Summary
Denna studie avslöjar mekanismen för Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vid behandling av lungadenokarcinom baserat på nätverksfarmakologi och experimentell verifiering. Studien visar också att PI3K / AKT-signalvägen spelar en viktig roll i verkan av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vid behandling av lungadenokarcinom.
Abstract
Vi syftade till att studera mekanismen för Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vid behandling av lungadenokarcinom (LUAD) baserat på nätverksfarmakologi och experimentell verifiering. De effektiva komponenterna och potentiella målen för Trichosanthis och Fritillaria thunbergii samlades in genom experiment med hög kapacitet och referensstyrd (HERB) databas över traditionell kinesisk medicin och en databas för likhetsensemblemetod (SEA), och de LUAD-relaterade målen frågades av databaserna GeneCards och Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Ett nätverk av läkemedelskomponent-sjukdom-mål konstruerades av programvaran Cytoscape. Protein-protein interaktion (PPI) nätverk, gen ontologi (GO) funktion och Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) väg anrikningsanalyser genomfördes för att erhålla kärnmål och viktiga vägar. Ett vattenextrakt av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii- och A549-celler användes för den efterföljande experimentella valideringen. Genom HERB-databasen och litteratursökning screenades 31 effektiva föreningar och 157 potentiella målgener av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii, varav 144 var regulatoriska mål för Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vid behandling av lungadenokarcinom. GO-analysen av funktionell anrikning visade att verkningsmekanismen för Trichosanthes-Fritillaria thunbergii mot lungadenokarcinom huvudsakligen är proteinfosforylering. KEGG-anrikningsanalysen föreslog att behandlingen av lungadenokarcinom av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii huvudsakligen involverar PI3K / AKT-signalvägen. Den experimentella valideringen visade att ett vattenextrakt av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii kunde hämma spridningen av A549-celler och fosforyleringen av AKT. Genom nätverksfarmakologi och experimentell validering verifierades att PI3K / AKT-signalvägen spelar en viktig roll i verkan av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vid behandling av lungadenokarcinom.
Introduction
Lungcancer avser maligna tumörer som härrör från lungbronkialslemhinnan, inklusive skivepitelcancer, adenokarcinom, storcelligt karcinom och småcellscancer1. Lungadenokarcinom (LUAD) är den vanligaste typen av lungcancer och står för cirka 40% av de totala lungcancerfallen2. De flesta patienter diagnostiseras i ett avancerat stadium eller har fjärrmetastaser och förlorar därmed möjligheten till operation3. I nuvarande klinisk behandling är samtidig kemoradioterapi den vanligaste strategin för behandling av LUAD, men dess tillämpning är begränsad på grund av allvarliga biverkningar4.
Traditionell kinesisk medicin (TCM) kan effektivt lindra de kliniska symtomen hos LUAD-patienter och minska biverkningarna orsakade av strålbehandling och kemoterapi och har därmed blivit en forskningshotspot 5,6,7. I traditionell kinesisk medicin hör lungcancer till kategorin "lungackumulering" och "lungpetrous". Bristen på Qi och interaktionen mellan slem, stasis och gift är viktiga vid patogenesen av lungcancer. Därför är tonifiering av Qi och eliminering av slem och blodstasis den huvudsakliga kliniska behandlingen8 metoder för lungcancer enligt TCM-teori9. Trichosanthes kirilowii Maxim (Gualou) och Fritillaria thunbergii Miq (Zhebeimu) representerar ett vanligt läkemedelspar vid behandling av lungcancer, och denna kombination har effekterna av att rensa värme och minska slem10,11,12. Dess verkningsmekanism är dock fortfarande oklar, och ytterligare forskning behöver genomföras.
Nätverksfarmakologi är en omfattande metod baserad på teorin om systembiologi och multidirektionell farmakologi som syftar till att avslöja komplexa nätverkssamband mellan flera läkemedel och sjukdomar13. Traditionella kinesiska recept har egenskaperna att vara multikomponent och multimål, vilket innebär att de är mycket lämpliga för studier av nätverksfarmakologi14,15. Nyligen har nätverksfarmakologi framträtt som ett kraftfullt tillvägagångssätt i studien av TCM-formler och har blivit en forskningshotspot16,17.
Men så vitt vi vet presenteras all forskning om nätverksfarmakologi som text. Att presentera denna teknik via video kommer att minska inlärningströskeln kraftigt och underlätta marknadsföringen av denna teknik, vilket är en av fördelarna med denna artikel. I denna studie tog vi Trichosanthes-Fritillaria thunbergii mot lungadenokarcinom som ett exempel för att utföra nätverksfarmakologisk prediktion och experimentell validering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla nätverksfarmakologiska procedurer utfördes i enlighet med riktlinjerna för utvärderingsmetoder för nätverksfarmakologi18. Alla experimentella procedurer utfördes i enlighet med laboratoriehanteringsreglerna vid Peking University of Chinese Medicine.
1. Farmakologisk prediktion av nätverk
- Val av aktiva komponenter
- Öppna HERB-databasen (http://herb.ac.cn)19 och använd "Gualou" (det kinesiska namnet för Trichosanthes kirilowii Maxim) och "Zhebeimu" (det kinesiska namnet för Bulbus Fritillariae thunbergii) som nyckelord för att få komponenterna i de två läkemedlen. Ladda ner listan och de kanoniska SMILES-strukturerna för de relaterade komponenterna i de två läkemedlen.
- Bestäm om den erhållna komponenten är den aktiva komponenten.
- Inkludera som aktiva komponenter de som har orala biotillgänglighet (OB) och läkemedelsliknande (DL) värden i HERB-gruppdatabasen (dvs. komponenter med OB-≥ 30% och DL ≥ 0,18)20,21.
- Om komponenten inte har några OB- och DL-värden matar du in komponenten i den schweiziska ADME-databasen (http://www.swissadme.ch/index.php)22 för att få information om varje komponent. Inkludera komponenter med "hög" GI-absorption och minst två "Ja" DL-värden som aktiva komponenter.
- Målförutsägelse av de aktiva komponenterna
- Öppna HERB-databasen (http://herb.ac.cn). Sök och kopiera de kanoniska SMILES-strukturerna för de aktiva komponenterna.
- Öppna SEA-databasen (Similarity ensemble approach, http://sea.bkslab.org)23. Klistra in de kanoniska SMILES-strukturerna för de aktiva komponenterna i sökrutan och klicka på Prova SEA för att hämta målnyckeln, målnamnet, P-värdet och MaxTC för varje aktiv komponent.
- Kopiera data till ett kalkylblad och använd filtreringsfunktionen i kalkylbladsfilen för att filtrera målen för de aktiva komponenterna efter målnyckel (Human, P < 0,05 och MaxTC > 0,5).
- Kopiera alla mål till ett kalkylblad och ta bort dubbletterna för att få läkemedelsmålen.
- Förutsägelse av sjukdomsmål
- Öppna GeneCards databas (https://www.genecards.org)24 och Online Mendelian Inheritance in Man-databasen (OMIM, https://www.omim.org)25 och använd lungadenokarcinom som nyckelord för att få sjukdomsmålen för lungadenokarcinom .
- Ladda ner kalkylbladen för sjukdomsmålen. Ta bort de upprepade målen för att erhålla LUAD-målen.
- Uppbyggnad av ett nätverk av läkemedelskomponent-sjukdom-mål
- Kopiera LUAD-relaterade mål och läkemedelsmål till samma kolumn i ett nytt kalkylblad. Använd funktionen Data - Identifiera dubbletter i verktygsfältet för att hämta skärningsmål för LUAD-relaterade mål och Trichosanthes-Fritillaria thunbergii aktiva komponentrelaterade mål.
- Öppna Cytoscape 3.8.0. Klicka på Arkiv i menyraden och välj sedan Importera > nätverk från fil för att importera kalkylarkfilen. Optimera storleken och färgen på nätverksnoderna genom stilfältet i den vänstra kontrollpanelen.
- Använd funktionen Analysera nätverk för analys av nätverkstopologi. Klicka på Verktyg i menyraden och välj sedan Analysera nätverk. På tabellpanelen klickar du på Grad i namnlisten för att ordna komponenterna efter grad i fallande ordning. Ta de tio viktigaste komponenterna och målen som de viktigaste aktiva komponenterna och kärnmålen.
- Uppbyggnad av PPI-nätverket och screening av kärnproteinerna
- Öppna STRING-databasen (https://cn.string-db.org/)26. Klistra in textformatlistan över potentiella mål för Trichosanthes-Fritillaria thunbergii mot LUAD i dialogrutan Lista över namn . Välj Homo sapiens i Organismer och klicka på knapparna SÖK > FORTSÄTT .
- När resultaten är tillgängliga klickar du på Inställningar och markerar Hög konfidens (0,700) i Grundinställningar > Minsta nödvändiga interaktionspoäng. Markera Dölj frånkopplade noder i nätverket i Avancerade inställningar och klicka sedan på knappen UPPDATERA .
- Klicka på Exporter i namnlisten och ladda ner den korta tabelltexten för PPI-relationen i TSV-format.
- Öppna Cytoscape 3.8.0. Klicka på Arkiv > Importera > nätverk från fil för att importera TSV-formatfilen för visuell analys.
- Använd funktionen Network Analyzer för att utföra den topologiska analysen. Optimera storleken och färgen på nätverksnoderna genom stilfältet i den vänstra kontrollpanelen.
- KEGG-anrikningsanalys
- Öppna plattformen Metascape (https://metascape.org/)27 . Klistra in textformatlistan över de potentiella terapeutiska målen i dialogrutan och klicka sedan på knappen Skicka . Markera H. sapiens i både Input as Species och Analysis as Species, och klicka sedan på knappen Anpassad analys . Välj Anrikning, markera endast KEGG-vägen och klicka sedan på Anrikningsanalys. När förloppsindikatorn når 100% klickar du på den orange knappen Analysrapportsida för berikningsresultaten.
- Klicka på All in One Zip-fil för nedladdning av berikningsresultatet och öppna sedan filen _ FINAL_GO.csv i mappen Enrichment_GO för att få resultatet.
- Öppna R-programvara (https://cran.r-project.org/). Skriv install.package (" ggplot2") och library (ggplot2) i R för installationen av ggplot2 R-paketet. Tryck på Enter för att köra KEGG-visualiseringsprogrammet.
2. Experimentell verifiering
- Läkemedelsberedning
OBS: Fritillaria thunbergii Miq och Trichosanthes kirilowii Maxim köptes från Dongzhimen Hospital, ansluten till Beijing University of Chinese Medicine.- Blanda 50 g Fritillaria thunbergii Miq och 50 g Trichosanthes kirilowii Maxim tillsammans. Blötlägg blandningen i 1 liter destillerat vatten i 20 minuter och dekorera sedan blandningen vid 100 °C under normalt tryck i 1 timme.
- Filtrera avkoket för att erhålla ett filtrat med ett dubbelt lager steril medicinsk gasbindning och använd sedan 80 μm filterpapper för att ytterligare filtrera extraktet. Upprepa ovanstående operation tre gånger.
- Blanda filtratet så att det får ett ca 1,2 l avkok. Placera lösningen i kolven i en rotationsindunstare. Ställ in rotationshastigheten på 50 rpm med en temperatur på 37 °C. Blanda och kondensera avkokningarna till ett extrakt i rotationsindunstaren i 6 timmar för att ge en viskös vätska.
- Slå på vakuumfrystorkningsmekanismen för att förkyla temperaturen till −40 °C. Lägg det erhållna extraktet i materialfacket och placera det i kylfällan för frysning.
- När kylfällans temperatur når −50 °C och materialet har varit fryst i 2 timmar, överför det frysta materialet till en torkställning som placerats i kylfällan. Slå på vakuumpumpen för att starta lyofiliseringsprocessen. Ta ut det frystorkade pulvret och förvara det i kylskåp vid -20 °C för senare användning.
- Cellodling
- Konfigurera DMEM komplett medium med 89% DMEM basmedium, 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin.
- Efter avlägsnande av A549-cellerna från flytande kväve, inkubera cellerna i ett 37 °C vattenbad och rör om tills mediet i injektionsflaskan smälter.
- Tillsätt en fyrfaldig volym DMEM komplett medium i de smälta cellerna. Centrifugera cellerna (4 °C, 679 x g, 5 min) och kassera supernatanten.
- Supetera de utfällda cellerna på nytt med 6 ml DMEM komplett medium, plätera dem i en T25-odlingskolv och inkubera kolven i en cellinkubator vid 37 °C, 5 %CO2.
- Detektion av cellviabilitet
- Smält de logaritmiska tillväxtfascellerna A549 med 1 ml 0,25% trypsin i 1 min vid 37 ° C. Tillsätt 1 ml DMEM komplett medium för att neutralisera trypsinet och blås det försiktigt för att främja cellavverkning. Centrifugera blandningen så att cellpelleten erhålls (4 °C, 192 x g, 5 min). Resuspendera de erhållna cellerna med DMEM komplett medium.
- Lägg till cellsuspensionen till en hemocytometer och räkna med en automatiserad cellräknare. Späd den till 5 x 104 celler/ml med DMEM komplett medium.
- Lös 1 g Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-vattenextrakt i 10 ml PBS-lösning och filtersterilisera det genom ett 0,22 μm-filter. Späd blandningen till 90 mg/ml, 80 mg/ml, 70 mg/ml, 60 mg/ml, 50 mg/ml, 40 mg/ml, 30 mg/ml, 20 mg/ml och 10 mg/ml med PBS.
- Platta de utspädda cellerna på 96-brunnsplattor med 100 μL per brunn. Efter cellvidhäftning, tillsätt 1 μL Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vattenextrakt med olika koncentrationer för att justera koncentrationen av varje brunn till 900 μg/ml, 800 μg/ml, 700 μg/ml, 600 μg/ml, 500 μg/ml, 400 μg/ml, 300 μg/ml, 200 μg/ml och 100 μg/ml.
- Kassera det ursprungliga mediet efter 24 timmars odling och tillsätt 100 μl DMEM basmedium för ytterligare inkubation i 2 timmar vid 37 °C, 5 %CO2.
- Efter ovanstående behandling, tillsätt 20 μL MTS-lösning (Table of Materials) och inkubera cellerna i ytterligare 1 h vid 37 °C, 5%CO2.
- Överför den inkuberade blandningen till en annan platta. Mät absorbansen (OD) vid en våglängd på 490 nm med hjälp av en mikroplattläsare. Beräkna cellviabiliteten med följande formel:
Viabilitet (%) = 100 × (OD för det behandlade provet − OD för mediet)/(OD för kontrollprovet − OD för mediet).
OBS: En lägsta koncentration nära IC50 definieras som en hög dos. Den koncentration vid vilken cellproliferationen börjar hämmas definieras som en lågdoskoncentration och mellanvärdet definieras som en medeldoskoncentration för efterföljande experimentella studier. I denna studie användes 400 μg/ml, 600 μg/ml och 800 μg/ml som låga, medelhöga och höga doser.
- Läkemedelsintervention och provinsamling
OBS: Celltillväxt plottades mot tiden för att bestämma logfasen.- Späd de logaritmiska tillväxtfascellerna A549 till 5 x 105 celler/ml. Tillsätt 2 ml av cellsuspensionen till en 6-brunnsplatta och växa i 12 timmar.
- Upprepa steg 2.3.3 för att erhålla 80 mg/ml, 60 mg/ml och 40 mg/ml PBS-spädningar av vattenextraktet Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Tillsätt 20 μl PBS-lösning, 20 μl 40 mg/ml Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-vattenextrakt, 20 μl 60 mg/ml Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-vattenextrakt och 20 μl 80 mg/ml Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-vattenextrakt till blindkontrollgruppen, lågkoncentrationsgruppen, medelkoncentrationsgruppen och högkoncentrationsgruppen. respektive. Kassera supernatanten efter 24 timmars ingrepp och rengör cellerna med PBS tre gånger.
OBS: Koncentrationerna av blindkontrollgruppen, lågkoncentrationsgruppen, medelkoncentrationsgruppen och högkoncentrationsgruppen av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-vattenextrakt var 0 μg/ml, 400 μg/ml, 600 μg/ml respektive 800 μg/ml. - Tillsätt 250 μL Ripa-buffert (innehållande 1 % PMSF och 1 % fosfatashämmare) till varje brunn och lysera cellerna i 30 minuter. Samla upp lysatet för centrifugering (4 °C, 6,714 x g, 10 min) och erhålla supernatanten.
- Västra blotting
- Avkänn provernas proteinkoncentration med BCA-metoden enligt tillverkarens anvisningar. Använd Ripa-buffert för att justera koncentrationen i varje prov så att den blir konsekvent.
- Blanda 40 μl av proteinprovet med 10 μl 5x laddningsbuffert och koka i 5 min vid 100 °C. Centrifugera (4 °C, 6,714 x g, 10 min) blandningen så att supernatanten erhålls för efterföljande experiment.
- Isolera proteinerna genom gelelektrofores med 120 V vertikal elektrofores.
- Förbered en elektrisk "smörgås" (svamp - filterpapper - gel - PVDF-membran - filterpapper - svamp). Blötlägg överföringsapparaten i ett isbad och överför proteinet till PVDF-membran vid 70 V i 60 minuter.
- Använd 100 ml TBST-lösning (0,05 % [v/v] Tween-20, 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) och 5 g skummjölkspulver för att konfigurera 5 % mjölk. Förspäd AKT- och p-AKT-antikropparna med antikroppsspädningsmedlet i förhållandet 1:1 000.
- Blockera PVDF-membranet i 5% skummjölkspulver i 1 timme med skakning. Efter blockering kasseras den blockerande mjölken och den utspädda primära antikroppen tillsätts för inkubation över natten vid 4 °C.
- Efter avlägsnande av den primära antikroppen, använd TBST-lösning för att tvätta PVDF-membranet fem gånger i 5 minuter vardera.
- Förspäd den sekundära antikroppen med antikroppsspädningsmedlet i förhållandet 1:5 000. Tillsätt den sekundära antikroppen och inkubera vid rumstemperatur (RT) i 1,5 timmar. Efter avlägsnande av den sekundära antikroppen, använd TBST-lösning för att tvätta PVDF-membranet fem gånger i 5 minuter vardera.
- Detektera proteinet med hjälp av ett kemiluminiscensdetekteringssystem.
3. Molekylär dockning
- Öppna UniProt-databasen (https://www.uniprot.org)28. Skriv målsymbolerna i sökrutan och klicka på knappen SÖK . I underrubriken Struktur klickar du på Ladda ner för proteinmålens 3D-strukturer.
- Öppna RCSB PDB-databasen (https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)29. Skriv namnet på proteinmakromolekylerna i sökrutan. Ladda ner proteinmakromolekylstrukturerna i PDB-format.
- Hämta installationspaketet för UCSF Chimera 1.16 software (https://vina.scripps.edu/) och AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/). Installera och öppna programvaran UCSF Chimera 1.16. Klicka på Arkiv > Öppna för att visa receptorproteinet.
- Klicka på Verktyg > strukturredigering > dockningsförberedelser och markera Ta bort lösningsmedel, tillsätt väten och lägg till avgifter i popover för att ta bort vatten och lägga till hydrering och balansladdningar. Klicka på Skriv mol2-fil för att spara receptorproteinet i mol2-format . Utför samma steg på liganden.
- Klicka på Arkiv > Öppna för att visa liganden i mol2-format i programvaran UCSF Chimera 1.16. I Tools > Surface/Binding Analysis > AutoDock Vina anger du receptorfältet till namnet på receptorproteinet och ligandfältet till namnet på liganden. Ange ett värde i rutan bakom Center och Size för att justera det nyutvecklade utrymmet, vilket gör det möjligt att helt omfatta liganden och receptorn.
- Klicka på OK för den virtuella screeningen för molekylär dockning för att få den optimala platsen för ligandbindning till receptorn. Registrera bindningsenergivärdet vid optimal position.
4. Statistisk analys
- Öppna statistikprogrammet SPSS 26.0. Klicka på Arkiv > Importera data för dataladdning.
- Presentera experimentella data som medelvärde ± standardavvikelse.
- Jämför flera grupper med en enkelriktad ANOVA.
OBS: P < 0,05 ansågs statistiskt signifikant i detta arbete.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt identifierades 31 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-relaterade aktiva komponenter, inklusive 21 Trichosanthes och 10 Fritillaria thunbergia-komponenter, samt 144 motsvarande mål. Totalt extraherades 9 049 och 67 LUAD-relaterade gener från GeneCards-databasen respektive OMIM-databasen. Efter radering av duplicerade gener identifierades 9 057 gener relaterade till LUAD. Skärningspunkten mellan de LUAD-relaterade generna och Trichosanthes-Fritillaria thunbergii aktiva komponentrelaterade mål genomfördes för att erhålla potentiella terapeutiska mål. Trichosanthes-Fritillaria thunbergiis interaktionsnätverk för läkemedelskomponent-sjukdom-mål mot LUAD visas i figur 1A. I interaktionsnätverket var de tio främsta aktiva komponenterna kaempferol, hydroxygenkwanin, genistein, diosmetin och β-sitosterol, palmitoleicacid, mandenol, hexadekansyra, karproinsyra och kaprinsyra, som identifierades som de viktigaste aktiva komponenterna i verkan av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vid behandling av LUAD (figur 1B). PPI-nätverket inkluderade 122 funktionella proteiner och 210 interaktionsrelationer, och visualiseringsresultaten visas i figur 2A. De tio bästa kärnproteinerna efter grad (parameter som används för visualiseringsanalys i Cytoscape-programvaran) i fallande ordning inkluderade ESR1, VEGFA, PPARA, CYP3A4, AR, APP, FGF2, CREB1 och CYP1A1, som huvudsakligen är involverade i neovaskularisering, cellproliferation, apoptos och cellmembrantransport 30,31,32,33,34,35,36,37 ,38,39(Figur 2B). Av de 20 bästa vägarna rankade av KEGG är PI3K / AKT-signalvägen 40, Rap1-signalvägen 41, fosfolipas D-signalvägen 42 ochMAPK1-signalvägen 43 nära associerad med lungcancer, bland vilka PI3K / AKT-vägen rankades först och användes därför för efterföljande verifiering (figur 3).
Experimenten indikerade att Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-extrakt vid koncentrationer över 400 μg/ml kunde hämma cellproliferation, och hämningseffekten på A549-celler vid koncentrationer upp till 800 μg/ml var nära den halva hämmande koncentrationen (IC50) (figur 4). Således användes 400 μg / ml, 600 μg / ml och 800 μg / ml som låga, medelstora och höga doser för de efterföljande experimenten. Interventionen av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-extrakt orsakade ingen signifikant förändring av AKT-proteinuttrycket i varje grupp; Uttrycket av p-AKT (Ser473) hämmades dock och visade en dosberoende effekt (figur 5). Nyckelkomponenterna i Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vid LUAD-behandling dockades molekylärt med nyckelproteinerna i PI3K / AKT-vägen, och resultaten föreslog att bindningsenergierna för diosmetin och kaempferol med AKT1 var mindre än -7, vilket indikerar stark bindningsaktivitet44 (figur 6).
Figur 1: Diagram över nätverket för läkemedelskomponent-sjukdom-mål. (A) Blått representerar sjukdomen; gult representerar läkemedlet; rött representerar komponenten; Grönt representerar målet. Förkortningar: GL = Trichosanthes; ZBM = Fritillaria thunbergia; LUAD = lungadenokarcinom. (B) De tio främsta aktiva ingredienserna i nätverket sorterade efter grad i fallande ordning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: PPI-nätverk av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vid behandling av LUAD. (A) Visualiseringsresultat för PPI-nätverket. Ju mörkare nod, desto mer centralt är proteinet i nätverket. (B) De tio främsta målen i nätverket efter examen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: KEGG-väganrikning av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-mål mot LUAD. (A) De 20 bästa KEGG-vägarna rangordnas enligt P-värdena i stigande ordning. (B) Karta över PI3K / AKT-signalvägen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Effekter av olika koncentrationer av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-extrakt på A549-cellproliferation (n = 3). Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-extrakt vid koncentrationer över 400 μg/ml kan hämma cellproliferation. Hämningseffekten på A549-celler vid koncentrationer upp till 800 μg/ml var nära den halva hämmande koncentrationen (IC50). Förkortning: GL-ZBM = Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Effekter av olika koncentrationer av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-extrakt på AKT-proteinuttryck och fosforyleringsnivåer (n = 3). Det fanns ingen signifikant förändring i AKT-proteinuttryck i varje grupp, medan proteinuttrycket av p-AKT (Ser473) i medeldos- och högdosgrupperna var signifikant nedreglerat och skillnaden var statistiskt signifikant jämfört med kontrollgruppen (*P < 0,05 jämfört med kontrollgruppen). Förkortning: GL-ZBM = Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Molekylär dockning av de relaterade komponenterna med kärnproteiner . (A) Värmekarta över bindningsenergin hos nyckelkomponenter i Trichosanthes-Fritillaria thunbergii för LUAD-behandling molekylärt dockad med nyckelproteiner i PI3K / AKT-vägen. (B) Molekylärt dockningsdiagram över diosmetin- och AKT1-proteiner. (C) Molekylärt dockningsdiagram över kaempferol- och AKT1-proteiner. De rosa linjerna representerar vätebindningar, de grå strukturerna representerar läkemedelskompositioner och den färgade strukturen representerar AKT1. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I allmänhet inkluderar en komplett nätverksfarmakologisk studie identifiering av aktiva komponenter från databaser, förvärv av mål som motsvarar aktiva komponenter och sjukdomar, uppbyggnad av ett nätverk för läkemedelskomponent-sjukdom-mål och förutsägelse av kärnmål och vägar. Sambandet mellan aktiva komponenter och kärnproteiner (molekylär dockning) förutsägs preliminärt av datorteknik, och den slutliga verifieringen utförs med hjälp av ett experiment.
Valet av relevanta databaser är den mest kritiska delen av nätverksfarmakologin, eftersom detta avgör forskningens kvalitet. HERB-databasen integrerar information från flera TCM-databaser, såsom Syμmap, TCMID, TCMSP och TCM-ID, och är den mest omfattande TCM- och ingrediensdatabasen för närvarande. Därför användes i denna studie HERB-databasen för screening av de aktiva komponenterna19.
I denna studie identifierades 31 aktiva komponenter och 144 skärningsmål för Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vid behandling av LUAD genom relaterade databaser. Genom att konstruera ett nätverk av läkemedelskomponent-sjukdom-mål utforskade vi tio viktiga aktiva komponenter genom topologisk analys. De centrala målen för Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vid behandling av LUAD screenades ut genom PPI-analys.
Bland de 20 bästa vägarna från KEGG-resultaten är PI3K / AKT-signalvägen, MAPK1-signalvägen, Rap1-signalvägen och PPAR-signalvägen nära besläktade med tumörer enligt litteraturen40,41,42. MAPK1, en klassisk cancerrelaterad signalväg, är en viktig regulator för celltillväxt och differentiering. När den aktiveras leder denna signalväg till okontrollerad cellproliferation, cellcykelförlängning och tumörförekomst och utveckling45. Rap1-signalvägen är en viktig regulator för NF-κB-signalvägen och MAPK1-signalvägen och är nära relaterad till celladhesion vid lungcancer46. Dessutom har det bekräftats att hämning av Rap1-signalvägen kan förbättra tumörmetastaser vid lungcancer47. PPAR-signalvägen är associerad med cellproliferation, energihomeostas, tumörgenes och metaboliska störningar48. Studier har bekräftat dess funktion för att främja tumörangiogenes och tumörtillväxt49.
PI3K / AKT-signalvägen påverkar huvudsakligen metabolismen, proliferationen, apoptos och vaskulariseringen av tumörer genom fosforylering och aktivering av AKT. Tidigare studier har visat att PI3K / AKT-signalvägen spelar en reglerande roll i MAPK1-signalvägen, Rap1-signalvägen och PPAR-signalvägen50,51,52. Dessutom visade KEGG-förutsägelseresultaten att PI3K / AKT-signalvägen var närmast relaterad till verkan av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii mot LUAD, så den valdes för efterföljande experimentell verifiering.
De PPI-förutsagda kärnmålen, VEGFA och CREB1 i PI3K / AKT-signalvägen, liksom nyckelproteinerna PI3K och AKT1 i PI3K / AKT-signalvägen, inkluderades för molekylär dockning. I en tidigare studie ansågs en dockningsbindande energi mindre än −7 vara signifikant44. Resultaten av denna studie föreslog att bindningsenergin för kaempferol och diosmetin med AKT1 överskred denna tröskel, vilket tyder på att effekterna av dessa två komponenter på AKT kan vara nyckeln till verkan av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii mot LUAD.
I ytterligare experimentell verifiering undersökte vi effekten av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-extrakt på fosforyleringsnivån av AKT. Resultaten visade att olika koncentrationer av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-extrakt inte hade någon signifikant effekt på uttrycket av AKT-proteinet, men Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-extrakt kunde signifikant hämma fosforyleringen av AKT-protein på ett dosberoende sätt. Dessa resultat tyder på att hämningen av PI3K / AKT-vägen är den viktigaste verkningsmekanismen för Trichosanthes-Fritillaria thunbergii mot LUAD.
Sammanfattningsvis har denna studie genom nätverksfarmakologi och experimentell validering verifierat att PI3K / AKT-signalvägen spelar en viktig roll i verkan av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vid behandling av LUAD.
Det finns fortfarande vissa brister i denna studie. Studien inkluderade endast aktiva komponenter med hög biotillgänglighet utan att diskutera den möjliga biotransformationen av aktiva molekyler i tjocktarmen, tarmcellerna och levern, vilket inte är tillräckligt omfattande. Dessutom verifierades effekten av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii på proliferations- och PI3K/AKT-vägen för lungadenokarcinomceller endast experimentellt in vitro. Denna studie ger en teoretisk grund för att utveckla nya läkemedel och utöka kliniska tillämpningar. I framtiden kommer ytterligare experimentella valideringar av dessa prediktionsresultat att utföras för att stödja bedömningar av potentiella kliniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av innovationsutbildningsprogrammet vid Beijing University of Chinese Medicine (nr: 202110026036).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | R001100 | |
| A549 cell line | Procell | CL-0016 | |
| AKT antibody | CST | 4691S | |
| BCA Protein Assay Kit | Solarbio | PC0020 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Solarbio | 11995 | |
| Enhanced chemiluminescence (ECL) kit | ABclonal | RM00021 | |
| Fetal bovine serum | ScienCell | 0025 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | ABclonal | AS014 | |
| MTS assay kit | Promega | G3580 | |
| p-AKT antibody | CST | 6040S | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | C14-15070-063 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Solarbio | P0100 | |
| Phosphatase inhibitor | Beyotime | P1081 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Solarbio | P1020 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| RIPA lysis solution | Solarbio | R0010 | |
| Rotary evaporator | Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory | RE52CS-1 | |
| Vacuum freeze-drying mechanism | Ningbo Scientz Biotechnology | SCIENTZ-10 | |
| β-Actin antibody | ABclonal | AC026 |
References
- Thai, A. A., Solomon, B. J., Sequist, L. V., Gainor, J. F., Heist, R. S.
- Sinha, A., et al. Early-stage lung adenocarcinoma MDM2 genomic amplification predicts clinical outcome and response to targeted therapy. Cancers. 14 (3), 708 (2022).
- Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. The New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
- Hirsch, F. R., et al. Lung cancer: Current therapies and new targeted treatments. The Lancet. 389 (10066), 299-311 (2017).
- Liu, J., et al. Comprehensive treatment with Chinese medicine in patients with advanced non-small cell lung cancer: A multicenter, prospective, cohort study. Chinese Journal of Integrative Medicine. 23 (10), 733-739 (2016).
- Xiao, Z. W., et al. Comprehensive TCM treatments combined with chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer: A randomized, controlled trial. Medicine. 100 (18), 25690 (2021).
- Li, Y., et al. Effectiveness of traditional Chinese medicine on chemoradiotherapy induced leukaemia in patients with lung cancer: A meta-analysis. Journal of Traditional Chinese Medicine. 38 (5), 661-667 (2018).
- Yuan, F., et al. Therapeutic effect and apoptosis mechanism of lung-tonifying and expectorant decoction on lung cancer rats with Qi deficiency and blood stasis. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 8 (11), 983-988 (2015).
- Zhang, Y. L., Liang, Y. E., He, C. W. Anticancer activities and mechanisms of heat-clearing and detoxicating traditional Chinese herbal medicine. Chinese Medicine. 12, 20 (2017).
- Wang, T. B., et al. Exploring the rules of application of RONG Yuan-ming in the treatment of non-small cell lung cancer. Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 25 (14), 22-25 (2019).
- Chen, T. T., Wang, Y., Tian, T. Medication regularity and mechanism of traditional Chinese medicine in treating lung cancer. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 24 (11), 206-210 (2018).
- Shen, C. J. Analysis of the rule of Chinese medicine in treating lung cancer. Journal of Shandong University of Traditional Chinese Medicine. 35 (2), 127-129 (2011).
- Yang, X. Y., et al. Evidence-based complementary and alternative medicine bioinformatics approach through network pharmacology and molecular docking to determine the molecular mechanisms of Erjing pill in Alzheimer's disease. Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (5), 1252 (2021).
- Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design Development and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
- Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong recipe in the treatment of osteoarthritis. Computational and Mathematical Methods in Medicine. 2022, 7858925 (2022).
- Xie, G. G., et al. A network pharmacology analysis to explore the effect of Astragali Radix-Radix Angelica Sinensis on traumatic brain injury. BioMed Research International. 2018, 3951783 (2018).
- Chen, G. Y., et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5233462 (2021).
- World Federation of Chinese Medicine Societies. Network pharmacology evaluation methodology guidance. World Chinese Medicine. 16 (4), 527-532 (2021).
- Fang, S. S., et al. A high-throughput experiment- and reference-guided database of traditional Chinese medicine. Nucleic Acids Research. 49, 1197-1206 (2021).
- Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2022, 1826299 (2022).
- Yu, J. H., et al. ZiYinHuaTan recipe inhibits cell proliferation and promotes apoptosis in gastric cancer by suppressing PI3K/AKT pathway. BioMed Research International. 2020, 2018162 (2020).
- Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Scientific Reports. 7, 42717 (2017).
- Keiser, M. J., et al. Relating protein pharmacology by ligand chemistry. Nature Biotechnology. 25 (2), 197-206 (2007).
- Safran, M., et al. GeneCards Version 3: The human gene integrator. Database. 2010, (2010).
- Amberger, J. S., Hamosh, A. Searching Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): A knowledgebase of human genes and genetic phenotypes. Current Protocols in Bioinformatics. 58, 1-12 (2017).
- Mering, C. V., et al. STRING: Known and predicted protein-protein associations, integrated and transferred across organisms. Nucleic Acids Research. 33, 433-437 (2005).
- Zhou, Y. Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10, 1523 (2019).
- Pundir, S., et al.
- Burley, S. K., et al. Protein data bank (PDB): The single global macromolecular structure archive. Methods in Molecular Biology. 1607, 627-641 (2017).
- Welsh, L. C., Welsh, M.
- Hsu, L. H., Chu, N. M., Kao, S. H. Estrogen, estrogen receptor and lung cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1713 (2017).
- Atmaca, A., et al. SNAI2/SLUG and estrogen receptor mRNA expression are inversely correlated and prognostic of patient outcome in metastatic non-small cell lung cancer. BMC Cancer. 15, 300 (2015).
- Lakshmi, S. P., Reddy, A. T., Banno, A., Reddy, R. C. PPAR agonists for the prevention and treatment of lung cancer. PPAR Research. 2017, 8252796 (2017).
- Oguro, A., Sakamoto, K., Funae, Y., Imaoka, S. Overexpression of CYP3A4, but not of CYP2D6, promotes hypoxic response and cell growth of Hep3B cells. Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 26 (4), 407-415 (2011).
- Jamroze, A., Chatta, G., Tang, D. G. Androgen receptor (AR) heterogeneity in prostate cancer and therapy resistance. Cancer Letters. 518, 1-9 (2021).
- Wu, Y. I., et al. Regulation of global gene expression and cell proliferation by APP. Scientific Reports. 6, 22460 (2016).
- Sedlář, A., et al. Growth factors VEGF-A 165 and FGF-2 as multifunctional biomolecules governing cell adhesion and proliferation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1843 (2021).
- Guo, L. H., Yin, M., Wang, Y. X. CREB1, a direct target of miR-122, promotes cell proliferation and invasion in bladder cancer. Oncology Letters. 16 (3), 3842-3848 (2018).
- Wang, D. D., et al. Induction of CYP1A1 increases gefitinib-induced oxidative stress and apoptosis in A549 cells. Toxicology In Vitro. 44, 36-43 (2017).
- Tan, A. C. Targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway in non-small cell lung cancer (NSCLC). Thoracic Cancer. 11 (3), 511-518 (2020).
- Jin, X., et al. RBM10 inhibits cell proliferation of lung adenocarcinoma via RAP1/AKT/CREB signalling pathway. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 3897-3904 (2019).
- Henkels, K. M., et al. Phospholipase D (PLD) drives cell invasion, tumor growth and metastasis in a human breast cancer xenograph model. Oncogene. 32 (49), 5551-5562 (2013).
- Zhang, Z. Y., et al. CircRNA_101237 promotes NSCLC progression via the miRNA-490-3p/MAPK1 axis. Scientific Reports. 10, 490-493 (2020).
- Gao, T. X., et al. Exploring the mechanism of Fu-Zi Decoction in treatment of chronic heart failure based on network pharmacology and molecular docking technology. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences. 30 (09), 705-715 (2021).
- Wang, B., et al. PP4C facilitates lung cancer proliferation and inhibits apoptosis via activating MAPK/ERK pathway. Pathology, Research and Practice. 216 (5), 152910 (2020).
- Moon, M. Y., et al. Rap1 regulates hepatic stellate cell migration through the modulation of RhoA activity in response to TGF-β1. International Journal of Molecular Medicine. 44 (2), 491-502 (2019).
- Kan, J., et al. He-Chan Pian inhibits the metastasis of non-small cell lung cancer via the miR-205-5p-mediated regulation of the GREM1/Rap1 signaling pathway. Phytomedicine. 94, 153821 (2022).
- Sidrat, T., et al. Role of Wnt signaling during in-vitro bovine blastocyst development and maturation in synergism with PPARδ signaling. Cells. 9 (4), 923 (2020).
- Wagner, N., Wagner, K. D. PPAR beta/delta and the hallmarks of cancer. Cells. 9 (5), 1133 (2020).
- Miriam, M., et al. PI3K/AKT signaling pathway and cancer: An updated review. Annals of Medicine. 46 (6), 372-383 (2014).
- Ma, X. L., et al. CD73 promotes hepatocellular carcinoma progression and metastasis via activating PI3K/AKT signaling by inducing Rap1-mediated membrane localization of P110β and predicts poor prognosis. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 37 (2019).
- Li, T., et al. Pomegranate flower extract bidirectionally regulates the proliferation, differentiation and apoptosis of 3T3-L1 cells through regulation of PPARγ expression mediated by PI3K-AKT signaling pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 131, 110769 (2020).
