Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Infektion af primære nasale epitelceller dyrket ved en luft-væske-grænseflade for at karakterisere humane coronavirus-værtsinteraktioner

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/64868
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3,4, 1,2, 3,4
1Department of Microbiology, University of Pennsylvania, 2Penn Center for Research on Coronaviruses and Other Emerging Pathogens, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, University of Pennsylvania, 4Corporal Michael J. Crescenz VA Medical Center

Summary

Det nasale epitel er det primære barrierested, som alle respiratoriske patogener støder på. Her skitserer vi metoder til at bruge primære nasale epitelceller dyrket som luft-væske-interface (ALI) kulturer til at karakterisere humane coronavirus-værtsinteraktioner i et fysiologisk relevant system.

Abstract

Tre højpatogene humane coronavirus (HCoV'er) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) og SARS-CoV-2 (2019) - er opstået og forårsaget betydelige folkesundhedskriser i de sidste 20 år. Fire yderligere HCoV'er forårsager en betydelig del af forkølelsestilfælde hvert år (HCoV-NL63, -229E, -OC43 og -HKU1), hvilket fremhæver vigtigheden af at studere disse vira i fysiologisk relevante systemer. HCoV'er kommer ind i luftvejene og etablerer infektion i næseepitelet, det primære sted, som alle respiratoriske patogener støder på. Vi bruger et primært nasal epitelkultursystem, hvor patientafledte næseprøver dyrkes ved en luft-væske-grænseflade (ALI) til at studere værtspatogeninteraktioner på dette vigtige vagtsted. Disse kulturer rekapitulerer mange funktioner i in vivo-luftvejene, herunder de tilstedeværende celletyper, ciliærfunktion og slimproduktion. Vi beskriver metoder til at karakterisere viral replikation, værtscelletropisme, virusinduceret cytotoksicitet og medfødt immuninduktion i nasale ALI-kulturer efter HCoV-infektion ved hjælp af nyere arbejde, der sammenligner dødelige og sæsonbestemte HCoV'er som et eksempel1. En øget forståelse af vært-patogen interaktioner i næsen har potentialet til at give nye mål for antivirale lægemidler mod HCoV'er og andre respiratoriske vira, der sandsynligvis vil dukke op i fremtiden.

Introduction

Syv humane coronavirus (HCoV'er) er blevet identificeret til dato og forårsager en række luftvejssygdomme2. De almindelige eller sæsonbestemte HCoV'er (HCoV-NL63, -229E, -OC43 og -HKU1) er typisk forbundet med øvre luftvejspatologi og forårsager anslået 10% -30% af forkølelsestilfælde årligt. Selvom dette er den typiske kliniske fænotype forbundet med de almindelige HCoV'er, kan disse vira forårsage mere signifikant sygdom i nedre luftveje i risikopopulationer, herunder børn, ældre voksne og immunkompromitterede personer 3,4. Tre patogene HCoV'er er opstået og forårsaget betydelige folkesundhedskriser i de sidste 20 år, herunder alvorligt akut respiratorisk syndrom (SARS)-CoV, Mellemøsten respiratorisk syndrom (MERS)-CoV og SARS-CoV-2. Dødelige HCoV'er er forbundet med mere alvorlig luftvejspatologi, hvilket tydeligt illustreres af >34% dødelighed forbundet med MERS-CoV-tilfælde (894 dødsfald fra over 2,500 tilfælde siden fremkomsten i 2012)5,6. Det er vigtigt at bemærke, at de dødelige HCoV'er også forårsager en række luftvejssygdomme, fra asymptomatiske infektioner til dødelig lungebetændelse, som det ses med den igangværende COVID-19-pandemi7.

HCoV'er, som andre respiratoriske patogener, kommer ind i luftvejene og etablerer en produktiv infektion i næseepitelet8. Spredning til de nedre luftveje menes at være forbundet med aspiration fra mundhulen / næsehulen til lungen, hvor HCoV'er forårsager mere signifikant nedre luftvejspatologi 9,10,11. Således fungerer næsen som den første portal for viral indgang og er den primære barriere for infektion med sit robuste mucociliære clearancemaskineri og unikke medfødte immunmekanismer, der sigter mod at forhindre yderligere viral spredning til de nedre luftveje12,13. For eksempel er nasale epitelceller blevet rapporteret at udtrykke højere end gennemsnittet basale niveauer af antivirale interferoner og interferonstimulerede gener, hvilket indikerer, at næseceller kan primes til tidlige reaktioner på respiratoriske vira14,15,16.

Vi har tidligere brugt patientafledte primære nasale epitelceller dyrket ved en luft-væske-grænseflade (ALI) til at modellere HCoV-værtsinteraktioner i næsen, hvor HCoV-infektioner begynder. Nasale ALI-kulturer er tilladelige for både patogene (SARS-CoV-2 og MERS-CoV) og almindelige HCoV'er (HCoV-NL63 og HCoV-229E) og tilbyder forskellige fordele i forhold til traditionelle luftvejsepitelcellelinjer såsom A549 (en lungeadenokarcinomcellelinje)16,17. Efter differentiering indeholder nasale ALI-kulturer en heterogen cellulær population og udviser mange af de funktioner, der forventes af in vivo nasal epitel, såsom mucociliær clearance maskiner18. Nasale celler tilbyder også fordele i forhold til nedre luftvejskultursystemer (såsom humane bronchiale epitelceller, HBEC'er), da erhvervelsen af nasale epitelceller via cytologisk børstning er signifikant mindre invasiv sammenlignet med anvendelse af teknikker som bronkoskopi til opnåelse af HBEC'er 19,20,21.

Dette papir beskriver metoder til udnyttelse af dette nasale ALI-kultursystem til at karakterisere HCoV-værtsinteraktioner i næseepitelet. Vi har anvendt disse metoder i nyligt offentliggjorte værker til at sammenligne SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 og HCoV-229E 1,16,17. Selvom disse metoder og repræsentative resultater understreger undersøgelsen af HCoV'er i denne næsecellemodel, er systemet meget tilpasningsdygtigt til andre HCoV'er såvel som andre respiratoriske patogener. Endvidere kan disse metoder anvendes mere bredt på andre ALI-dyrkningssystemer for at undersøge viral replikation og cellulær tropisme samt cytotoksicitet og medfødt immuninduktion efter infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Anvendelsen af næseprøver blev godkendt af University of Pennsylvania Institutional Review Board (protokol # 800614) og Philadelphia VA Institutional Review Board (protokol # 00781).

1. Infektion af nasale ALI-kulturer

BEMÆRK: Erhvervelse af kliniske prøver samt vækst og differentiering af nasale ALI-kulturer ligger uden for rammerne af denne artikel. Specifikke metoder til dyrkning af primære nasale epitelceller findes i nyligt offentliggjorte værker, der anvender disse kulturer 18,22,23. Nedenstående protokoller kan desuden anvendes på kommercielt tilgængelige nasale epitel-ALI-kulturer, hvis det ønskes. Protokoller og volumener, der er beskrevet nedenfor, gælder for 24-brønds pladetranswellindsatser (6,5 mm diameter, 0,33 cm2 membranoverfladeareal). Hvis du bruger ALI-kulturer, der dyrkes på større transwells (dvs. plader med 12 brønde, 12 mm diameter, 1,12 cm2 overfladeareal), skal du justere volumenerne proportionalt for at afspejle transwellstørrelsen.

  1. Dag før infektion:
    1. ALI-kulturer vaskes 3x med fosfatbufret saltvand (PBS) apisk (tilsættes ~200 μL opvarmet PBS, anbringes i 37 °C inkubator i 5 min, PBS suges og gentages).
    2. Udskift basalmediet (500 μL).
    3. Lad kulturerne ekvilibrere ved den temperatur, ved hvilken infektioner vil blive udført natten over (dvs. hvis de inficerer ved 33 °C, anbringes kulturer i en 33 °C inkubator efter PBS-vask).
      BEMÆRK: HCoV'er, der er forbundet med forkølelse, såsom HCoV-229E og HCoV-NL63, rapporteres at replikere mere effektivt ved 33 ° C. Derudover er temperaturen på in vivo næseepitelet 33 ° C (dette adskiller sig fra lungens temperatur, som er 37 ° C).
  2. Fortynd virus efter behov i serumfrit Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) for at opnå den ønskede infektionsmultiplicitet (MOI) i et totalt podevolumen på 50 μL.
    BEMÆRK: Infektioner er typisk udført ved MOI = 5 (høj MOI); infektioner ved MOI = 0.5 (lav MOI) er imidlertid også blevet brugt til SARS-CoV-2 og forkølelsesassocierede HCoV'er, og disse resulterer i sammenlignelige maksimale virale titere, men med variabel kinetik (enten MOI er acceptabel).
  3. Tilsæt inokulum apikalt, og placer kulturer tilbage i inkubatoren i 1 time.
  4. Stenplader forsigtigt hvert 15. minut under infektion (hold pladen fast i begge hænder, rock frem og tilbage og side til side for at sikre ensartet adsorption af viral podning).
  5. Efter 1 times inkubation aspireres viruspodningen, og hver inficeret kultur vaskes 3x med PBS for at sikre fjernelse af viruspodning (for hver vask tilsættes 200 μL PBS, inkuberes i 5 minutter og aspireres eller fjernes med en pipette).
  6. Hvis det ønskes, indsamle den tredje PBS vask for at bekræfte tilstrækkelig fjernelse af input virus.
  7. Udskift basalmediet med frisk medium på inficerede ALI hver 72. time under infektion.

2. Opsamling af apikal overfladevæske (ASL) og titrering af skurvirus

  1. På forudbestemte tidspunkter efter infektion tilsættes 200 μL PBS til det apikale kammer i hver inficeret transwell.
    BEMÆRK: Relevante tidspunkter varierer afhængigt af HCoV af interesse og spænder fra 24 timer til 192 timer efter infektion (se afsnittet om repræsentative resultater for virale replikationsdata for forskellige HCoV'er).
  2. Pipette PBS op og ned 5x for at sikre maksimal opsamling af apikalt udgydt virus og samle hele volumenet i et mikrocentrifugerør (dette er ASL-prøven).
    BEMÆRK: ASL inkluderer skurede virale partikler ud over slim og andre produkter, der udskilles apikalt fra ALI-kulturer.
  3. Kvantificer infektiøs virus i ASL via standard viral plaque-assay (serielt fortyndet virusholdigt prøver for at kvantificere koncentrationen af virale partikler).
    BEMÆRK: Celletyper og inkubationsperiode, der anvendes til plaque-analyse, afhænger af den anvendte virus: SARS-CoV-2 (VeroE6-celler); MERS-CoV (VeroCCL81-celler); HCoV-NL63 (LLC-MK2-celler); HCoV-229E (Huh7-celler). Detaljer om, hvordan man udfører virale plakassays, ligger uden for dette manuskripts anvendelsesområde, men er tidligere blevet beskrevet i en Journal of Visualized Experiments (JoVE) publikation24.
  4. Hvis det ønskes, saml basalmediet på forskellige tidspunkter efter infektion for at bekræfte fraværet af basalt frigivet virus. HCoV'er frigives typisk apikalt fra nasale epitelceller, men bekræfter dette via plaque-analyse af ufortyndet basalmedium.
  5. ASL-prøver opbevares ved -80 °C, hvis kvantificering ved plaqueanalyse ikke finder sted på indsamlingsdagen.

3. Kvantificering af intracellulær virus

  1. Efter indsamling af ASL-prøve flyttes hver transwell til en ren plade med 24 brønde, der er forudindlæst med 500 μL DMEM indeholdende 2% føtalt bovint serum (FBS) grundlæggende.
    BEMÆRK: DMEM med 2% FBS bruges til at stabilisere virussen under efterfølgende fryse-optøningscyklusser.
  2. Hver transwell 3x apikal vaskes med PBS for at sikre fuldstændig fjernelse af apikalt skuret virus.
  3. Efter aspirering for at fjerne den endelige PBS-vask tilsættes 100 μL DMEM med 2% FBS til det apikale rum.
  4. Flyt pladen indeholdende transwells med både apikale og basale medier ind i en -80 °C fryser, og gennemfør tre på hinanden følgende fryse-optøningscyklusser for at lyse cellerne.
  5. Efter den endelige fryse-optøningscyklus pooles apikale (100 μL) og basale (500 μL) medier i et rent rør.
  6. Der centrifugeres ved 500 × g i 10 minutter ved 4 °C for at pelletere celleaffald.
  7. Supernatanten hentes. Dette er den intracellulære virusprøve til titrering via standard plaque-assay.
    BEMÆRK: Tredobbelt fortynding sker under indsamlingsprocessen i forhold til ASL-indsamling; ASL-prøver opsamles i 200 μL PBS, mens intracellulær virusprøve opsamles i et samlet volumen på 600 μL.

4. Måling af transepitelial elektrisk modstand (TEER)

BEMÆRK: Til TEER-måling bør PBS suppleret med calcium og magnesium (PBS + Ca 2+/Mg2+) anvendes. Der anvendes et epitelvolt/ohmmeter, der er indstillet til at læse i ohm (se materialetabellen).

  1. EVOM-instrumentet rengøres, afbalanceres og tømmes i henhold til producentens anvisninger; Brug en "tom" transwell uden næseceller tilsat til blanking. Optag blank TER-måling.
    BEMÆRK: Hvis der anvendes flere vira, skal EVOM-instrumentet rengøres strengt mellem forholdene for at undgå krydskontaminering (vask med 70% ethanol efterfulgt af deioniseret vand er tilstrækkeligt).
  2. Hver inficeret transwell flyttes til en formærket, ren plade med 24 brønde med 500 μL PBS + Ca 2+/Mg2+ grundlæggende for at vaske resterende basalmedium fra transwells.
  3. Der tilsættes 200 μL PBS + Ca 2+/Mg2+ til det apikale rum i hver transwell.
  4. Der tilsættes 1 ml PBS + Ca 2+/Mg2+ til Endohm-6 målekammeret.
  5. Flyt hver transwell ind i Endohm-6-målekammeret, og udskift kammerets låg, så den apikale elektrode hviler i 200 μL PBS i det apikale rum; basalelektroden er indbygget i bunden af Endohm-6-kammeret.
  6. Lad EVOM-aflæsningen stabilisere sig, og registrer rå TER-måling.
  7. ASL-prøve indsamles som beskrevet ovenfor efter TEER-måling, hvis titering ønskes (opsaml de 200 μL PBS + Ca 2+/Mg2+, der blev tilsat til TEER-måling).
    BEMÆRK: ASL-prøveindsamling kan fremkalde mikrotårer i epitelbarrieren, der kan forvirre TEER-aflæsninger, så ASL skal indsamles efter TEER-måling. Endvidere må basalsubstratet ikke ændres umiddelbart før TEER-aflæsninger, da dette også kan påvirke TEER-værdierne.
  8. For at konvertere rå TEER-aflæsninger til endelige målinger i ohm/cm2 trækkes tom TEER-værdi fra, og denne værdi ganges med overfladearealet af transwellmembranen ved hjælp af ligning (1):
    TEER = [TEER-aflæsning - tom TEER-værdi] × (overfladeareal af transwell) (1)
  9. For HCoV'er skal TEER evalueres hver 24. time eller 48 timer efter infektion; Kinetikken af TEER-ændringer varierer ofte mellem vira og kræver fejlfinding på forskellige tidspunkter.
  10. Ved måling af TEER skal du altid inkludere mock-inficerede kulturer og evaluere på hvert tidspunkt (negativ kontrol).
    BEMÆRK: For mock-kulturer bør TEER-målinger forblive stabile eller kan stige lidt fra baseline, når differentieringen af kulturerne er afsluttet. Overfladearealet af membranstøtter vil variere afhængigt af størrelse og producent af transwells; 24-brønds transboringer har typisk et overfladeareal på 0,33 cm2.

5. Måling af cytotoksicitet under infektion via lactat dehydrogenase (LDH) assay

BEMÆRK: I dette arbejde blev LDH-indholdet i ASL-prøver kvantificeret ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt cytotoksicitetsdetekteringssæt. LDH-signal i basalmedium var ofte under detektionsgrænsen og ofte mindre reproducerbart end LDH kvantificeret i ASL-prøver fra HCoV-inficerede kulturer.

  1. Forbered yderligere kontroller, der er nødvendige for LDH-assay.
    1. Baggrundskontrol: Brug PBS (brug PBS indeholdende calcium og magnesium, hvis ASL-prøver blev indsamlet på denne måde).
    2. Positiv kontrol (loftværdi): behandle ALI apikalt med Triton X-100. Saml Triton-kontrolbrønde (brug typisk tre ALI-kulturer til dette på hvert tidspunkt).
      1. Tilsæt 200 μL 2% Triton X-100 i PBS direkte til transbrøndens apikale rum.
      2. Inkuber i 10-15 minutter for at lade cellerne lysere fuldstændigt.
      3. Saml hele lydstyrken som en Triton-loftprøve.
    3. Negativ kontrol (lav kontrol/baseline LDH-frigivelse): indsamle ASL fra mock-inficerede ALI-kulturer afledt af samme donor som inficerede kulturer.
      1. Indsaml negativ kontrol mock ASL ved at følge ASL-indsamlingsproceduren ovenfor.
        BEMÆRK: De samme transwells kan bruges til denne negative kontrol for alle tidspunkter, mens friske transwells vil være nødvendige for hvert tidspunkt for Triton-kontrollen.
  2. For at muliggøre kvantificering af skurvirus ud over LDH-aflæsninger fra hver ASL-prøve ilægges en optisk klar fladbundet sort 96-brøndplade som følger:
    1. Alle prøver fortyndes i PBS med 45 μL prøve og 55 μL PBS (100 μL totalvolumen).
    2. Behandl Triton positiv kontrol og mock baggrundskontrolprøver på samme måde.
      BEMÆRK: Denne fortynding giver mulighed for tredobbelt påfyldning af hver forsøgsprøve (45 μL x 3) og tilstrækkelig resterende ASL-volumen til titering via plakanalyse.
    3. Indlæs LDH-plade i tre eksemplarer: Triton-loft, mock baggrundskontrol, PBS-kontrol og eksperimentelle prøver.
    4. Forbered reaktionsblandingen som angivet af producenten (farvestofopløsning + katalysator).
      1. Der tilsættes 100 μL reaktionsblanding til hvert hul, og pladen inkuberes ved stuetemperatur i 20 min beskyttet mod lys.
    5. Efter 20 min måles absorbansen ved 492 nm.
    6. Beregn den procentvise cytotoksicitet i forhold til Triton-loftværdien ved hjælp af ligning (2).
      Cytotoksicitet (%) Equation 1 (2)

6. Fremstilling af nasale ALI-kulturer til immunfluorescens (IF) billeddannelse

  1. Flyt transbrønden til en frisk plade med 24 brønde, og vask 3x apisk med PBS (saml den første PBS-vask som ASL, hvis titering; udfør derefter to ekstra PBS-vaske for at fjerne overskydende skurvirus, der kan hindre IF-kvalitet)
  2. Efter den sidste PBS-vask dækkes transbrønden apisk og basalt i 4% PFA.
  3. Inkuber i 30 minutter for at fiksere i 4% PFA, og fjern derefter og vask 3x med PBS.
  4. Punktafgifter transwell-støtten, der indeholder cellerne, ved hjælp af et skærpet barberblad eller en saks.
  5. For at øge antallet af IF-mål for hver transwell skal du skære hver membran i halve og plette hver halvdel med forskellige antistofkombinationer.
  6. Permeabilize med 0,2% Triton X-100 i PBS i 10 min.
  7. Bloker med 10% normalt æselserum og 1% BSA i PBST (PBS + 0,2% Triton X-100) i 60 minutter ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Beskyt prøver mod lyseksponering fra dette trin fremad.
  8. Der inkuberes i primær antistofopløsning natten over ved 4 °C. Fortynd alle antistoffer 1:1.000 i blokerende buffer.
    BEMÆRK: Repræsentative antistoffer til HCoV-nukleocapsidfarvning samt epitelcelletypemarkører og cytoskeletale pletter er anført nedenfor (se materialetabellen for producentinformation og katalognumre).
    1. Til HCoV-antigenfarvning skal du bruge antistoffer rettet mod SARS-CoV-2-nukleocapsid, MERS-CoV-nukleocapsid og HCoV-NL63-nukleocapsid.
    2. For at identificere epitelcelletyper skal du bruge antistoffer rettet mod bægercellemarkør MUC5AC og cilieret cellemarkør type IV β-tubulin.
    3. Til cytoskeletale markører skal du bruge antistoffer rettet mod phalloidin (binder F-actin) og epitelcelleadhæsionsmarkør: EpCAM (CD326).
  9. Inkuberes i sekundær antistofopløsning i 60 minutter ved stuetemperatur; Brug sekundære antistoffarvestoffer fortyndet 1: 1.000 i blokerende buffer.
  10. Når farvningen er afsluttet, overføres membranen til et glasglas med en spatel, orienterer transbrønden med den apikale side mod objektglasset og tilsæt monteringsopløsning. Lad det bundfælde sig i 15-30 min, inden du påfører klar neglelak rundt om kanterne.
  11. Hent billeder ved hjælp af et konfokalmikroskop (Z-aksetrin: 0,5 μm; sekventiel scanning)1,16,17.
    BEMÆRK: Efter fiksering af kulturer i 4% PFA og vask med PBS kan faste kulturer opbevares ved 4 °C i uger til måneder før farvning og forberedelse til billeddannelse. Efter farvning og montering af membraner kan prøverne opbevares på lang sigt (>2 år) ved 4 °C i mørke.

7. Indsamling af intracellulært protein til vestlig immunblotting eller RNA til RT-qPCR-analyse

  1. ASL indsamles som beskrevet ovenfor, hvis virale titere kvantificeres (protokolafsnit 2).
  2. Flyt transbrønden til en ren plade med 24 brønde, da skrabning af membranen kan føre til brud på indsatsen.
  3. Til western blot-analyse indsamles total proteinlysat i 125 μL RIPA-buffer (50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 0,5% deoxycholat, 0,1% SDS, 1% NP40) suppleret med proteasehæmmere og fosfatasehæmmere.
  4. Tilsæt 125 μL RIPA buffer til det apikale rum, og inkuber i 5-10 min.
  5. Skrab membranen ved hjælp af en P200-pipettespids for at fjerne eventuelle resterende fastgjorte celler, og saml hele volumenet (skrab kraftigt over hele membranens overflade, og pipette derefter op og ned flere gange for at opsamle hele prøven).
  6. Der inkuberes proteinlysatprøver på is i 10 minutter, og centrifugeres derefter ved maksimal hastighed (20.000 × g) i 10 minutter ved 4 °C.
  7. Supernatanten blandes med 4x Laemmli prøvebuffer med β-mercaptoethanol (reduktionsmiddel) i henhold til producentens protokoller.
  8. Kog proteinprøver ved 95 °C i 5 minutter, og kør derefter ved hjælp af traditionelle western blotting-protokoller 1,16,17.
  9. Til indsamling af total RNA skal du bruge et kommercielt tilgængeligt RNA-ekstraktionssæt efter eget valg.
    BEMÆRK: Det apikale rum af 24-brønds transwellindsatser har et maksimalt volumen på ~ 200 μL; Således udfører vi to sekventielle vaske på hver kultur for at nå det samlede anbefalede volumen. Detaljer nedenfor svarer til anbefalet indsamling af RNA-prøver i et 350 μL totalvolumen.
  10. Tilsæt 200 μL lysisbuffer til det apikale rum i den inficerede transwell.
  11. Lad sidde i 5-10 minutter, skrab eventuelle resterende celler fra membranen ved hjælp af en pipettespids, og saml hele volumenet i et mærket mikrocentrifugerør.
  12. Der tilsættes 150 μL yderligere lysisbuffer til transbrøndens apikale rum, og pipetten pipetteres op og ned, før den opsamles i samme mikrocentrifugerør.
  13. Uddrag RNA i henhold til producentens protokol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De repræsentative tal er delvist tilpasset fra data, der findes i manuskriptet Otter et al.1. Nasale ALI-kulturer afledt af fire eller seks donorer blev inficeret med en af fire HCoV'er (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 og HCoV-229E) i henhold til protokollerne beskrevet ovenfor, og de gennemsnitlige apikale udgydelse af virale titere for hver virus er afbildet i figur 1A. Mens alle fire af disse HCoV'er replikerer produktivt i nasale ALI-kulturer, replikerer SARS-CoV-2 og HCoV-229E mest effektivt. Bemærk, at disse er gennemsnitlige virale titere, og at titere for hver HCoV i individuelle donorer for nylig blev offentliggjort1. Efter vask af nasale ALI-kulturer som beskrevet i protokolafsnit 3 sammenlignes MERS-CoV-titere i apikal overfladevæske (ASL) med intracellulære virale titere i figur 1B. MERS-CoV intracellulære og apikale skurede virale titere er omtrent de samme 48 timer efter infektion (hpi).

Immunofluorescensbilleddannelse af inficerede nasale ALI-kulturer er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at undersøge cellulær tropisme og andre infektionsparametre, såsom syncytiadannelse, celle-til-celle-fusion og skade på epitelbarriereintegritet. Co-farvning af inficerede kulturer med antistoffer, der er specifikke for virale antigener (såsom nukleocapsid eller HCoV nonstrukturelle proteiner) og markører for cilierede eller bægerceller (henholdsvis type IV β-tubulin og MUC5AC) kan bestemme cellulær tropisme for en HCoV i nasale ALI'er25,26. Figur 2A viser repræsentative billeder af næsekulturer inficeret med SARS-CoV-2, MERS-CoV og HCoV-NL63.

SARS-CoV-2 og HCoV-NL63 inficerer primært cilierede celler (fremgår af colokalisering af viral nukleocapsidfarvning med ciliamarkør type IV β-tubulin og manglende colokalisering af viralt antigen med bægercellemarkør MUC5AC). MERS-CoV inficerer overvejende ikke-cilierede bægerceller i nasale ALI-kulturer, da MERS-CoV viser det modsatte mønster med colokalisering af viral antigenfarvning med MUC5AC og minimal colokalisering af viral nukleocapsidfarvning med type IV β-tubulin. Markører såsom phalloidin, som binder til actinfilamenter, eller EpCAM, epitelcelleadhæsionsmolekyle, kan bruges til at visualisere epitelcytoskelettet og detektere et tab af epitelbarriereintegritet27. Figur 2B viser phalloidinfarvning i nasale ALI-kulturer; panel 1 viser intakt cytoskeletal F-actin ultrastruktur i en mock-inficeret kultur, og panel 2 viser et tab af phalloidinintegritet og antyder potentiel skade på epitelbarrierefunktion i en HCoV-NL63-inficeret kultur. Epitelmarkører som disse kan anvendes på HCoV-infektioner for at karakterisere epitelbarrieredynamikken under infektion.

Efter infektion af nasale ALI-kulturer med hver af de fire HCoV'er blev transepitelial elektrisk modstand (TEER) overvåget. Baseline TEER-aflæsninger blev registreret før infektion, 0 hpi, og TEER blev igen evalueret for hver transwell ved 96 hpi og 192 hpi. Figur 3 viser TEER-ændringer for hver af HCoV'erne. Figur 3A,B viser ΔTEER-værdier (forskelle i TEER beregnet for hver transwell ved at trække baseline TEER ved 0 hpi fra TEER målt på et givet punkt). For SARS-CoV-2, MERS-CoV og HCoV-NL63 forekommer store ændringer i TEER sent i infektionen (192 hpi), og figur 3A illustrerer, at SARS-CoV-2- og HCoV-NL63-infektioner resulterer i negative ΔTEER-værdier (192 hpi - 0 hpi), mens MERS-CoV-infektion ikke gør det. Mock ΔTEER-værdier er inkluderet til sammenligning og illustrerer, at ændringer i TEER efter MERS-CoV-infektion ikke er signifikant forskellige fra dem, der ses under mock-infektion. Negative ΔTEER-værdier indikerer fald i epitelbarriereintegritet og kompromitteret epitelbarrierefunktion. Figur 3B viser ΔTEER-værdier for HCoV-229E (beregnet ud fra 96 hpi og 192 hpi). HCoV-229E forårsager epitelbarrieredysfunktion på det tidligere tidspunkt (96 hpi), men genopretning til mock-niveauer sker på det senere tidspunkt (192 hpi). Disse data fremhæver, hvordan TEER-kinetikken kan variere mellem vira. Figur 3C,D viser TEER-spor, som viser rå TEER-data for hver inficeret transwell over tid, hvilket giver mulighed for visualisering af TEER-tendenser i løbet af infektionsforløbet. Hvis det ønskes, kan behandling med cytokinet IL-13 inkluderes som en positiv kontrol under TEER-forsøg, da dette forringer stramme kryds, kompromitterer epitelbarrierefunktionen og dermed øger membranpermeabiliteten i luftvejsepitel; derfor forventes cytokin IL-13 at resultere i fald i TEER28,29,30.

Som supplement til TEER-målinger i næsekulturer kan cytotoksicitet kvantificeres via kvantificering af laktatdehydrogenase (LDH), der frigives apikalt under infektion. Figur 4 viser gennemsnitlige cytotoksicitetsdata ved 96 hpi og 192 hpi fra kulturer afledt af 10 donorer inficeret med hver af HCoV'erne assayet. SARS-CoV-2, HCoV-NL63 og HCoV-229E forårsager signifikant cytotoksicitet i næsekulturer, mens MERS-CoV ikke gør det.

Total protein eller RNA indsamlet fra inficerede nasale kulturer kan bruges til at undersøge forskellige HCoV-værtsinteraktioner. Vi behandlede næsekulturer med type 2 cytokin IL-13 for at inducere bægercellehyperplasi og modellere vævslandskabet i en astmatisk luftvej. Figur 5A viser qPCR-data, der kvantificerer mRNA-overflod af to store HCoV-receptorer efter IL-13-behandling. DPP4 er den cellulære receptor for MERS-CoV, og ACE2 er den cellulære receptor for både SARS-CoV-2 og HCoV-NL63. IL-13-behandling resulterer i dramatisk øget DPP4-ekspression, men ingen signifikante ændringer i ACE2-ekspression. Figur 5B viser western blot-data til evaluering af proteinoverflod efter IL-13-behandling i uinficerede og SARS-CoV-2-inficerede kulturer. IL-13-behandling resulterer i signifikant øget MUC5AC (en bægercellemarkør) og nedsat type IV β-tubulin (en cilieret cellemarkør), hvilket afspejler den forventede bægercellehyperplasi forårsaget af denne cytokinbehandling. Proteinniveauanalyse viser, at IL-13-behandling øger DPP4-ekspression, men reducerer ACE2-ekspression. Western blotting for SARS-CoV-2 nukleocapsidprotein afslører, at IL-13-behandling resulterer i et lille fald i viralt antigen sammenlignet med skambehandlede kulturer. Lignende analyser kan udføres for ethvert mRNA eller protein af interesse efter manipulation af nasale ALI-kulturer og/eller infektion med HCoV'er.

Figure 1
Figur 1: HCoV-replikation i nasale ALI-kulturer. Nasale kulturer afledt af seks eller fire donorer blev inficeret i tre eksemplarer med SARS-CoV-2 (6), MERS-CoV (6), HCoV-NL63 (6) eller HCoV-229E (4) ved MOI = 5. Apikal overfladevæske blev opsamlet ved 0 hpi, 48 hpi, 96 hpi og 144 hpi, og infektiøs virus blev kvantificeret ved plaqueanalyse. (A) Gennemsnitlige virale titere fra alle donorer, der er inficeret med hver HCoV, er afbildet. (B) Nasale kulturer afledt af en enkelt donor blev inficeret i tre eksemplarer ved MOI = 5, og ASL blev indsamlet ved 48 hpi. Efter ASL-opsamling blev transwellerne vasket 3x med PBS og derefter lyseret via fryse-optøning for at kvantificere intracellulær virus. Infektiøs virus i det apikale skurrum versus i det intracellulære rum blev kvantificeret ved plaqueassay. Data vises som middelværdi ± SD. Forkortelser: ALI = luft-væske-grænseflade; MOI = mangfoldighed af infektion; ASL = apikal overfladevæske; HPI = timer efter infektion; PBS = fosfatbufret saltvand. Dette tal blev konstrueret ved hjælp af data offentliggjort i Otter et al.1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Immunofluorescensbilleddannelse af nasale ALI-kulturer til karakterisering af cellulær tropisme og epitelintegritet. (A) Nasale ALI-kulturer blev inficeret med SARS-CoV-2, MERS-CoV eller HCoV-NL63 ved MOI = 5 og fikseret i 4% paraformaldehyd ved 96 hpi. Kulturer blev forberedt til immunfluorescensbilleddannelse, som beskrevet ovenfor i protokolafsnit 6, ved anvendelse af primære antistoffer mod hvert virusnukleocapsidprotein (vist i rødt), cilieret cellemarkør type IV β-tubulin (grøn) eller bægercellemarkør MUC5AC (grøn). Det skal bemærkes, at et antistof mod MERS-CoV nonstructural protein 8 (nsp8) blev anvendt i stedet for et antistof mod nukleocapsidprotein på grund af artens uforenelighed med MUC5AC-antistoffet. Colokalisering mellem viralt antigen og hver af epitelcellemarkørerne visualiseres som orange / gul farve i fusionerede billeder for hver virus. (B) Nasale ALI-kulturer blev farvet ved hjælp af phalloidin (som pletter actin cytoskeletale filamenter) for at visualisere cytoskeletal integritet, som vist i pink. Hoescht-farvning er vist med blåt. Panel 2B.1 viser skarp, intakt phalloidinfarvning, hvilket indikerer intakt cytoskeletal arkitektur, mens panel 2B.2 viser et tab af epitelintegritet og sløring af phalloidin-pletten. Skalastænger = (A) 50 μm, (B) 10 μm. Forkortelser: ALI = luft-væske interface; MOI = mangfoldighed af infektion; HPI = timer efter infektion. Denne figur blev konstrueret ved hjælp af data offentliggjort i Otter et al. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Måling af transepitelial elektrisk modstand i ALI-kulturer under infektion. (A) Nasale ALI-kulturer afledt af 10 donorer blev enten mock-inficeret eller inficeret ved MOI = 5 med SARS-CoV-2, MERS-CoV eller HCoV-NL63. ΔTEER blev beregnet for hver transwell som TEER ved 192 hpi minus TEER ved 0 hpi (baseline TEER). Hver søjle illustrerer den gennemsnitlige ΔTEER-værdi for hver virus blandt tredobbelte kulturer fra hver donor. (B) Nasale ALI-kulturer afledt af 8 donorer blev mock-inficeret eller inficeret med HCoV-229E ved MOI = 5. ΔTEER fra baseline TEER blev beregnet som i (A) ved anvendelse af TEER ved enten 96 hpi eller 192 hpi. (C,D) TEER-sporingsdata er afbildet for mock-inficerede eller HCoV-inficerede kulturer afledt af hver af fire donorer. Hver linje repræsenterer TEER-data fra en enkelt transwell over tid (tredobbelt transwells fra hver donor blev analyseret). Donornumre er farvekodede og vises i nøglen til højre for hver graf. Data vises som middelværdi ± SD i panel A og panel B. Forkortelser: ALI = luft-væske interface; MOI = mangfoldighed af infektion; HPI = timer efter infektion; TEER = transepitelial elektrisk modstand. Dette tal blev konstrueret ved hjælp af data offentliggjort i Otter et al.1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Cytotoksicitetskvantificering under HCoV-infektion af nasale ALI-kulturer. Nasale kulturer afledt af 10 donorer inficeret med hver HCoV i tre eksemplarer ved MOI = 5 gennemgik LDH-kvantificering i ASL-prøver, som beskrevet ovenfor. Gennemsnitlig cytotoksicitet blandt alle testede donorer er vist for hver HCoV ved 96 hpi og 192 hpi. Data vises som middelværdi ± SD. Forkortelser: ALI = luft-væske-grænseflade; MOI = mangfoldighed af infektion; HPI = timer efter infektion; TEER = transepitelial elektrisk modstand; ASL = apikal overfladevæske; LDH = lactat dehydrogenase. Dette tal blev konstrueret ved hjælp af data offentliggjort i Otter et al.1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: mRNA/proteinanalyse efter infektion af næsekulturer. Nasale kulturer behandlet med type 2 cytokin IL-13 eller sham-behandlede blev anvendt til at evaluere ændringer i ekspression af HCoV-receptorer såvel som i cilierede og bægercellemarkører. (A) mRNA-ekspression af DPP4 og ACE2 blev kvantificeret via RT-qPCR. Data for kulturer fra tre donorer behandlet med IL-13 vises som foldændringer over skinbehandlede kulturer afledt af de samme donorer. Data vises som gennemsnit ± SD, hvor hvert punkt repræsenterer gennemsnitlig foldændringsinduktion for en enkelt donor. (B) Samlet protein blev høstet fra nasale kulturer, der enten var skam- eller IL-13-behandlede og enten mock- eller SARS-CoV-2-inficerede. Proteiner blev adskilt via SDS-PAGE og immunblottet med antistoffer mod epitelcellemarkører (type IV β-tubulin, MUC5AC), HCoV-receptorer (ACE2, DPP4), SARS-CoV-2 nukleocapsidprotein og GAPDH. Forkortelser: RT-qPCR = reverse-transkription-kvantitativ polymerasekædereaktion; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese. Dette tal blev konstrueret ved hjælp af data offentliggjort i Otter et al.1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De metoder, der er beskrevet her, beskriver et primært epitelkultursystem, hvor patientafledte nasale epitelceller dyrkes ved en luft-væske-grænseflade og anvendes til undersøgelse af HCoV-værtsinteraktioner. Når de er differentieret, rekapitulerer disse nasale ALI-kulturer mange funktioner i in vivo næseepitelet, herunder en heterogen cellulær population med cilierede, bæger- og basalceller repræsenteret samt intakt mucociliær funktion med robust bankende cilia og slimsekretion. Denne heterogene cellepopulation er en vigtig fordel ved dette kultursystem i forhold til traditionelle respiratoriske epitelcellelinjer, da det giver mulighed for karakterisering af værtscelletropisme under virusinfektion (som vist i figur 2). Traditionelle luftvejsepitelcellelinjer mangler også funktionelle mucociliære clearancemekanismer, som spiller nøgleroller i det primære forsvar mod respiratoriske vira sammen med medfødte immunveje såsom interferonproduktion.

Kritiske trin i protokollen omfatter den indledende infektionsprocedure; For eksempel skal kulturerne ekvilibreres ved den ønskede temperatur før infektion, og der skal anvendes en konsekvent metode til at starte hver infektion. Disse trin er afgørende for at standardisere metoden og sikre reproducerbarhed i downstream-fund.

Måske er den vigtigste del af disse metoder kvantificeringen af apikalt frigivet virus, da forståelse af den unikke replikationscyklus for hver HCoV hjælper med at bestemme de tidspunkter, der kan være bedst til yderligere analyse. De ovenfor beskrevne immunfluorescensteknikker er også kritiske, da evnen til at visualisere virusinfektioner i et in vitro næseepitel med en repræsentativ heterogen cellulær population muliggør nøjagtig vurdering af viral tropisme og giver mulighed for yderligere at forespørge virus-værtsinteraktioner i en fysiologisk indstilling.

Næseepitelet er det primære barrierested, som alle respiratoriske vira støder på, og det er derfor sandsynligt, at HCoV-infektioner begynder med primær infektion i næseepitelet, med potentiale til at sprede sig til den nedre luftvej via en oral-lungeaspirationsakse. Dette spiller sandsynligvis en rolle i udviklingen af alvorlig lungebetændelse og luftvejssygdomme under patogen HCoV-infektion (MERS-CoV, SARS-CoV-2), mens sæsonbestemte HCoV'er kun har tendens til at forårsage sygdom i de øvre luftveje. Det er afgørende at forstå HCoV-værtsinteraktioner på dette vigtige immunkontrolsted, og dette nasale ALI-system muliggør karakterisering af viral replikation, værtscelletropisme samt cytotoksicitet og medfødt immuninduktion under HCoV-infektion.

Dette nasale ALI-dyrkningssystem er også meget tilpasningsdygtigt og kan bruges til at afspejle mange kliniske sygdomstilstande. Nasale prøver erhvervet fra patienter med genetiske lungesygdomme såsom cystisk fibrose (forårsaget af en chloridkanaldefekt) eller primære ciliære dyskinesier (hvor ciliære slagmekanismer er dysfunktionelle) kan bruges til at dyrke nasale ALI-kulturer, der er repræsentative for disse patologier for at forstå, hvordan disse patienter kan påvirkes forskelligt af HCoV-infektion31,32. Derudover kan forskellige cytokinbehandlinger anvendes under differentieringen af nasale ALI-kulturer for at genskabe træk ved andre sygdomstilstande. For eksempel inducerer IL-13-behandling under differentiering bægercellehyperplasi og kan bruges som surrogat til undersøgelse af astmatiske eller allergiske luftveje33,34. Således er dette nasale ALI-system et kraftfuldt værktøj til at undersøge HCoV-vært såvel som andre virus-værtsinteraktioner både i raske og syge nasale luftveje.

Selvom dette system giver mange fordele, opstår der også nogle begrænsninger ved brug af nasale ALI-kulturer. Selvom næseceller kræver langt mindre invasive teknikker til erhvervelse end bronchiale eller lungeceller, kræver dyrkning og differentiering af ALI-kulturer betydeligt mere tid og ressourcer end brugen af traditionelle udødeliggjorte cellelinjer. Derudover kan donor-til-donor-variation med hensyn til tilladelse til infektion samt værtsrespons på HCoV-infektion gøre det vanskeligere at reproducere og fortolke data (det er derfor, eksperimenter ofte udføres med kulturer afledt af 5-10 donorer for at afbøde disse problemer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Susan Weiss er medlem af Scientific Advisory Boards for Ocugen. Noam A. Cohen rådgiver for GSK, AstraZeneca, Novartis, Sanofi/Regeron og Oyster Point Pharmaceuticals og har et amerikansk patent, "Therapy and Diagnostics for Respiratory Infection" (10.881.698 B2, WO20913112865), og en licensaftale med GeneOne Life Sciences.

Acknowledgments

Denne undersøgelse har følgende finansieringskilder: National Institutes of Health (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. og N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. og N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. og N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) Invitrogen Various
BSA (bovine serum albumin) Sigma-Aldrich A7906
cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor Roche 11836170001
Cytotoxicity detection kit Roche 11644793001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) Gibco 11965-084
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) Gibco 14190136
DPBS + calcium + magnesium Gibco 14040-117
Endohm-6G measurement chamber World Precision Instruments ENDOHM-6G
Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) eBiosciences 14-9326-82
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) World Precision Instruments 300523
FBS (Fetal Bovine Serum) HyClone SH30071.03
FV10-ASW software for imaging Olympus Version 4.02
HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) BEI Resources NR-470
HCoV-NL63 nucleocapsid antibody Sino Biological 40641-V07E
Hoescht stain Thermo Fisher H3570
Laemmli sample buffer (4x) BIO-RAD 1610747
LLC-MK2 cells ATCC CCL-7 To titrate HCoV-NL63
MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) BEI Resources  NR-44260
MERS-CoV nucleocapsid antibody Sino Biological 40068-MM10
MUC5AC antibody Sigma-Aldrich AMAB91539
Olympus Fluoview confocal microscope Olympus FV1000
Phalloidin-iFluor 647 stain Abcam ab176759
PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors)  Roche PHOSS-RO
Plate reader  Perkin Elmer HH34000000 Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm
RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) Thermo Fisher 89990 Can prep in-house or purchase
RNeasy Plus Kit Qiagen 74134
SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) BEI Resources NR-52281
SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody Genetex GTX135357
Triton-X 100 Fisher Scientific BP151100
Type IV β- tubulin antibody Abcam ab11315
VeroCCL81 cells ATCC CCL-81 To titrate MERS-CoV
VeroE6 cells ATCC CRL-1586 To titrate SARS-CoV-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Otter, C. J., et al. Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120 (2023).
  2. Fehr, A., Perlman, S. Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis. Methods in Molecular Biology. 1282, 1-23 (2015).
  3. Gaunt, E. R., Hardie, A., Claas, E. C. J., Simmonds, P., Templeton, K. E. Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2940-2947 (2010).
  4. Kesheh, M. M., Hosseini, P., Soltani, S., Zandi, M. An overview on the seven pathogenic human coronaviruses. Reviews in Medical Virology. 32 (2), 2282 (2022).
  5. MERS-CoV Worldwide Overview. European Centre for Disease Prevention and Control. , Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update (2022).
  6. MERS Situation Update. World Health Organization Regional Office for the Eastern Mediterranean. , Available from: http://www.emro.who.int/health-topics/mers-cov/mers-outbreaks.html (2022).
  7. Cao, Y., Liu, X., Xiong, L., Cai, K. Imaging and clinical features of patients with 2019 novel coronavirus SARS-CoV-2: A systematic review and meta-analysis. Journal of Medical Virology. 92 (9), 1449-1459 (2020).
  8. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses. Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).
  9. Farzal, Z., et al. Comparative study of simulated nebulized and spray particle deposition in chronic rhinosinusitis patients. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 746-758 (2019).
  10. Gaeckle, N. T., Pragman, A. A., Pendleton, K. M., Baldomero, A. K., Criner, G. J. The oral-lung axis: The impact of oral health on lung health. Respiratory Care. 65 (8), 1211-1220 (2020).
  11. Hou, Y., et al. SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract. Cell. 182, 429-446 (2020).
  12. Hariri, B. M., Cohen, N. A. New insights into upper airway innate immunity. American Journal of Rhinology and Allergy. 30 (5), 319-323 (2016).
  13. Hiemstra, P. S., McCray, P. B., Bals, R. The innate immune function of airway epithelial cells in inflammatory lung disease. European Respiratory Journal. 45 (4), 1150-1162 (2015).
  14. Hatton, C. F., et al. Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2. Nature Communications. 12 (1), 7092 (2021).
  15. Sungnak, W., et al. SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes. Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).
  16. Li, Y., et al. SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118 (2021).
  17. Comar, C. E., et al. MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119 (2022).
  18. Lee, R. J., et al. Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells. Science Signaling. 10 (495), (2017).
  19. Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
  20. Comer, D. M., Elborn, J. S., Ennis, M. Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD. PLoS One. 7 (3), e32924 (2012).
  21. Vanders, R. L., Hsu, A., Gibson, P. G., Murphy, V. E., Wark, P. A. B. Nasal epithelial cells to assess in vitro immune responses to respiratory virus infection in pregnant women with asthma. Respiratory Research. 20 (1), 259 (2019).
  22. Lee, R. J., et al. Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function. Scientific Reports. 6, 33221 (2016).
  23. Patel, N. N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
  24. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065 (2014).
  25. Robinot, R., et al. SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance. Nature Communications. 12 (1), 4354 (2021).
  26. Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).
  27. Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin. Journal of Cell Science. 135 (16), 259871 (2022).
  28. Schmidt, H., et al. IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222 (2019).
  29. Huang, Z. Q., et al. Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749 (2020).
  30. Saatian, B., et al. Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells. Tissue Barriers. 1 (2), e24333 (2013).
  31. Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753 (2020).
  32. Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. Air−liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions. Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111 (2021).
  33. Seibold, M. A. Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium. Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).
  34. Morrison, C. B., et al. SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119 (2022).

Tags

Infektion Primære nasale epitelceller Luft-væske-grænseflade Human coronavirus Værtsinteraktioner SARS-CoV MERS-CoV SARS-CoV-2 HCoV-NL63 HCoV-229E HCoV-OC43 HCoV-HKU1 Luftveje Næseepitel Patientafledte næseprøver Værtspatogeninteraktioner Luftveje Ciliærfunktion Slimproduktion Viral replikation Værtscelletropisme Virusinduceret cytotoksicitet Medfødt immuninduktion Antiviral terapi
Infektion af primære nasale epitelceller dyrket ved en luft-væske-grænseflade for at karakterisere humane coronavirus-værtsinteraktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Otter, C. J., Fausto, A., Tan, L.… More

Otter, C. J., Fausto, A., Tan, L. H., Weiss, S. R., Cohen, N. A. Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions. J. Vis. Exp. (199), e64868, doi:10.3791/64868 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter