Summary
Questo studio rivela il meccanismo di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii nel trattamento dell'adenocarcinoma polmonare sulla base della farmacologia di rete e della verifica sperimentale. Lo studio dimostra inoltre che la via di segnalazione PI3K/AKT svolge un ruolo vitale nell'azione di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii nel trattamento dell'adenocarcinoma polmonare.
Abstract
Abbiamo mirato a studiare il meccanismo di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii nel trattamento dell'adenocarcinoma polmonare (LUAD) sulla base della farmacologia di rete e della verifica sperimentale. I componenti efficaci e i potenziali bersagli di Trichosanthis e Fritillaria thunbergii sono stati raccolti dal database HERB (High-throughput experiment and reference-guided Guided) della medicina tradizionale cinese e da un database di similarity ensemble approach (SEA), e gli obiettivi relativi a LUAD sono stati interrogati dai database GeneCards e Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Una rete farmaco-componente-malattia-bersaglio è stata costruita dal software Cytoscape. Sono state condotte analisi di interazione proteina-proteina (PPI), ontologia genica (GO) e Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis per ottenere obiettivi principali e percorsi chiave. Un estratto acquoso di cellule Trichosanthes-Fritillaria thunbergii e A549 è stato utilizzato per la successiva validazione sperimentale. Attraverso il database HERB e la ricerca bibliografica, sono stati sottoposti a screening 31 composti efficaci e 157 potenziali geni bersaglio di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii, di cui 144 erano bersagli regolatori di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii nel trattamento dell'adenocarcinoma polmonare. L'analisi di arricchimento funzionale di GO ha mostrato che il meccanismo d'azione di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contro l'adenocarcinoma polmonare è principalmente la fosforilazione proteica. L'analisi di arricchimento della via KEGG ha suggerito che il trattamento dell'adenocarcinoma polmonare da parte di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii coinvolge principalmente la via di segnalazione PI3K / AKT. La validazione sperimentale ha dimostrato che un estratto acquoso di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii potrebbe inibire la proliferazione delle cellule A549 e la fosforilazione di AKT. Attraverso la farmacologia di rete e la validazione sperimentale, è stato verificato che la via di segnalazione PI3K/AKT svolge un ruolo vitale nell'azione di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii nel trattamento dell'adenocarcinoma polmonare.
Introduction
Il cancro del polmone si riferisce a tumori maligni provenienti dalla mucosa bronchiale polmonare, tra cui carcinoma a cellule squamose, adenocarcinoma, carcinoma a grandi cellule e carcinoma a piccole cellule1. L'adenocarcinoma polmonare (LUAD) è il tipo più comune di cancro del polmone, rappresentando circa il 40% dei casi totali di cancro al polmone2. La maggior parte dei pazienti viene diagnosticata in una fase avanzata o ha metastasi a distanza e, quindi, perde l'opportunità di un intervento chirurgico3. Nell'attuale trattamento clinico, la chemioradioterapia concomitante è la strategia più comune per il trattamento della LUAD, ma la sua applicazione è limitata a causa di gravi reazioni avverse4.
La medicina tradizionale cinese (MTC) può alleviare efficacemente i sintomi clinici dei pazienti LUAD e ridurre le reazioni avverse causate dalla radioterapia e dalla chemioterapia ed è, quindi, diventata un hotspot di ricerca 5,6,7. Nella medicina tradizionale cinese, il cancro del polmone appartiene alla categoria di "accumulo polmonare" e "petroso polmonare". La carenza di Qi e l'interazione di catarro, stasi e veleno sono importanti nella patogenesi del cancro del polmone. Pertanto, tonificare il Qi ed eliminare catarro e stasi del sangue sono i principali metodi di trattamento clinico8 per il cancro del polmone secondo la teoria TCM9. Trichosanthes kirilowii Maxim (Gualou) e Fritillaria thunbergii Miq (Zhebeimu) rappresentano una coppia di farmaci comune nel trattamento del cancro del polmone e questa combinazione ha gli effetti di eliminare il calore e ridurre la flemma10,11,12. Tuttavia, il suo meccanismo d'azione non è ancora chiaro e devono essere condotte ulteriori ricerche.
La farmacologia di rete è un metodo completo basato sulla teoria della biologia dei sistemi e della farmacologia multidirezionale che mira a rivelare complesse relazioni di rete tra più farmaci e malattie13. Le prescrizioni tradizionali cinesi hanno le caratteristiche di essere multi-componente e multi-target, il che significa che sono molto adatte per lo studio della farmacologia di rete14,15. Recentemente, la farmacologia di rete è emersa come un potente approccio nello studio delle formule TCM ed è diventata un hotspot di ricerca16,17.
Tuttavia, per quanto ne sappiamo, tutte le ricerche sulla farmacologia di rete sono presentate come testo. Presentare questa tecnologia attraverso il video ridurrà notevolmente la soglia di apprendimento e faciliterà la promozione di questa tecnologia, che è uno dei vantaggi di questo articolo. In questo studio, abbiamo preso Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contro l'adenocarcinoma polmonare come esempio per effettuare la previsione della farmacologia di rete e la convalida sperimentale.
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Protocol
Tutte le procedure di farmacologia di rete sono state eseguite in conformità con le linee guida per i metodi di valutazione della farmacologia di rete18. Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con i regolamenti di gestione del laboratorio dell'Università di Medicina Cinese di Pechino.
1. Predizione farmacologica di rete
- Selezione dei componenti attivi
- Apri il database HERB (http://herb.ac.cn)19 e usa "Gualou" (il nome cinese per Trichosanthes kirilowii Maxim) e "Zhebeimu" (il nome cinese per Bulbus Fritillariae thunbergii) come parole chiave per ottenere i componenti dei due farmaci. Scarica l'elenco e le canoniche strutture SMILES dei relativi componenti dei due farmaci.
- Determinare se il componente ottenuto è il componente attivo.
- Includere come componenti attivi quelli che hanno valori di biodisponibilità orale (OB) e farmaco-simili (DL) nel database del gruppo HERB (cioè componenti con OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18)20,21.
- Se il componente non ha valori OB e DL, inserirlo nella banca dati Swiss ADME (http://www.swissadme.ch/index.php)22 per ottenere le informazioni su ciascun componente. Includere componenti con assorbimento GI "elevato" e almeno due valori DL "Sì" come componenti attivi.
- Previsione target dei componenti attivi
- Aprire il database HERB (http://herb.ac.cn). Cerca e copia le strutture SMILES canoniche dei componenti attivi.
- Aprire la banca dati VAS (Similarity ensemble approach, http://sea.bkslab.org)23. Incollare le strutture SMILES canoniche dei componenti attivi nella casella di ricerca e fare clic su Try SEA per ottenere la chiave Target, il nome del target, il valore P e il MaxTC di ciascun componente attivo.
- Copiare i dati in un foglio di calcolo e utilizzare la funzione di filtro del file del foglio di calcolo per filtrare le destinazioni dei componenti attivi in base alla chiave di destinazione (Human, P < 0.05 e MaxTC > 0.5).
- Copiare tutti gli obiettivi in un foglio di calcolo e rimuovere i duplicati per ottenere gli obiettivi farmacologici.
- Previsione degli obiettivi della malattia
- Aprire il database GeneCards (https://www.genecards.org)24 e il database Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM, https://www.omim.org)25 e utilizzare Adenocarcinoma polmonare come parola chiave per ottenere i bersagli della malattia dell'adenocarcinoma polmonare.
- Scarica i fogli di calcolo degli obiettivi della malattia. Eliminare le destinazioni ripetute per ottenere le destinazioni LUAD.
- Costruzione di una rete farmaco-componente-malattia-bersaglio
- Copia gli obiettivi correlati a LUAD e gli obiettivi farmacologici nella stessa colonna in un nuovo foglio di calcolo. Utilizzare la funzione Dati - Identifica duplicati nella barra degli strumenti per ottenere destinazioni di intersezione delle destinazioni correlate a LUAD e delle destinazioni correlate al componente attivo Trichosanthes-Fritillaria thunbergii .
- Aprire Cytoscape 3.8.0. Fare clic su File nella barra dei menu, quindi selezionare Importa > rete da file per importare il file del foglio di calcolo. Ottimizza le dimensioni e il colore dei nodi di rete attraverso la barra di stile nel pannello di controllo a sinistra.
- Utilizzare la funzione Analizza rete per l'analisi della topologia di rete . Fare clic su Strumenti nella barra dei menu, quindi selezionare Analizza rete. Nel pannello Tabella , fate clic su Grado nella barra del titolo per disporre i componenti per grado in ordine decrescente. Prendi i primi dieci componenti e obiettivi come principali componenti attivi e obiettivi principali.
- Costruzione della rete PPI e screening delle proteine core
- Aprire il database STRING (https://cn.string-db.org/)26. Incollare l'elenco in formato testo dei potenziali bersagli di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contro LUAD nella finestra di dialogo Elenco di nomi . Selezionare Homo sapiens in Organismi, e fare clic sui pulsanti CERCA > CONTINUA .
- Quando i risultati sono disponibili, fai clic su Impostazioni e seleziona Alta confidenza (0,700) in Impostazioni di base > Punteggio di interazione minimo richiesto. Selezionare Nascondi nodi disconnessi nella rete in Impostazioni avanzate, quindi fare clic sul pulsante AGGIORNA.
- Fai clic su Esporta nella barra del titolo e scarica il breve testo tabellare della relazione PPI in formato TSV.
- Aprire Cytoscape 3.8.0. Fare clic su File > Importa > rete da file per importare il file in formato TSV per l'analisi visiva.
- Utilizzare la funzione Network Analyzer per eseguire l'analisi topologica. Ottimizza le dimensioni e il colore dei nodi di rete attraverso la barra di stile nel pannello di controllo a sinistra.
- Analisi dell'arricchimento KEGG
- Apri la piattaforma Metascape (https://metascape.org/)27. Incollare l'elenco in formato testo dei potenziali bersagli terapeutici nella finestra di dialogo, quindi fare clic sul pulsante Invia. Selezionare H. sapiens sia in Input come specie che in Analisi come specie, quindi fare clic sul pulsante Analisi personalizzata. Selezionare Arricchimento, selezionare solo il percorso KEGG, quindi fare clic su Analisi arricchimento. Dopo che la barra di avanzamento raggiunge il 100%, fare clic sul pulsante arancione Pagina report analisi per i risultati dell'arricchimento.
- Fare clic su All in One Zip File per scaricare il risultato dell'arricchimento, quindi aprire il file _ FINAL_GO.csv nella cartella Enrichment_GO per ottenere il risultato.
- Software Open R (https://cran.r-project.org/). Digitare install.package (" ggplot2") e libreria (ggplot2) in R per l'installazione del pacchetto ggplot2 R. Premere Invio per eseguire il programma di visualizzazione KEGG.
2. Verifica sperimentale
- Preparazione del farmaco
NOTA: Fritillaria thunbergii Miq e Trichosanthes kirilowii Maxim sono stati acquistati dall'ospedale Dongzhimen, affiliato all'Università di medicina cinese di Pechino.- Mescolare 50 g di Fritillaria thunbergii Miq e 50 g di Trichosanthes kirilowii Maxim insieme. Immergere la miscela in 1 L di acqua distillata per 20 minuti, quindi decotto la miscela a 100 °C a pressione normale per 1 ora.
- Filtrare il decotto per ottenere un filtrato con un doppio strato di garza medica sterile, quindi utilizzare carta da filtro da 80 μm per filtrare ulteriormente l'estratto. Ripetere l'operazione precedente tre volte.
- Mescolare il filtrato fino ad ottenere un decotto di circa 1,2 L. Porre la soluzione nel pallone di un evaporatore rotante. Impostare la velocità di rotazione a 50 giri/min con una temperatura di 37 °C. Mescolare e condensare i decotti in un estratto nell'evaporatore rotante per 6 ore per ottenere un liquido viscoso.
- Accendere il meccanismo di liofilizzazione sottovuoto per preraffreddare la temperatura a -40 °C. Mettere l'estratto ottenuto nel vassoio del materiale e metterlo nella trappola fredda per il congelamento.
- Quando la temperatura della trappola fredda raggiunge -50 °C e il materiale è stato congelato per 2 ore, trasferire i materiali congelati in uno stendino posto nella trappola fredda. Accendere la pompa per vuoto per avviare il processo di liofilizzazione. Estrarre la polvere liofilizzata e conservarla in frigorifero a -20 °C per un uso successivo.
- Coltivazione cellulare
- Configura il terreno completo DMEM con l'89% di terreno di base DMEM, il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina-streptomicina.
- Dopo aver rimosso le cellule A549 dall'azoto liquido, incubare le cellule in un bagno d'acqua a 37 °C e mescolare fino a quando il mezzo nel flaconcino si scioglie.
- Aggiungere un volume quadruplo di mezzo completo DMEM nelle celle fuse. Centrifugare le cellule (4 °C, 679 x g, 5 min) ed eliminare il surnatante.
- Risospendere le cellule precipitate con 6 mL di terreno completo DMEM, placcarle in un matraccio di coltura T25 e incubare il matraccio in un incubatore cellulare a 37 °C, 5% CO2.
- Rilevamento della vitalità cellulare
- Digerire le cellule A549 della fase di crescita logaritmica con 1 mL di tripsina allo 0,25% per 1 minuto a 37°C. Aggiungere 1 mL di terreno completo DMEM per neutralizzare la tripsina e soffiarlo delicatamente per promuovere la dispersione cellulare. Centrifugare la miscela per ottenere il pellet cellulare (4 °C, 192 x g, 5 min). Risospendere le cellule ottenute utilizzando il mezzo completo DMEM.
- Aggiungere la sospensione cellulare a un emocitometro e contare utilizzando un contatore automatico delle cellule. Diluirlo a 5 x 104 cellule/ml utilizzando DMEM mezzo completo.
- Sciogliere 1 g di estratto acquoso di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii in 10 ml di soluzione PBS e sterilizzarlo con filtro attraverso un filtro da 0,22 μm. Diluire la miscela a 90 mg/ml, 80 mg/ml, 70 mg/mL, 60 mg/mL, 50 mg/mL, 40 mg/mL, 30 mg/mL, 20 mg/mL e 10 mg/mL usando PBS.
- Placcare le celle diluite su piastre a 96 pozzetti con 100 μL per pozzetto. Dopo l'aderenza cellulare, aggiungere 1 μL di estratti d'acqua Trichosanthes-Fritillaria thunbergii di diverse concentrazioni per regolare la concentrazione di ciascun pozzetto a 900 μg/mL, 800 μg/mL, 700 μg/mL, 600 μg/mL, 500 μg/mL, 400 μg/mL, 300 μg/mL, 200 μg/mL e 100 μg/mL.
- Scartare il terreno originale dopo 24 ore di coltura e aggiungere 100 μL di terreno di base DMEM per un'ulteriore incubazione per 2 ore a 37 °C, 5% CO2.
- Dopo il trattamento di cui sopra, aggiungere 20 μL di soluzione MTS (Table of Materials) e incubare le cellule per un altro 1 h a 37 °C, 5% CO2.
- Trasferire la miscela incubata in una piastra diversa. Misurare l'assorbanza (OD) a una lunghezza d'onda di 490 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Calcola la vitalità cellulare usando la seguente formula:
Viabilità (%) = 100 × (OD del campione trattato − OD del substrato)/(OD del campione di controllo − OD del substrato).
NOTA: Una concentrazione minima vicina a IC50 è definita come una dose elevata. La concentrazione alla quale la proliferazione cellulare inizia ad essere inibita è definita come una concentrazione a basse dosi e il valore intermedio è definito come una concentrazione a dose media per studi sperimentali successivi. In questo studio, 400 μg / mL, 600 μg / mL e 800 μg / mL sono stati utilizzati come dosi basse, medie e alte.
- Intervento farmacologico e raccolta di campioni
NOTA: la crescita cellulare è stata tracciata rispetto al tempo per determinare la fase logaritmica.- Diluire le cellule A549 della fase di crescita logaritmica a 5 x 105 cellule/ml. Aggiungere 2 ml della sospensione cellulare in una piastra a 6 pozzetti e crescere per 12 ore.
- Ripetere il punto 2.3.3 per ottenere 80 mg/mL, 60 mg/ml e 40 mg/mL di diluizioni PBS di estratto acquoso di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Aggiungere 20 μL della soluzione PBS, 20 μL dell'estratto d'acqua 40 mg/mL di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii, 20 μL dell'estratto d'acqua di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii da 60 mg/mL e 20 μL dell'estratto d'acqua di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii da 80 mg/mL al gruppo di controllo bianco, al gruppo a bassa concentrazione, al gruppo a media concentrazione e al gruppo ad alta concentrazione, rispettivamente. Scartare il surnatante dopo 24 ore di intervento e pulire le cellule con PBS tre volte.
NOTA: Le concentrazioni del gruppo di controllo bianco, del gruppo a bassa concentrazione, del gruppo a media concentrazione e del gruppo ad alta concentrazione dell'estratto di acqua Trichosanthes-Fritillaria thunbergii erano rispettivamente 0 μg / mL, 400 μg / mL, 600 μg / mL e 800 μg / mL. - Aggiungere 250 μL di tampone RIPA (contenente l'1% di PMSF e l'1% di inibitore della fosfatasi) a ciascun pozzetto e lisare le cellule per 30 minuti. Raccogliere il lisato per centrifugazione (4 °C, 6,714 x g, 10 min) e ottenere il surnatante.
- Western blotting
- Rilevare la concentrazione proteica dei campioni con il metodo BCA secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare il buffer RIPA per regolare la concentrazione di ciascun campione in modo che sia coerente.
- Mescolare 40 μL del campione proteico con 10 μL di tampone di carico 5x e far bollire per 5 minuti a 100 °C. Centrifugare (4 °C, 6,714 x g, 10 min) la miscela per ottenere il surnatante per esperimenti successivi.
- Isolare le proteine mediante elettroforesi su gel utilizzando l'elettroforesi verticale a 120 V.
- Preparare un "sandwich" elettrico (spugna - carta da filtro - gel - membrana PVDF - carta da filtro - spugna). Immergere l'apparecchio di trasferimento in un bagno di ghiaccio e trasferire la proteina su membrane PVDF a 70 V per 60 minuti.
- Utilizzare 100 ml di soluzione TBST (0,05% [v/v] Tween-20, 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) e 5 g di latte scremato in polvere per configurare il 5% di latte. Pre-diluire gli anticorpi AKT e p-AKT con il diluente anticorpale in un rapporto di 1:1.000.
- Bloccare la membrana PVDF nel latte scremato in polvere al 5% per 1 ora agitando. Dopo il blocco, eliminare il latte bloccante e aggiungere l'anticorpo primario diluito per l'incubazione notturna a 4 °C.
- Dopo aver rimosso l'anticorpo primario, utilizzare la soluzione TBST per lavare la membrana PVDF cinque volte per 5 minuti ciascuna.
- Pre-diluire l'anticorpo secondario con il diluente anticorpale in un rapporto di 1:5.000. Aggiungere l'anticorpo secondario e incubare a temperatura ambiente (RT) per 1,5 ore. Dopo aver rimosso l'anticorpo secondario, utilizzare la soluzione TBST per lavare la membrana PVDF cinque volte per 5 minuti ciascuna.
- Rilevare la proteina utilizzando un sistema di rilevamento a chemiluminescenza.
3. Docking molecolare
- Aprire il database UniProt (https://www.uniprot.org)28. Digitare i simboli di destinazione nella casella di ricerca e fare clic sul pulsante CERCA . Nel sottotitolo Struttura , fare clic su Download per le strutture 3D dei bersagli proteici.
- Aprire il database RCSB PDB (https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)29. Digitare il nome delle macromolecole proteiche nella casella di ricerca. Scarica le strutture delle macromolecole proteiche in formato PDB.
- Scaricare il pacchetto di installazione del software UCSF Chimera 1.16 (https://vina.scripps.edu/) e AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/). Installare e aprire il software UCSF Chimera 1.16. Fare clic su File > Apri per visualizzare la proteina recettore.
- Fai clic su Strumenti > modifica della struttura > Preparazione dock e seleziona Elimina solvente, Aggiungi idrogeno e Aggiungi cariche nel popover per rimuovere l'acqua e aggiungere le spese di idrogenazione e bilanciamento. Fare clic su Scrivi file mol2 per salvare la proteina del recettore in formato mol2 . Eseguire lo stesso passaggio sul ligando.
- Fare clic su File > Apri per visualizzare il ligando in formato mol2 nel software UCSF Chimera 1.16. In Strumenti > analisi di superficie/legame > AutoDock Vina, impostare la barra del recettore sul nome della proteina del recettore e la barra del ligando sul nome del ligando. Inserisci un valore nella casella dietro Centro e Dimensioni per regolare lo spazio appena sviluppato, rendendo possibile comprendere completamente il ligando e il recettore.
- Fare clic su OK per lo screening virtuale del docking molecolare per ottenere la posizione ottimale per il legame del ligando al recettore. Registrare il valore dell'energia di legame nella posizione ottimale.
4. Analisi statistica
- Aprire il software statistico SPSS 26.0. Fare clic su File > Importa dati per il caricamento dei dati.
- Presentare i dati sperimentali come media ± deviazione standard.
- Confronta più gruppi utilizzando un ANOVA unidirezionale.
NOTA: P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo in questo lavoro.
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Representative Results
Sono stati identificati un totale di 31 componenti attivi correlati a Trichosanthes-Fritillaria thunbergii, tra cui 21 componenti di Trichosanthes e 10 di Fritillaria thunbergia, nonché 144 bersagli corrispondenti. Complessivamente, 9.049 e 67 geni correlati a LUAD sono stati estratti rispettivamente dal database GeneCards e dal database OMIM. Dopo aver eliminato geni duplicati, sono stati identificati 9.057 geni correlati a LUAD. L'intersezione dei geni correlati a LUAD e dei bersagli correlati ai componenti attivi di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii è stata condotta per ottenere potenziali bersagli terapeutici. La rete di interazione farmaco-componente-malattia-bersaglio di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contro LUAD è mostrata nella Figura 1A. Nella rete di interazione, i primi dieci componenti attivi erano kaempferol, hydroxygenkwanin, genisteina, diosmetina e β-sitosterolo, acido palmitoleico, mandenolo, acido esadecanoico, acido carproico e acido caprico, che sono stati identificati come i componenti attivi chiave dell'azione di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii nel trattamento di LUAD (Figura 1B). La rete PPI comprendeva 122 proteine funzionali e 210 relazioni di interazione e i risultati della visualizzazione sono mostrati nella Figura 2A. Le prime dieci proteine core per grado (parametro utilizzato per l'analisi di visualizzazione nel software Cytoscape) in ordine decrescente includevano ESR1, VEGFA, PPARA, CYP3A4, AR, APP, FGF2, CREB1 e CYP1A1, che sono principalmente coinvolte nella neovascolarizzazione, proliferazione cellulare, apoptosi e trasporto della membrana cellulare 30,31,32,33,34,35,36,37,38,39(Figura 2B). Dei primi 20 percorsi classificati da KEGG, la via di segnalazione PI3K / AKT40, la via di segnalazione Rap1 41, la via di segnalazione della fosfolipasi D42 e la via di segnalazioneMAPK1 43 sono strettamente associate al cancro del polmone, tra cui la via PI3K / AKT si è classificata al primo posto e, quindi, è stata utilizzata per la successiva verifica (Figura 3).
Gli esperimenti hanno indicato che gli estratti di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii a concentrazioni superiori a 400 μg/ml potrebbero inibire la proliferazione cellulare e l'effetto di inibizione sulle cellule A549 a concentrazioni fino a 800 μg/ml era vicino alla metà della concentrazione inibitoria (IC50) (Figura 4). Pertanto, 400 μg / mL, 600 μg / ml e 800 μg / ml sono stati utilizzati come dosi basse, medie e alte per gli esperimenti successivi. L'intervento degli estratti di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii non ha causato alcun cambiamento significativo nell'espressione della proteina AKT in ciascun gruppo; tuttavia, l'espressione di p-AKT (Ser473) è stata inibita e ha mostrato un effetto dose-dipendente (Figura 5). I componenti chiave di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii nel trattamento LUAD sono stati agganciati molecolarmente con le proteine chiave della via PI3K / AKT e i risultati hanno suggerito che le energie di legame di diosmetina e kaempferolo con AKT1 erano inferiori a -7, indicando una forte attività di legame44 (Figura 6).
Figura 1: Diagramma della rete farmaco-componente-malattia-bersaglio. (A) Il blu rappresenta la malattia; il giallo rappresenta il farmaco; il rosso rappresenta il componente; Il verde rappresenta l'obiettivo. Abbreviazioni: GL = Trichosanthes; ZBM = Fritillaria thunbergia; LUAD = adenocarcinoma polmonare. (B) I primi dieci principi attivi della rete ordinati per grado in ordine decrescente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Rete PPI di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii nel trattamento di LUAD. (A) Risultati di visualizzazione della rete PPI. Più scuro è il nodo, più centrale è la proteina nella rete. (B) I primi dieci obiettivi della rete per grado. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Arricchimento del pathway KEGG di bersagli Trichosanthes-Fritillaria thunbergii rispetto a LUAD. (A) I primi 20 percorsi KEGG sono classificati in ordine crescente in base ai valori P. (B) Mappa della via di segnalazione PI3K/AKT. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Effetti di diverse concentrazioni di estratto di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii sulla proliferazione cellulare A549 (n = 3). Gli estratti di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii a concentrazioni superiori a 400 μg/ml potrebbero inibire la proliferazione cellulare. L'effetto di inibizione sulle cellule A549 a concentrazioni fino a 800 μg/ml era vicino alla metà della concentrazione inibitoria (IC50). Abbreviazione: GL-ZBM = Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Effetti di diverse concentrazioni di estratto di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii sull'espressione della proteina AKT e sui livelli di fosforilazione (n = 3). Non c'è stato alcun cambiamento significativo nell'espressione della proteina AKT in ciascun gruppo, mentre l'espressione proteica di p-AKT (Ser473) nei gruppi a dose media e alta era significativamente sottoregolata e la differenza era statisticamente significativa rispetto al gruppo di controllo (*P < 0,05 rispetto al gruppo di controllo). Abbreviazione: GL-ZBM = Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Docking molecolare dei componenti correlati con proteine core . (A) Mappa termica dell'energia di legame dei componenti chiave di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii per il trattamento LUAD molecolarmente agganciati a proteine chiave della via PI3K/AKT. (B) Diagramma di docking molecolare delle proteine Diosmetina e AKT1. (C) Diagramma di docking molecolare delle proteine kaempferol e AKT1. Le linee rosa rappresentano i legami idrogeno, le strutture grigie rappresentano le composizioni dei farmaci e la struttura colorata rappresenta AKT1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Generalmente, uno studio farmacologico di rete completo include l'identificazione di componenti attivi da database, l'acquisizione di bersagli corrispondenti a componenti attivi e malattie, la costruzione di una rete farmaco-componente-malattia-bersaglio e la previsione di obiettivi e percorsi principali. L'associazione tra componenti attivi e proteine core (docking molecolare) è preliminarmente prevista dalla tecnologia informatica e la verifica finale viene condotta utilizzando un esperimento.
La selezione di database pertinenti è la parte più critica della farmacologia di rete, in quanto determina la qualità della ricerca. Il database HERB integra informazioni provenienti da diversi database TCM, come Syμmap, TCMID, TCMSP e TCM-ID, ed è attualmente il database TCM e degli ingredienti più completo. Pertanto, in questo studio, il database HERB è stato utilizzato per lo screening dei componenti attivi19.
In questo studio, 31 componenti attivi e 144 bersagli di intersezione di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii nel trattamento di LUAD sono stati identificati attraverso database correlati. Costruendo una rete farmaco-componente-malattia-bersaglio, abbiamo esplorato dieci componenti attivi chiave attraverso l'analisi topologica. I bersagli principali di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii nel trattamento di LUAD sono stati selezionati attraverso l'analisi PPI.
Tra le prime 20 vie dei risultati KEGG, la via di segnalazione PI3K / AKT, la via di segnalazione MAPK1, la via di segnalazione Rap1 e la via di segnalazione PPAR sono strettamente correlate ai tumori secondo la letteratura40,41,42. MAPK1, una classica via di segnalazione correlata al cancro, è un importante regolatore della crescita e della differenziazione cellulare. Quando attivata, questa via di segnalazione porta alla proliferazione cellulare incontrollata, all'estensione del ciclo cellulare e all'insorgenza e allo sviluppo del tumore45. La via di segnalazione Rap1 è un importante regolatore della via di segnalazione NF-κB e della via di segnalazione MAPK1 ed è strettamente correlata all'adesione cellulare nel carcinoma polmonare46. Inoltre, è stato confermato che l'inibizione della via di segnalazione Rap1 può migliorare le metastasi tumorali nel carcinoma polmonare47. La via di segnalazione PPAR è associata alla proliferazione cellulare, all'omeostasi energetica, alla tumorigenesi e ai disordini metabolici48. Gli studi hanno confermato la sua funzione nel promuovere l'angiogenesi tumorale e la crescita tumorale49.
La via di segnalazione PI3K/AKT influenza principalmente il metabolismo, la proliferazione, l'apoptosi e la vascolarizzazione dei tumori attraverso la fosforilazione e l'attivazione di AKT. Studi precedenti hanno dimostrato che la via di segnalazione PI3K/AKT svolge un ruolo regolatore nella via di segnalazione MAPK1, nella via di segnalazione Rap1 e nella via di segnalazione PPAR50,51,52. Inoltre, i risultati della predizione KEGG hanno mostrato che la via di segnalazione PI3K/AKT era più strettamente correlata all'azione di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contro LUAD, quindi è stata selezionata per la successiva verifica sperimentale.
I bersagli principali previsti da PPI, VEGFA e CREB1 nella via di segnalazione PI3K/AKT, così come le proteine chiave PI3K e AKT1 nella via di segnalazione PI3K/AKT, sono stati inclusi per l'aggancio molecolare. In uno studio precedente, un'energia di legame di attracco inferiore a -7 è stata considerata significativa44. I risultati di questo studio hanno suggerito che l'energia di legame di kaempferol e diosmetina con AKT1 ha superato questa soglia, suggerendo che gli effetti di questi due componenti sull'AKT potrebbero essere la chiave per l'azione di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contro LUAD.
In ulteriori verifiche sperimentali, abbiamo studiato l'effetto dell'estratto di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii sul livello di fosforilazione di AKT. I risultati hanno mostrato che diverse concentrazioni di estratto di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii non hanno avuto alcun effetto significativo sull'espressione della proteina AKT, ma l'estratto di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii potrebbe inibire significativamente la fosforilazione della proteina AKT in modo dose-dipendente. Questi risultati suggeriscono che l'inibizione della via PI3K/AKT è il meccanismo d'azione chiave di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contro LUAD.
In conclusione, attraverso la farmacologia di rete e la validazione sperimentale, questo studio ha verificato che la via di segnalazione PI3K/AKT svolge un ruolo vitale nell'azione di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii nel trattamento della LUAD.
Ci sono ancora alcune carenze in questo studio. Lo studio ha incluso solo componenti attivi ad alta biodisponibilità senza discutere la possibile biotrasformazione delle molecole attive nel colon, nelle cellule intestinali e nel fegato, che non è abbastanza completa. Inoltre, l'effetto di Trichosanthes-Fritillaria thunbergii sulla proliferazione e sulla via PI3K/AKT delle cellule di adenocarcinoma polmonare è stato verificato sperimentalmente solo in vitro. Questo studio fornisce una base teorica per lo sviluppo di nuovi farmaci e l'espansione delle applicazioni cliniche. In futuro, verranno eseguite ulteriori convalide sperimentali di questi risultati di previsione per supportare le valutazioni di potenziali applicazioni cliniche.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dall'Innovation Training Program dell'Università di Medicina Cinese di Pechino (No: 202110026036).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | R001100 | |
| A549 cell line | Procell | CL-0016 | |
| AKT antibody | CST | 4691S | |
| BCA Protein Assay Kit | Solarbio | PC0020 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Solarbio | 11995 | |
| Enhanced chemiluminescence (ECL) kit | ABclonal | RM00021 | |
| Fetal bovine serum | ScienCell | 0025 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | ABclonal | AS014 | |
| MTS assay kit | Promega | G3580 | |
| p-AKT antibody | CST | 6040S | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | C14-15070-063 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Solarbio | P0100 | |
| Phosphatase inhibitor | Beyotime | P1081 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Solarbio | P1020 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| RIPA lysis solution | Solarbio | R0010 | |
| Rotary evaporator | Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory | RE52CS-1 | |
| Vacuum freeze-drying mechanism | Ningbo Scientz Biotechnology | SCIENTZ-10 | |
| β-Actin antibody | ABclonal | AC026 |
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