Summary
Her beskriver vi en enkel metode for å implantere en kommersiell kontinuerlig glukosemonitor designet for pasienter på mus og gi skriptene for å analysere resultatene.
Abstract
Mus er en vanlig modellorganisme som brukes til å studere metabolske sykdommer som diabetes mellitus. Glukosenivåer måles vanligvis ved haleblødning, noe som krever håndtering av musene, forårsaker stress og gir ikke data om mus som oppfører seg fritt i den mørke syklusen. State-of-the-art kontinuerlig glukosemåling hos mus krever å sette inn en sonde i musens aortabue, samt et spesialisert telemetrisystem. Denne utfordrende og dyre metoden har ikke blitt tatt i bruk av de fleste laboratorier. Her presenterer vi en enkel protokoll som involverer bruk av kommersielt tilgjengelige kontinuerlige glukosemonitorer som brukes av millioner av pasienter for å måle glukose kontinuerlig i mus som en del av grunnforskningen. Den glukosefølsomme sonden settes inn i det subkutane rommet på baksiden av musen gjennom et lite snitt på huden og holdes på plass tett ved hjelp av et par suturer. Enheten sys på musehuden for å sikre at den forblir på plass. Enheten kan måle glukosenivået i opptil 2 uker og sender dataene til en nærliggende mottaker uten behov for å håndtere musene. Skript for grunnleggende dataanalyse av registrerte glukosenivåer er gitt. Denne metoden, fra kirurgi til beregningsanalyse, er kostnadseffektiv og potensielt svært nyttig i metabolsk forskning.
Introduction
Diabetes mellitus (DM) er en ødeleggende sykdom preget av høyt blodsukkernivå. Type 1 DM kan være et resultat av et autoimmunt angrep på de insulinproduserende betacellene i bukspyttkjertelen. Type 2 DM og svangerskaps DM, derimot, er preget av en svikt i beta-cellene til å utskille tilstrekkelig insulin som respons på en økning i glukosenivået1. Musen er en vanlig modellorganisme som brukes til å studere DM siden den har lignende fysiologi, og dens normale glukosenivåer er nær menneskers. Videre kan spesifikke musestammer utvikle DM på grunn av mutasjoner i viktige signalveier eller etter eksponering for spesifikke dietter, noe som muliggjør sykdomsmodellering 2,3,4.
Blodsukker måles vanligvis hos mus ved hjelp av glukometre designet for pasienter ved å trekke ut en liten dråpe blod (1-2 μL) fra tuppen av musens hale. Denne metoden forårsaker stress og krever håndtering av musen, noe som påvirker glukosenivået og forbyr måling av blodsukkernivået hos mus som oppfører seg fritt, eller når forskeren ikke er i nærheten av5. Blødning av musene kan forårsake stress for nærliggende mus, spesielt for mus i samme bur hvis glykemi ikke er målt ennå, og dermed påvirke resultatene. Mus reagerer forskjellig avhengig av håndtereren, og personen som måler glukose kan påvirke glukosenivået til musene. Disse fallgruvene krever nøye eksperimentell design og ligger til grunn for noen inkonsekvenser mellom eksperimenter.
Det er mulig å måle glukose i fritt bevegelige mus uten blødning ved å implantere glukosesensorer i musens aortabue ved hjelp av toppmoderne telemetri6. De resulterende målingene er veldig gode og kan opprettholdes over en lang periode, men det er utfordrende å implantere disse sensorene, og telemetrisystemet er dyrt, noe som fører til en moderat bruk av denne metoden og ingen adopsjon i ikke-spesialiserte laboratorier. Subkutane eller andre glukosesensorer som er skreddersydd til dimensjonene til musene og deres fysiologi har blitt utviklet de siste årene, men disse krever igjen dyktige eksperter og er i noen tilfeller kostbare 6,7,8,9,10.
Kommersielle kontinuerlige glukosemonitorer (CGM) som opprinnelig ble utviklet for å overvåke glukosenivåene til DM-pasienter, tilbyr et annet alternativ for å måle glukose i fritt bevegelige mus, med lavere kostnader og krav til teknisk ekspertise enn implanterte sonder. Slike sonder har blitt brukt i grunnforskning av noen få laboratorier 5,11,12,13,14,15 inkludert våre kolleger som brukte denne protokollen 16. Disse enhetene inkluderer vanligvis en sensor, en monteringsenhet, en mottaker og et program. Sensoren har en kanyle som styrer den enzymatiske glukosensoren, tape, en energikilde, korttidsminne og en trådløs kommunikasjonsmodul som lagrer og sender dataene til mottakeren. Mottakeren kan vise gjeldende glukosenivåer og sender dataene til en server; Denne mottakeren kan være en mobiltelefon. Programvaren gir data for pasienten og det medisinske behandlingsteamet om pasientens glykemi. Hos pasienter festes sensoren enkelt ved hjelp av monteringsenheten. Kanylen settes inn subkutant ved å presse monteringsenheten mot huden, og sensoren holder seg på plass ved hjelp av tape.
Dette er en detaljert protokoll for å tilpasse en kommersiell CGM-enhet for å måle glukosenivået i mus. Denne protokollen beskriver hvordan du kirurgisk setter inn glukosesensoren og fester den til musen. Skript for grunnleggende dataanalyse og datavisualisering tilbys. De potensielle fallgruvene, feilsøking og eksempler på standardresultater er gitt. Protokollen nedenfor er spesifikk for en bestemt CGM, men kan enkelt tilpasses andre typer kommersielle CGM etter hvert som de blir tilgjengelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøkene ble godkjent av det hebraiske universitetets institusjonelle dyrepleie- og brukskomité (IACUC).
MERK: Alle verktøy må steriliseres, og håndtering av kanylen må utføres ved hjelp av en steril teknikk. Protokollen nedenfor er finjustert til en bestemt CGM. Protokollen kan tilpasses andre CGM-er.
1. Analgetisk administrering før prosedyren
- Administrer 5 % glukose og 0,45 % saltvann med meloksikam subkutant 5 mg/kg kroppsvekt.
2. Administrasjon av anestesi
- Plasser musen i induksjonskammeret, lukk lokket tett. Still inn induksjonen av anestesi i induksjonskammeret på 3 % isofluran med en strømningshastighet på 500 ml/min.
- Når musen ikke reagerer, fjern musen fra kammeret og sett nesekjeglen til musen. Bekreft anestesinivået med en interdigital klype. Sett konsentrasjonen til 1%-1,5% isofluran og strømningshastigheten til 100 ml/min hos mus som veier 30 g.
- Påfør oftalmisk salve i øynene for å forhindre tørrhet under anestesi.
3. Forberedelse av sensoren
- Monter sensoren på sensormonteringsenheten for å eksponere sensorens tape og kanyleside (figur 1A). Vær forsiktig siden nålen settes inn i kanylen og eksponeres.
- Sutur to 5-0 taper punkt suturer til båndet på begge sider av kanylen (figur 1A).
4. Hårfjerning og desinfeksjon
- Barber et område på ca. 4 cm x 4 cm på midtlinjen på baksiden av musen.
- Administrer en hårfjerningskrem til det barberte området for å sikre fullstendig hårfjerning.
- Tørk huden og desinfiser den med en antiseptisk løsning inneholdende 2% klorhexidinglukonat og 70% isopropylalkohol.
5. Dorsal hudforberedelse
- Gjør et 2 mm snitt i midten av det barberte området over ryggraden ved hjelp av skarp saks (figur 1B).
- Sett kort opp små tanger med butt kant under huden for å danne en liten underhudslomme slik at kanylen enkelt kan settes inn i underhuden (figur 1B).
- Før en sutur fra trinn 3.2 gjennom huden på hver side av snittet (figur 1C).
6. Innsetting av sensor
- Fjern sensoren helt fra sensormonteringsenheten (kanylen er tom for nålen), og hold sensoren med tang for å forhindre at den omkringliggende tapen fester seg til seg selv.
- Sett kanylen forsiktig inn i underhudslommen.
- Trekk suturene på hver side, og stram og bind dem for å feste sensoren godt på plass, slik at kanylen ikke glir ut fra underhudslommen når tapen løsner over tid.
7. Sensorfeste og suturering
- Fest sensoren godt på baksiden ved å binde de indre suturene og bruke tapen som omgir sensoren.
- Lag åtte diskontinuerlige suturer rundt sensoren, fest kanten av sensorens tape til huden (figur 1D).
8. Aktivering av leseren
- Når sensoren er satt inn, aktiverer du leseren ved å slå på leseren, trykke på Start ny sensor og sveipe sensoren i henhold til produsentens instruksjoner.
- Den første avlesningen kan bare tas noen få minutter etter installasjon av CGM. Når det gjelder denne CGM, kan den første avlesningen tas etter 60 min.
9. Leseresultater
- Plasser leseren nær musen (det er ikke nødvendig å berøre den). Alle data som er lagret i sensoren, overføres til leseren.
MERK: Ulike CGM-enheter kan variere i perioden med historisk datalagringskapasitet. Når det gjelder denne CGM, kan maksimalt 8 timer lagres mellom to avlesninger.
10. Fjerne sensoren
- Bedøv musen (se avsnitt 2).
- Klipp suturene som kobler sensoren til baksiden av musen ved hjelp av skarp saks.
- Fjern og kutt suturene ved snittet ved å fjerne sensoren forsiktig.
- Bruk om nødvendig en enkelt sutur for å lukke snittet på baksiden av musen.
11. Analyse av data
- Datanedlasting: Last ned dataene i henhold til instruksjonene fra CGM-produsenten.
MERK: Hver CGM har et annet format, som kanskje eller kanskje ikke er lett tilgjengelig for brukeren. Dette er et viktig hensyn ved valg av CGM. - For analyse med den medfølgende programvaren, formater dataene i henhold til instruksjonene i readme-filen på Github (https://github.com/mika-littor/CGM-in-Mice-Analysis.git).
Figur 1: Fest sensoren til musen . (A) To suturer markert med røde piler føres gjennom sensorbåndet på begge sider av kanylen på undersiden av CGM-sensoren, markert med en hvit pil. (B) Et lite snitt på 2 mm gjøres i midten av det barberte området langs ryggraden ved hjelp av skarp saks. Små tang med butt kant settes kort inn under huden for å danne en liten underhudslomme slik at kanylen kan settes inn subkutant. (C) De samme suturene fra A føres subkutant på hver side av snittet. De røde pilene markerer suturene festet til sensoren som i A, de blå pilene markerer stedet suturene passerte gjennom til huden på baksiden av musen, og den svarte pilen viser snittet. (D) Etter at kanylen er satt inn, strammes de indre suturene og bindes nær snittet for å sikre CGM. Sensoren sys deretter til huden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kirurgisk utfall
Resultater fra åtte HSD: ICR-mus (i alderen 8 uker) matet et fettfattig høyt sukrose diett (HFHS) i 18 uker og fem magre HSD: ICR-mus (i alderen 12 uker) er vist. Enheten vi brukte lagrer data i opptil 8 timer. Tilgang til den lokale dyreavdelingen ble begrenset til 07:00-19:00, og forbød dermed datainnsamling i slutten av PM-timene, når musene er aktive. Musene ble derfor plassert i et rom med omvendt belysning i 7 dager før det kirurgiske inngrepet, med mørke timer mellom 8:30 og 20:30. Dette er ikke nødvendig for alle enheter eller dyreavdelinger, og vi anbefaler å bruke enheter som kan lagre informasjon i over 12 timer.
Det var ingen mortalitet etter operasjonen. Operasjonen førte til ca. 10 % vekttap i løpet av forsøkstiden (figur 2A). Derfor bør målingene som tas de første dagene etter operasjonen, under vekttap, tolkes med forsiktighet. Vekttap skyldtes ikke musens manglende evne til å nå mat og vann. Sammenligningen av CGM-målinger og blodsukkermålinger på halespissen viste godt samsvar i fastende og ikke-fastende tilstander (figur 2B). CGM var i gjennomsnitt aktiv i 11 dager (figur 2C). Maksimalt antall dager for denne typen enhet er 14 dager. Da enheten ble inaktiv tidligere, var det ikke på grunn av at CGM falt av.
Figur 2: Generelle resultater ved bruk av CGM. (A) Gjennomsnittlig vektreduksjon i løpet av tiden CGM var aktiv. n = 8 mus. (B) Den gjennomsnittlige forskjellen mellom glukoseavlesningene fra det håndholdte glukometeret og CGM-enheten. Forskjellen var ikke signifikant forskjellig fra 0 mg/dl. n = 10 avlesninger i seks mus. (C) Gjennomsnittlig tid CGM var aktiv for i n = 8 mus. Feilfelt representerer standardfeilen til gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Rå produksjon
Glukosenivåene for en enkelt dag vises på en graf produsert av CGM-programvaren (figur 3A). Dataene fra noen få dager kan vises ved hjelp av koden som følger med (figur 3B). Vi viser data fra 3 dager for klarhet.
Figur 3: Dataanalyse . (A) Kommersiell produksjon. Data ble ikke samlet inn mellom kl. 18.00 og midnatt. Det skraverte området viser normoglykemiverdier hos pasienter, som er mellom 70-100 mg / dL. (B) Rå utdatadata på 3 dager fra en enkelt mus ved hjelp av koden som følger med. Legg merke til forskjellen i skala i y-aksen mellom A og B. Akseparametrene, og alle de andre parametrene, kan moduleres i koden. Data for 3 dager vises for klarhet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Analyse
Når dataene er trukket ut, kan analysen gjøres ved hjelp av koden som følger med eller annen spesialbygd programvare. Nedenfor er gjennomsnittet (figur 4A, C) og median (figur 4B, D) glukosenivåer ved hvert tidspunkt for en enkelt mus. Et skyvevindu kan brukes til å jevne ut tomten. Bare to mus er vist for klarhet.
Figur 4: Dataanalyseutdata ved hjelp av de medfølgende skriptene . (A) Gjennomsnittlige og (B) median glukosenivåer ved hvert tidspunkt i en bestemt mus. Det skraverte området angir standardavviket i glukosenivåer. (C) Gjennomsnittlig og (D) median glukosenivå fra to mus. Bare to mus er vist for klarhet. En stiplet linje angir overgangen fra lys (20:30-08:30) til mørk (8:30-20:30). Et skyvevindu på 20 min ble brukt til å jevne ut kurven. Størrelsen på vinduet, og alle parametrene, kan endres i koden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen tilbyr en enkel, billig metode for å overvåke glukosenivået hos mus som ikke krever utfordrende mikrokirurgi og ikke involverer blødning eller håndtering av musene. Metoden er enkel å implementere i alle anlegg og forårsaker ikke dødelighet, smerte eller overdreven ubehag for musene. Det mest kritiske trinnet i protokollen er å sette kanylen til glukosesensoren under musens hud. Tilsetningen av noen få suturer gjør at kanylen kan holde seg på plass i lengre tid. Sensorene er små og kan bli blokkert eller feilplassert når musen beveger seg. Sensoren må festes av de indre suturene og festes på baksiden av musen med noen suturer. Protokollen kan tilpasses mange kommersielle CGM-systemer.
Musene gikk ned i vekt etter operasjonen, som forventes etter operasjonen og kan være forbundet med stresset av kirurgi og anestesi, byrden ved å bære enheten og enkelthuset pålagt av den spesifikke protokollen som ble brukt i denne studien. Etter hvert som CGM-enheter blir gradvis lettere og mer nøyaktige, forventes disse effektene å bli mindre. Vi observerte at mus som bar CGM beveget seg fritt i buret og nådde matpellets som krevde klatring. Metoden begrenses av hver CGMs evne til å fungere over tid. Forskere bør overvåke for vekttap og vurdere fordelene og ulempene ved denne metoden sammenlignet med standardalternativer som krever hyppig håndtering og blødning av musene, som antar at blødning en mus har liten effekt på glykemi av sine naboer og involverer måling av glukosenivåer i en stressende tilstand på dagtid.
Protokollen beskrevet ovenfor er ganske enkel, rask og skalerbar. Det krever ingen spesiell innstilling i dyreavdelingen eller dyrt utstyr, kan brukes parallelt med andre prosedyrer som er en del av forsøket, og kan brukes på hvilken som helst genetisk bakgrunn eller med ernæring. Dataanalyseskript er gitt for å lette analyse av forskningsgrupper som er mindre erfarne i dataanalyse. Forhåpentligvis vil denne detaljerte protokollen og dataanalyseskriptene gjøre det mulig for andre laboratorier å måle glukose i sine eksperimenter i metabolske og andre forskningsfelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dvir Mintz DVM og veterinær- og dyreholdspersonalet på dyreavdelingen, samt medlemmer av gruppen vår, for fruktbare diskusjoner. Denne studien ble støttet av et Israel Science Foundation-stipend 1541/21 tildelt DBZ, DBZ, er et Zuckerman STEM-fakultet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2% Chlorhexidine Gluconate and 70% Isopropyl Alcohol | 3M | ID 7000136290 | |
| 5% Dextrose and 0.45% Sodium Chloride Injection, USP | Braun | L6120 | |
| Castroviejo needle holder | FST | 12061-02 | |
| Extra Fine Bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| FreeStyle Libre 1 reader | Abbott | ART27543 | |
| FreeStyle Libre sensor | Abbott | ART36687 | |
| FreeStyle Libre sensor applicator | Abbott | ART36787 | |
| Gauze pads | Sion medical | PC912017 | |
| Graefe Forceps | FST | 11052-10 | |
| Hair Removal Cream | Veet | 3116523 | |
| High-fat high-sucrose diet | Envigo Teklad diets | TD.08811 | |
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | 26675-46-7 | |
| Meloxicam 5 mg/mL | Chanelle Pharma | 08749/5024 | |
| MiniARCO Clipper kit | Moser | CL8787-KIT | |
| PROLENE Polypropylene Suture 5-0 | Ethicon | 8725H | |
| Puralube Opthalmic Ointment | Perrigo | 574402511 | |
| Q-tips | B.H.W | 271676 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific | SOMNO |
References
- Polonsky, K. S. The past 200 years in diabetes. New England Journal of Medicine. 367 (14), 1332-1340 (2012).
- Rees, D. A., Alcolado, J. C.
- Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. The importance of the non-obese diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).
- Heydemann, A. An overview of murine high fat diet as a model for Type 2 diabetes mellitus. Journal of Diabetes Research. 2016, 2902351 (2016).
- Kennard, M. R., et al. The use of mice in diabetes research: The impact of experimental protocols. Diabetic Medicine. 38 (12), 14705 (2021).
- Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technology and Therapeutics. 8 (3), 402-412 (2006).
- Wuyts, C., Simoens, C., Pinto, S., Philippaert, K., Vennekens, R. Continuous glucose monitoring during pregnancy in healthy mice. Scientific Reports. 11, 4450 (2021).
- Korstanje, R., et al. Continuous glucose monitoring in female NOD mice reveals daily rhythms and a negative correlation with body temperature. Endocrinology. 158 (9), 2707-2712 (2017).
- Han, B. G., et al. Markers of glycemic control in the mouse: Comparisons of 6-h-and overnight-fasted blood glucoses to Hb A1c. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 295 (4), 981-986 (2008).
- Xie, X., et al. Reduction of measurement noise in a continuous glucose monitor by coating the sensor with a zwitterionic polymer. Nature Biomedical Engineering. 2 (12), 894-906 (2018).
- Van Der Meulen, T., et al. Urocortin3 mediates somatostatin-dependent negative feedback control of insulin secretion. Nature Medicine. 21 (7), 769-776 (2015).
- Peterson, Q. P., et al. A method for the generation of human stem cell-derived alpha cells. Nature Communications. 11, 2241 (2020).
- Klueh, U., Liu, Z., Feldman, B., Kreutzer, D. Interstitial fluid physiology as it relates to glucose monitoring technologies: Importance of Interleukin-1 and Interleukin-1 receptor antagonist in short-term glucose sensor function in vivo. Journal of Diabetes Science and Technology. 4 (5), 1073 (2010).
- Klueh, U., Antar, O., Qiao, Y., Kreutzer, D. L. Role of interleukin-1/interleukin-1 receptor antagonist family of cytokines in long-term continuous glucose monitoring in vivo. Journal of Diabetes Science and Technology. 7 (6), 1538 (2013).
- Klueh, U., Kaur, M., Qiao, Y., Kreutzer, D. L. Critical role of tissue mast cells in controlling long-term glucose sensor function in vivo. Biomaterials. 31 (16), 4540-4551 (2010).
- Kogot-Levin, A., et al. Mapping the metabolic reprogramming induced by sodium-glucose cotransporter 2 inhibition. JCI Insight. , 164296 (2023).
