Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Prédiction pharmacologique en réseau et validation expérimentale du mécanisme d’action de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contre l’adénocarcinome pulmonaire

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64847
Automatic Translation
1, 1, 1, 2
1Dongzhimen Hospital affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, 2Traditional Chinese Medicine Department, Peking University People's Hospital

Summary

Cette étude révèle le mécanisme de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire basé sur la pharmacologie de réseau et la vérification expérimentale. L’étude démontre également que la voie de signalisation PI3K / AKT joue un rôle essentiel dans l’action de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire.

Abstract

Notre objectif était d’étudier le mécanisme de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire (LUAD) sur la base de la pharmacologie de réseau et de la vérification expérimentale. Les composants efficaces et les cibles potentielles de Trichosanthis et Fritillaria thunbergii ont été collectés par la base de données expérimentale à haut débit et guidée par référence (HERB) de la médecine traditionnelle chinoise et une base de données d’approche d’ensemble de similarité (SEA), et les cibles liées à LUAD ont été interrogées par les bases de données GeneCards et Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Un réseau médicament-composant-maladie-cible a été construit par le logiciel Cytoscape. Le réseau d’interaction protéine-protéine (PPI), la fonction d’ontologie génique (GO) et les analyses d’enrichissement des voies de l’encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) ont été effectués pour obtenir des cibles principales et des voies clés. Un extrait aqueux de cellules Trichosanthes-Fritillaria thunbergii et A549 a été utilisé pour la validation expérimentale ultérieure. Grâce à la base de données HERB et à la recherche documentaire, 31 composés efficaces et 157 gènes cibles potentiels de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ont été examinés, dont 144 étaient des cibles régulatrices de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire. L’analyse de l’enrichissement fonctionnel GO a montré que le mécanisme d’action de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contre l’adénocarcinome pulmonaire est principalement la phosphorylation des protéines. L’analyse d’enrichissement de la voie KEGG suggère que le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire par Trichosanthes-Fritillaria thunbergii implique principalement la voie de signalisation PI3K/AKT. La validation expérimentale a montré qu’un extrait aqueux de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii pouvait inhiber la prolifération des cellules A549 et la phosphorylation de l’AKT. Grâce à la pharmacologie en réseau et à la validation expérimentale, il a été vérifié que la voie de signalisation PI3K / AKT joue un rôle essentiel dans l’action de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de l’adénocarcinome pulmonaire.

Introduction

Le cancer du poumon fait référence aux tumeurs malignes provenant de la muqueuse bronchique pulmonaire, y compris le carcinome épidermoïde, l’adénocarcinome, le carcinome à grandes cellules et le carcinome à petites cellules1. L’adénocarcinome du poumon (LUAD) est le type de cancer du poumon le plus courant, représentant environ 40 % du total des cas de cancer du poumon2. La plupart des patients sont diagnostiqués à un stade avancé ou ont des métastases à distance et, par conséquent, perdent l’occasion d’une intervention chirurgicale3. Dans le traitement clinique actuel, la chimioradiothérapie concomitante est la stratégie la plus courante pour traiter LUAD, mais son application est limitée en raison d’effets indésirables graves4.

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) peut soulager efficacement les symptômes cliniques des patients atteints de LUAD et réduire les effets indésirables causés par la radiothérapie et la chimiothérapie et est ainsi devenue un haut lieu de recherche 5,6,7. En médecine traditionnelle chinoise, le cancer du poumon appartient à la catégorie de « l’accumulation pulmonaire » et « pétreux pulmonaire ». La carence en Qi et l’interaction des mucosités, de la stase et du poison sont importantes dans la pathogenèse du cancer du poumon. Par conséquent, tonifier le Qi et éliminer les mucosités et la stase sanguine sont les principales méthodes de traitement clinique8 pour le cancer du poumon selon la théorie de la MTC9. Trichosanthes kirilowii Maxim (Gualou) et Fritillaria thunbergii Miq (Zhebeimu) représentent une paire de médicaments commune dans le traitement du cancer du poumon, et cette combinaison a pour effet d’éliminer la chaleur et de réduire les mucosités10,11,12. Cependant, son mécanisme d’action n’est pas encore clair et d’autres recherches doivent être menées.

La pharmacologie de réseau est une méthode complète basée sur la théorie de la biologie des systèmes et la pharmacologie multidirectionnelle qui vise à révéler des relations de réseau complexes entre plusieurs médicaments et maladies13. Les prescriptions traditionnelles chinoises ont les caractéristiques d’être multi-composants et multi-cibles, ce qui signifie qu’elles sont très appropriées pour l’étude de la pharmacologie de réseau14,15. Récemment, la pharmacologie de réseau est apparue comme une approche puissante dans l’étude des formules de MTC et est devenue un point chaud de la recherche16,17.

Cependant, à notre connaissance, toutes les recherches sur la pharmacologie des réseaux sont présentées sous forme de texte. Présenter cette technologie par vidéo réduira considérablement le seuil d’apprentissage et facilitera la promotion de cette technologie, ce qui est l’un des avantages de cet article. Dans cette étude, nous avons pris Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contre l’adénocarcinome pulmonaire comme exemple pour effectuer la prédiction pharmacologique en réseau et la validation expérimentale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Toutes les procédures de pharmacologie en réseau ont été effectuées conformément aux lignes directrices pour les méthodes d’évaluation de la pharmacologie des réseaux18. Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux règles de gestion de laboratoire de l’Université de médecine chinoise de Beijing.

1. Prédiction pharmacologique en réseau

  1. Sélection des composants actifs
    1. Ouvrez la base de données HERB (http://herb.ac.cn)19 et utilisez « Gualou » (le nom chinois de Trichosanthes kirilowii Maxim) et « Zhebeimu » (le nom chinois de Bulbus Fritillariae thunbergii) comme mots-clés pour obtenir les composants des deux médicaments. Téléchargez la liste et les structures SMILES canoniques des composants connexes des deux médicaments.
    2. Déterminez si le composant obtenu est le composant actif.
      1. Inclure comme composants actifs ceux qui ont des valeurs de biodisponibilité orale (BO) et de médicament (DL) dans la base de données du groupe HERB (c.-à-d. les composants avec ≥ obstétricien et DL ≥ 0,18)20,21.
      2. Si le composant n’a pas de valeurs OB et DL, entrez le composant dans la base de données suisse ADME (http://www.swissadme.ch/index.php)22 pour obtenir les informations sur chaque composant. Inclure les composants ayant une absorption gastro-intestinale « élevée » et au moins deux valeurs DL « Oui » comme composants actifs.
  2. Prédiction cible des composants actifs
    1. Ouvrez la base de données HERB (http://herb.ac.cn). Recherchez et copiez les structures SMILES canoniques des composants actifs.
    2. Ouvrez la base de données SEA (Similarity ensemble approach, http://sea.bkslab.org)23. Collez les structures SMILES canoniques des composants actifs dans la zone de recherche, puis cliquez sur Essayer SEA pour obtenir la clé cible, le nom de la cible, la valeur P et le MaxTC de chaque composant actif.
    3. Copiez les données dans une feuille de calcul et utilisez la fonction de filtrage du fichier de feuille de calcul pour filtrer les cibles des composants actifs par touche cible (Humain, P < 0,05 et MaxTC > 0,5).
    4. Copiez toutes les cibles dans une feuille de calcul et supprimez les doublons pour obtenir les cibles médicamenteuses.
  3. Prédiction des cibles de la maladie
    1. Ouvrez la base de données GeneCards (https://www.genecards.org)24 et la base de données OMIM, https://www.omim.org)25 et utilisez l’adénocarcinome pulmonaire comme mot-clé pour obtenir les cibles de la maladie de l’adénocarcinome pulmonaire.
    2. Téléchargez les feuilles de calcul des cibles de la maladie. Supprimez les cibles répétées pour obtenir les cibles LUAD.
  4. Construction d’un réseau médicament-composant-maladie-cible
    1. Copiez les cibles liées à LUAD et les cibles médicamenteuses dans la même colonne dans une nouvelle feuille de calcul. Utilisez la fonction Données - Identifier les doublons de la barre d’outils pour obtenir les cibles d’intersection des cibles liées à LUAD et des cibles liées aux composants actifs Trichosanthes-Fritillaria thunbergii .
    2. Ouvrez Cytoscape 3.8.0. Cliquez sur Fichier dans la barre de menus, puis sélectionnez Importer > réseau à partir du fichier pour importer le fichier de feuille de calcul. Optimisez la taille et la couleur des nœuds réseau via la barre de style située dans le panneau de configuration de gauche.
    3. Utilisez la fonction Analyser le réseau pour l’analyse de la topologie du réseau . Cliquez sur Outils dans la barre de menus, puis sélectionnez Analyser le réseau. Dans le panneau Tableau , cliquez sur le degré dans la barre de titre pour organiser les composants par degré par ordre décroissant. Prenez les dix principaux composants et cibles comme principaux composants actifs et cibles principales.
  5. Construction du réseau PPI et criblage des protéines centrales
    1. Ouvrez la base de données STRING (https://cn.string-db.org/)26. Collez la liste au format texte des cibles potentielles de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contre LUAD dans la boîte de dialogue Liste des noms . Sélectionnez Homo sapiens dans Organismes, puis cliquez sur les boutons RECHERCHER > CONTINUER .
    2. Lorsque les résultats sont disponibles, cliquez sur Paramètres et cochez Confiance élevée (0,700) dans Paramètres de base > Score d’interaction minimum requis. Cochez Masquer les nœuds déconnectés du réseau dans Paramètres avancés, puis cliquez sur le bouton METTRE À JOUR.
    3. Cliquez sur Exportations dans la barre de titre et téléchargez le court texte tabulaire de la relation PPI au format TSV.
    4. Ouvrez Cytoscape 3.8.0. Cliquez sur Fichier > Importer > Réseau à partir du Fichier pour importer le fichier au format TSV pour une analyse visuelle.
    5. Utilisez la fonction Network Analyzer pour effectuer l’analyse topologique. Optimisez la taille et la couleur des nœuds réseau via la barre de style située dans le panneau de configuration de gauche.
  6. Analyse d’enrichissement KEGG
    1. Ouvrez la plateforme Metascape (https://metascape.org/)27. Collez la liste en format texte des cibles thérapeutiques potentielles dans la boîte de dialogue, puis cliquez sur le bouton Soumettre. Cochez H. sapiens dans Entrée en tant qu’espèce et Analyse en tant qu’espèce, puis cliquez sur le bouton Analyse personnalisée. Sélectionnez Enrichissement, cochez uniquement la voie KEGG, puis cliquez sur Analyse de l’enrichissement. Une fois que la barre de progression atteint 100%, cliquez sur le bouton orange de la page du rapport d’analyse pour les résultats de l’enrichissement.
    2. Cliquez sur All in One Zip File pour télécharger le résultat de l’enrichissement, puis ouvrez le fichier _ FINAL_GO.csv dans le dossier Enrichment_GO pour obtenir le résultat.
    3. Logiciel Open R (https://cran.r-project.org/). Tapez install.package (« ggplot2 ») et library (ggplot2) dans R pour l’installation du package ggplot2 R. Appuyez sur Entrée pour exécuter le programme de visualisation KEGG.

2. Vérification expérimentale

  1. Préparation du médicament
    NOTE: Fritillaria thunbergii Miq et Trichosanthes kirilowii Maxim ont été achetés à l’hôpital Dongzhimen, affilié à l’Université de médecine chinoise de Pékin.
    1. Mélanger 50 g de Fritillaria thunbergii Miq et 50 g de Trichosanthes kirilowii Maxim. Faire tremper le mélange dans 1 L d’eau distillée pendant 20 min, puis décocter le mélange à 100 °C sous pression normale pendant 1 h.
    2. Filtrer la décoction pour obtenir un filtrat avec une double couche de gaze médicale stérile, puis utiliser du papier filtre de 80 μm pour filtrer davantage l’extrait. Répétez l’opération ci-dessus trois fois.
    3. Mélanger le filtrat ensemble pour obtenir une décoction d’environ 1,2 L. Placer la solution dans le ballon d’un évaporateur rotatif. Réglez la vitesse de rotation à 50 tr/min avec une température de 37 °C. Mélanger et condenser les décoctions en un extrait dans l’évaporateur rotatif pendant 6 h pour obtenir un liquide visqueux.
    4. Allumez le mécanisme de lyophilisation sous vide pour prérefroidir la température à −40 °C. Mettez l’extrait obtenu dans le plateau de matériau et placez-le dans le piège à froid pour la congélation.
    5. Lorsque la température du piège à froid atteint −50 °C et que le matériau a été congelé pendant 2 h, transférer les matériaux congelés dans un séchoir placé dans le piège à froid. Allumez la pompe à vide pour lancer le processus de lyophilisation. Sortez la poudre lyophilisée et conservez-la au réfrigérateur à −20 °C pour une utilisation ultérieure.
  2. Culture cellulaire
    1. Configurer le milieu complet DMEM avec 89% de milieu basique DMEM, 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine.
    2. Après avoir retiré les cellules A549 de l’azote liquide, incuber les cellules dans un bain-marie à 37 °C et remuer jusqu’à ce que le milieu dans le flacon fonde.
    3. Ajouter un quadruple volume de milieu complet DMEM dans les cellules fondues. Centrifuger les cellules (4 °C, 679 x g, 5 min) et jeter le surnageant.
    4. Resuspendre les cellules précipitées avec 6 mL de milieu complet DMEM, les plaquer dans une fiole de culture T25 et incuber la fiole dans un incubateur cellulaire à 37 °C, 5% CO2.
  3. Détection de la viabilité cellulaire
    1. Digérer les cellules A549 logarithmiques en phase de croissance avec 1 mL de trypsine à 0,25% pendant 1 min à 37°C. Ajouter 1 mL de milieu complet DMEM pour neutraliser la trypsine, et souffler doucement pour favoriser l’excrétion cellulaire. Centrifuger le mélange pour obtenir la pastille cellulaire (4 °C, 192 x g, 5 min). Remettez en suspension les cellules obtenues en utilisant le milieu complet DMEM.
    2. Ajoutez la suspension cellulaire à un hémocytomètre et comptez à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Diluer à 5 x 104 cellules/mL en utilisant le milieu complet DMEM.
    3. Dissoudre 1 g d’extrait aqueux de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans 10 mL de solution de PBS et le stériliser par filtre à travers un filtre de 0,22 μm. Diluer le mélange à 90 mg/mL, 80 mg/ml, 70 mg/mL, 60 mg/mL, 50 mg/mL, 40 mg/mL, 30 mg/mL, 20 mg/mL et 10 mg/mL à l’aide du PBS.
    4. Plaquer les cellules diluées sur des plaques de 96 puits avec 100 μL par puits. Après l’adhérence cellulaire, ajouter 1 μL d’extraits aqueux de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii de différentes concentrations pour ajuster la concentration de chaque puits à 900 μg/mL, 800 μg/mL, 700 μg/mL, 600 μg/mL, 500 μg/mL, 400 μg/mL, 300 μg/mL, 200 μg/mL et 100 μg/mL.
    5. Jeter le milieu d’origine après 24 h de culture et ajouter 100 μL de milieu basique DMEM pour une incubation ultérieure pendant 2 h à 37 °C, 5 % de CO2.
    6. Après le traitement ci-dessus, ajouter 20 μL de solution MTS (Table of Materials), et incuber les cellules pendant encore 1 h à 37 °C, 5% CO2.
    7. Transférer le mélange incubé dans une assiette différente. Mesurer l’absorbance (OD) à une longueur d’onde de 490 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Calculez la viabilité de la cellule à l’aide de la formule suivante :
      Viabilité (%) = 100 × (DO de l’échantillon traité − DO du milieu)/(DO de l’échantillon témoin − DO du milieu).
      NOTE: Une concentration minimale proche de CI50 est définie comme une dose élevée. La concentration à laquelle la prolifération cellulaire commence à être inhibée est définie comme une concentration à faible dose, et la valeur intermédiaire est définie comme une concentration à dose moyenne pour les études expérimentales ultérieures. Dans cette étude, 400 μg/mL, 600 μg/mL et 800 μg/mL ont été utilisés comme doses faible, moyenne et élevée.
  4. Intervention en matière de drogue et prélèvement d’échantillons
    REMARQUE: La croissance cellulaire a été tracée en fonction du temps pour déterminer la phase logarithmique.
    1. Diluer les cellules A549 logarithmiques en phase de croissance à 5 x 105 cellules/mL. Ajouter 2 mL de la suspension cellulaire dans une plaque de 6 puits et cultiver pendant 12 h.
    2. Répéter l’étape 2.3.3 pour obtenir des dilutions PBS de 80 mg/mL, 60 mg/mL et 40 mg/mL d’extrait aqueux de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Ajouter 20 μL de la solution de PBS, 20 μL de l’extrait aqueux de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii à 40 mg/mL, 20 μL de l’extrait aqueux de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii à 60 mg/mL et 20 μL de l’extrait aqueux de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii à 80 mg/mL au groupe témoin blanc, au groupe à faible concentration, au groupe à concentration moyenne et au groupe à concentration élevée, respectivement. Jeter le surnageant après 24 h d’intervention et nettoyer les cellules avec du PBS trois fois.
      NOTA : Les concentrations du groupe témoin blanc, du groupe à faible concentration, du groupe à concentration moyenne et du groupe à forte concentration de l’extrait aqueux de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii étaient de 0 μg/mL, 400 μg/mL, 600 μg/mL et 800 μg/mL, respectivement.
    3. Ajouter 250 μL de tampon RIPA (contenant 1% PMSF et 1% inhibiteur de phosphatase) à chaque puits, et lyser les cellules pendant 30 min. Recueillir le lysat pour centrifugation (4 °C, 6 714 x g, 10 min) et obtenir le surnageant.
  5. Western blotting
    1. Détecter la concentration en protéines des échantillons par la méthode BCA conformément aux instructions du fabricant. Utilisez le tampon RIPA pour ajuster la concentration de chaque échantillon afin qu’elle soit cohérente.
    2. Mélanger 40 μL de l’échantillon de protéines avec 10 μL de tampon de charge 5x et faire bouillir pendant 5 min à 100 °C. Centrifuger (4 °C, 6 714 x g, 10 min) le mélange pour obtenir le surnageant pour les expériences ultérieures.
    3. Isoler les protéines par électrophorèse sur gel en utilisant une électrophorèse verticale de 120 V.
    4. Préparez un « sandwich » électrique (éponge - papier filtre - gel - membrane PVDF - papier filtre - éponge). Faire tremper l’appareil de transfert dans un bain de glace et transférer la protéine sur des membranes de PVDF à 70 V pendant 60 min.
    5. Utilisez 100 mL de solution TBST (0,05 % [v/v] Tween-20, 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) et 5 g de lait écrémé en poudre pour configurer le lait à 5 %. Pré-diluer les anticorps AKT et p-AKT avec le diluant d’anticorps dans un rapport de 1:1 000.
    6. Bloquer la membrane PVDF dans du lait écrémé en poudre à 5% pendant 1 h en agitant. Après le blocage, jeter le lait bloquant et ajouter l’anticorps primaire dilué pour une incubation nocturne à 4 °C.
    7. Après avoir retiré l’anticorps primaire, utilisez la solution TBST pour laver la membrane PVDF cinq fois pendant 5 minutes chacune.
    8. Pré-diluer l’anticorps secondaire avec le diluant d’anticorps dans un rapport de 1:5 000. Ajouter l’anticorps secondaire et incuber à température ambiante (RT) pendant 1,5 h. Après avoir retiré l’anticorps secondaire, utilisez la solution TBST pour laver la membrane PVDF cinq fois pendant 5 minutes chacune.
    9. Détecter la protéine à l’aide d’un système de détection par chimiluminescence.

3. Amarrage moléculaire

  1. Ouvrez la base de données UniProt (https://www.uniprot.org)28. Tapez les symboles cibles dans la zone de recherche et cliquez sur le bouton RECHERCHER . Dans le sous-titre Structure , cliquez sur Télécharger pour les structures 3D des cibles protéiques.
  2. Ouvrez la base de données PDB RCSB (https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)29. Tapez le nom des macromolécules de protéines dans la zone de recherche. Téléchargez les structures des macromolécules protéiques au format PDB.
  3. Téléchargez le package d’installation du logiciel UCSF Chimera 1.16 (https://vina.scripps.edu/) et AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/). Installez et ouvrez le logiciel UCSF Chimera 1.16. Cliquez sur Fichier > Ouvrir pour afficher la protéine réceptrice.
  4. Cliquez sur Outils > Modification de la structure > Dock Prep, puis cochez Supprimer le solvant, Ajouter des hydrogènes et Ajouter des charges dans la fenêtre contextuelle pour éliminer l’eau et ajouter des charges d’hydrogénation et d’équilibre. Cliquez sur Write Mol2 File pour enregistrer la protéine réceptrice au format mol2. Effectuez la même étape sur le ligand.
  5. Cliquez sur Fichier > Ouvrir pour afficher le ligand au format mol2 dans le logiciel UCSF Chimera 1.16. Dans Outils > Analyse de surface/liaison > AutoDock Vina, définissez la barre de récepteur sur le nom de la protéine réceptrice et la barre de ligand sur le nom du ligand. Entrez une valeur dans la case derrière Centre et Taille pour ajuster l’espace nouvellement développé, ce qui permet d’englober complètement le ligand et le récepteur.
  6. Cliquez sur OK pour le criblage virtuel d’amarrage moléculaire afin d’obtenir l’emplacement optimal pour la liaison du ligand au récepteur. Enregistrez la valeur de l’énergie de liaison à la position optimale.

4. Analyse statistique

  1. Ouvrez le logiciel statistique SPSS 26.0. Cliquez sur Fichier > Importer des données pour le chargement des données.
  2. Présenter les données expérimentales sous forme d’écart moyen ± type.
  3. Comparez plusieurs groupes à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle.
    REMARQUE : P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif dans ce travail.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Au total, 31 composants actifs liés à Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ont été identifiés, dont 21 Trichosanthes et 10 Fritillaria thunbergia, ainsi que 144 cibles correspondantes. Au total, 9 049 et 67 gènes liés à LUAD ont été extraits de la base de données GeneCards et de la base de données OMIM, respectivement. Après suppression des gènes dupliqués, 9 057 gènes liés à LUAD ont été identifiés. L’intersection des gènes liés à LUAD et des cibles liées au composant actif de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii a été réalisée pour obtenir des cibles thérapeutiques potentielles. Le réseau d’interaction médicament-composant-maladie-cible de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contre LUAD est illustré à la figure 1A. Dans le réseau d’interaction, les dix principaux composants actifs étaient le kaempférol, l’hydroxygénkwanine, la génistéine, la diosmétine et le β-sitostérol, l’acide palmitoléique, le mandénol, l’acide hexadécanoïque, l’acide carproïque et l’acide caprique, qui ont été identifiés comme les composants actifs clés de l’action de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de la LUAD (Figure 1B). Le réseau PPI comprenait 122 protéines fonctionnelles et 210 relations d’interaction, et les résultats de la visualisation sont présentés à la figure 2A. Les dix principales protéines de base par degré (paramètre utilisé pour l’analyse de visualisation dans le logiciel Cytoscape) dans l’ordre décroissant comprenaient ESR1, VEGFA, PPARA, CYP3A4, AR, APP, FGF2, CREB1 et CYP1A1, qui sont principalement impliquées dans la néovascularisation, la prolifération cellulaire, l’apoptose et le transport de la membrane cellulaire 30,31,32,33,34,35,36,37 ,38,39(figure 2B). Parmi les 20 principales voies classées par KEGG, la voie de signalisation PI3K/AKT40, la voie de signalisation Rap1 41, la voie de signalisation phospholipase D42 et la voie de signalisationMAPK1 43 sont étroitement associées au cancer du poumon, parmi lesquelles la voie PI3K/AKT s’est classée première et, par conséquent, a été utilisée pour la vérification ultérieure (Figure 3).

Les expériences ont indiqué que les extraits de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii à des concentrations supérieures à 400 μg/mL pouvaient inhiber la prolifération cellulaire, et que l’effet inhibiteur sur les cellules A549 à des concentrations allant jusqu’à 800 μg/mL était proche de la concentration demi-inhibitrice (CI50) (Figure 4). Ainsi, 400 μg/mL, 600 μg/mL et 800 μg/mL ont été utilisés comme doses faible, moyenne et élevée pour les expériences ultérieures. L’intervention des extraits de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii n’a entraîné aucun changement significatif dans l’expression de la protéine AKT dans chaque groupe ; cependant, l’expression de p-AKT (Ser473) a été inhibée et a montré un effet dose-dépendant (Figure 5). Les composants clés de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement LUAD ont été amarrés moléculairement aux protéines clés de la voie PI3K/AKT, et les résultats ont suggéré que les énergies de liaison de la diosmétine et du kaempférol avec AKT1 étaient inférieures à -7, indiquant une forte activité de liaison44 (Figure 6).

Figure 1
Figure 1 : Diagramme du réseau médicament-composant-maladie-cible. (A) Le bleu représente la maladie; le jaune représente le médicament; le rouge représente le composant ; Le vert représente la cible. Abréviations : GL = Trichosanthes; ZBM = Fritillaria thunbergia; LUAD = adénocarcinome pulmonaire. (B) Les dix principaux ingrédients actifs du réseau classés par degré par ordre décroissant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Réseau PPI de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de LUAD. (A) Résultats de visualisation du réseau PPI. Plus le nœud est sombre, plus la protéine est centrale dans le réseau. (B) Les dix premières cibles du réseau par degré. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Enrichissement de la voie KEGG des cibles Trichosanthes-Fritillaria thunbergii par rapport à LUAD. (A) Les 20 premières voies KEGG sont classées selon les valeurs P par ordre croissant. (B) Carte de la voie de signalisation PI3K/AKT. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Effets de différentes concentrations d’extrait de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii sur la prolifération cellulaire A549 (n = 3). Les extraits de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii à des concentrations supérieures à 400 μg/mL pourraient inhiber la prolifération cellulaire. L’effet inhibiteur sur les cellules A549 à des concentrations allant jusqu’à 800 μg/mL était proche de la concentration demi-inhibitrice (CI50). Abréviation : GL-ZBM = Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Effets de différentes concentrations d’extrait de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii sur l’expression de la protéine AKT et les niveaux de phosphorylation (n = 3). Il n’y avait pas de changement significatif dans l’expression de la protéine AKT dans chaque groupe, tandis que l’expression protéique de p-AKT (Ser473) dans les groupes exposés à des doses moyennes et élevées était significativement régulée à la baisse, et la différence était statistiquement significative par rapport au groupe témoin (*P < 0,05 par rapport au groupe témoin). Abréviation : GL-ZBM = Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Amarrage moléculaire des composants apparentés aux protéines du noyau. (A) Carte thermique de l’énergie de liaison des composants clés de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii pour le traitement LUAD amarré moléculairement avec des protéines clés de la voie PI3K/AKT. (B) Diagramme d’amarrage moléculaire des protéines Diosmetin et AKT1. (C) Diagramme d’amarrage moléculaire des protéines kaempférol et AKT1. Les lignes roses représentent les liaisons hydrogène, les structures grises représentent les compositions médicamenteuses et la structure colorée représente AKT1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En général, une étude pharmacologique de réseau complète comprend l’identification des composants actifs à partir de bases de données, l’acquisition de cibles correspondant aux composants actifs et aux maladies, la construction d’un réseau médicament-composant-maladie-cible, et la prédiction des cibles et des voies principales. L’association entre les composants actifs et les protéines centrales (amarrage moléculaire) est prédite de manière préliminaire par la technologie informatique, et la vérification finale est effectuée à l’aide d’une expérience.

La sélection des bases de données pertinentes est la partie la plus critique de la pharmacologie de réseau, car elle détermine la qualité de la recherche. La base de données HERB intègre des informations provenant de plusieurs bases de données de MTC, telles que Syμmap, TCMID, TCMSP et TCM-ID, et constitue la base de données de MTC et d’ingrédients la plus complète à l’heure actuelle. Par conséquent, dans cette étude, la base de données HERB a été utilisée pour le criblage des composants actifs19.

Dans cette étude, 31 composants actifs et 144 cibles d’intersection de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de LUAD ont été identifiés par des bases de données connexes. En construisant un réseau médicament-composant-maladie-cible, nous avons exploré dix composants actifs clés par l’analyse topologique. Les cibles principales de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de LUAD ont été éliminées par analyse IPP.

Parmi les 20 premières voies des résultats KEGG, la voie de signalisation PI3K / AKT, la voie de signalisation MAPK1, la voie de signalisation Rap1 et la voie de signalisation PPAR sont étroitement liées aux tumeurs selon la littérature40,41,42. MAPK1, une voie de signalisation classique liée au cancer, est un régulateur important de la croissance et de la différenciation cellulaires. Lorsqu’elle est activée, cette voie de signalisation conduit à une prolifération cellulaire incontrôlée, à une extension du cycle cellulaire et à l’apparition et au développement de tumeurs45. La voie de signalisation Rap1 est un régulateur important de la voie de signalisation NF-κB et de la voie de signalisation MAPK1 et est étroitement liée à l’adhésion cellulaire dans le cancer du poumon46. De plus, il a été confirmé que l’inhibition de la voie de signalisation Rap1 peut améliorer les métastases tumorales dans le carcinome pulmonaire47. La voie de signalisation PPAR est associée à la prolifération cellulaire, à l’homéostasie énergétique, à la tumorigenèse et aux troubles métaboliques48. Des études ont confirmé sa fonction dans la promotion de l’angiogenèse tumorale et de la croissance tumorale49.

La voie de signalisation PI3K / AKT affecte principalement le métabolisme, la prolifération, l’apoptose et la vascularisation des tumeurs par la phosphorylation et l’activation de AKT. Des études antérieures ont montré que la voie de signalisation PI3K / AKT joue un rôle régulateur dans la voie de signalisation MAPK1, la voie de signalisation Rap1 et la voie de signalisation PPAR50,51,52. De plus, les résultats de la prédiction KEGG ont montré que la voie de signalisation PI3K/AKT était la plus étroitement liée à l’action de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contre LUAD, de sorte qu’elle a été sélectionnée pour une vérification expérimentale ultérieure.

Les cibles principales prédites par PPI, VEGFA et CREB1 dans la voie de signalisation PI3K/AKT, ainsi que les protéines clés PI3K et AKT1 dans la voie de signalisation PI3K/AKT, ont été incluses pour l’amarrage moléculaire. Dans une étude précédente, une énergie de liaison d’amarrage inférieure à −7 était considérée comme significative44. Les résultats de cette étude suggèrent que l’énergie de liaison du kaempférol et de la diosmétine avec AKT1 dépasse ce seuil, suggérant que les effets de ces deux composants sur AKT pourraient être la clé de l’action de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contre LUAD.

Dans une vérification expérimentale plus poussée, nous avons étudié l’effet de l’extrait de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii sur le niveau de phosphorylation de l’AKT. Les résultats ont montré que différentes concentrations d’extrait de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii n’avaient pas d’effet significatif sur l’expression de la protéine AKT, mais l’extrait de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii pouvait inhiber de manière significative la phosphorylation de la protéine AKT de manière dose-dépendante. Ces résultats suggèrent que l’inhibition de la voie PI3K/AKT est le mécanisme d’action clé de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contre LUAD.

En conclusion, grâce à la pharmacologie des réseaux et à la validation expérimentale, cette étude a vérifié que la voie de signalisation PI3K/AKT joue un rôle essentiel dans l’action de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii dans le traitement de LUAD.

Il y a encore quelques lacunes dans cette étude. L’étude n’a inclus que des composants actifs à haute biodisponibilité sans discuter de la biotransformation possible des molécules actives dans le côlon, les cellules intestinales et le foie, ce qui n’est pas assez complet. De plus, l’effet de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii sur la prolifération et la voie PI3K/AKT des cellules d’adénocarcinome pulmonaire n’a été vérifié expérimentalement qu’in vitro. Cette étude fournit une base théorique pour le développement de nouveaux médicaments et l’expansion des applications cliniques. À l’avenir, d’autres validations expérimentales de ces résultats de prédiction seront effectuées pour appuyer les évaluations des applications cliniques potentielles.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par le Programme de formation à l’innovation de l’Université de médecine chinoise de Beijing (No: 202110026036).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco R001100
A549 cell line Procell CL-0016
AKT antibody CST 4691S
BCA Protein Assay Kit Solarbio PC0020
Chemiluminescence detection system Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory ChemiScope 6100
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Solarbio 11995
Enhanced chemiluminescence (ECL) kit  ABclonal RM00021
Fetal bovine serum ScienCell 0025
HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) ABclonal AS014
MTS assay kit Promega G3580
p-AKT antibody CST 6040S
Penicillin streptomycin Gibco C14-15070-063
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Solarbio P0100
Phosphatase inhibitor Beyotime P1081
Phosphate buffered saline (PBS) Solarbio P1020
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes Millipore ISEQ00010
RIPA lysis solution Solarbio R0010
Rotary evaporator Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory RE52CS-1
Vacuum freeze-drying mechanism Ningbo Scientz Biotechnology SCIENTZ-10
β-Actin antibody ABclonal AC026

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thai, A. A., Solomon, B. J., Sequist, L. V., Gainor, J. F., Heist, R. S. Lung cancer. The Lancet. 398 (10299), 535-554 (2021).
  2. Sinha, A., et al. Early-stage lung adenocarcinoma MDM2 genomic amplification predicts clinical outcome and response to targeted therapy. Cancers. 14 (3), 708 (2022).
  3. Howlader, N., et al. The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality. The New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).
  4. Hirsch, F. R., et al. Lung cancer: Current therapies and new targeted treatments. The Lancet. 389 (10066), 299-311 (2017).
  5. Liu, J., et al. Comprehensive treatment with Chinese medicine in patients with advanced non-small cell lung cancer: A multicenter, prospective, cohort study. Chinese Journal of Integrative Medicine. 23 (10), 733-739 (2016).
  6. Xiao, Z. W., et al. Comprehensive TCM treatments combined with chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer: A randomized, controlled trial. Medicine. 100 (18), 25690 (2021).
  7. Li, Y., et al. Effectiveness of traditional Chinese medicine on chemoradiotherapy induced leukaemia in patients with lung cancer: A meta-analysis. Journal of Traditional Chinese Medicine. 38 (5), 661-667 (2018).
  8. Yuan, F., et al. Therapeutic effect and apoptosis mechanism of lung-tonifying and expectorant decoction on lung cancer rats with Qi deficiency and blood stasis. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 8 (11), 983-988 (2015).
  9. Zhang, Y. L., Liang, Y. E., He, C. W. Anticancer activities and mechanisms of heat-clearing and detoxicating traditional Chinese herbal medicine. Chinese Medicine. 12, 20 (2017).
  10. Wang, T. B., et al. Exploring the rules of application of RONG Yuan-ming in the treatment of non-small cell lung cancer. Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 25 (14), 22-25 (2019).
  11. Chen, T. T., Wang, Y., Tian, T. Medication regularity and mechanism of traditional Chinese medicine in treating lung cancer. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 24 (11), 206-210 (2018).
  12. Shen, C. J. Analysis of the rule of Chinese medicine in treating lung cancer. Journal of Shandong University of Traditional Chinese Medicine. 35 (2), 127-129 (2011).
  13. Yang, X. Y., et al. Evidence-based complementary and alternative medicine bioinformatics approach through network pharmacology and molecular docking to determine the molecular mechanisms of Erjing pill in Alzheimer's disease. Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (5), 1252 (2021).
  14. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design Development and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
  15. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong recipe in the treatment of osteoarthritis. Computational and Mathematical Methods in Medicine. 2022, 7858925 (2022).
  16. Xie, G. G., et al. A network pharmacology analysis to explore the effect of Astragali Radix-Radix Angelica Sinensis on traumatic brain injury. BioMed Research International. 2018, 3951783 (2018).
  17. Chen, G. Y., et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5233462 (2021).
  18. World Federation of Chinese Medicine Societies. Network pharmacology evaluation methodology guidance. World Chinese Medicine. 16 (4), 527-532 (2021).
  19. Fang, S. S., et al. A high-throughput experiment- and reference-guided database of traditional Chinese medicine. Nucleic Acids Research. 49, 1197-1206 (2021).
  20. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2022, 1826299 (2022).
  21. Yu, J. H., et al. ZiYinHuaTan recipe inhibits cell proliferation and promotes apoptosis in gastric cancer by suppressing PI3K/AKT pathway. BioMed Research International. 2020, 2018162 (2020).
  22. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Scientific Reports. 7, 42717 (2017).
  23. Keiser, M. J., et al. Relating protein pharmacology by ligand chemistry. Nature Biotechnology. 25 (2), 197-206 (2007).
  24. Safran, M., et al. GeneCards Version 3: The human gene integrator. Database. 2010, (2010).
  25. Amberger, J. S., Hamosh, A. Searching Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): A knowledgebase of human genes and genetic phenotypes. Current Protocols in Bioinformatics. 58, 1-12 (2017).
  26. Mering, C. V., et al. STRING: Known and predicted protein-protein associations, integrated and transferred across organisms. Nucleic Acids Research. 33, 433-437 (2005).
  27. Zhou, Y. Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10, 1523 (2019).
  28. Pundir, S., et al. UniProt protein knowledgebase. Methods in Molecular Biology. 1558, 41-55 (2017).
  29. Burley, S. K., et al. Protein data bank (PDB): The single global macromolecular structure archive. Methods in Molecular Biology. 1607, 627-641 (2017).
  30. Welsh, L. C., Welsh, M. VEGFA and tumour angiogenesis. Journal of Internal Medicine. 273 (2), 114-127 (2013).
  31. Hsu, L. H., Chu, N. M., Kao, S. H. Estrogen, estrogen receptor and lung cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1713 (2017).
  32. Atmaca, A., et al. SNAI2/SLUG and estrogen receptor mRNA expression are inversely correlated and prognostic of patient outcome in metastatic non-small cell lung cancer. BMC Cancer. 15, 300 (2015).
  33. Lakshmi, S. P., Reddy, A. T., Banno, A., Reddy, R. C. PPAR agonists for the prevention and treatment of lung cancer. PPAR Research. 2017, 8252796 (2017).
  34. Oguro, A., Sakamoto, K., Funae, Y., Imaoka, S. Overexpression of CYP3A4, but not of CYP2D6, promotes hypoxic response and cell growth of Hep3B cells. Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 26 (4), 407-415 (2011).
  35. Jamroze, A., Chatta, G., Tang, D. G. Androgen receptor (AR) heterogeneity in prostate cancer and therapy resistance. Cancer Letters. 518, 1-9 (2021).
  36. Wu, Y. I., et al. Regulation of global gene expression and cell proliferation by APP. Scientific Reports. 6, 22460 (2016).
  37. Sedlář, A., et al. Growth factors VEGF-A 165 and FGF-2 as multifunctional biomolecules governing cell adhesion and proliferation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1843 (2021).
  38. Guo, L. H., Yin, M., Wang, Y. X. CREB1, a direct target of miR-122, promotes cell proliferation and invasion in bladder cancer. Oncology Letters. 16 (3), 3842-3848 (2018).
  39. Wang, D. D., et al. Induction of CYP1A1 increases gefitinib-induced oxidative stress and apoptosis in A549 cells. Toxicology In Vitro. 44, 36-43 (2017).
  40. Tan, A. C. Targeting the PI3K/Akt/mTOR pathway in non-small cell lung cancer (NSCLC). Thoracic Cancer. 11 (3), 511-518 (2020).
  41. Jin, X., et al. RBM10 inhibits cell proliferation of lung adenocarcinoma via RAP1/AKT/CREB signalling pathway. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 3897-3904 (2019).
  42. Henkels, K. M., et al. Phospholipase D (PLD) drives cell invasion, tumor growth and metastasis in a human breast cancer xenograph model. Oncogene. 32 (49), 5551-5562 (2013).
  43. Zhang, Z. Y., et al. CircRNA_101237 promotes NSCLC progression via the miRNA-490-3p/MAPK1 axis. Scientific Reports. 10, 490-493 (2020).
  44. Gao, T. X., et al. Exploring the mechanism of Fu-Zi Decoction in treatment of chronic heart failure based on network pharmacology and molecular docking technology. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences. 30 (09), 705-715 (2021).
  45. Wang, B., et al. PP4C facilitates lung cancer proliferation and inhibits apoptosis via activating MAPK/ERK pathway. Pathology, Research and Practice. 216 (5), 152910 (2020).
  46. Moon, M. Y., et al. Rap1 regulates hepatic stellate cell migration through the modulation of RhoA activity in response to TGF-β1. International Journal of Molecular Medicine. 44 (2), 491-502 (2019).
  47. Kan, J., et al. He-Chan Pian inhibits the metastasis of non-small cell lung cancer via the miR-205-5p-mediated regulation of the GREM1/Rap1 signaling pathway. Phytomedicine. 94, 153821 (2022).
  48. Sidrat, T., et al. Role of Wnt signaling during in-vitro bovine blastocyst development and maturation in synergism with PPARδ signaling. Cells. 9 (4), 923 (2020).
  49. Wagner, N., Wagner, K. D. PPAR beta/delta and the hallmarks of cancer. Cells. 9 (5), 1133 (2020).
  50. Miriam, M., et al. PI3K/AKT signaling pathway and cancer: An updated review. Annals of Medicine. 46 (6), 372-383 (2014).
  51. Ma, X. L., et al. CD73 promotes hepatocellular carcinoma progression and metastasis via activating PI3K/AKT signaling by inducing Rap1-mediated membrane localization of P110β and predicts poor prognosis. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 37 (2019).
  52. Li, T., et al. Pomegranate flower extract bidirectionally regulates the proliferation, differentiation and apoptosis of 3T3-L1 cells through regulation of PPARγ expression mediated by PI3K-AKT signaling pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 131, 110769 (2020).

Tags

Ce mois-ci dans JoVE numéro 193 Adénocarcinome pulmonaire pharmacologie de réseau Trichosanthes kirilowii Maxim Fritillaria thunbergii Miq voie de signalisation PI3K / AKT
Prédiction pharmacologique en réseau et validation expérimentale du mécanisme d’action de <em>Trichosanthes-Fritillaria</em> <em>thunbergii</em> contre l’adénocarcinome pulmonaire
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, X. y., Yang, Y. y., Feng, J.… More

Zhao, X. y., Yang, Y. y., Feng, J. l., Feng, C. l. Network Pharmacology Prediction and Experimental Validation of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Action Mechanism Against Lung Adenocarcinoma. J. Vis. Exp. (193), e64847, doi:10.3791/64847 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter