Summary
Este estudo revela o mecanismo de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento do adenocarcinoma pulmonar com base na farmacologia de rede e verificação experimental. O estudo também demonstra que a via de sinalização PI3K/AKT desempenha um papel vital na ação do Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento do adenocarcinoma pulmonar.
Abstract
Nosso objetivo foi estudar o mecanismo de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento do adenocarcinoma pulmonar (LUAD) com base na farmacologia de rede e verificação experimental. Os componentes efetivos e alvos potenciais de Trichosanthis e Fritillaria thunbergii foram coletados por experimentos de alto rendimento e banco de dados guiados por referência (HERB) da medicina tradicional chinesa e um banco de dados de similaridade ensemble approach (SEA), e os alvos relacionados ao LUAD foram consultados pelos bancos de dados GeneCards e Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Uma rede fármaco-componente-doença-alvo foi construída pelo software Cytoscape. Análises da rede de interação proteína-proteína (PPI), da ontologia gênica (GO) e da enciclopédia de Kyoto de enriquecimento de genes e genomas (KEGG) foram conduzidas para obter alvos centrais e vias-chave. Um extrato aquoso de células de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii e A549 foi utilizado para posterior validação experimental. Através do banco de dados HERB e busca na literatura, 31 compostos efetivos e 157 potenciais genes-alvo de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii foram examinados, dos quais 144 foram alvos regulatórios de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento de adenocarcinoma pulmonar. A análise do enriquecimento funcional do GO mostrou que o mecanismo de ação do Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contra o adenocarcinoma pulmonar é principalmente a fosforilação de proteínas. A análise do enriquecimento da via de KEGG sugeriu que o tratamento do adenocarcinoma pulmonar por Trichosanthes-Fritillaria thunbergii envolve principalmente a via de sinalização PI3K/AKT. A validação experimental mostrou que um extrato aquoso de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii pode inibir a proliferação de células A549 e a fosforilação de AKT. Através da farmacologia de rede e validação experimental, verificou-se que a via de sinalização PI3K/AKT desempenha um papel vital na ação do Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento do adenocarcinoma pulmonar.
Introduction
O câncer de pulmão refere-se a tumores malignos originados da mucosa brônquica pulmonar, incluindo carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma de grandes células e carcinoma de pequenascélulas1. O adenocarcinoma de pulmão (LUAD) é o tipo mais comum de câncer de pulmão, correspondendo a cerca de 40% do total de casos de câncer depulmão2. A maioria dos pacientes é diagnosticada em estágio avançado ou com metástase à distância e, assim, perde a oportunidade dacirurgia3. No tratamento clínico atual, a quimiorradioterapia concomitante é a estratégia mais comum para o tratamento da LUAD, mas sua aplicação é limitada devido a reações adversasgraves4.
A medicina tradicional chinesa (MTC) pode efetivamente aliviar os sintomas clínicos de pacientes com LUAD e reduzir as reações adversas causadas pela radioterapia e quimioterapia, tornando-se, assim, um foco de pesquisa 5,6,7. Na medicina tradicional chinesa, o câncer de pulmão pertence à categoria de "acúmulo pulmonar" e "petroso pulmonar". A deficiência de Qi e a interação de catarro, estase e veneno são importantes na patogênese do câncer de pulmão. Portanto, tonificar o Qi e eliminar o catarro e a estase sanguínea são os principais métodos de tratamento clínico8 para o câncer de pulmão de acordo com a teoria daMTC9. Trichosanthes kirilowii Maxim (Gualou) e Fritillaria thunbergii Miq (Zhebeimu) representam um par de drogas comum no tratamento do câncer de pulmão, e essa combinação tem como efeito limpar o calor e reduzir o catarro10,11,12. No entanto, seu mecanismo de ação ainda não está claro, e mais pesquisas precisam ser conduzidas.
A farmacologia de redes é um método abrangente baseado na teoria da biologia de sistemas e farmacologia multidirecional que visa revelar complexas relações em rede entre múltiplas drogas e doenças13. As prescrições tradicionais chinesas têm as características de serem multicomponentes e multialvo, o que significa que são muito adequadas para o estudo da farmacologia de rede14,15. Recentemente, a farmacologia de redes emergiu como uma abordagem poderosa no estudo de fórmulas de MTC e tornou-se um hotspot de pesquisa16,17.
No entanto, até onde sabemos, todas as pesquisas em farmacologia de redes são apresentadas como texto. Apresentar essa tecnologia por meio de vídeo reduzirá muito o limiar de aprendizado e facilitará a divulgação dessa tecnologia, que é uma das vantagens deste artigo. Neste estudo, tomamos como exemplo Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contra adenocarcinoma pulmonar para predição farmacológica de rede e validação experimental.
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Protocol
Todos os procedimentos de farmacologia de rede foram realizados de acordo com as Diretrizes para Métodos de Avaliação de Farmacologia de Rede18. Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com os regulamentos de gestão laboratorial da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim.
1. Predição farmacológica de rede
- Seleção de componentes ativos
- Abra o banco de dados HERB (http://herb.ac.cn)19 e use "Gualou" (nome chinês para Trichosanthes kirilowii Maxim) e "Zhebeimu" (nome chinês para Bulbus Fritillariae thunbergii) como palavras-chave para obter os componentes dos dois medicamentos. Faça o download da lista e das estruturas SMILES canônicas dos componentes relacionados dos dois medicamentos.
- Determine se o componente obtido é o componente ativo.
- Incluir como componentes ativos aqueles que apresentam valores de biodisponibilidade oral (OB) e fármaco-like (DL) no banco de dados do grupo HERB (i.e., componentes com OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18)20,21.
- Se o componente não tiver valores de OB e DL, insira o componente no banco de dados suíço ADME (http://www.swissadme.ch/index.php)22 para obter as informações sobre cada componente. Inclua componentes com absorção GI "alta" e pelo menos dois valores de DL "Sim" como componentes ativos.
- Previsão de destino dos componentes ativos
- Abra o banco de dados HERB (http://herb.ac.cn). Pesquise e copie as estruturas SMILES canônicas dos componentes ativos.
- Abra o banco de dados SEA (Similarity ensemble approach, http://sea.bkslab.org)23. Cole as estruturas SMILES canônicas dos componentes ativos na caixa de pesquisa e clique em Testar SEA para obter a chave de destino, o nome de destino, o valor P e o MaxTC de cada componente ativo.
- Copie os dados em uma planilha e use a função de filtragem do arquivo de planilha para filtrar os destinos dos componentes ativos pela chave Target (Human, P < 0.05 e MaxTC > 0.5).
- Copie todos os alvos para uma planilha e remova as duplicatas para obter os alvos da droga.
- Predição de alvos de doença
- Abra os bancos de dados GeneCards (https://www.genecards.org)24 e Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM, https://www.omim.org)25 e use Lung Adenocarcinoma como palavra-chave para obter os alvos da doença do adenocarcinoma pulmonar.
- Faça o download das planilhas dos alvos da doença. Exclua os destinos repetidos para obter os destinos do LUAD.
- Construção de uma rede droga-componente-doença-alvo
- Copie os alvos relacionados ao LUAD e os alvos de drogas na mesma coluna em uma nova planilha. Use a função Dados - Identificar duplicatas na barra de ferramentas para obter destinos de interseção dos destinos relacionados ao LUAD e dos destinos relacionados ao componente ativo Trichosanthes-Fritillaria thunbergii .
- Abra o Cytoscape 3.8.0. Clique em Arquivo na barra de menus e selecione Importar > rede do arquivo para importar o arquivo de planilha. Otimize o tamanho e a cor dos nós de rede através da barra de estilos no painel de controle esquerdo.
- Use a função Analisar rede para a análise de topologia de rede . Clique em Ferramentas na barra de menus e selecione Analisar rede. No painel Tabela , clique no Grau na barra de título para organizar os componentes por grau em ordem decrescente. Tome os dez principais componentes e alvos como os principais componentes ativos e alvos principais.
- Construção da rede PPI e triagem das proteínas centrais
- Abra o banco de dados STRING (https://cn.string-db.org/)26. Cole a lista de formato de texto dos alvos potenciais de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contra LUAD na caixa de diálogo Lista de nomes . Selecione Homo sapiens em Organismos e clique nos botões PESQUISAR > CONTINUAR .
- Quando os resultados estiverem disponíveis, clique em Configurações e marque Alta Confiança (0,700) em Configurações Básicas > Pontuação Mínima de Interação Necessária. Marque Ocultar nós desconectados na rede em Configurações avançadas e clique no botão ATUALIZAR.
- Clique em Exportações na barra de título e baixe o texto tabular curto da relação PPI no formato TSV.
- Abra o Cytoscape 3.8.0. Clique em Arquivo > Importar > rede do arquivo para importar o arquivo de formato TSV para análise visual.
- Use a função Analisador de Rede para realizar a análise topológica. Otimize o tamanho e a cor dos nós de rede através da barra de estilos no painel de controle esquerdo.
- Análise de enriquecimento KEGG
- Abra a plataforma Metascape (https://metascape.org/)27. Cole a lista em formato de texto dos potenciais alvos terapêuticos na caixa de diálogo e, em seguida, clique no botão Enviar. Marque H. sapiens em Input as Species e Analysis as Species e, em seguida, clique no botão Custom analysis. Selecione Enriquecimento, marque apenas o Caminho KEGG e clique em Análise de Enriquecimento. Depois que a barra de progresso atingir 100%, clique no botão laranja da Página do Relatório de Análise para obter os resultados do enriquecimento.
- Clique em All in One Zip File para baixar o resultado do enriquecimento e, em seguida, abra o arquivo _ FINAL_GO.csv na pasta Enrichment_GO para obter o resultado.
- Abra o software R (https://cran.r-project.org/). Digite install.package (" ggplot2") e library (ggplot2) em R para a instalação do pacote ggplot2 R. Pressione Enter para executar o programa de visualização KEGG.
2. Verificação experimental
- Preparo de medicamentos
NOTA: Fritillaria thunbergii Miq e Trichosanthes kirilowii Maxim foram comprados do Hospital Dongzhimen, afiliado à Universidade de Medicina Chinesa de Pequim.- Misture 50 g de Fritillaria thunbergii Miq e 50 g de Trichosanthes kirilowii Maxim juntos. Mergulhe a mistura em 1 L de água destilada durante 20 minutos e, em seguida, decocte a mistura a 100 °C sob pressão normal durante 1 h.
- Filtrar a decocção para obter um filtrado com uma camada dupla de gaze médica estéril e, em seguida, usar papel de filtro de 80 μm para filtrar ainda mais o extrato. Repita a operação acima três vezes.
- Misture o filtrado para obter uma decocção de aproximadamente 1,2 L. Colocar a solução no balão de um evaporador rotativo. Ajuste a velocidade de rotação para 50 rpm com uma temperatura de 37 °C. Misture e condense as decocções em um extrato no evaporador rotativo por 6 h para obter um líquido viscoso.
- Ligue o mecanismo de liofilização a vácuo para pré-resfriar a temperatura a -40 °C. Coloque o extrato obtido na bandeja de material e coloque-o na armadilha fria para congelamento.
- Quando a temperatura da armadilha fria atingir -50 °C e o material tiver sido congelado por 2 h, transfira os materiais congelados para uma prateleira de secagem colocada na armadilha fria. Ligue a bomba de vácuo para iniciar o processo de liofilização. Retire o pó liofilizado e guarde-o na geladeira a -20 °C para uso posterior.
- Cultivo celular
- Configure o meio DMEM completo com 89% de DMEM meio básico, 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina.
- Depois de remover as células A549 do azoto líquido, incube as células num banho-maria a 37 °C e mexa até derreter o meio no frasco para injetáveis.
- Adicione um volume quádruplo de meio completo DMEM nas células fundidas. Centrifugar as células (4 °C, 679 x g, 5 min) e eliminar o sobrenadante.
- Ressuspender as células precipitadas com 6 mL de meio DMEM completo, plaqueá-las em um balão de cultura T25 e incubar o frasco em uma incubadora de células a 37 °C, 5% CO2.
- Detecção de viabilidade celular
- Digerir as células A549 da fase logarítmica de crescimento com 1 mL de tripsina a 0,25% por 1 min a 37°C. Adicione 1 mL de meio DMEM completo para neutralizar a tripsina e sopre suavemente para promover a eliminação celular. Centrifugar a mistura para obter o pellet de célula (4 °C, 192 x g, 5 min). Ressuspender as células obtidas usando meio completo DMEM.
- Adicione a suspensão celular a um hemocitômetro e conte usando um contador de células automatizado. Diluir para 5 x 104 células/mL utilizando meio completo de DMEM.
- Dissolver 1 g de extrato aquoso de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii em 10 mL de solução de PBS e filtrá-lo através de um filtro de 0,22 μm. Diluir a mistura para 90 mg/mL, 80 mg/ml, 70 mg/mL, 60 mg/mL, 50 mg/mL, 40 mg/mL, 30 mg/mL, 20 mg/mL e 10 mg/mL usando PBS.
- Plaquear as células diluídas em placas de 96 poços com 100 μL por poço. Após a adesão celular, adicionar 1 μL de extratos aquosos de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii de diferentes concentrações para ajustar a concentração de cada poço para 900 μg/mL, 800 μg/mL, 700 μg/mL, 600 μg/mL, 500 μg/mL, 400 μg/mL, 300 μg/mL, 200 μg/mL e 100 μg/mL.
- Eliminar o meio original após 24 h de cultura e adicionar 100 μL de meio básico DMEM para posterior incubação durante 2 h a 37 °C, 5% CO2.
- Após o tratamento acima, adicionar 20 μL de solução de MTS (Tabela de Materiais) e incubar as células por mais 1 h a 37 °C, 5% CO2.
- Transfira a mistura incubada para uma placa diferente. Meça a absorbância (OD) em um comprimento de onda de 490 nm usando um leitor de microplacas. Calcule a viabilidade celular usando a seguinte fórmula:
Viabilidade (%) = 100 × (DO da amostra tratada − DO do meio)/(DO da amostra controle − DO do meio).
NOTA: Uma concentração mínima próxima de IC50 é definida como uma dose elevada. A concentração na qual a proliferação celular começa a ser inibida é definida como uma concentração de baixa dose, e o valor intermediário é definido como uma concentração de dose média para estudos experimentais subsequentes. Neste estudo, 400 μg/mL, 600 μg/mL e 800 μg/mL foram utilizados nas doses baixa, média e alta.
- Intervenção medicamentosa e coleta de amostras
NOTA: O crescimento celular foi plotado contra o tempo para determinar a fase logarítmica.- Diluir as células A549 da fase logarítmica de crescimento para 5 x 105 células/mL. Adicione 2 mL da suspensão celular a uma placa de 6 poços e cresça por 12 horas.
- Repetir o passo 2.3.3 para obter diluições de 80 mg/mL, 60 mg/mL e 40 mg/mL de PBS do extrato aquoso de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Adicionar 20 μL da solução PBS, 20 μL do extracto aquoso de 40 mg/ml de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii, 20 μL do extracto aquoso de 60 mg/ml de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii e 20 μL do extracto aquoso de 80 mg/ml de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ao grupo de controlo em branco, ao grupo de baixa concentração, ao grupo de concentração média e ao grupo de alta concentração, respectivamente. Descarte o sobrenadante após 24 h de intervenção e limpe as células com PBS três vezes.
NOTA: As concentrações do grupo controle em branco, grupo de baixa concentração, grupo de concentração média e grupo de alta concentração do extrato aquoso de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii foram 0 μg/mL, 400 μg/mL, 600 μg/mL e 800 μg/mL, respectivamente. - Adicionar 250 μL de tampão RIPA (contendo 1% de PMSF e 1% de inibidor de fosfatase) a cada poço e lisar as células por 30 min. Recolher o lisado para centrifugação (4 °C, 6.714 x g, 10 min) e obter o sobrenadante.
- Mancha ocidental
- Detectar a concentração de proteínas das amostras pelo método BCA de acordo com as instruções do fabricante. Use o tampão RIPA para ajustar a concentração de cada amostra para que seja consistente.
- Misturar 40 μL da amostra de proteína com 10 μL de tampão de carga 5x e ferver durante 5 minutos a 100 °C. Centrifugar (4 °C, 6.714 x g, 10 min) a mistura para obter o sobrenadante para experimentos subsequentes.
- Isolar as proteínas por eletroforese em gel usando eletroforese vertical de 120 V.
- Prepare um "sanduíche" elétrico (esponja - papel filtro - gel - membrana PVDF - papel filtro - esponja). Mergulhe o aparelho de transferência em um banho de gelo e transfira a proteína para membranas de PVDF a 70 V por 60 min.
- Utilizar 100 mL de solução de TBST (Tween-20 a 0,05% [v/v], Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) e 5 g de leite em pó desnatado para configurar o leite a 5%. Pré-diluir os anticorpos AKT e p-AKT com o diluente de anticorpos na proporção de 1:1.000.
- Bloquear a membrana de PVDF em leite em pó desnatado a 5% durante 1 h com agitação. Após o bloqueio, elimine o leite bloqueador e adicione o anticorpo primário diluído para incubação durante a noite a 4 °C.
- Depois de remover o anticorpo primário, use a solução de TBST para lavar a membrana de PVDF cinco vezes por 5 min cada.
- Pré-diluir o anticorpo secundário com o diluente de anticorpos na proporção de 1:5.000. Adicionar o anticorpo secundário e incubar à temperatura ambiente (TR) por 1,5 h. Depois de remover o anticorpo secundário, use a solução de TBST para lavar a membrana de PVDF cinco vezes por 5 min cada.
- Detecte a proteína usando um sistema de detecção por quimioluminescência.
3. Acoplamento molecular
- Abra o banco de dados UniProt (https://www.uniprot.org)28. Digite os símbolos de destino na caixa de pesquisa e clique no botão PESQUISAR . No subtítulo Estrutura , clique em Download para as estruturas 3D dos alvos de proteína.
- Abra o banco de dados RCSB PDB (https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)29. Digite o nome das macromoléculas de proteína na caixa de pesquisa. Faça o download das estruturas das macromoléculas proteicas em formato PDB.
- Faça o download do pacote de instalação dos softwares UCSF Chimera 1.16 (https://vina.scripps.edu/) e AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/). Instale e abra o software UCSF Chimera 1.16. Clique em Arquivo > Abrir para exibir a proteína receptora.
- Clique em Ferramentas > Edição de Estrutura > Dock Prep e marque Excluir solvente, Adicionar hidrogênio e Adicionar cargas no popover para remover água e adicionar hidrogenação e balancear cargas. Clique em Gravar arquivo Mol2 para salvar a proteína do receptor no formato mol2. Execute o mesmo passo no ligante.
- Clique em Arquivo > Abrir para exibir o ligante de formato mol2 no software UCSF Chimera 1.16. Em Ferramentas > Análise de Superfície/Ligação > AutoDock Vina, defina a barra Receptor para o nome da proteína receptora e a barra Ligante para o nome do ligante. Digite um valor na caixa atrás de Centro e Tamanho para ajustar o espaço recém-desenvolvido, tornando possível abranger totalmente o ligante e o receptor.
- Clique em OK para a triagem virtual de acoplamento molecular para obter o local ideal para a ligação do ligante ao receptor. Registre o valor de energia de ligação na posição ideal.
4. Análise estatística
- Abra o software estatístico SPSS 26.0. Clique em Arquivo > Importar Dados para carregamento de dados.
- Apresentar os dados experimentais como média ± desvio padrão.
- Compare vários grupos usando uma ANOVA unidirecional.
LEGENDA: P < 0,05 foi considerado estatisticamente significante neste trabalho.
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Representative Results
Um total de 31 componentes ativos relacionados a Trichosanthes-Fritillaria thunbergii foram identificados, incluindo 21 componentes de Trichosanthes e 10 componentes de Fritillaria thunbergia, bem como 144 alvos correspondentes. No total, 9.049 e 67 genes relacionados ao LUAD foram extraídos do banco de dados GeneCards e do banco de dados OMIM, respectivamente. Após a exclusão de genes duplicados, 9.057 genes relacionados ao LUAD foram identificados. A intersecção dos genes relacionados ao LUAD e alvos relacionados ao componente ativo de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii foi conduzida para a obtenção de potenciais alvos terapêuticos. A rede de interação fármaco-componente-doença-alvo de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contra LUAD é mostrada na Figura 1A. Na rede de interação, os dez principais componentes ativos foram kaempferol, hidroxigenkwanina, genisteína, diosmetina e β-sitosterol, ácido palmitoléico, mandenol, ácido hexadecanóico, ácido carpróico e ácido cáprico, que foram identificados como os principais componentes ativos da ação de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento da LUAD (Figura 1B). A rede PPI incluiu 122 proteínas funcionais e 210 relações de interação, e os resultados da visualização são mostrados na Figura 2A. As dez principais proteínas centrais por grau (parâmetro usado para análise de visualização no software Cytoscape) em ordem decrescente incluíram ESR1, VEGFA, PPARA, CYP3A4, AR, APP, FGF2, CREB1 e CYP1A1, que estão envolvidas principalmente na neovascularização, proliferação celular, apoptose e transporte de membrana celular 30,31,32,33,34,35,36,37,38,39(Figura 2B). Das 20 principais vias classificadas pelo KEGG, a via de sinalização PI3K/AKT40, a via de sinalização Rap1 41, a via de sinalização fosfolipase D42 e a via de sinalizaçãoMAPK1 43 estão intimamente associadas ao câncer de pulmão, dentre as quais a via PI3K/AKT foi a primeira e, portanto, foi utilizada para posterior verificação (Figura 3).
Os experimentos indicaram que extratos de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii em concentrações acima de 400 μg/mL podem inibir a proliferação celular, e o efeito inibitório em células A549 em concentrações de até 800 μg/mL foi próximo à metade da concentração inibitória (IC50) (Figura 4). Assim, 400 μg/mL, 600 μg/mL e 800 μg/mL foram utilizados como doses baixa, média e alta para os experimentos subsequentes. A intervenção dos extratos de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii não causou alteração significativa na expressão da proteína AKT em cada grupo; entretanto, a expressão de p-AKT (Ser473) foi inibida e mostrou efeito dose-dependente (Figura 5). Os componentes-chave de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento com LUAD foram acoplados molecularmente com as proteínas-chave da via PI3K/AKT, e os resultados sugeriram que as energias de ligação de diosmetina e kaempferol com AKT1 foram menores que −7, indicando forte atividade de ligação44 (Figura 6).
Figura 1: Diagrama da rede droga-componente-doença-alvo. (A) O azul representa a doença; amarelo representa a droga; vermelho representa o componente; verde representa o alvo. Abreviações: GL = Trichosanthes; ZBM = Fritillaria thunbergia; LUAD = adenocarcinoma pulmonar. (B) Os dez principais ingredientes ativos da rede ordenados por grau em ordem decrescente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Rede PPI de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento do LUAD. (A) Visualização dos resultados da rede PPI. Quanto mais escuro o nó, mais central é a proteína na rede. (B) Os dez principais alvos da rede por grau. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Enriquecimento da via KEGG de alvos de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contra LUAD. (A) As 20 principais vias de KEGG são classificadas de acordo com os valores de P em ordem crescente. (B) Mapa da via de sinalização PI3K/AKT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeitos de diferentes concentrações do extrato de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii sobre a proliferação celular A549 (n = 3). Extratos de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii em concentrações acima de 400 μg/mL podem inibir a proliferação celular. O efeito inibitório sobre as células A549 em concentrações até 800 μg/mL foi próximo à metade da concentração inibitória (IC50). Abreviação: GL-ZBM = Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Efeitos de diferentes concentrações do extrato de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii sobre a expressão da proteína AKT e níveis de fosforilação (n = 3). Não houve alteração significativa na expressão da proteína AKT em cada grupo, enquanto a expressão proteica da p-AKT (Ser473) nos grupos de dose média e alta foi significativamente down-regulated, e a diferença foi estatisticamente significativa quando comparada com o grupo controle (*P < 0,05 versus grupo controle). Abreviação: GL-ZBM = Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Docking molecular dos componentes relacionados com proteínas core . (A) Mapa térmico da energia de ligação de componentes-chave de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii para tratamento com LUAD acoplado molecularmente com proteínas-chave da via PI3K/AKT. (B) Diagrama de acoplamento molecular das proteínas Diosmetina e AKT1. (C) Diagrama de acoplamento molecular das proteínas kaempferol e AKT1. As linhas rosa representam ligações de hidrogênio, as estruturas cinzas representam composições de fármacos e a estrutura colorida representa AKT1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Geralmente, um estudo completo de farmacologia em rede inclui a identificação de componentes ativos a partir de bancos de dados, a aquisição de alvos correspondentes a componentes ativos e doenças, a construção de uma rede droga-componente-doença-alvo e a previsão de alvos e vias centrais. A associação entre componentes ativos e proteínas centrais (docking molecular) é preliminarmente prevista pela tecnologia computacional, e a verificação final é conduzida por meio de um experimento.
A seleção de bases de dados relevantes é a parte mais crítica da farmacologia de redes, pois determina a qualidade da pesquisa. O banco de dados HERB integra informações de vários bancos de dados TCM, como Syμmap, TCMID, TCMSP e TCM-ID, e é o banco de dados TCM e ingredientes mais abrangente no momento. Portanto, neste estudo, o banco de dados HERB foi utilizado para a triagem dos componentes ativos19.
Neste estudo, 31 componentes ativos e 144 alvos de intersecção de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento da LUAD foram identificados por meio de bancos de dados relacionados. Através da construção de uma rede droga-componente-doença-alvo, exploramos dez componentes ativos chave através da análise topológica. Os alvos centrais de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento de LUAD foram rastreados através da análise de IBP.
Dentre as 20 principais vias dos resultados do KEGG, a via de sinalização PI3K/AKT, a via de sinalização MAPK1, a via de sinalização Rap1 e a via de sinalização PPAR estão intimamente relacionadas aos tumores de acordo com a literatura40,41,42. MAPK1, uma via de sinalização clássica relacionada ao câncer, é um importante regulador do crescimento e diferenciação celular. Quando ativada, essa via de sinalização leva à proliferação celular descontrolada, extensão do ciclo celular, ocorrência e desenvolvimento tumoral45. A via de sinalização Rap1 é um importante regulador da via de sinalização NF-κB e da via de sinalização MAPK1 e está intimamente relacionada à adesão celular no câncer depulmão46. Além disso, foi confirmado que a inibição da via de sinalização Rap1 pode melhorar a metástase tumoral no carcinoma pulmonar47. A via de sinalização PPAR está associada à proliferação celular, homeostase energética, tumorigênese e distúrbios metabólicos48. Estudos têm confirmado sua função em promover angiogênese tumoral e crescimento tumoral49.
A via de sinalização PI3K/AKT afeta principalmente o metabolismo, proliferação, apoptose e vascularização de tumores através da fosforilação e ativação da AKT. Estudos prévios demonstraram que a via de sinalização PI3K/AKT desempenha um papel regulatório na via de sinalização MAPK1, via de sinalização Rap1 e via de sinalização PPAR50,51,52. Além disso, os resultados da predição de KEGG mostraram que a via de sinalização PI3K/AKT foi a mais relacionada com a ação de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contra o LUAD, por isso foi selecionada para posterior verificação experimental.
Os alvos centrais preditos pelo PPI, VEGFA e CREB1 na via de sinalização PI3K/AKT, bem como as proteínas-chave PI3K e AKT1 na via de sinalização PI3K/AKT, foram incluídos para o acoplamento molecular. Em um estudo anterior, uma energia de ligação de encaixe menor que −7 foi considerada significativa44. Os resultados deste estudo sugeriram que a energia de ligação do kaempferol e diosmetina com AKT1 excedeu esse limiar, sugerindo que os efeitos desses dois componentes sobre a AKT podem ser a chave para a ação de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contra o LUAD.
Em verificação experimental posterior, investigamos o efeito do extrato de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii sobre o nível de fosforilação da AKT. Os resultados mostraram que diferentes concentrações do extrato de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii não tiveram efeito significativo sobre a expressão da proteína AKT, mas o extrato de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii pode inibir significativamente a fosforilação da proteína AKT de forma dose-dependente . Estes resultados sugerem que a inibição da via PI3K/AKT é o principal mecanismo de ação de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contra o LUAD.
Em conclusão, através da farmacologia de rede e validação experimental, este estudo verificou que a via de sinalização PI3K/AKT desempenha um papel vital na ação de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii no tratamento da LUAD.
Ainda existem algumas lacunas neste estudo. O estudo incluiu apenas componentes ativos de alta biodisponibilidade, sem discutir a possível biotransformação de moléculas ativas no cólon, células intestinais e fígado, o que não é abrangente o suficiente. Além disso, o efeito de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii sobre a proliferação e a via PI3K/AKT de células de adenocarcinoma pulmonar foi verificado apenas experimentalmente in vitro. Este estudo fornece uma base teórica para o desenvolvimento de novos fármacos e expansão de aplicações clínicas. No futuro, novas validações experimentais desses resultados de predição serão realizadas para apoiar avaliações de potenciais aplicações clínicas.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Programa de Treinamento em Inovação da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (No: 202110026036).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | R001100 | |
| A549 cell line | Procell | CL-0016 | |
| AKT antibody | CST | 4691S | |
| BCA Protein Assay Kit | Solarbio | PC0020 | |
| Chemiluminescence detection system | Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory | ChemiScope 6100 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Solarbio | 11995 | |
| Enhanced chemiluminescence (ECL) kit | ABclonal | RM00021 | |
| Fetal bovine serum | ScienCell | 0025 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | ABclonal | AS014 | |
| MTS assay kit | Promega | G3580 | |
| p-AKT antibody | CST | 6040S | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | C14-15070-063 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Solarbio | P0100 | |
| Phosphatase inhibitor | Beyotime | P1081 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Solarbio | P1020 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010 | |
| RIPA lysis solution | Solarbio | R0010 | |
| Rotary evaporator | Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory | RE52CS-1 | |
| Vacuum freeze-drying mechanism | Ningbo Scientz Biotechnology | SCIENTZ-10 | |
| β-Actin antibody | ABclonal | AC026 |
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