
図1:ConA-セファロース沈降アッセイワークフローの概要 。 (A)ConA-セファロースビーズの調製。(B)アミロペクチン基質とのインキュベーション。(C)SEX4タンパク質とのインキュベーション。(D)遠心分離による結合タンパク質画分と非結合タンパク質画分の分離。(E)SDS-PAGEによるタンパク質の分離。(F)ウェスタンブロット分析。(g)Hisタグ付きSEX4タンパク質の化学発光検出。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
グルカンホスファターゼファミリーのタンパク質の重要な特徴の1つは、グルカン基質に結合する能力です。まず、SEX4のConA-セファロース:アミロペクチンビーズへの結合能をSDS-PAGEを用いて分析した(図2A)。ウシ血清アルブミン(BSA)は、ConA-Sepharose:アミロペクチンビーズへのタンパク質の非特異的結合を検出するためのネガティブコントロールとして機能しました。タンパク質のSDS-PAGE分析では、ペレット画分にSEX4タンパク質、上清画分にBSAが存在することが示されました。グルカン結合能が有意に低下した既知のSEX4変異体であるW278Aもアッセイに含まれました。W278A変異体は上清画分に現れ、SEX4タンパク質のグルカン結合能を検出するためのこのアッセイの有用性と特異性を示しています。SDS-PAGEはSEX4タンパク質を可視化しましたが、小さなグルカンホスファターゼの感度と使用について懸念がありました。たとえば、ConAレクチンタンパク質は、LSF2などの小さなタンパク質の検出を妨げる可能性があります。この方法がグルカンホスファターゼのみを検出できるかどうかをテストするために、N末端ヒスチジンタグに特異的な抗体を使用してウェスタンブロットを実施しました。実際、SEX4の検出は有意に増加しており、この方法はN末端ヒスチジンタグを有するグルカンホスファターゼの検出に特異的です(図2B)。リガンド-タンパク質相互作用実験の定量的測定では、適切なリガンドおよびタンパク質濃度を確立するために不可欠な制御を行う必要があります。したがって、共沈降アッセイを次に3つの異なるSEX4濃度で試験した(図2C−E)。化学発光検出 による 可視化には2 μgのSEX4で十分ですが、5 μgまたは10 μgのSEX4を使用すると、部分結合をより正確に検出できます。さまざまなアミロペクチン濃度(0.5 mg / mL、1.0 mg / mL、および5 mg / mL)に対するSEX4結合もテストされました。これらの結果は、アミロペクチン濃度の増加に伴うSEX4結合の増加、5 mg / mLのアミロペクチンでの飽和結合も示しています。.
アミロペクチンとSEX4野生型タンパク質の結合親和性を決定するために、10 μgのSEX4をアミロペクチン(最大5 mg/mL)とインキュベートし、各濃度での結合を決定しました(図3A)。タンパク質結合率データを特定の1部位結合モデルに適合させると、KD は1.03 ± 0.23 mg/mLとなりました(図3B)。SEX4野生型タンパク質の利用可能な結晶構造はありません。代わりに、触媒的に不活性なSEX4 C198S変異体の結晶構造は、DSPと炭水化物結合分子(CBM)ドメインからなるSEX4の結合界面を明らかにします。SEX4 C198Sとアミロペクチン相互作用の結合親和性は、C198S変異タンパク質に対して0.11±0.05 mg / mLのKD を有すると決定されました。a~10倍の結合親和性は、SEX4野生型タンパク質と比較して増加した。C198Sの結合増加の正確なメカニズムは理解されていませんが、SEX4の一点変異がグルカン結合能の有意な増加をもたらす方法を見るのは興味深いことです。
次に、ジャガイモアミロペクチンに対するラフォリン、LSF2、トウモロコシ(Zea mays)SEX4、およびジャガイモ(Solanum tuberosum)SEX4の結合を測定するためのこの方法の適用性を評価した。ここで提示されたプロトコルを使用して、結果は、農業的に重要な作物からのラフォリン、LSF2、およびSEX4もアミロペクチンに分化的に結合することを示し、各タンパク質に対して異なる結合メカニズムを示唆しています(図4A、B)。まとめると、これらの発見は、グルカンホスファターゼとアミロペクチン基質との基質結合の測定のための成功した方法開発を明らかにしました。
図2:ペレット(P)および上清(S)SEX4画分の可視化とアッセイパラメータの最適化。 (A)SDS-PAGEおよびクマシー染色を用いたペレットおよび上清画分中の5 μgのSEX4タンパク質(34 kDa)の可視化。25 kDa以下のタンパク質バンドは、セファロースビーズに結合したConAタンパク質のものです。(B)ウェスタン分析によるペレットおよび上清画分中のSEX4タンパク質の可視化。5 μgのSEX4タンパク質は、ヒスチジンタグ用に開発された抗体を介して検出されました。(C-E)ウェスタン分析は、さまざまな量のSEX4タンパク質(2 μg、5 μg、および10 μg)およびアミロペクチン濃度(0.5 mg / mL、1.0 mg / mL、および5.0 mg / mL)を使用して行われました。平衡結合を確実にするために、250 μLの容量のビーズと30分のインキュベーション時間をすべての実験に使用しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:定量的 インビトロ 沈降アッセイ 。 (A)アミロペクチン濃度が0 mg/mLから5 mg/mLに増加したときの上清枯渇とSEX4野生型タンパク質のペレットシグナルの漸進的な増加の代表的なデータ。(B)ConA-セファロースビーズに固定化されたさまざまな量のアミロペクチンに対して結合したSEX4野生型タンパク質の割合。ビーズを10,000 x g で1分間ペレット化し、上清とペレットタンパク質の両方をSDS-PAGEで分離し、ウェスタン分析で検出し、定量して結合率を測定しました。データは、3回の反復の平均±SDを表す。(C)アミロペクチン濃度が0 mg/mLから5 mg/mLに増加したときの上清枯渇とSEX4 C198Sタンパク質のペレットシグナルの漸進的な増加の代表的なデータ。(D)ConA-セファロースビーズに固定化されたさまざまな量のアミロペクチンに対して結合したSEX4 C198Sタンパク質の割合。ビーズを10,000 x g で1分間ペレット化し、上清とペレットタンパク質の両方をSDS-PAGEで分離し、ウェスタン分析で検出し、定量して結合率を測定しました。データは、3回の反復の平均±SDを表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:可溶化アミロペクチンに対するSEX4オルソログ、ラフォリン、LSF2の基質結合 。 (A)ConA-セファロースビーズに固定化された5 mg/mLのアミロペクチンと各タンパク質の代表的な結合。(B)結合タンパク質の割合は、3回の独立した実験で得られた正規化化学発光シグナルを用いて計算した。データは3回の反復の平均±SDを表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この研究は、グルカン-グルカンホスファターゼ相互作用の結合親和性の決定を可能にする新しい in vitro 沈降アッセイの開発に成功したことを示しています。アッセイデザインでは、グルコースのヒドロキシル残基 を介した グルカンへのレクチンConAの特異的結合を利用して、可溶化された炭水化物基質をセファロースビーズ上に間接的に捕捉します。これにより、遠心分離 による 結合タンパク質画分と非結合タンパク質画分の分離、および可溶化グルカン基質とグルカンホスファターゼの結合親和性の決定が可能になります。試験したすべてのグルカンホスファターゼは、アミロペクチンに特異的に結合することがわかりましたが、アミロペクチンがない場合、ConA-Sepharoseビーズへの結合は検出できませんでした。
実験は、ConA-セファロースビーズに結合した少量の一定量のSEX4タンパク質および範囲のアミロペクチン濃度との結合親和性を測定するために実施された。ビーズへの結合が最も高いアミロペクチン濃度を確保するために、過剰のConA-セファロースビーズが使用されました。アミロペクチンの完全な結合をグルコースアッセイ で 試験した。原稿に示されているプロトコルは、定量的沈降を利用して結合タンパク質画分と非結合タンパク質画分を分離し、ゲル電気泳動とウェスタン分析を利用して、ConA-Sepharose:アミロペクチンビーズに結合した量と比較して上清中のSEX4の量を測定します。ペレット画分の定量は、結合平衡を乱さないように最小限の洗浄で済みます。ペレット画分の過小評価を避けるためには、ペレットを調べるのではなく、上清中の遊離SEX4の濃度を測定し、結合したSEX4:アミロペクチン複合体の差を計算するだけで十分です。
ここに記載されている インビトロ 沈降アッセイにより、SEX4野生型タンパク質の差次的結合親和性を決定しました。興味深いことに、開発された インビトロ 沈降アッセイを用いて決定されたSEX4野生型タンパク質の結合親和性は、ゲルシフトアッセイ25で決定された報告値のより高い範囲内に入る。結合アッセイは、より低い基質濃度に敏感で、単純であるべきですが、ゲルシフトアッセイでは、さまざまな量のグルカン基質の存在下で個々の天然ゲルを作製する必要があります。この時間のかかる方法では、試験できる濃度の数が制限され、限られた基質濃度範囲を試験することができます。代わりに、サンプル調製は、当社の in vitro 沈降アッセイで迅速かつ信頼性があります。SEX4野生型タンパク質とSEX4 C198S変異体を比較すると、10倍の結合親和性の違いが明らかになります。これに関して、このアッセイは、SEX4変異タンパク質の結合を定量的および定性的に決定するために敏感である。
タンパク質-炭水化物相互作用は、触媒作用、細胞シグナル伝達、認識など、多くの重要な生物学的プロセスに不可欠です。また、製薬業界や食品業界で重要な役割を果たしているため、ますます注目を集めています。X線結晶構造解析は、原子レベルでタンパク質構造を得るために広く使用されています。しかし、糖鎖基質の構造の不均一性と柔軟性により、糖鎖結合タンパク質構造を得ることが難しくなります。最近では、クライオEMおよび核磁気共鳴(NMR)分光法も、糖鎖結合タンパク質の構造を決定するために採用されています26。高分解能構造技術の多くの進歩にもかかわらず、糖鎖-タンパク質複合体の構造を得ることは困難である。その結果、限られた数のタンパク質 - 炭水化物複合体構造のみが実験的に解明されてきた。さらに、結晶構造は、特定の立体配座におけるタンパク質のスナップショットを提供するだけであり、基質結合の動的な性質は提供しません。あるいは、等温滴定熱量測定(ITC)および表面プラズモン共鳴(SPR)を含むいくつかの生物物理学的手法を使用して、タンパク質-炭水化物相互作用を測定します27。しかしながら、これらの方法もまた制限がないわけではない。タンパク質-糖鎖相互作用を決定する際の主な課題の1つは、他のタンパク質-リガンド相互作用と比較して比較的弱い相互作用です。高マイクロモルから低マイクロモルの範囲内の相互作用は、ITCおよびSPRの使いやすさを著しく低下させる。 ゲルシフトアッセイやプルダウンアッセイなどの間接法は、他の方法では評価が困難な相互作用を決定するために大きな注目を集めています25。したがって、この結合アッセイは、タンパク質および可溶性炭水化物相互作用の高感度測定に広く適用可能なアプローチです。
グリコーゲンとデンプンは、グルコースの分岐ポリマーで作られた主要な炭水化物貯蔵分子です。分岐パターン、柔軟性、およびデンプンとグリコーゲン内の異なるミクロドメインの存在は、独自の基質結合メカニズムを採用するために相互作用するタンパク質を必要とします。SEX4の基質認識メカニズムに関する多くの理解は、構造誘導突然変異誘発と組み合わせたX線結晶学的研究から得られています。デンプンを脱リン酸化するには、SEX4はデンプン顆粒の著しく異なるマイクロドメインと相互作用して、位置特異的な脱リン酸化のためのリン酸塩を見つける必要があります。実験的には、タンパク質とグルカンの間の弱い相互作用、および炭水化物の構造の柔軟性と不均一性を考えると、グルカンホスファターゼの結合親和性を決定することは依然として課題です。この原稿は、Concanavalin A(ConA)ベースの in vitro 沈降アッセイを使用して、グルカンホスファターゼ-炭水化物相互作用の結合親和性を決定する方法を提示します。グルカンホスファターゼは、炭水化物を結合、位置特定、および脱リン酸化するために異なるメカニズムを採用しています。これまで、ITCはラフォリンと直鎖状オリゴ糖鎖の結合親和性の測定に用いられてきました。しかし、ITCやSPRなどの直接的な技術 を介して 、グルカンホスファターゼとその生理学的基質との結合親和性を明らかにした研究はありません。グルカンホスファターゼの基質結合を決定するためのこのアッセイの有用性をよりよく理解するために、アミロペクチンに対するラフォリン、LSF2、およびSEX4の結合を評価しました。将来の研究は、すべてのグルカンホスファターゼおよびそれらの生理学的に関連するグルカン基質の結合親和性を実験的に決定するために行うことができる。本方法の重要なステップの1つは、アッセイに最適なインキュベーション時間と基質濃度範囲を決定することです。各グルカンホスファターゼは基質と異なる結合をし、この方法はSEX4用に最適化されています。これらのパラメータを把握するには、初期最適化実験を実行することが重要です。もう1つの制限は、アッセイのためのヒスチジンタグ付きタンパク質の使用である。ただし、研究タンパク質に抗体が存在する場合、この方法は任意のグルカン相互作用タンパク質に対して簡単に最適化できます。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、国立科学財団賞MCB-2012074によってサポートされました。著者らは、貴重な議論と支援を提供してくれたフロリダ大学生化学分子生物学部のクレイグW.ヴァンダークーイ博士に感謝します。著者らはまた、フロリダ大学生化学・分子生物学部のマシュー・S・ジェントリー博士の支援に感謝している。スキッドモア大学神経科学プログラムの議長であるサラ・ラガルワー博士に、ウェスタンブロットイメージングにLICORC桁ブロットスキャナーの使用を許可してくださったことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP | Therm Fisher Scientific | MA1-21315-HRP | |
| Biorad gel electrophoresis and Western blot kit | Biorad | 1703930 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 208291 | |
| C-Digit blot scanner | LICOR | 3600-00 | Blot scanner |
| Complete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| Concanavalin A-sepharose beads | Sigma-Aldrich | C9017 | This product contains in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol |
| Centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | Version 8.0 | Data analysis software |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H8651 | |
| Image Studio | LICOR | 3600-501 | Acquisition Software |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | PI28312 | |
| Potato amylopectin | Sigma-Aldrich | A8515 | |
| Precast SDSPAGE Gels | Genscript | M00653S | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | MP1TWEEN201 | |
| Westernsure premium chemiluminescence substrate | LI-COR | 926-95000 |
References
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