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Immunology and Infection

मानव कोरोनावायरस-होस्ट इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए एक वायु-तरल इंटरफ़ेस पर विकसित प्राथमिक नाक उपकला कोशिकाओं का संक्रमण

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/64868
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3,4, 1,2, 3,4
1Department of Microbiology, University of Pennsylvania, 2Penn Center for Research on Coronaviruses and Other Emerging Pathogens, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, University of Pennsylvania, 4Corporal Michael J. Crescenz VA Medical Center

Summary

नाक उपकला सभी श्वसन रोगजनकों द्वारा सामना की जाने वाली प्राथमिक बाधा साइट है। यहां, हम शारीरिक रूप से प्रासंगिक प्रणाली में मानव कोरोनावायरस-होस्ट इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) संस्कृतियों के रूप में विकसित प्राथमिक नाक उपकला कोशिकाओं का उपयोग करने के तरीकों की रूपरेखा तैयार करते हैं।

Abstract

तीन अत्यधिक रोगजनक मानव कोरोनावायरस (एचसीओवी) - सार्स-सीओवी (2002), एमईआरएस-सीओवी (2012), और सार्स-सीओवी-2 (2019) - उभरे हैं और पिछले 20 वर्षों में महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य संकट पैदा किए हैं। चार अतिरिक्त एचसीओवी हर साल सामान्य सर्दी के मामलों (एचसीओवी-एनएल 63, -229 ई, -ओसी 43, और -एचकेयू 1) के एक महत्वपूर्ण हिस्से का कारण बनते हैं, जो शारीरिक रूप से प्रासंगिक प्रणालियों में इन वायरस का अध्ययन करने के महत्व पर प्रकाश डालते हैं। एचसीओवी श्वसन पथ में प्रवेश करते हैं और नाक उपकला में संक्रमण स्थापित करते हैं, जो सभी श्वसन रोगजनकों द्वारा सामना की जाने वाली प्राथमिक साइट है। हम एक प्राथमिक नाक उपकला संस्कृति प्रणाली का उपयोग करते हैं जिसमें इस महत्वपूर्ण प्रहरी स्थल पर मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए रोगी-व्युत्पन्न नाक के नमूने एक वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) पर उगाए जाते हैं। ये संस्कृतियां विवो वायुमार्ग की कई विशेषताओं को पुन: प्रस्तुत करती हैं, जिसमें सेल प्रकार मौजूद हैं, सिलिअरी फ़ंक्शन और बलगम उत्पादन। हम एचसीओवी संक्रमण के बाद नाक एएलआई संस्कृतियों में वायरल प्रतिकृति, मेजबान सेल ट्रोपिज्म, वायरस-प्रेरित साइटोटॉक्सिसिटी और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रेरण को चिह्नित करने के तरीकों का वर्णन करते हैं, उदाहरण1 के रूप में घातक और मौसमी एचसीओवी की तुलना करने वाले हालिया काम का उपयोग करते हैं। नाक में मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन की बढ़ती समझ में एचसीओवी और अन्य श्वसन वायरस के खिलाफ एंटीवायरल चिकित्सीय के लिए नए लक्ष्य प्रदान करने की क्षमता है जो भविष्य में उभरने की संभावना है।

Introduction

अब तक सात मानव कोरोनावायरस (एचसीओवी) की पहचान की गई है और यहश्वसन रोगों की एक श्रृंखला का कारण बनता है। सामान्य या मौसमी एचसीओवी (एचसीओवी-एनएल 63, -229 ई, -ओसी 43, और -एचकेयू 1) आमतौर पर ऊपरी श्वसन पथ विकृति से जुड़े होते हैं और सालाना अनुमानित 10% -30% सामान्य सर्दी के मामलों का कारण बनते हैं। हालांकि यह सामान्य एचसीओवी से जुड़ा विशिष्ट नैदानिक फेनोटाइप है, ये वायरस बच्चों, बड़े वयस्कों और इम्युनोकॉम्प्रोमाइज्डव्यक्तियों सहित जोखिम वाली आबादी में अधिक महत्वपूर्ण निचले श्वसन पथ की बीमारी का कारण बन सकते हैं। पिछले 20 वर्षों में तीन रोगजनक एचसीओवी उभरे हैं और महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य आपात स्थिति पैदा की हैं, जिनमें गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम (सार्स)-सीओवी, मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम (एमईआरएस)-सीओवी और सार्स-सीओवी-2 शामिल हैं। घातक एचसीओवी अधिक गंभीर श्वसन पथ विकृति से जुड़े होते हैं, जो स्पष्ट रूप से एमईआरएस-सीओवी मामलों से जुड़े >34% मामले-मृत्यु दर (2012 में इसके उद्भव के बाद से 2,500 से अधिक मामलों से 894 मौतें) 5,6 द्वारा चित्रित किया गया है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि घातक एचसीओवी श्वसन पथ के रोगों की एक श्रृंखला का कारण बनते हैं, जिसमें स्पर्शोन्मुख संक्रमण से लेकर घातक निमोनिया तक शामिल हैं, जैसा कि चल रहे सीओवीआईडी -19 महामारी7 के साथ देखा गया है।

एचसीओवी, अन्य श्वसन रोगजनकों की तरह, श्वसन पथ में प्रवेश करते हैं और नाक उपकला8 में एक उत्पादक संक्रमण स्थापित करते हैं। निचले वायुमार्ग में फैलने को मौखिक / नाक गुहा से फेफड़ों तक आकांक्षा से जुड़ा हुआ माना जाता है, जहां एचसीओवी अधिक महत्वपूर्ण निचले श्वसन पथ विकृति 9,10,11 का कारण बनता है। इस प्रकार, नाक वायरल प्रवेश के लिए प्रारंभिक पोर्टल के रूप में कार्य करता है और इसकी मजबूत म्यूकोसिलरी क्लीयरेंस मशीनरी और अद्वितीय जन्मजात प्रतिरक्षा तंत्र के साथ संक्रमण के लिए प्राथमिक बाधा है जिसका उद्देश्य निचले वायुमार्ग12,13 में आगे वायरल प्रसार को रोकना है। उदाहरण के लिए, नाक उपकला कोशिकाओं को एंटीवायरल इंटरफेरॉन और इंटरफेरॉन-उत्तेजित जीन के औसत बेसल स्तर से अधिक व्यक्त करने की सूचना दी गई है, यह दर्शाता है कि श्वसन वायरस14,15,16 के लिए प्रारंभिक प्रतिक्रियाओं के लिए नाक की कोशिकाएं प्रमुख हो सकती हैं।

हमने पहले नाक में एचसीओवी-होस्ट इंटरैक्शन को मॉडल करने के लिए वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) में विकसित रोगी-व्युत्पन्न प्राथमिक नाक उपकला कोशिकाओं का उपयोग किया है, जहां एचसीओवी संक्रमण शुरू होता है। नाक की एएलआई संस्कृतियां रोगजनक (सार्स-सीओवी-2 और एमईआरएस-सीओवी) और सामान्य एचसीओवी (एचसीओवी-एनएल63 और एचसीओवी-229ई) दोनों के लिए अनुमेय हैं और पारंपरिक वायुमार्ग उपकला कोशिका लाइनों जैसे ए 549 (एक फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा सेल लाइन) 16,17 पर विभिन्न लाभ प्रदान करती हैं। भेदभाव के बाद, नाक एएलआई संस्कृतियों में एक विषम सेलुलर आबादी होती है और विवो नाक उपकला में अपेक्षित कई कार्यों का प्रदर्शन करती है, जैसे कि म्यूकोसिलरी क्लीयरेंस मशीनरी18। नाक कोशिकाएं निचले वायुमार्ग संस्कृति प्रणालियों (जैसे मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं, एचबीईसी) पर भी लाभ प्रदान करती हैं, क्योंकि साइटोलॉजिकल ब्रशिंग के माध्यम से नाक उपकला कोशिकाओं का अधिग्रहण एचबीईसी 19,20,21 प्राप्त करने के लिए ब्रोंकोस्कोपी जैसी तकनीकों का उपयोग करने की तुलना में काफी कम आक्रामक है।

यह पेपर नाक उपकला में एचसीओवी-होस्ट इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए इस नाक एएलआई संस्कृति प्रणाली का उपयोग करने के तरीकों का वर्णन करता है। हमने सार्स-सीओवी-2, एमईआरएस-सीओवी, एचसीओवी-एनएल63 और एचसीओवी-229ई 1,16,17 की तुलना करने के लिए हाल ही में प्रकाशित कार्यों में इन तरीकों को लागू किया है। हालांकि ये विधियां और प्रतिनिधि परिणाम इस नाक सेल मॉडल में एचसीओवी के अध्ययन पर जोर देते हैं, सिस्टम अन्य एचसीओवी, साथ ही अन्य श्वसन रोगजनकों के लिए अत्यधिक अनुकूलनीय है। इसके अलावा, इन विधियों को वायरल प्रतिकृति और सेलुलर ट्रोपिज्म, साथ ही संक्रमण के बाद साइटोटॉक्सिसिटी और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रेरण की जांच करने के लिए अन्य एएलआई संस्कृति प्रणालियों पर अधिक व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।

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Protocol

नाक के नमूनों के उपयोग को पेंसिल्वेनिया संस्थागत समीक्षा बोर्ड (प्रोटोकॉल # 800614) और फिलाडेल्फिया वीए संस्थागत समीक्षा बोर्ड (प्रोटोकॉल # 00781) विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. नाक एएलआई संस्कृतियों का संक्रमण

नोट: नैदानिक नमूनों का अधिग्रहण, साथ ही नाक एएलआई संस्कृतियों का विकास और भेदभाव, इस पेपर के दायरे से बाहर है। प्राथमिक नाक उपकला कोशिकाओं के संवर्धन के लिए विशिष्ट तरीके इन संस्कृतियों18,22,23 का उपयोग करके हाल ही में प्रकाशित कार्यों में पाए जा सकते हैं। यदि वांछित हो तो नीचे दिए गए प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नाक उपकला एएलआई संस्कृतियों पर भी लागू किए जा सकते हैं। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल और वॉल्यूम 24-वेल प्लेट ट्रांसवेल इंसर्ट (6.5 मिमी व्यास, 0.33 सेमी2 झिल्ली सतह क्षेत्र) पर लागू होते हैं। यदि बड़े ट्रांसवेल (यानी, 12-वेल प्लेट्स, 12 मिमी व्यास, 1.12 सेमी2 सतह क्षेत्र) पर उगाई गई एएलआई संस्कृतियों का उपयोग करते हुए, ट्रांसवेल आकार को प्रतिबिंबित करने के लिए वॉल्यूम को आनुपातिक रूप से समायोजित करें।

  1. संक्रमण से एक दिन पहले:
    1. एएलआई संस्कृतियों को फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ 3x धोएं (गर्म पीबीएस के ~ 200 μL जोड़ें, 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें, एस्पिरेट पीबीएस, और दोहराएं)।
    2. बेसल माध्यम (500 μL) को प्रतिस्थापित करें।
    3. संस्कृतियों को उस तापमान पर संतुलन करने की अनुमति दें जिस पर संक्रमण रात भर आयोजित किया जाएगा (यानी, यदि 33 डिग्री सेल्सियस पर संक्रमित होता है, तो पीबीएस धोने के बाद संस्कृतियों को 33 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें)।
      नोट: सामान्य सर्दी से जुड़े एचसीओवी जैसे एचसीओवी -229 ई और एचसीओवी-एनएल 63 को 33 डिग्री सेल्सियस पर अधिक कुशलता से दोहराने की सूचना दी गई है। इसके अतिरिक्त, विवो नाक उपकला में तापमान 33 डिग्री सेल्सियस है (यह फेफड़े के तापमान से भिन्न होता है, जो 37 डिग्री सेल्सियस है)।
  2. सीरम मुक्त डलबेकको के मॉडिफाइड ईगल मीडियम (डीएमईएम) में आवश्यकतानुसार वायरस को पतला करें ताकि 50 μL की कुल इनोकुलम मात्रा में संक्रमण की वांछित बहुलता (एमओआई) प्राप्त की जा सके।
    नोट: संक्रमण आमतौर पर एमओआई = 5 (उच्च एमओआई) पर आयोजित किया गया है; हालांकि, एमओआई = 0.5 (कम एमओआई) पर संक्रमण का उपयोग सार्स-सीओवी-2 और सामान्य सर्दी से जुड़े एचसीओवी के लिए भी किया गया है, और इनके परिणामस्वरूप तुलनीय पीक वायरल टिटर्स होते हैं, लेकिन परिवर्तनीय कैनेटीक्स (या तो एमओआई स्वीकार्य है)।
  3. इनोकुलम को एपिकल रूप से जोड़ें, और संस्कृतियों को 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  4. संक्रमण के दौरान हर 15 मिनट में रॉक प्लेट्स को धीरे से (वायरल इनोकुलम के समान सोखने के लिए प्लेट को दोनों हाथों में मजबूती से पकड़ना, आगे और पीछे और बगल से बगल में रखना)।
  5. इनक्यूबेशन के 1 घंटे के बाद, वायरल इनोकुलम को एस्पिरेट करें, और वायरल इनोकुलम को हटाने के लिए पीबीएस के साथ प्रत्येक संक्रमित कल्चर को 3 गुना धो लें (प्रत्येक धोने के लिए, पीबीएस के 200 μL जोड़ें, 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और पिपेट के साथ एस्पिरेट या निकालें)।
  6. यदि वांछित हो, तो इनपुट वायरस के पर्याप्त निष्कासन की पुष्टि करने के लिए तीसरा पीबीएस वॉश एकत्र करें।
  7. संक्रमण के दौरान हर 72 घंटे में संक्रमित एएलआई पर बेसल माध्यम को ताजा माध्यम से बदलें।

2. एपिकल सतह तरल (एएसएल) का संग्रह और शेड वायरस का अनुमापन।

  1. संक्रमण के बाद पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं पर, प्रत्येक संक्रमित ट्रांसवेल के एपिकल चैंबर में पीबीएस के 200 μL जोड़ें।
    नोट: प्रासंगिक समय बिंदु एचसीओवी के आधार पर भिन्न होते हैं और संक्रमण के बाद 24 घंटे से 192 घंटे तक होते हैं (विभिन्न एचसीओवी के लिए वायरल प्रतिकृति डेटा के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें)।
  2. पिपेट पीबीएस को एपिकल शेड वायरस के अधिकतम संग्रह को सुनिश्चित करने के लिए 5 x ऊपर और नीचे करें, और पूरी मात्रा को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें (यह एएसएल नमूना है)।
    नोट: एएसएल में एएलआई संस्कृतियों से स्रावित बलगम और अन्य उत्पादों के अलावा वायरल कण शामिल हैं।
  3. मानक वायरल पट्टिका परख के माध्यम से एएसएल में संक्रामक वायरस की मात्रा निर्धारित करें (वायरल कणों की एकाग्रता को निर्धारित करने के लिए वायरस युक्त नमूनों को क्रमिक रूप से पतला करें)।
    नोट: पट्टिका परख के लिए उपयोग किए जाने वाले सेल प्रकार और इनक्यूबेशन अवधि उपयोग किए गए वायरस पर निर्भर करेगी: सार्स-सीओवी -2 (वेरोई 6 कोशिकाएं); MERS-CoV (वेरोसीसीएल 81 कोशिकाएं); HCoV-NL63 (LLC-MK2 कोशिकाएं); HCoV-229E (Huh7 कोशिकाएं)। वायरल पट्टिका परख का संचालन करने के तरीके पर विनिर्देश इस पांडुलिपि के दायरे से परे हैं, लेकिन पहले जर्नल ऑफ विज़ुअलाइज़्ड एक्सपेरिमेंट्स (JoVE) प्रकाशन24 में विस्तृत किया गया है।
  4. यदि वांछित हो, तो बेसल रूप से जारी वायरस की अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए संक्रमण के बाद विभिन्न समय पर बेसल माध्यम एकत्र करें। एचसीओवी आमतौर पर नाक उपकला कोशिकाओं से एपिकल रूप से जारी किए जाते हैं, लेकिन इसकी पुष्टि बिना पतला बेसल माध्यम की पट्टिका परख के माध्यम से करते हैं।
  5. एएसएल नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें यदि संग्रह के दिन पट्टिका परख द्वारा परिमाणीकरण नहीं होगा।

3. इंट्रासेल्युलर वायरस का परिमाणीकरण

  1. एएसएल नमूना एकत्र करने के बाद, प्रत्येक ट्रांसवेल को एक साफ 24-वेल प्लेट में ले जाएं जिसमें डीएमईएम के 500 μL प्रीलोडेड होते हैं जिसमें 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) बेसल होता है।
    नोट: 2% एफबीएस के साथ डीएमईएम का उपयोग बाद के फ्रीज-पिघलने चक्रों के दौरान वायरस को स्थिर करने के लिए किया जाता है।
  2. एपिकल शेड वायरस को पूरी तरह से हटाने के लिए पीबीएस के साथ प्रत्येक ट्रांसवेल 3 x एपिकल रूप से धोएं।
  3. अंतिम पीबीएस वॉश को हटाने के बाद, एपिकल डिब्बे में 2% एफबीएस के साथ डीएमईएम के 100 μL जोड़ें।
  4. एपिकल और बेसल मीडिया दोनों के साथ ट्रांसवेल युक्त प्लेट को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ले जाएं, और कोशिकाओं को स्थिर करने के लिए लगातार तीन फ्रीज-पिघलना चक्र पूरा करें।
  5. अंतिम फ्रीज-पिघलना चक्र के बाद, एपिकल (100 μL) और बेसल (500 μL) मीडिया को एक साफ ट्यूब में पूल करें।
  6. किसी भी सेलुलर मलबे को पेलेट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  7. सतह पर तैरने वाला इकट्ठा करें। यह मानक पट्टिका परख के माध्यम से अनुमापन के लिए इंट्रासेल्युलर वायरस का नमूना है।
    नोट: एएसएल संग्रह के सापेक्ष संग्रह प्रक्रिया के दौरान तीन गुना कमजोर पड़ने की संभावना है; एएसएल नमूने पीबीएस के 200 μL में एकत्र किए जाते हैं, जबकि इंट्रासेल्युलर वायरस का नमूना 600 μL की कुल मात्रा में एकत्र किया जाता है।

4. ट्रांसएपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईआर) माप।

नोट: टीईआर माप के लिए, कैल्शियम और मैग्नीशियम (पीबीएस + सीए 2 + / मिलीग्राम2 +) के साथ पूरक पीबीएस का उपयोग किया जाना चाहिए। ओम में पढ़ने के लिए एक उपकला वोल्ट / ओममीटर सेट का उपयोग किया जाता है (सामग्री की तालिका देखें)।

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार EVOM उपकरण को साफ, समतुल्य और रिक्त करें; एक "खाली" ट्रांसवेल का उपयोग करें जिसमें खाली करने के लिए कोई नाक की कोशिकाएं नहीं जोड़ी गई हैं। रिक्त TEER माप रिकॉर्ड करें।
    नोट: यदि कई वायरस का उपयोग कर रहे हैं, तो ईवीओएम उपकरण को क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए स्थितियों के बीच सख्ती से साफ किया जाना चाहिए (विआयनीकृत पानी के बाद 70% इथेनॉल के साथ धोया जाना पर्याप्त है)।
  2. ट्रांसवेल से अवशिष्ट बेसल माध्यम को धोने के लिए प्रत्येक संक्रमित ट्रांसवेल को 500 μL PBS + Ca2 + / Mg2 + बेसल के साथ एक प्रीलेबल, साफ 24-वेल प्लेट में ले जाएं।
  3. प्रत्येक ट्रांसवेल के एपिकल डिब्बे में पीबीएस + सीए 2 + / एमजी2 + के200 μL जोड़ें।
  4. एंडोहम -6 माप कक्ष में पीबीएस + सीए 2 + / मिलीग्राम2 + के 1 एमएल जोड़ें।
  5. प्रत्येक ट्रांसवेल को एंडोहम -6 माप कक्ष में ले जाएं, और कक्ष के ढक्कन को प्रतिस्थापित करें ताकि एपिकल इलेक्ट्रोड एपिकल डिब्बे में पीबीएस के 200 μL में टिका रहे; बेसल इलेक्ट्रोड एंडोहम -6 कक्ष के तल में बनाया गया है।
  6. EVOM रीडिंग को स्थिर करने की अनुमति दें, और कच्चे TEER माप को रिकॉर्ड करें।
  7. टीईआर माप लेने के बाद ऊपर वर्णित एएसएल नमूना एकत्र करें यदि टिटरिंग वांछित है (टीईआर माप के लिए जोड़े गए पीबीएस + सीए 2 + / मिलीग्राम2 + के 200 μL में एकत्र करें)।
    नोट: एएसएल नमूना संग्रह उपकला बाधा में सूक्ष्म-आँसू को प्रेरित कर सकता है जो टीईआर रीडिंग को भ्रमित कर सकता है, इसलिए टीईआर माप के बाद एएसएल एकत्र किया जाना चाहिए। इसके अलावा, टीईआर रीडिंग से तुरंत पहले बेसल माध्यम को नहीं बदला जाना चाहिए क्योंकि यह टीईआर मूल्यों को भी प्रभावित कर सकता है।
  8. कच्चे टीईआर रीडिंग को ओम्स /सेमी2 में अंतिम माप में बदलने के लिए, रिक्त टीईआर मान घटाएं, और समीकरण (1) का उपयोग करके ट्रांसवेल झिल्ली के सतह क्षेत्र से इस मान को गुणा करें:
    टीईआर = [टीईआर रीडिंग - रिक्त टीईआर मान] × (ट्रांसवेल का सतह क्षेत्र) (1)।
  9. एचसीओवी के लिए, संक्रमण के बाद हर 24 घंटे या 48 घंटे में टीईआर का मूल्यांकन करें; टीईआर परिवर्तनों के कैनेटीक्स अक्सर वायरस के बीच भिन्न होते हैं और विभिन्न समय बिंदुओं पर समस्या निवारण की आवश्यकता होती है।
  10. टीईआर को मापते समय, हमेशा मॉक-संक्रमित संस्कृतियों को शामिल करें और प्रत्येक समय बिंदु (नकारात्मक नियंत्रण) पर मूल्यांकन करें।
    नोट: नकली संस्कृतियों के लिए, टीईआर माप स्थिर रहना चाहिए या संस्कृतियों के भेदभाव के पूरा होने के बाद बेसलाइन से थोड़ा बढ़ सकता है। झिल्ली समर्थन का सतह क्षेत्र ट्रांसवेल के आकार और निर्माता के आधार पर भिन्न होगा; 24-वेल ट्रांसवेल में आमतौर पर 0.33 सेमी 2 का सतह क्षेत्र होताहै।

5. लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) परख के माध्यम से संक्रमण के दौरान साइटोटॉक्सिसिटी का माप।

नोट: इस काम में, एएसएल नमूनों में एलडीएच सामग्री को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध साइटोटॉक्सिसिटी डिटेक्शन किट का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। बेसल माध्यम में एलडीएच सिग्नल अक्सर पहचान की सीमा से नीचे था और अक्सर एचसीओवी-संक्रमित संस्कृतियों से एएसएल नमूनों में एलडीएच की मात्रा की तुलना में कम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य था।

  1. एलडीएच परख के लिए आवश्यक अतिरिक्त नियंत्रण तैयार करें।
    1. पृष्ठभूमि नियंत्रण: पीबीएस का उपयोग करें (कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त पीबीएस का उपयोग करें यदि एएसएल नमूने इस तरह से एकत्र किए गए थे)।
    2. सकारात्मक नियंत्रण (छत मूल्य): ट्राइटन एक्स -100 के साथ एएलआई का इलाज करें। ट्राइटन नियंत्रण कुओं को इकट्ठा करें (आमतौर पर प्रत्येक समय बिंदु पर इसके लिए तीन एएलआई संस्कृतियों का उपयोग करें)।
      1. पीबीएस में 2% ट्राइटन एक्स -100 के 200 μL को सीधे ट्रांसवेल के एपिकल डिब्बे में जोड़ें।
      2. कोशिकाओं को पूरी तरह से लाइज करने की अनुमति देने के लिए 10-15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      3. ट्राइटन छत के नमूने के रूप में पूरी मात्रा एकत्र करें।
    3. नकारात्मक नियंत्रण (कम नियंत्रण / बेसलाइन एलडीएच रिलीज): संक्रमित संस्कृतियों के समान दाता से प्राप्त नकली संक्रमित एएलआई संस्कृतियों से एएसएल एकत्र करें।
      1. ऊपर एएसएल संग्रह प्रक्रिया का पालन करते हुए नकारात्मक नियंत्रण मॉक एएसएल एकत्र करें।
        नोट: सभी समय बिंदुओं के लिए इस नकारात्मक नियंत्रण के लिए एक ही ट्रांसवेल का उपयोग किया जा सकता है, जबकि ट्राइटन नियंत्रण के लिए प्रत्येक समय बिंदु के लिए ताजा ट्रांसवेल आवश्यक होंगे।
  2. प्रत्येक एएसएल नमूने से एलडीएच रीडिंग के अलावा शेड वायरस की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देने के लिए, एक ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट फ्लैट-बॉटम ब्लैक 96-वेल प्लेट निम्नानुसार लोड करें:
    1. 45 μL नमूने और 55 μL PBS (100 μL कुल मात्रा) का उपयोग करके PBS में सभी नमूने पतला करें।
    2. ट्राइटन सकारात्मक नियंत्रण और नकली पृष्ठभूमि नियंत्रण नमूनों को उसी तरह से इलाज करें।
      नोट: यह कमजोर पड़ने से प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूने (45 μL x 3) की तीन प्रतियों को लोड करने और पट्टिका परख के माध्यम से टिटरिंग के लिए पर्याप्त अवशिष्ट एएसएल मात्रा की अनुमति मिलती है।
    3. तीन प्रतियों में एलडीएच प्लेट लोड करें: ट्राइटन छत, मॉक पृष्ठभूमि नियंत्रण, पीबीएस नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूने।
    4. निर्माता (डाई समाधान + उत्प्रेरक) द्वारा इंगित प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें।
      1. प्रत्येक कुएं में 100 μL प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ें, और प्रकाश से सुरक्षित 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    5. 20 मिनट के बाद, अवशोषण को 492 एनएम पर मापें।
    6. समीकरण (2) का उपयोग करके ट्राइटन छत मूल्य के सापेक्ष प्रतिशत साइटोटॉक्सिसिटी की गणना करें।
      साइटोटॉक्सिसिटी (%) Equation 1 (2)

6. इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) इमेजिंग के लिए नाक एएलआई संस्कृतियों की तैयारी

  1. ट्रांसवेल को एक ताजा 24-वेल प्लेट में ले जाएं, और पीबीएस के साथ 3x एपिकल रूप से धोएं (टिटरिंग करते समय एएसएल के रूप में पहला पीबीएस वॉश एकत्र करें; फिर, अतिरिक्त शेड वायरस को हटाने के लिए दो अतिरिक्त पीबीएस वॉश करें जो आईएफ गुणवत्ता में बाधा डाल सकता है)
  2. अंतिम पीबीएस धोने के बाद, ट्रांसवेल को 4% पीएफए में एपिकल और बेसल रूप से कवर करें।
  3. 4% पीएफए में ठीक करने के लिए 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर पीबीएस के साथ 3x निकालें और धोएं।
  4. एक तेज रेजर ब्लेड या कैंची का उपयोग करके कोशिकाओं वाले ट्रांसवेल समर्थन का उत्पादन करें।
  5. प्रत्येक ट्रांसवेल के लिए आईएफ लक्ष्यों की संख्या बढ़ाने के लिए, प्रत्येक झिल्ली को आधे में काट लें, और प्रत्येक आधे को अलग-अलग एंटीबॉडी संयोजनों के साथ दाग दें।
  6. 10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.2% ट्राइटन एक्स -100 के साथ परमेबिलाइज करें।
  7. कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए पीबीएसटी (पीबीएस + 0.2% ट्राइटन एक्स -100) में 10% सामान्य गधा सीरम और 1% बीएसए के साथ ब्लॉक।
    नोट: इस कदम से आगे नमूने को प्रकाश जोखिम से बचाएं।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में इनक्यूबेट करें। बफर को अवरुद्ध करने में सभी एंटीबॉडी 1: 1,000 को पतला करें।
    नोट: एचसीओवी न्यूक्लियोकैप्सिड धुंधला, साथ ही उपकला सेल प्रकार मार्कर और साइटोस्केलेटल दाग के लिए प्रतिनिधि एंटीबॉडी नीचे सूचीबद्ध हैं (निर्माता जानकारी और कैटलॉग संख्या के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
    1. एचसीओवी एंटीजन धुंधला होने के लिए, सार्स-सीओवी-2 न्यूक्लियोकैप्सिड, एमईआरएस-सीओवी न्यूक्लियोकैप्सिड और एचसीओवी-एनएल 63 न्यूक्लियोकैप्सिड को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी का उपयोग करें।
    2. उपकला कोशिका प्रकारों की पहचान करने के लिए, गोब्लेट सेल मार्कर MUC5AC और सिलिएटेड सेल मार्कर टाइप IV β-ट्यूबुलिन को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी का उपयोग करें।
    3. साइटोस्केलेटल मार्करों के लिए, फेलोइडिन (एफ-एक्टिन को बांधता है) और उपकला कोशिका आसंजन मार्कर के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग करें: ईपीकैम (सीडी 326)।
  9. कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान में इनक्यूबेट; बफर को अवरुद्ध करने में 1: 1,000 पतला द्वितीयक एंटीबॉडी रंगों का उपयोग करें।
  10. धुंधला होने के बाद, झिल्ली को स्पैटुला के साथ एक ग्लास स्लाइड पर स्थानांतरित करें, ट्रांसवेल को स्लाइड की ओर एपिकल साइड के साथ उन्मुख करें, और माउंटिंग घोल जोड़ें। किनारों के चारों ओर स्पष्ट नेल पॉलिश लगाने से पहले 15-30 मिनट के लिए व्यवस्थित होने दें।
  11. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (जेड-अक्ष चरण: 0.5 μm; अनुक्रमिक स्कैनिंग) 1,16,17 का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करें।
    नोट: 4% पीएफए में संस्कृतियों के निर्धारण और पीबीएस के साथ धोने के बाद, निश्चित संस्कृतियों को धुंधला होने और इमेजिंग की तैयारी से पहले हफ्तों से महीनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। झिल्ली के धुंधला और बढ़ने के बाद, नमूने अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक (>2 वर्ष) संग्रहीत किए जा सकते हैं।

7. आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए पश्चिमी इम्यूनोब्लॉटिंग या आरएनए के लिए इंट्रासेल्युलर प्रोटीन का संग्रह।

  1. वायरल टिटर्स (प्रोटोकॉल अनुभाग 2) की मात्रा निर्धारित करते समय ऊपर वर्णित एएसएल एकत्र करें।
  2. ट्रांसवेल को एक साफ 24-वेल प्लेट में ले जाएं, क्योंकि झिल्ली को स्क्रैप करने से इंसर्ट टूट सकता है।
  3. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए, आरआईपीए बफर (50 एमएम ट्रिस, पीएच 8, 150 एमएम एनएसीएल, 0.5% डीऑक्सीकोलेट, 0.1% एसडीएस, 1% एनपी 40) के 125 μ एल में कुल प्रोटीन लाइसेट एकत्र करें, जो प्रोटीज इनहिबिटर और फॉस्फेट इनहिबिटर के साथ पूरक है।
  4. एपिकल डिब्बे में आरआईपीए बफर के 125 μL जोड़ें, और 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. किसी भी शेष संलग्न कोशिकाओं को हटाने के लिए पी 200 पिपेट टिप का उपयोग करके झिल्ली को खुरचें, और पूरी मात्रा एकत्र करें (झिल्ली की पूरी सतह पर सख्ती से खुरचें, और फिर पूरे नमूने को इकट्ठा करने के लिए कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें)।
  6. 10 मिनट के लिए बर्फ पर प्रोटीन लाइसेट नमूने इनक्यूबेट करें, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अधिकतम गति (20,000 × ग्राम) पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार β-मर्कैप्टोएथेनॉल (कम करने वाले एजेंट) के साथ 4x लैम्मली नमूना बफर के साथ सतह पर तैरनेवाला मिलाएं।
  8. प्रोटीन के नमूनों को 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालें, और फिर पारंपरिक पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल 1,16,17 का उपयोग करके चलाएं।
  9. कुल आरएनए के संग्रह के लिए, पसंद के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करें।
    नोट: 24-वेल ट्रांसवेल इंसर्ट के एपिकल कम्पार्टमेंट में ~ 200 μL की अधिकतम मात्रा है; इस प्रकार, हम कुल अनुशंसित मात्रा तक पहुंचने के लिए प्रत्येक संस्कृति पर दो अनुक्रमिक वॉश करते हैं। नीचे दिए गए विवरण 350 μL कुल मात्रा में आरएनए नमूनों के अनुशंसित संग्रह के अनुरूप हैं।
  10. संक्रमित ट्रांसवेल के एपिकल डिब्बे में 200 μL लाइसिस बफर जोड़ें।
  11. 5-10 मिनट के लिए बैठने दें, पिपेट टिप का उपयोग करके झिल्ली से किसी भी शेष कोशिकाओं को खुरचें, और पूरी मात्रा को एक लेबल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें।
  12. ट्रांसवेल के एपिकल डिब्बे में 150 μL अतिरिक्त लाइसिस बफर जोड़ें, और एक ही माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा होने से पहले ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  13. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार आरएनए निकालें।

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Representative Results

प्रतिनिधि आंकड़े आंशिक रूप से डेटा से अनुकूलित होते हैं जो पांडुलिपि ओटर एट अल .1 में पाए जा सकते हैं। चार या छह दाताओं से प्राप्त नाक एएलआई संस्कृतियां ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार चार एचसीओवी (सार्स-सीओवी-2, एमईआरएस-सीओवी, एचसीओवी-एनएल63 और एचसीओवी-229ई) में से एक से संक्रमित थीं, और प्रत्येक वायरस के लिए औसत एपिकल शेड वायरल टिटर्स को चित्रा 1 ए में दर्शाया गया है। जबकि ये सभी चार एचसीओवी नाक की एएलआई संस्कृतियों में उत्पादक रूप से प्रतिकृति करते हैं, सार्स-सीओवी-2 और एचसीओवी-229ई सबसे कुशलता से प्रतिकृति बनाते हैं। ध्यान दें कि ये औसत वायरल टिटर्स हैं, और व्यक्तिगत दाताओं में प्रत्येक एचसीओवी के लिए टिटर्स हाल हीमें प्रकाशित किए गए थे। प्रोटोकॉल खंड 3 में वर्णित नाक एएलआई संस्कृतियों को धोने के बाद, एपिकल सतह तरल (एएसएल) में एमईआरएस-सीओवी टिटर्स की तुलना चित्रा 1 बी में इंट्रासेल्युलर वायरल टिटर्स से की जाती है। एमईआरएस-सीओवी इंट्रासेल्युलर और एपिकल-शेड वायरल टिटर्स संक्रमण (एचपीआई) के बाद 48 घंटे में लगभग समान होते हैं।

संक्रमित नाक एएलआई संस्कृतियों की इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग एक शक्तिशाली उपकरण है जिसका उपयोग सेलुलर ट्रोपिज्म और अन्य संक्रमण मापदंडों की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि सिंकिटिया गठन, सेल-टू-सेल फ्यूजन और उपकला बाधा अखंडता को नुकसान। वायरल एंटीजन (जैसे न्यूक्लियोकैप्सिड या एचसीओवी नॉनस्ट्रक्चरल प्रोटीन) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी और सिलिएटेड या गोब्लेट कोशिकाओं (क्रमशः टाइप IV β-ट्यूबुलिन और एमयूसी 5एसी) के लिए मार्करों के साथ संक्रमित संस्कृतियों का सह-धुंधलापन नाक एएलआई25,26 में एचसीओवी के लिए सेलुलर ट्रोपिज्म निर्धारित कर सकता है। चित्र 2ए सार्स-सीओवी-2, एमईआरएस-सीओवी और एचसीओवी-एनएल63 से संक्रमित नाक संस्कृतियों की प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है।

सार्स-सीओवी-2 और एचसीओवी-एनएल63 मुख्य रूप से सिलिएटेड कोशिकाओं को संक्रमित करते हैं (सिलिया मार्कर टाइप IV β-ट्यूबुलिन के साथ वायरल न्यूक्लियोकैप्सिड धुंधला होने के सह-स्थानीयकरण और गोब्लेट सेल मार्कर एमयूसी 5एसी के साथ वायरल एंटीजन के कोलोकलाइजेशन की कमी से स्पष्ट है)। एमईआरएस-सीओवी मुख्य रूप से नाक एएलआई संस्कृतियों में गैर-सिलिएटेड गोब्लेट कोशिकाओं को संक्रमित करता है, क्योंकि एमईआरएस-सीओवी विपरीत पैटर्न दिखाता है, जिसमें एमयूसी 5एसी के साथ वायरल एंटीजन धुंधला होने का सह-स्थानीयकरण और टाइप IV β-ट्यूबुलिन के साथ वायरल न्यूक्लियोकैप्सिड धुंधला होने का न्यूनतम कोलोकलाइजेशन होता है। फेलोइडिन जैसे मार्कर, जो एक्टिन फिलामेंट्स, या ईपीकैम, उपकला कोशिका आसंजन अणु को बांधते हैं, का उपयोग उपकला साइटोस्केलेटन की कल्पना करने और उपकलाबाधा अखंडता के नुकसान का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। चित्रा 2 बी नाक एएलआई संस्कृतियों में फैलोइडिन धुंधला दिखाता है; पैनल 1 एक नकली संक्रमित संस्कृति में बरकरार साइटोस्केलेटल एफ-एक्टिन अल्ट्रास्ट्रक्चर दिखाता है, और पैनल 2 फेलोइडिन अखंडता के नुकसान को दर्शाता है और एचसीओवी-एनएल 63-संक्रमित संस्कृति में उपकला बाधा समारोह को संभावित नुकसान का सुझाव देता है। संक्रमण के दौरान उपकला बाधा गतिशीलता को चिह्नित करने के लिए इन जैसे उपकला मार्करों को एचसीओवी संक्रमण पर लागू किया जा सकता है।

चार एचसीओवी में से प्रत्येक के साथ नाक एएलआई संस्कृतियों के संक्रमण के बाद, ट्रांस-एपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईआर) की निगरानी की गई थी। संक्रमण से पहले बेसलाइन टीईआर रीडिंग दर्ज की गई थी, 0 एचपीआई, और टीईआर का मूल्यांकन फिर से 96 एचपीआई और 192 एचपीआई पर प्रत्येक ट्रांसवेल के लिए किया गया था। चित्र 3 प्रत्येक एचसीओवी के लिए टीईआर परिवर्तनों को दर्शाता है। चित्र 3A, B में त्रिभुज TEER मान दिखाते हैं (किसी भी बिंदु पर मापा गया TEER से 0 hpi पर बेसलाइन TEER को घटाकर प्रत्येक ट्रांसवेल के लिए गणना की गई TEER में अंतर)। सार्स-सीओवी-2, एमईआरएस-सीओवी और एचसीओवी-एनएल63 के लिए, टीईआर में बड़े बदलाव संक्रमण (192 एचपीआई) में देर से होते हैं, और चित्र 3ए दर्शाता है कि सार्स-सीओवी-2 और एचसीओवी-एनएल63 संक्रमणों के परिणामस्वरूप नकारात्मक त्रिभुज टीईईआर मान (192 एचपीआई - 0 एचपीआई) होते हैं, जबकि एमईआरएस-सीओवी संक्रमण नहीं होता है। तुलना के लिए मॉक त्रिभुज मान शामिल किए गए हैं और बताते हैं कि एमईआरएस-सीओवी संक्रमण के बाद टीईआर में परिवर्तन मॉक संक्रमण के दौरान देखे गए परिवर्तनों की तुलना में काफी अलग नहीं हैं। नकारात्मक त्रिभुज मान उपकला बाधा अखंडता में कमी और उपकला बाधा समारोह से समझौता करने का संकेत देते हैं। चित्र 3B HCoV-229E (96 hpi और 192 hpi से गणना) के लिए त्रिभुज TEER मान दिखाता है। HCoV-229E पहले समय बिंदु (96 एचपीआई) पर उपकला बाधा शिथिलता का कारण बनता है, लेकिन नकली स्तर पर वसूली बाद के समय बिंदु (192 एचपीआई) पर होती है। ये डेटा इस बात पर प्रकाश डालते हैं कि टीईआर कैनेटीक्स वायरस के बीच कैसे भिन्न हो सकते हैं। चित्रा 3 सी, डी टीईआर निशान दिखाते हैं, जो समय के साथ प्रत्येक संक्रमित ट्रांसवेल के लिए कच्चे टीईआर डेटा को दर्शाते हैं, इस प्रकार संक्रमण के दौरान टीईआर रुझानों के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देते हैं। यदि वांछित हो, तो साइटोकिन आईएल -13 के साथ उपचार को टीईआर प्रयोगों के दौरान एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया जा सकता है, क्योंकि यह तंग जंक्शनों को बाधित करता है, उपकला बाधा समारोह से समझौता करता है, और इस प्रकार, वायुमार्ग एपिथेलिया में झिल्ली पारगम्यता बढ़ाता है; इसलिए, साइटोकिन आईएल -13 के परिणामस्वरूप टीईआर 28,29,30 में कमी होने की उम्मीद है।

नाक संस्कृतियों में टीईआर माप के पूरक के लिए, साइटोटॉक्सिसिटी को संक्रमण के दौरान एपिकल रूप से जारी लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) की मात्रा का परिमाणीकरण के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है। चित्रा 4 में प्रत्येक एचसीओवी परख से संक्रमित 10 दाताओं से प्राप्त संस्कृतियों से 96 एचपीआई और 192 एचपीआई पर औसत साइटोटॉक्सिसिटी डेटा को दर्शाया गया है। सार्स-सीओवी-2, एचसीओवी-एनएल63 और एचकोव-229ई नाक की संस्कृतियों में महत्वपूर्ण साइटोटॉक्सिसिटी का कारण बनते हैं, जबकि एमईआरएस-सीओवी ऐसा नहीं करता है।

संक्रमित नाक संस्कृतियों से एकत्र किए गए कुल प्रोटीन या आरएनए का उपयोग विभिन्न एचसीओवी-होस्ट इंटरैक्शन की जांच के लिए किया जा सकता है। हमने गोब्लेट सेल हाइपरप्लासिया को प्रेरित करने और अस्थमा वायुमार्ग के ऊतक परिदृश्य को मॉडल करने के लिए टाइप 2 साइटोकिन आईएल -13 के साथ नाक संस्कृतियों का इलाज किया। चित्रा 5 ए आईएल -13 उपचार के बाद दो प्रमुख एचसीओवी रिसेप्टर्स के एमआरएनए बहुतायत को निर्धारित करने वाले क्यूपीसीआर डेटा को दर्शाता है। डीपीपी 4 एमईआरएस-सीओवी के लिए सेलुलर रिसेप्टर है, और एसीई2 सार्स-सीओवी-2 और एचसीओवी-एनएल63 दोनों के लिए सेलुलर रिसेप्टर है। आईएल -13 उपचार के परिणामस्वरूप नाटकीय रूप से डीपीपी 4 अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई है लेकिन एसीई 2 अभिव्यक्ति में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं हुआ है। चित्र 5बी असंक्रमित और सार्स-सीओवी-2 संक्रमित संस्कृतियों में आईएल-13 उपचार के बाद प्रोटीन की प्रचुरता का मूल्यांकन करने के लिए पश्चिमी धब्बा डेटा दिखाता है। आईएल -13 उपचार के परिणामस्वरूप एमयूसी 5एसी (एक गोब्लेट सेल मार्कर) में काफी वृद्धि हुई है और टाइप IV β-ट्यूबुलिन (एक सिलिएटेड सेल मार्कर) में कमी आई है, जो इस साइटोकिन उपचार के कारण अपेक्षित गोब्लेट सेल हाइपरप्लासिया को दर्शाता है। प्रोटीन-स्तर विश्लेषण से पता चलता है कि आईएल -13 उपचार डीपीपी 4 अभिव्यक्ति को बढ़ाता है लेकिन एसीई 2 अभिव्यक्ति को कम करता है। सार्स-सीओवी-2 न्यूक्लियोकैप्सिड प्रोटीन के लिए वेस्टर्न ब्लॉटिंग से पता चलता है कि आईएल-13 उपचार के परिणामस्वरूप शाम-उपचारित संस्कृतियों की तुलना में वायरल एंटीजन में थोड़ी कमी आती है। नाक की एएलआई संस्कृतियों और / या एचसीओवी के साथ संक्रमण के हेरफेर के बाद किसी भी एमआरएनए या प्रोटीन के लिए इसी तरह के विश्लेषण किए जा सकते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: नाक एएलआई संस्कृतियों में एचसीओवी प्रतिकृति। छह या चार दाताओं से प्राप्त नाक कल्चर को एमओआई = 5 पर सार्स-सीओवी-2 (6), एमईआरएस-सीओवी (6), एचसीओवी-एनएल 63 (6), या एचसीओवी-229ई (4) के साथ तीन प्रतियों में संक्रमित किया गया था। एपिकल सतह तरल को 0 एचपीआई, 48 एचपीआई, 96 एचपीआई और 144 एचपीआई पर एकत्र किया गया था, और संक्रामक वायरस को पट्टिका परख द्वारा निर्धारित किया गया था। (ए) प्रत्येक एचसीओवी से संक्रमित सभी दाताओं से औसत वायरल टिटर्स को दर्शाया गया है। (बी) एक एकल दाता से प्राप्त नाक संस्कृतियों को एमओआई = 5 पर तीन प्रतियों में संक्रमित किया गया था, और एएसएल को 48 एचपीआई पर एकत्र किया गया था। एएसएल संग्रह के बाद, ट्रांसवेल को पीबीएस के साथ 3 गुना धोया गया और फिर इंट्रासेल्युलर वायरस को मापने के लिए फ्रीज-पिघलाव के माध्यम से लयित किया गया। इंट्रासेल्युलर डिब्बे में बनाम एपिकल शेड डिब्बे में संक्रामक वायरस को पट्टिका परख द्वारा निर्धारित किया गया था। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। संक्षेप: ALI = वायु-तरल इंटरफ़ेस; एमओआई = संक्रमण की बहुलता; एएसएल = एपिकल सतह तरल; एचपीआई = संक्रमण के बाद के घंटे; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा। इस आंकड़े का निर्माण ओटर एट अल.1 में प्रकाशित डेटा का उपयोग करके किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सेलुलर ट्रोपिज्म और उपकला अखंडता को चिह्नित करने के लिए नाक एएलआई संस्कृतियों की इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग। (ए) नाक की एएलआई संस्कृतियां एमओआई = 5 पर सार्स-सीओवी-2, एमईआरएस-सीओवी, या एचसीओवी-एनएल 63 से संक्रमित थीं और 96 एचपीआई पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में तय की गई थीं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए संस्कृतियां तैयार की गईं, जैसा कि प्रोटोकॉल खंड 6 में ऊपर वर्णित है, प्रत्येक वायरस न्यूक्लियोकैप्सिड प्रोटीन (लाल रंग में दिखाया गया), सिलिएटेड सेल मार्कर टाइप IV β-ट्यूबुलिन (हरा), या गोब्लेट सेल मार्कर MUC5AC (हरा) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके। ध्यान दें, MERS-CoV नॉनस्ट्रक्चरल प्रोटीन 8 (nsp8) के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग MUC5AC एंटीबॉडी के साथ प्रजातियों की असंगति के कारण न्यूक्लियोकैप्सिड प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के स्थान पर किया गया था। वायरल एंटीजन और प्रत्येक एपिथेलियल सेल मार्करों के बीच कोलोकलाइजेशन को प्रत्येक वायरस के लिए विलय की गई छवियों में नारंगी / पीले रंग के रूप में देखा जाता है। (बी) नाक एएलआई संस्कृतियों को साइटोस्केलेटल अखंडता की कल्पना करने के लिए फैलोइडिन (जो एक्टिन साइटोस्केलेटल फिलामेंट्स को दागता है) का उपयोग करके दाग दिया गया था, जैसा कि गुलाबी रंग में दिखाया गया है। होस्कट धुंधला नीले रंग में दिखाया गया है। पैनल 2बी.1 कुरकुरा, बरकरार फेलोइडिन धुंधला दिखाता है, जो बरकरार साइटोस्केलेटल आर्किटेक्चर का संकेत देता है, जबकि पैनल 2 बी.2 उपकला अखंडता के नुकसान और फैलोइडिन दाग के धुंधलेपन को दर्शाता है। स्केल सलाखों = (ए) 50 μm, (B) 10 μm. संक्षेप: एएलआई = वायु-तरल इंटरफ़ेस; एमओआई = संक्रमण की बहुलता; एचपीआई = संक्रमण के बाद के घंटे। इस आंकड़े का निर्माण ओटर एट अल में प्रकाशित डेटा का उपयोग करके किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: संक्रमण के दौरान एएलआई संस्कृतियों में ट्रांस-उपकला विद्युत प्रतिरोध का माप । (ए) 10 दाताओं से प्राप्त नाक एएलआई संस्कृतियां या तो मॉक-संक्रमित थीं या एमओआई = 5 में सार्स-सीओवी-2, एमईआरएस-सीओवी, या एचसीओवी-एनएल 63 से संक्रमित थीं। प्रत्येक ट्रांसवेल के लिए 0 एचपीआई (बेसलाइन टीईआर) पर 192 एचपीआई माइनस टीईआर पर टीईआर के रूप में त्रिभुज टीईईआर की गणना की गई थी। प्रत्येक बार प्रत्येक दाता से तीन प्रतियों के बीच प्रत्येक वायरस के लिए औसत त्रिभुज मूल्य को दर्शाता है। (बी) 8 दाताओं से प्राप्त नाक अली संस्कृतियां एमओआई = 5 पर एचसीओवी -229 ई से नकली संक्रमित या संक्रमित थीं। बेसलाइन टीईआर से त्रिभुज टीईईआर की गणना (ए) में टीईआर का उपयोग करके 96 एचपीआई या 192 एचपीआई पर की गई थी। (C, D) टीईआर ट्रेस डेटा को चार दाताओं में से प्रत्येक से प्राप्त नकली-संक्रमित या एचसीओवी-संक्रमित संस्कृतियों के लिए चित्रित किया गया है। प्रत्येक पंक्ति समय के साथ एक एकल ट्रांसवेल से टीईआर डेटा का प्रतिनिधित्व करती है (प्रत्येक दाता से तीन प्रतियों की परख की गई थी)। दाता संख्यारंग-कोडित होती है और प्रत्येक ग्राफ के दाईं ओर कुंजी में दिखाई जाती है। डेटा को पैनल ए और पैनल बी में माध्य ± एसडी के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। संक्षेप: एएलआई = वायु-तरल इंटरफ़ेस; एमओआई = संक्रमण की बहुलता; एचपीआई = संक्रमण के बाद के घंटे; टीईआर = ट्रांस-उपकला विद्युत प्रतिरोध। इस आंकड़े का निर्माण ओटर एट अल.1 में प्रकाशित डेटा का उपयोग करके किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: नाक एएलआई संस्कृतियों के एचसीओवी संक्रमण के दौरान साइटोटॉक्सिसिटी परिमाणीकरण। एमओआई = 5 पर तीन प्रतियों में प्रत्येक एचसीओवी से संक्रमित 10 दाताओं से प्राप्त नाक संस्कृतियों ने एएसएल नमूनों में एलडीएच परिमाणीकरण किया, जैसा कि ऊपर वर्णित है। परीक्षण किए गए सभी दाताओं के बीच औसत साइटोटॉक्सिसिटी प्रत्येक एचसीओवी के लिए 96 एचपीआई और 192 एचपीआई पर दिखाई गई है। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। संक्षेप: ALI = वायु-तरल इंटरफ़ेस; एमओआई = संक्रमण की बहुलता; एचपीआई = संक्रमण के बाद के घंटे; टीईआर = ट्रांस-एपिथेलियल विद्युत प्रतिरोध; एएसएल = एपिकल सतह तरल; एलडीएच = लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज। इस आंकड़े का निर्माण ओटर एट अल.1 में प्रकाशित डेटा का उपयोग करके किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: नाक संस्कृतियों के संक्रमण के बाद एमआरएनए / प्रोटीन विश्लेषण। टाइप 2 साइटोकिन आईएल -13 या शाम-उपचारित के साथ इलाज किए गए नाक संस्कृतियों का उपयोग एचसीओवी रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था, साथ ही साथ सिलिएटेड और गोब्लेट सेल मार्करों में भी। (ए) डीपीपी 4 और एसीई2 की एमआरएनए अभिव्यक्ति आरटी-क्यूपीसीआर के माध्यम से निर्धारित की गई थी। आईएल -13 के साथ इलाज किए गए तीन दाताओं की संस्कृतियों के आंकड़ों को एक ही दाताओं से प्राप्त दिखावटी संस्कृतियों पर गुना परिवर्तन के रूप में दिखाया गया है। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में प्रदर्शित किया जाता है, जिसमें प्रत्येक बिंदु एकल दाता के लिए औसत गुना परिवर्तन प्रेरण का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) कुल प्रोटीन नाक संस्कृतियों से प्राप्त किया गया था जो या तो शम-या आईएल -13 का इलाज किया गया था और या तो नकली या सार्स-सीओवी-2-संक्रमित था। प्रोटीन को एसडीएस-पेज के माध्यम से अलग किया गया और एपिथेलियल सेल मार्करों (टाइप IV β-ट्यूबुलिन, एमयूसी 5एसी), एचसीओवी रिसेप्टर्स (एसीई 2, डीपीपी 4), सार्स-सीओवी -2 न्यूक्लियोकैप्सिड प्रोटीन और जीएपीडीएच के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोब्लॉट किया गया। संक्षेप: आरटी-क्यूपीसीआर = रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन-मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन; एसडीएस-पेज = सोडियम डोडेसिलसल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन। इस आंकड़े का निर्माण ओटर एट अल.1 में प्रकाशित डेटा का उपयोग करके किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां विस्तृत तरीके एक प्राथमिक उपकला संस्कृति प्रणाली का वर्णन करते हैं जिसमें रोगी-व्युत्पन्न नाक उपकला कोशिकाओं को एक वायु-तरल इंटरफ़ेस पर उगाया जाता है और एचसीओवी-होस्ट इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए लागू किया जाता है। एक बार विभेदित होने के बाद, ये नाक एएलआई संस्कृतियां विवो नाक उपकला की कई विशेषताओं को पुन: उत्पन्न करती हैं, जिसमें सिलिएटेड, गोब्लेट और बेसल कोशिकाओं के साथ एक विषम सेलुलर आबादी शामिल है, साथ ही साथ मजबूत रूप से बीटिंग सिलिया और बलगम स्राव के साथ बरकरार म्यूकोसिलरी फ़ंक्शन भी शामिल है। यह विषम कोशिका आबादी पारंपरिक श्वसन उपकला कोशिका लाइनों पर इस संस्कृति प्रणाली का एक महत्वपूर्ण लाभ है, क्योंकि यह वायरल संक्रमण के दौरान मेजबान सेल ट्रोपिज्म के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है (जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है)। पारंपरिक वायुमार्ग उपकला कोशिका लाइनों में कार्यात्मक म्यूकोसिलरी क्लीयरेंस तंत्र की भी कमी होती है, जो इंटरफेरॉन उत्पादन जैसे जन्मजात प्रतिरक्षा मार्गों के साथ श्वसन वायरस के खिलाफ प्राथमिक रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदमों में प्रारंभिक संक्रमण प्रक्रिया शामिल है; उदाहरण के लिए, संक्रमण से पहले वांछित तापमान पर संस्कृतियों को संतुलित किया जाना चाहिए, और प्रत्येक संक्रमण को शुरू करने के लिए एक सुसंगत पद्धति का उपयोग किया जाना चाहिए। ये कदम विधि को मानकीकृत करने और डाउनस्ट्रीम निष्कर्षों में प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

शायद इन विधियों का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा एपिकल रूप से जारी वायरस का परिमाणीकरण है, क्योंकि प्रत्येक एचसीओवी के अद्वितीय प्रतिकृति चक्र को समझने से समय बिंदुओं को निर्धारित करने में मदद मिलती है जो आगे के विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा हो सकता है। ऊपर वर्णित इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक ें भी महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि एक प्रतिनिधि विषम सेलुलर आबादी के साथ इन विट्रो नाक उपकला में वायरल संक्रमण की कल्पना करने की क्षमता वायरल ट्रोपिज्म के सटीक मूल्यांकन की अनुमति देती है और फिजियोलॉजिकल सेटिंग में वायरस-होस्ट इंटरैक्शन को आगे बढ़ाने की क्षमता प्रदान करती है।

नाक उपकला सभी श्वसन वायरस द्वारा सामना की जाने वाली प्राथमिक बाधा साइट है, और, इस प्रकार, यह संभावना है कि एचसीओवी संक्रमण नाक उपकला के प्राथमिक संक्रमण से शुरू होता है, जिसमें मौखिक-फेफड़े की आकांक्षा अक्ष के माध्यम से निचले वायुमार्ग में फैलने की क्षमता होती है। यह रोगजनक एचसीओवी संक्रमण (एमईआरएस-सीओवी, सार्स-सीओवी-2) के दौरान गंभीर निमोनिया और श्वसन रोग के विकास में भूमिका निभाता है, जबकि मौसमी एचसीओवी केवल ऊपरी वायुमार्ग में बीमारी का कारण बनते हैं। इस महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा प्रहरी साइट में एचसीओवी-होस्ट इंटरैक्शन को समझना महत्वपूर्ण है, और यह नाक एएलआई प्रणाली वायरल प्रतिकृति, होस्ट सेल ट्रोपिज्म, साथ ही साइटोटॉक्सिसिटी और एचसीओवी संक्रमण के दौरान जन्मजात प्रतिरक्षा प्रेरण के लक्षण वर्णन की अनुमति देती है।

यह नाक एएलआई संस्कृति प्रणाली भी अत्यधिक अनुकूलनीय है और इसका उपयोग कई नैदानिक रोग राज्यों को प्रतिबिंबित करने के लिए किया जा सकता है। आनुवांशिक फुफ्फुसीय रोगों जैसे सिस्टिक फाइब्रोसिस (क्लोराइड चैनल दोष के कारण) या प्राथमिक सिलिअरी डिस्केनेसिया (जिसमें सिलिअरी बीटिंग तंत्र निष्क्रिय होते हैं) के रोगियों से प्राप्त नाक के नमूनों का उपयोग नाक के एएलआई संस्कृतियों को विकसित करने के लिए किया जा सकता है जो इन विकृतियों के प्रतिनिधि हैं ताकि यह समझा जा सके कि इन रोगियों को एचसीओवी संक्रमण31,32 से अलग-अलग कैसे प्रभावित किया जा सकता है।. इसके अतिरिक्त, अन्य रोग राज्यों की विशेषताओं को फिर से बनाने के लिए नाक एएलआई संस्कृतियों के भेदभाव के दौरान विभिन्न साइटोकिन उपचार का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, भेदभाव के दौरान आईएल -13 उपचार गोब्लेट सेल हाइपरप्लासिया को प्रेरित करता है और अस्थमा या एलर्जी वायुमार्ग33,34 का अध्ययन करने के लिए सरोगेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रकार, यह नाक एएलआई प्रणाली स्वस्थ और रोगग्रस्त नाक वायुमार्ग दोनों में एचसीओवी-होस्ट के साथ-साथ अन्य वायरस-होस्ट इंटरैक्शन की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

हालांकि यह प्रणाली कई फायदे प्रदान करती है, नाक एएलआई संस्कृतियों के उपयोग के साथ कुछ सीमाएं भी उत्पन्न होती हैं। हालांकि नाक की कोशिकाओं को ब्रोन्कियल या फेफड़ों की कोशिकाओं की तुलना में अधिग्रहण के लिए बहुत कम आक्रामक तकनीकों की आवश्यकता होती है, एएलआई संस्कृतियों को बढ़ने और अलग करने के लिए पारंपरिक अमर सेल लाइनों के उपयोग की तुलना में काफी अधिक समय और संसाधनों की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, संक्रमण के लिए अनुमेयता के साथ-साथ एचसीओवी संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं के संदर्भ में दाता-से-दाता परिवर्तनशीलता डेटा को पुन: पेश करना और व्याख्या करना अधिक कठिन बना सकती है (यही कारण है कि इन मुद्दों को कम करने के लिए अक्सर 5-10 दाताओं से प्राप्त संस्कृतियों के साथ प्रयोग किए जाते हैं)।

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Disclosures

सुसान वीस ओक्यूजेन के लिए वैज्ञानिक सलाहकार बोर्ड ों में हैं। नोम ए कोहेन जीएसके, एस्ट्राजेनेका, नोवार्टिस, सनोफी / रेगेरोन और ऑयस्टर पॉइंट फार्मास्यूटिकल्स के लिए परामर्श करते हैं और उनके पास एक अमेरिकी पेटेंट, "श्वसन संक्रमण के लिए थेरेपी और निदान" (10,881,698 बी 2, WO20913112865) और जीनवन लाइफ साइंसेज के साथ एक लाइसेंसिंग समझौता है।

Acknowledgments

इस अध्ययन में निम्नलिखित वित्त पोषण स्रोत हैं: राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) आर01एआई 169537 (एसआरडब्ल्यू और एनएसी), एनआईएच आर01एआई 140442 (एसआरडब्ल्यू), वीए मेरिट रिव्यू CX001717 (एनएसी), वीए मेरिट रिव्यू BX005432 (एसआरडब्ल्यू और एनएसी), पेन सेंटर फॉर रिसर्च ऑन कोरोनावायरस और अन्य उभरते रोगजनकों (एसआरडब्ल्यू), लाफी-मैकहग फाउंडेशन (एसआरडब्ल्यू) टी 32 AI055400 (सीजेओ), टी 32 AI007324 (एएफ)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) Invitrogen Various
BSA (bovine serum albumin) Sigma-Aldrich A7906
cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor Roche 11836170001
Cytotoxicity detection kit Roche 11644793001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) Gibco 11965-084
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) Gibco 14190136
DPBS + calcium + magnesium Gibco 14040-117
Endohm-6G measurement chamber World Precision Instruments ENDOHM-6G
Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) eBiosciences 14-9326-82
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) World Precision Instruments 300523
FBS (Fetal Bovine Serum) HyClone SH30071.03
FV10-ASW software for imaging Olympus Version 4.02
HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) BEI Resources NR-470
HCoV-NL63 nucleocapsid antibody Sino Biological 40641-V07E
Hoescht stain Thermo Fisher H3570
Laemmli sample buffer (4x) BIO-RAD 1610747
LLC-MK2 cells ATCC CCL-7 To titrate HCoV-NL63
MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) BEI Resources  NR-44260
MERS-CoV nucleocapsid antibody Sino Biological 40068-MM10
MUC5AC antibody Sigma-Aldrich AMAB91539
Olympus Fluoview confocal microscope Olympus FV1000
Phalloidin-iFluor 647 stain Abcam ab176759
PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors)  Roche PHOSS-RO
Plate reader  Perkin Elmer HH34000000 Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm
RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) Thermo Fisher 89990 Can prep in-house or purchase
RNeasy Plus Kit Qiagen 74134
SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) BEI Resources NR-52281
SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody Genetex GTX135357
Triton-X 100 Fisher Scientific BP151100
Type IV β- tubulin antibody Abcam ab11315
VeroCCL81 cells ATCC CCL-81 To titrate MERS-CoV
VeroE6 cells ATCC CRL-1586 To titrate SARS-CoV-2

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References

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मानव कोरोनावायरस-होस्ट इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए एक वायु-तरल इंटरफ़ेस पर विकसित प्राथमिक नाक उपकला कोशिकाओं का संक्रमण
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