Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Nettverksfarmakologi prediksjon og eksperimentell validering av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii virkningsmekanisme mot lungeadenokarsinom

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64847
Automatic Translation
1, 1, 1, 2
1Dongzhimen Hospital affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, 2Traditional Chinese Medicine Department, Peking University People's Hospital

Summary

Denne studien avslører mekanismen til Trichosanthes-Fritillaria thunbergii i behandling av lungeadenokarsinom basert på nettverksfarmakologi og eksperimentell verifisering. Studien viser også at PI3K / AKT-signalveien spiller en viktig rolle i virkningen av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ved behandling av lungeadenokarsinom.

Abstract

Vi hadde som mål å studere mekanismen til Trichosanthes-Fritillaria thunbergii i behandling av lungeadenokarsinom (LUAD) basert på nettverksfarmakologi og eksperimentell verifisering. De effektive komponentene og potensielle målene for Trichosanthis og Fritillaria thunbergii ble samlet inn av high-throughput experiment og referansestyrt (HERB) database over tradisjonell kinesisk medisin og en likhetsensembletilnærming (SEA) database, og LUAD-relaterte mål ble spurt av GeneCards og Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) databaser. Et stoff-komponent-sykdom-målnettverk ble konstruert av Cytoscape programvare. Protein-protein interaksjon (PPI) nettverk, genontologi (GO) funksjon, og Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analyser ble utført for å oppnå kjernemål og viktige veier. Et vandig ekstrakt av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii og A549 celler ble brukt for den påfølgende eksperimentelle valideringen. Gjennom HERB-databasen og litteratursøket ble 31 effektive forbindelser og 157 potensielle målgener av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii screenet, hvorav 144 var regulatoriske mål for Trichosanthes-Fritillaria thunbergii i behandlingen av lungeadenokarsinom. GO funksjonell anrikningsanalyse viste at virkningsmekanismen til Trichosanthes-Fritillaria thunbergii mot lungeadenokarsinom hovedsakelig er proteinfosforylering. KEGG-veiberikelsesanalysen antydet at behandling av lungeadenokarsinom av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii hovedsakelig involverer PI3K / AKT-signalveien. Den eksperimentelle valideringen viste at et vandig ekstrakt av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii kunne hemme spredning av A549-celler og fosforylering av AKT. Gjennom nettverksfarmakologi og eksperimentell validering ble det verifisert at PI3K / AKT-signalveien spiller en viktig rolle i virkningen av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii i behandling av lungeadenokarsinom.

Introduction

Lungekreft refererer til ondartede svulster som stammer fra lungebronkialslimhinnen, inkludert plateepitelkarsinom, adenokarsinom, storcellet karsinom og småcellet karsinom1. Lungeadenokarsinom (LUAD) er den vanligste typen lungekreft, og står for ca 40% av de totale lungekrefttilfellene2. De fleste pasienter diagnostiseres på et avansert stadium eller har fjernmetastase og mister dermed muligheten for kirurgi3. I dagens kliniske behandling er samtidig kjemoradioterapi den vanligste strategien for behandling av LUAD, men anvendelsen er begrenset på grunn av alvorlige bivirkninger4.

Tradisjonell kinesisk medisin (TCM) kan effektivt lindre de kliniske symptomene til LUAD-pasienter og redusere bivirkningene forårsaket av strålebehandling og kjemoterapi og har dermed blitt et forskningspunkt 5,6,7. I tradisjonell kinesisk medisin tilhører lungekreft kategorien "lungeakkumulering" og "lungepetrous". Mangelen på Qi og samspillet mellom slim, stasis og gift er viktig i patogenesen av lungekreft. Derfor er tonifisering av Qi og eliminering av slim og blodstasis den viktigste kliniske behandlingen8 metoder for lungekreft i henhold til TCM teori9. Trichosanthes kirilowii Maxim (Gualou) og Fritillaria thunbergii Miq (Zhebeimu) representerer et vanlig stoffpar ved behandling av lungekreft, og denne kombinasjonen har effekten av å rydde varme og redusere slim10,11,12. Imidlertid er virkningsmekanismen fortsatt uklar, og videre forskning må gjennomføres.

Nettverksfarmakologi er en omfattende metode basert på teorien om systembiologi og multidireksjonell farmakologi som tar sikte på å avdekke komplekse nettverksforhold mellom flere legemidler og sykdommer13. Tradisjonelle kinesiske resepter har egenskapene til å være multikomponent og multi-mål, noe som betyr at de er svært egnet for studiet av nettverksfarmakologi14,15. Nylig har nettverksfarmakologi dukket opp som en kraftig tilnærming i studiet av TCM-formler og har blitt et forskningspunkt16,17.

Men så vidt vi vet, presenteres all forskning på nettverksfarmakologi som tekst. Å presentere denne teknologien gjennom video vil redusere læringsterskelen sterkt og lette markedsføringen av denne teknologien, noe som er en av fordelene med denne artikkelen. I denne studien tok vi Trichosanthes-Fritillaria thunbergii mot lungeadenokarsinom som et eksempel for å utføre nettverksfarmakologiprediksjon og eksperimentell validering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle nettverksfarmakologiske prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjene for evalueringsmetoder for nettverksfarmakologi18. Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med laboratoriestyringsforskriftene ved Beijing University of Chinese Medicine.

1. Nettverksfarmakologisk prediksjon

  1. Utvalg av aktive komponenter
    1. Åpne HERB-databasen (http://herb.ac.cn)19, og bruk "Gualou" (det kinesiske navnet for Trichosanthes kirilowii Maxim) og "Zhebeimu" (det kinesiske navnet for Bulbus Fritillariae thunbergii) som nøkkelord for å få komponentene i de to legemidlene. Last ned listen og de kanoniske smilestrukturene til de relaterte komponentene i de to stoffene.
    2. Bestem om den oppnådde komponenten er den aktive komponenten.
      1. Inkluder som aktive komponenter de som har oral biotilgjengelighet (OB) og narkotikalignende (DL) verdier i HERB-gruppedatabasen (dvs. komponenter med OB ≥ 30% og DL ≥ 0,18) 20,21.
      2. Hvis komponenten ikke har noen OB- og DL-verdier, skriver du inn komponenten i den sveitsiske ADME-databasen (http://www.swissadme.ch/index.php)22 for å hente informasjonen om hver komponent. Inkluder komponenter med "høy" GI-absorpsjon og minst to "Ja" DL-verdier som aktive komponenter.
  2. Målprediksjon av de aktive komponentene
    1. Åpne HERB-databasen (http://herb.ac.cn). Søk og kopier de kanoniske SMILS-strukturene til de aktive komponentene.
    2. Åpne databasen SEA (Similarity ensemble approach, http://sea.bkslab.org)23. Lim inn de kanoniske SMIL-strukturene til de aktive komponentene i søkeboksen, og klikk på Prøv SEA for å få målnøkkelen, målnavnet, P-verdien og MaxTC for hver aktive komponent.
    3. Kopier dataene til et regneark, og bruk filtreringsfunksjonen til regnearkfilen til å filtrere målene for de aktive komponentene etter måltast (Human, P < 0,05 og MaxTC > 0,5).
    4. Kopier alle målene til et regneark, og fjern duplikatene for å få narkotikamålene.
  3. Prediksjon av sykdomsmål
    1. Åpne GeneCards-databasen (https://www.genecards.org)24 og Online Mendelian Inheritance in Man-databasen (OMIM, https://www.omim.org)25 og bruk lungeadenokarsinom som nøkkelord for å oppnå sykdomsmålene for lungeadenokarsinom .
    2. Last ned regnearkene over sykdomsmålene. Slett de gjentatte målene for å hente LUAD-målene.
  4. Bygging av et nettverk av målnettverk for narkotika-komponent-sykdom
    1. Kopier LUAD-relaterte mål og narkotikamål i samme kolonne i et nytt regneark. Bruk funksjonen Data - Identifiser duplikater på verktøylinjen for å hente skjæringsmål for de LUAD-relaterte målene og de aktive komponentrelaterte målene Trichosanthes-Fritillaria thunbergii .
    2. Åpne Cytoscape 3.8.0. Klikk på Fil i menylinjen, og velg deretter Importer > Nettverk fra fil for å importere regnearkfilen. Optimaliser størrelsen og fargen på nettverksnodene gjennom stillinjen i venstre kontrollpanel.
    3. Bruk funksjonen Analyser nettverk for nettverkstopologianalysen. Klikk på Verktøy i menylinjen, og velg deretter Analyser nettverk. I Tabell-panelet klikker du på Grad i tittellinjen for å ordne komponentene etter grad i synkende rekkefølge. Ta de ti øverste komponentene og målene som de viktigste aktive komponentene og kjernemålene.
  5. Oppbygging av PPI-nettverket og screening av kjerneproteinene
    1. Åpne STRING-databasen (https://cn.string-db.org/)26. Lim inn tekstformatlisten over potensielle mål for Trichosanthes-Fritillaria thunbergii mot LUAD i dialogboksen Liste over navn . Velg Homo sapiens i Organismer, og klikk på SØK > FORTSETT-knappene .
    2. Når resultatene er tilgjengelige, klikker du på Innstillinger og merker av for Høy konfidensialitet (0,700) i Grunnleggende innstillinger > Minste nødvendige interaksjonspoengsum. Merk av for Skjul frakoblede noder i nettverket i Avanserte innstillinger, og klikk deretter på UPDATE-knappen .
    3. Klikk på Eksporter i tittellinjen, og last ned den korte tabellteksten til PPI-forholdet i TSV-format.
    4. Åpne Cytoscape 3.8.0. Klikk på Fil > Importer > Nettverk fra fil for å importere TSV-formatfilen for visuell analyse.
    5. Bruk funksjonen Network Analyzer til å utføre den topologiske analysen. Optimaliser størrelsen og fargen på nettverksnodene gjennom stillinjen i venstre kontrollpanel.
  6. KEGG berikelse analyse
    1. Åpne Metascape (https://metascape.org/)27-plattformen. Lim inn tekstformatlisten over potensielle terapeutiske mål i dialogboksen, og klikk deretter på Send-knappen. Merk av for H. sapiens i både Input as Species og Analysis as Species, og klikk deretter på Custom Analysis-knappen. Velg Berikelse, merk bare av for KEGG-banen, og klikk deretter på Berikelsesanalyse. Etter at fremdriftslinjen når 100%, klikker du på den oransje knappen Analyserapportside for berikelsesresultatene.
    2. Klikk på Alt i ett zip-fil for nedlasting av anrikningsresultatet, og åpne deretter _ FINAL_GO.csv filen i Enrichment_GO-mappen for å få resultatet.
    3. Åpne R-programvare (https://cran.r-project.org/). Skriv install.package (" ggplot2") og bibliotek (ggplot2) i R for installasjon av ggplot2 R-pakken. Trykk Enter for å kjøre KEGG-visualiseringsprogrammet.

2. Eksperimentell verifisering

  1. Narkotika forberedelse
    MERK: Fritillaria thunbergii Miq og Trichosanthes kirilowii Maxim ble kjøpt fra Dongzhimen Hospital, tilknyttet Beijing University of Chinese Medicine.
    1. Bland 50 g Fritillaria thunbergii Miq og 50 g Trichosanthes kirilowii Maxim sammen. Bløtlegg blandingen i 1 liter destillert vann i 20 minutter, og kok deretter blandingen ved 100 °C under normalt trykk i 1 time.
    2. Filtrer avkoket for å oppnå et filtrat med et dobbeltlag sterilt medisinsk gasbind, og bruk deretter 80 μm filterpapir for å filtrere ekstraktet ytterligere. Gjenta operasjonen ovenfor tre ganger.
    3. Bland filtratet sammen for å oppnå et avkok på ca. 1,2 l. Plasser løsningen i kolben til en roterende fordamper. Sett rotasjonshastigheten til 50 o / min med en temperatur på 37 ° C. Bland og kondenser avkokene til et ekstrakt i den roterende fordamperen i 6 timer for å gi en tyktflytende væske.
    4. Slå på vakuumfrysetørkingsmekanismen for å forkjøle temperaturen til -40 °C. Sett det oppnådde ekstraktet i materialskuffen, og legg det i kaldfellen for frysing.
    5. Når kuldefelletemperaturen når -50 °C og materialet har vært frosset i 2 timer, overfører du de frosne materialene til et tørkestativ som er plassert i kuldefellen. Slå på vakuumpumpen for å starte lyofiliseringsprosessen. Ta ut det frysetørkede pulveret, og oppbevar det i kjøleskapet ved -20 °C for senere bruk.
  2. Celledyrking
    1. Konfigurer DMEM komplett medium med 89% DMEM basisk medium, 10% føtal bovint serum og 1% penicillin-streptomycin.
    2. Etter at A549-cellene er fjernet fra flytende nitrogen, inkuberer du cellene i et vannbad på 37 °C og rører til mediet i hetteglasset smelter.
    3. Legg til et firefold volum DMEM komplett medium inn i de smeltede cellene. Sentrifuger cellene (4 °C, 679 x g, 5 min), og kast supernatanten.
    4. Resuspender de utfelte cellene med 6 ml DMEM komplett medium, plate dem i en T25-kulturkolbe og inkuber kolben i en celleinkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
  3. Påvisning av celle levedyktighet
    1. Fordøy de logaritmiske vekstfase A549-cellene med 1 ml 0,25% trypsin i 1 minutt ved 37 °C. Tilsett 1 ml DMEM komplett medium for å nøytralisere trypsinet, og forsiktig blåse det for å fremme celleutskillelse. Sentrifuger blandingen for å oppnå cellepelleten (4 °C, 192 x g, 5 min). Resuspender de oppnådde cellene ved hjelp av DMEM komplett medium.
    2. Legg cellesuspensjonen til et hemocytometer, og telle ved hjelp av en automatisert celleteller. Fortynn den til 5 x 104 celler/ml ved bruk av DMEM komplett medium.
    3. Løs opp 1 g Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vannekstrakt i 10 ml PBS-løsning, og filtrersteriliser det gjennom et 0,22 μm filter. Fortynn blandingen til 90 mg/ml, 80 mg/ml, 70 mg/ml, 60 mg/ml, 50 mg/ml, 40 mg/ml, 30 mg/ml, 20 mg/ml og 10 mg/ml ved bruk av PBS.
    4. Plate de fortynnede cellene på 96-brønnplater med 100 μL per brønn. Etter celleadherens, tilsett 1 μL Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vannekstrakter av forskjellige konsentrasjoner for å justere konsentrasjonen av hver brønn til 900 μg / ml, 800 μg / ml, 700 μg / ml, 600 μg / ml, 500 μg / ml, 400 μg / ml, 300 μg / ml, 200 μg / ml og 100 μg / ml.
    5. Kast det opprinnelige mediet etter 24 timers kultur, og tilsett 100 μL DMEM basisk medium for videre inkubasjon i 2 timer ved 37 °C, 5% CO2.
    6. Etter ovennevnte behandling, tilsett 20 μL MTS-oppløsning (materialfortegnelse), og inkuber cellene i ytterligere 1 time ved 37 ° C, 5% CO2.
    7. Overfør den inkuberte blandingen til en annen plate. Mål absorbansen (OD) ved en bølgelengde på 490 nm ved hjelp av en mikroplateleser. Beregn cellens levedyktighet ved hjelp av følgende formel:
      Levedyktighet (%) = 100 × (OD av den behandlede prøven − OD av mediet)/(OD av kontrollprøven − OD av mediet).
      MERK: En minimumskonsentrasjon nær IC50 er definert som en høy dose. Konsentrasjonen der celleproliferasjonen begynner å hemmes er definert som en lavdosekonsentrasjon, og mellomverdien er definert som en middels dosekonsentrasjon for senere eksperimentelle studier. I denne studien ble 400 μg/ml, 600 μg/ml og 800 μg/ml brukt som lave, middels og høye doser.
  4. Legemiddelintervensjon og prøvetaking
    MERK: Cellevekst ble plottet mot tiden for å bestemme loggfasen.
    1. Fortynn de logaritmiske vekstfase A549-cellene til 5 x 105 celler/ml. Tilsett 2 ml av cellesuspensjonen til en 6-brønnsplate, og vokse i 12 timer.
    2. Gjenta trinn 2.3.3 for å oppnå 80 mg/ml, 60 mg/ml og 40 mg/ml PBS fortynning av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vannekstrakt. Tilsett 20 μL av PBS-oppløsningen, 20 μL av 40 mg/ml Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vannekstrakt, 20 μL av 60 mg/ml Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vannekstrakt, og 20 μL av 80 mg/ml Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vannekstrakt til den tomme kontrollgruppen, lavkonsentrasjonsgruppen, middels konsentrasjonsgruppe og høy konsentrasjonsgruppe, henholdsvis. Kast supernatanten etter 24 timers intervensjon, og rengjør cellene med PBS tre ganger.
      MERK: Konsentrasjonene av den tomme kontrollgruppen, lavkonsentrasjonsgruppen, middels konsentrasjonsgruppen og høykonsentrasjonsgruppen av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii vannekstrakt var henholdsvis 0 μg / ml, 400 μg / ml, 600 μg / ml og 800 μg / ml.
    3. Tilsett 250 μL RIPA-buffer (inneholdende 1% PMSF og 1% fosfatasehemmer) til hver brønn, og lyse cellene i 30 minutter. Samle lysatet for sentrifugering (4 °C, 6 714 x g, 10 min), og oppnå supernatanten.
  5. Vestlig blotting
    1. Oppdag proteinkonsentrasjonen av prøvene ved hjelp av BCA-metoden i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk RIPA-buffer til å justere konsentrasjonen av hver prøve slik at den er konsistent.
    2. Bland 40 μL av proteinprøven med 10 μL 5x lastebuffer, og kok i 5 minutter ved 100 °C. Sentrifuge (4 °C, 6 714 x g, 10 min) blandingen for å oppnå supernatanten for påfølgende eksperimenter.
    3. Isoler proteinene ved gelelektroforese ved bruk av 120 V vertikal elektroforese.
    4. Forbered en elektrisk "sandwich" (svamp - filterpapir - gel - PVDF membran - filterpapir - svamp). Bløtlegg overføringsapparatet i et isbad, og overfør proteinet til PVDF-membraner ved 70 V i 60 minutter.
    5. Bruk 100 ml TBST-oppløsning (0,05 % [v/v] mellom 20, 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) og 5 g skummetmelkpulver for å konfigurere 5 % melk. Forfortynn AKT- og p-AKT-antistoffene med antistofffortynningsmiddelet i forholdet 1:1 000.
    6. Blokker PVDF-membranen i 5% skummetmelkpulver i 1 time med risting. Etter blokkering kastes den blokkerende melken og tilsettes det fortynnede primære antistoffet for inkubasjon over natten ved 4 °C.
    7. Etter å ha fjernet det primære antistoffet, bruk TBST-løsningen til å vaske PVDF-membranen fem ganger i 5 minutter hver.
    8. Forfortynn det sekundære antistoffet med antistofffortynningsmiddelet i forholdet 1:5 000. Tilsett det sekundære antistoffet, og inkuber ved romtemperatur (RT) i 1,5 time. Etter å ha fjernet det sekundære antistoffet, bruk TBST-løsningen til å vaske PVDF-membranen fem ganger i 5 minutter hver.
    9. Oppdag proteinet ved hjelp av et kjemiluminescensdeteksjonssystem.

3. Molekylær dokking

  1. Åpne UniProt-databasen (https://www.uniprot.org)28. Skriv inn målsymbolene i søkeboksen, og klikk på SØK-knappen . I underoverskriften Struktur klikker du på Last ned for 3D-strukturene til proteinmålene.
  2. Åpne RCSB PDB-databasen (https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)29. Skriv inn navnet på proteinmakromolekylene i søkeboksen. Last ned proteinmakromolekylstrukturene i PDB-format.
  3. Last ned installasjonspakken til UCSF Chimera 1.16-programvaren (https://vina.scripps.edu/) og AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/). Installer og åpne UCSF Chimera 1.16-programvaren. Klikk på Fil > Åpne for å vise reseptorproteinet.
  4. Klikk på Verktøy > strukturredigering > Dock Prep, og merk av for Slett løsningsmiddel, tilsett hydrogener og legg til ladninger i popoveren for å fjerne vann og legge til hydrogenerings- og balanseladninger. Klikk på Skriv Mol2-fil for å lagre reseptorproteinet i smeltet 2-format. Utfør det samme trinnet på liganden.
  5. Klikk på File > Open for å vise liganden i smeltet 2-format i UCSF Chimera 1.16-programvaren. I Verktøy > overflate-/bindingsanalyse > AutoDock Vina setter du reseptorlinjen til navnet på reseptorproteinet og Ligand-linjen til navnet på liganden. Skriv inn en verdi i boksen bak Senter og størrelse for å justere det nyutviklede rommet, noe som gjør det mulig å omfatte liganden og reseptoren fullt ut.
  6. Klikk på OK for molekylær docking virtuell screening for å oppnå optimal plassering for ligandbinding til reseptoren. Registrer bindingsenergiværdien i optimal posisjon.

4. Statistisk analyse

  1. Åpne SPSS 26.0 statistisk programvare. Klikk på Fil > Importer data for datainnlasting.
  2. Presentere eksperimentelle data som gjennomsnitt ± standardavvik.
  3. Sammenlign flere grupper ved hjelp av en enveis ANOVA.
    MERK: P < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant i dette arbeidet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Totalt 31 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-relaterte aktive komponenter ble identifisert, inkludert 21 Trichosanthes og 10 Fritillaria thunbergia komponenter , samt 144 tilsvarende mål. Totalt ble 9049 og 67 LUAD-relaterte gener hentet fra henholdsvis GeneCards-databasen og OMIM-databasen. Etter å ha slettet dupliserte gener ble 9057 gener relatert til LUAD identifisert. Skjæringspunktet mellom LUAD-relaterte gener og Trichosanthes-Fritillaria thunbergii aktive komponentrelaterte mål ble utført for å oppnå potensielle terapeutiske mål. Legemiddelkomponent-sykdom-mål-interaksjonsnettverket av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii mot LUAD er vist i figur 1A. I interaksjonsnettverket var de ti viktigste aktive komponentene kaempferol, hydroxygenkwanin, genistein, diosmetin og β-sitosterol, palmitolsyre, mandenol, heksadekansyre, karproinsyre og kaprinsyre, som ble identifisert som de viktigste aktive komponentene i virkningen av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ved behandling av LUAD (figur 1B). PPI-nettverket inkluderte 122 funksjonelle proteiner og 210 interaksjonsrelasjoner, og visualiseringsresultatene er vist i figur 2A. De ti beste kjerneproteinene etter grad (parameter brukt til visualiseringsanalyse i Cytoscape-programvare) i synkende rekkefølge inkluderte ESR1, VEGFA, PPARA, CYP3A4, AR, APP, FGF2, CREB1 og CYP1A1, som hovedsakelig er involvert i neovaskularisering, celleproliferasjon, apoptose og cellemembrantransport 30,31,32,33,34,35,36,37,38,39(figur 2B). Av de 20 beste veiene rangert av KEGG, er PI3K / AKT-signalveien 40, Rap1-signalveien 41, fosfolipase D-signalvei42 og MAPK1-signalvei43 nært forbundet med lungekreft, blant annet PI3K / AKT-banen rangerte den første og dermed ble brukt til etterfølgende verifisering (figur 3).

Forsøkene indikerte at Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-ekstrakter i konsentrasjoner over 400 μg/ml kunne hemme celleproliferasjon, og inhiberingseffekten på A549-celler ved konsentrasjoner opp til 800 μg/ml var nær den halvhemmende konsentrasjonen (IC50) (figur 4). Dermed ble 400 μg / ml, 600 μg / ml og 800 μg / ml brukt som lave, middels og høye doser for de påfølgende forsøkene. Intervensjonen av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-ekstrakter forårsaket ingen signifikant endring i AKT-proteinuttrykk i hver gruppe; Uttrykket av p-AKT (Ser473) var imidlertid hemmet og viste doseavhengig effekt (figur 5). Nøkkelkomponentene i Trichosanthes-Fritillaria thunbergii i LUAD-behandling var molekylært forankret med nøkkelproteinene i PI3K / AKT-banen, og resultatene antydet at bindingsenergiene til diosmetin og kaempferol med AKT1 var mindre enn -7, noe som indikerer sterk bindingsaktivitet44 (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Diagram over målnettverket for legemiddelkomponent-sykdom. (A) Blå representerer sykdommen; gul representerer stoffet; rød representerer komponenten; Grønt representerer målet. Forkortelser: GL = Trichosanthes; ZBM = Fritillaria thunbergia; LUAD = lungeadenokarsinom. (B) Topp ti aktive ingredienser i nettverket sortert etter grad i synkende rekkefølge. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: PPI-nettverk av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii i behandling av LUAD. (A) Visualiseringsresultater av PPI-nettverket. Jo mørkere noden er, desto mer sentralt er proteinet i nettverket. (B) Topp ti mål i nettverket etter grad. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: KEGG-anrikning av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii mål mot LUAD. (A) De 20 beste KEGG-banene rangeres i henhold til P-verdiene i stigende rekkefølge. (B) Kart over signalveien PI3K/AKT. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Effekter av ulike konsentrasjoner av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ekstrakt på A549 celleproliferasjon (n = 3). Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-ekstrakter i konsentrasjoner over 400 μg / ml kan hemme celleproliferasjon. Inhiberingseffekten på A549-celler ved konsentrasjoner opp til 800 μg/ml var nær den halvhemmende konsentrasjonen (IC50). Forkortelse: GL-ZBM = Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Effekter av ulike konsentrasjoner av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-ekstrakt på AKT-proteinuttrykk og fosforyleringsnivå (n = 3). Det var ingen signifikant endring i AKT-proteinuttrykk i hver gruppe, mens proteinuttrykket av p-AKT (Ser473) i gruppene med medium og høy dose var signifikant nedregulert, og forskjellen var statistisk signifikant sammenlignet med kontrollgruppen (*P < 0,05 versus kontrollgruppen). Forkortelse: GL-ZBM = Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Molekylær dokking av de relaterte komponentene med kjerneproteiner . (A) Varmekart over bindingsenergien til nøkkelkomponenter i Trichosanthes-Fritillaria thunbergii for LUAD-behandling molekylært forankret med nøkkelproteiner i PI3K / AKT-banen. (B) Molekylært dokkingdiagram av Diosmetin og AKT1 proteiner. (C) Molekylært dokkingdiagram av kaempferol og AKT1 proteiner. De rosa linjene representerer hydrogenbindinger, de grå strukturer representerer stoffsammensetninger, og den fargede strukturen representerer AKT1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Generelt omfatter en komplett nettverksfarmakologistudie identifisering av aktive komponenter fra databaser, oppkjøp av mål som svarer til aktive komponenter og sykdommer, bygging av et legemiddelkomponent-sykdomsmålnettverk og prediksjon av kjernemål og veier. Sammenhengen mellom aktive komponenter og kjerneproteiner (molekylær docking) forutsies foreløpig av datateknologi, og den endelige verifiseringen utføres ved hjelp av et eksperiment.

Utvalget av relevante databaser er den mest kritiske delen av nettverksfarmakologi, da dette bestemmer kvaliteten på forskningen. HERB-databasen integrerer informasjon fra flere TCM-databaser, som Syμmap, TCMID, TCMSP og TCM-ID, og er den mest omfattende TCM og ingrediensdatabasen for tiden. I denne studien ble derfor HERB-databasen brukt til screening av de aktive komponentene19.

I denne studien ble 31 aktive komponenter og 144 skjæringsmål for Trichosanthes-Fritillaria thunbergii i behandling av LUAD identifisert gjennom relaterte databaser. Ved å konstruere et målnettverk for narkotika-komponent-sykdom, utforsket vi ti viktige aktive komponenter gjennom topologisk analyse. Kjernemålene for Trichosanthes-Fritillaria thunbergii i behandlingen av LUAD ble screenet ut gjennom PPI-analyse.

Blant de 20 beste veiene fra KEGG-resultatene er PI3K / AKT-signalveien, MAPK1-signalveien, Rap1-signalveien og PPAR-signalveien nært knyttet til svulster i henhold til litteraturen40,41,42. MAPK1, en klassisk kreftrelatert signalvei, er en viktig regulator for cellevekst og differensiering. Når den aktiveres, fører denne signalveien til ukontrollert celleproliferasjon, cellesyklusforlengelse og tumorforekomst og utvikling45. Rap1-signalveien er en viktig regulator for NF-κB-signalveien og MAPK1-signalveien og er nært knyttet til celleadhesjon i lungekreft46. I tillegg har det blitt bekreftet at inhibering av Rap1-signalveien kan forbedre tumormetastase i lungekarsinom47. PPAR-signalveien er assosiert med celleproliferasjon, energihomeostase, tumorigenese og metabolske forstyrrelser48. Studier har bekreftet sin funksjon i å fremme tumorangiogenese og tumorvekst49.

PI3K / AKT-signalveien påvirker hovedsakelig metabolisme, proliferasjon, apoptose og vaskularisering av svulster gjennom fosforylering og aktivering av AKT. Tidligere studier har vist at PI3K / AKT-signalveien spiller en regulatorisk rolle i MAPK1-signalveien, Rap1-signalveien og PPAR-signalveien50,51,52. Videre viste KEGG-prediksjonsresultatene at PI3K / AKT-signalveien var nærmest relatert til virkningen av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii mot LUAD, så den ble valgt for påfølgende eksperimentell verifisering.

De PPI-predikerte kjernemålene, VEGFA og CREB1 i PI3K/AKT-signalveien, samt nøkkelproteinene PI3K og AKT1 i PI3K/AKT-signalveien, ble inkludert for molekylær dokking. I en tidligere studie ble en dokkingbindingsenergi mindre enn -7 ansett som signifikant44. Resultatene av denne studien antydet at bindingsenergien til kaempferol og diosmetin med AKT1 overskred denne terskelen, noe som tyder på at effekten av disse to komponentene på AKT kan være nøkkelen til virkningen av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii mot LUAD.

I videre eksperimentell verifikasjon undersøkte vi effekten av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-ekstrakt på fosforyleringsnivået av AKT. Resultatene viste at forskjellige konsentrasjoner av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-ekstrakt ikke hadde noen signifikant effekt på ekspresjonen av AKT-proteinet, men Trichosanthes-Fritillaria thunbergii-ekstrakt kunne signifikant hemme fosforyleringen av AKT-protein på en doseavhengig måte. Disse resultatene antyder at inhiberingen av PI3K / AKT-banen er den viktigste virkningsmekanismen til Trichosanthes-Fritillaria thunbergii mot LUAD.

For å konkludere, gjennom nettverksfarmakologi og eksperimentell validering, har denne studien bekreftet at PI3K / AKT-signalveien spiller en viktig rolle i virkningen av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii i behandlingen av LUAD.

Det er fortsatt noen mangler i denne studien. Studien inkluderte bare aktive komponenter med høy biotilgjengelighet uten å diskutere mulig biotransformasjon av aktive molekyler i tykktarmen, tarmceller og lever, noe som ikke er omfattende nok. I tillegg ble effekten av Trichosanthes-Fritillaria thunbergii på proliferasjon og PI3K/AKT-veien til lungeadenokarsinomceller kun eksperimentelt verifisert in vitro. Denne studien gir et teoretisk grunnlag for å utvikle nye legemidler og utvide kliniske applikasjoner. I fremtiden vil ytterligere eksperimentelle valideringer av disse prediksjonsresultatene bli utført for å støtte vurderinger av potensielle kliniske applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av innovasjonsopplæringsprogrammet ved Beijing University of Chinese Medicine (nr: 202110026036).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco R001100
A549 cell line Procell CL-0016
AKT antibody CST 4691S
BCA Protein Assay Kit Solarbio PC0020
Chemiluminescence detection system Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory ChemiScope 6100
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Solarbio 11995
Enhanced chemiluminescence (ECL) kit  ABclonal RM00021
Fetal bovine serum ScienCell 0025
HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) ABclonal AS014
MTS assay kit Promega G3580
p-AKT antibody CST 6040S
Penicillin streptomycin Gibco C14-15070-063
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Solarbio P0100
Phosphatase inhibitor Beyotime P1081
Phosphate buffered saline (PBS) Solarbio P1020
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes Millipore ISEQ00010
RIPA lysis solution Solarbio R0010
Rotary evaporator Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory RE52CS-1
Vacuum freeze-drying mechanism Ningbo Scientz Biotechnology SCIENTZ-10
β-Actin antibody ABclonal AC026

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thai, A. A., Solomon, B. J., Sequist, L. V., Gainor, J. F., Heist, R. S. Lung cancer. The Lancet. 398 (10299), 535-554 (2021).
  2. Sinha, A., et al. Early-stage lung adenocarcinoma MDM2 genomic amplification predicts clinical outcome and response to targeted therapy. Cancers. 14 (3), 708 (2022).
  3. Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. The New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
  4. Hirsch, F. R., et al. Lung cancer: Current therapies and new targeted treatments. The Lancet. 389 (10066), 299-311 (2017).
  5. Liu, J., et al. Comprehensive treatment with Chinese medicine in patients with advanced non-small cell lung cancer: A multicenter, prospective, cohort study. Chinese Journal of Integrative Medicine. 23 (10), 733-739 (2016).
  6. Xiao, Z. W., et al. Comprehensive TCM treatments combined with chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer: A randomized, controlled trial. Medicine. 100 (18), 25690 (2021).
  7. Li, Y., et al. Effectiveness of traditional Chinese medicine on chemoradiotherapy induced leukaemia in patients with lung cancer: A meta-analysis. Journal of Traditional Chinese Medicine. 38 (5), 661-667 (2018).
  8. Yuan, F., et al. Therapeutic effect and apoptosis mechanism of lung-tonifying and expectorant decoction on lung cancer rats with Qi deficiency and blood stasis. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 8 (11), 983-988 (2015).
  9. Zhang, Y. L., Liang, Y. E., He, C. W. Anticancer activities and mechanisms of heat-clearing and detoxicating traditional Chinese herbal medicine. Chinese Medicine. 12, 20 (2017).
  10. Wang, T. B., et al. Exploring the rules of application of RONG Yuan-ming in the treatment of non-small cell lung cancer. Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 25 (14), 22-25 (2019).
  11. Chen, T. T., Wang, Y., Tian, T. Medication regularity and mechanism of traditional Chinese medicine in treating lung cancer. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 24 (11), 206-210 (2018).
  12. Shen, C. J. Analysis of the rule of Chinese medicine in treating lung cancer. Journal of Shandong University of Traditional Chinese Medicine. 35 (2), 127-129 (2011).
  13. Yang, X. Y., et al. Evidence-based complementary and alternative medicine bioinformatics approach through network pharmacology and molecular docking to determine the molecular mechanisms of Erjing pill in Alzheimer's disease. Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (5), 1252 (2021).
  14. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design Development and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
  15. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong recipe in the treatment of osteoarthritis. Computational and Mathematical Methods in Medicine. 2022, 7858925 (2022).
  16. Xie, G. G., et al. A network pharmacology analysis to explore the effect of Astragali Radix-Radix Angelica Sinensis on traumatic brain injury. BioMed Research International. 2018, 3951783 (2018).
  17. Chen, G. Y., et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5233462 (2021).
  18. World Federation of Chinese Medicine Societies. Network pharmacology evaluation methodology guidance. World Chinese Medicine. 16 (4), 527-532 (2021).
  19. Fang, S. S., et al. A high-throughput experiment- and reference-guided database of traditional Chinese medicine. Nucleic Acids Research. 49, 1197-1206 (2021).
  20. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2022, 1826299 (2022).
  21. Yu, J. H., et al. ZiYinHuaTan recipe inhibits cell proliferation and promotes apoptosis in gastric cancer by suppressing PI3K/AKT pathway. BioMed Research International. 2020, 2018162 (2020).
  22. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Scientific Reports. 7, 42717 (2017).
  23. Keiser, M. J., et al. Relating protein pharmacology by ligand chemistry. Nature Biotechnology. 25 (2), 197-206 (2007).
  24. Safran, M., et al. GeneCards Version 3: The human gene integrator. Database. 2010, (2010).
  25. Amberger, J. S., Hamosh, A. Searching Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): A knowledgebase of human genes and genetic phenotypes. Current Protocols in Bioinformatics. 58, 1-12 (2017).
  26. Mering, C. V., et al. STRING: Known and predicted protein-protein associations, integrated and transferred across organisms. Nucleic Acids Research. 33, 433-437 (2005).
  27. Zhou, Y. Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10, 1523 (2019).
  28. Pundir, S., et al. UniProt protein knowledgebase. Methods in Molecular Biology. 1558, 41-55 (2017).
  29. Burley, S. K., et al. Protein data bank (PDB): The single global macromolecular structure archive. Methods in Molecular Biology. 1607, 627-641 (2017).
  30. Welsh, L. C., Welsh, M. VEGFA and tumour angiogenesis. Journal of Internal Medicine. 273 (2), 114-127 (2013).
  31. Hsu, L. H., Chu, N. M., Kao, S. H. Estrogen, estrogen receptor and lung cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1713 (2017).
  32. Atmaca, A., et al. SNAI2/SLUG and estrogen receptor mRNA expression are inversely correlated and prognostic of patient outcome in metastatic non-small cell lung cancer. BMC Cancer. 15, 300 (2015).
  33. Lakshmi, S. P., Reddy, A. T., Banno, A., Reddy, R. C. PPAR agonists for the prevention and treatment of lung cancer. PPAR Research. 2017, 8252796 (2017).
  34. Oguro, A., Sakamoto, K., Funae, Y., Imaoka, S. Overexpression of CYP3A4, but not of CYP2D6, promotes hypoxic response and cell growth of Hep3B cells. Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 26 (4), 407-415 (2011).
  35. Jamroze, A., Chatta, G., Tang, D. G. Androgen receptor (AR) heterogeneity in prostate cancer and therapy resistance. Cancer Letters. 518, 1-9 (2021).
  36. Wu, Y. I., et al. Regulation of global gene expression and cell proliferation by APP. Scientific Reports. 6, 22460 (2016).
  37. Sedlář, A., et al. Growth factors VEGF-A 165 and FGF-2 as multifunctional biomolecules governing cell adhesion and proliferation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1843 (2021).
  38. Guo, L. H., Yin, M., Wang, Y. X. CREB1, a direct target of miR-122, promotes cell proliferation and invasion in bladder cancer. Oncology Letters. 16 (3), 3842-3848 (2018).
  39. Wang, D. D., et al. Induction of CYP1A1 increases gefitinib-induced oxidative stress and apoptosis in A549 cells. Toxicology In Vitro. 44, 36-43 (2017).
  40. Tan, A. C. Targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway in non-small cell lung cancer (NSCLC). Thoracic Cancer. 11 (3), 511-518 (2020).
  41. Jin, X., et al. RBM10 inhibits cell proliferation of lung adenocarcinoma via RAP1/AKT/CREB signalling pathway. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 3897-3904 (2019).
  42. Henkels, K. M., et al. Phospholipase D (PLD) drives cell invasion, tumor growth and metastasis in a human breast cancer xenograph model. Oncogene. 32 (49), 5551-5562 (2013).
  43. Zhang, Z. Y., et al. CircRNA_101237 promotes NSCLC progression via the miRNA-490-3p/MAPK1 axis. Scientific Reports. 10, 490-493 (2020).
  44. Gao, T. X., et al. Exploring the mechanism of Fu-Zi Decoction in treatment of chronic heart failure based on network pharmacology and molecular docking technology. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences. 30 (09), 705-715 (2021).
  45. Wang, B., et al. PP4C facilitates lung cancer proliferation and inhibits apoptosis via activating MAPK/ERK pathway. Pathology, Research and Practice. 216 (5), 152910 (2020).
  46. Moon, M. Y., et al. Rap1 regulates hepatic stellate cell migration through the modulation of RhoA activity in response to TGF-β1. International Journal of Molecular Medicine. 44 (2), 491-502 (2019).
  47. Kan, J., et al. He-Chan Pian inhibits the metastasis of non-small cell lung cancer via the miR-205-5p-mediated regulation of the GREM1/Rap1 signaling pathway. Phytomedicine. 94, 153821 (2022).
  48. Sidrat, T., et al. Role of Wnt signaling during in-vitro bovine blastocyst development and maturation in synergism with PPARδ signaling. Cells. 9 (4), 923 (2020).
  49. Wagner, N., Wagner, K. D. PPAR beta/delta and the hallmarks of cancer. Cells. 9 (5), 1133 (2020).
  50. Miriam, M., et al. PI3K/AKT signaling pathway and cancer: An updated review. Annals of Medicine. 46 (6), 372-383 (2014).
  51. Ma, X. L., et al. CD73 promotes hepatocellular carcinoma progression and metastasis via activating PI3K/AKT signaling by inducing Rap1-mediated membrane localization of P110β and predicts poor prognosis. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 37 (2019).
  52. Li, T., et al. Pomegranate flower extract bidirectionally regulates the proliferation, differentiation and apoptosis of 3T3-L1 cells through regulation of PPARγ expression mediated by PI3K-AKT signaling pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 131, 110769 (2020).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 193 Lungeadenokarsinom nettverksfarmakologi Trichosanthes kirilowii Maxim Fritillaria thunbergii Miq PI3K / AKT signalvei
Nettverksfarmakologi prediksjon og eksperimentell validering av <em>Trichosanthes-Fritillaria</em> <em>thunbergii</em> virkningsmekanisme mot lungeadenokarsinom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, X. y., Yang, Y. y., Feng, J.… More

Zhao, X. y., Yang, Y. y., Feng, J. l., Feng, C. l. Network Pharmacology Prediction and Experimental Validation of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Action Mechanism Against Lung Adenocarcinoma. J. Vis. Exp. (193), e64847, doi:10.3791/64847 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter