Summary
Näsepitelet är det primära barriärstället som alla luftvägspatogener stöter på. Här beskriver vi metoder för att använda primära nasala epitelceller odlade som luft-vätskegränssnittskulturer (ALI) för att karakterisera humana interaktioner mellan coronavirus och värd i ett fysiologiskt relevant system.
Abstract
Tre högpatogena humana coronavirus (HCoV) – SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) och SARS-CoV-2 (2019) – har dykt upp och orsakat betydande folkhälsokriser under de senaste 20 åren. Ytterligare fyra HCoV:er orsakar en betydande andel av vanliga förkylningsfall varje år (HCoV-NL63, -229E, -OC43 och -HKU1), vilket belyser vikten av att studera dessa virus i fysiologiskt relevanta system. HCoVs kommer in i luftvägarna och etablerar infektion i näsepitelet, den primära platsen som alla luftvägspatogener påträffar. Vi använder ett primärt nasalt epitelodlingssystem där patientderiverade nasala prover odlas vid ett luft-vätskegränssnitt (ALI) för att studera värd-patogeninteraktioner vid denna viktiga sentinelplats. Dessa kulturer rekapitulerar många egenskaper hos in vivo-luftvägarna , inklusive de celltyper som finns, ciliarfunktion och slemproduktion. Vi beskriver metoder för att karakterisera viral replikation, värdcellstropism, virusinducerad cytotoxicitet och medfödd immuninduktion i nasala ALI-kulturer efter HCoV-infektion, med hjälp av nyligen utfört arbete som jämför letala och säsongsbetonade HCoVs som ett exempel1. En ökad förståelse för värd-patogeninteraktioner i näsan har potential att ge nya mål för antivirala terapier mot HCoVs och andra luftvägsvirus som sannolikt kommer att dyka upp i framtiden.
Introduction
Sju humana coronavirus (HCoV) har hittills identifierats och orsakar en rad luftvägssjukdomar2. De vanliga eller säsongsbetonade HCoVs (HCoV-NL63, -229E, -OC43 och -HKU1) är vanligtvis associerade med patologi i de övre luftvägarna och orsakar uppskattningsvis 10%-30% av vanliga förkylningsfall årligen. Även om detta är den typiska kliniska fenotypen som förknippas med den vanliga HCoV:n, kan dessa virus orsaka mer betydande sjukdomar i de nedre luftvägarna i riskpopulationer, inklusive barn, äldre vuxna och immunsupprimerade individer 3,4. Tre patogena HCoV:er har dykt upp och orsakat betydande folkhälsokriser under de senaste 20 åren, inklusive svår akut respiratorisk sjukdom (SARS)-CoV, Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV och SARS-CoV-2. Dödliga HCoVs är förknippade med allvarligare luftvägspatologi, vilket tydligt illustreras av den >34 % dödlighet som förknippas med MERS-CoV-fall (894 dödsfall från över 2 500 fall sedan dess uppkomst 2012)5,6. Det är viktigt att notera att de dödliga HCoV:erna också orsakar en rad luftvägssjukdomar, från asymtomatiska infektioner till dödlig lunginflammation, vilket har setts med den pågående covid-19-pandemin7.
HCoV, liksom andra luftvägspatogener, kommer in i luftvägarna och etablerar en produktiv infektion i näsepitelet8. Spridning till de nedre luftvägarna tros vara förknippad med aspiration från munhålan/näshålan till lungan, där HCoVs orsakar mer signifikant patologi i de nedre luftvägarna 9,10,11. Således fungerar näsan som den första portalen för virusinträde och är den primära barriären för infektion med sitt robusta mukociliära rensningsmaskineri och unika medfödda immunmekanismer som syftar till att förhindra ytterligare virusspridning till de nedre luftvägarna12,13. Till exempel har nasala epitelceller rapporterats uttrycka högre basala nivåer av antivirala interferoner och interferonstimulerade gener än genomsnittet, vilket tyder på att nasala celler kan vara förberedda för tidiga svar på luftvägsvirus14,15,16.
Vi har tidigare använt patient-deriverade primära nasala epitelceller odlade vid ett luft-vätskegränssnitt (ALI) för att modellera HCoV-värdinteraktioner i näsan, där HCoV-infektioner börjar. Nasala ALI-kulturer är tillåtande för både patogena (SARS-CoV-2 och MERS-CoV) och vanliga HCoVs (HCoV-NL63 och HCoV-229E) och erbjuder olika fördelar jämfört med traditionella luftvägsepitelcellinjer såsom A549 (en lungadenokarcinomcellinje)16,17. Efter differentiering innehåller nasala ALI-kulturer en heterogen cellulär population och uppvisar många av de funktioner som förväntas av in vivo nasala epitel, såsom mukociliärtclearancemaskineri 18. Näsceller erbjuder också fördelar jämfört med odlingssystem i de nedre luftvägarna (t.ex. humana bronkialepitelceller, HBEC), eftersom förvärv av nasala epitelceller via cytologisk borstning är betydligt mindre invasivt jämfört med att använda tekniker som bronkoskopi för att uppnå HBEC 19,20,21.
Denna artikel beskriver metoder för att använda detta nasala ALI-odlingssystem för att karakterisera HCoV-värdinteraktioner i det nasala epitelet. Vi har tillämpat dessa metoder i nyligen publicerade arbeten för att jämföra SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 och HCoV-229E 1,16,17. Även om dessa metoder och representativa resultat betonar studiet av HCoVs i denna nasala cellmodell, är systemet mycket anpassningsbart till andra HCoV, såväl som andra luftvägspatogener. Vidare kan dessa metoder tillämpas bredare på andra ALI-odlingssystem för att undersöka virusreplikation och cellulär tropism, samt cytotoxicitet och medfödd immuninduktion efter infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användningen av nasala prover godkändes av University of Pennsylvania Institutional Review Board (protokoll # 800614) och Philadelphia VA Institutional Review Board (protokoll # 00781).
1. Infektion av nasala ALI-kulturer
OBS: Förvärv av kliniska prover, såväl som tillväxt och differentiering av nasala ALI-kulturer, ligger utanför ramen för denna artikel. Specifika metoder för att odla primära nasala epitelceller finns i nyligen publicerade arbeten som använder dessa kulturer 18,22,23. Nedanstående protokoll kan dessutom tillämpas på kommersiellt tillgängliga nasala epiteliala ALI-kulturer om så önskas. Protokoll och volymer som beskrivs nedan är tillämpliga på 24-håls platttransbrunnsinsatser (6,5 mm diameter, 0,33 cm2 membranyta). Om du använder ALI-kulturer som odlats på större brunnar (dvs. plattor med 12 brunnar, 12 mm diameter, 1,12 cm2 yta), justera volymerna proportionellt för att återspegla brunnsstorleken.
- Dagen före infektion:
- Tvätta ALI-kulturer 3x med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) apikalt (tillsätt ~200 μL uppvärmd PBS, placera i 37 °C inkubator i 5 minuter, aspirera PBS och upprepa).
- Byt ut basalmediet (500 μL).
- Låt odlingarna komma i jämvikt vid den temperatur vid vilken infektionerna kommer att utföras över natten (dvs. om de infekteras vid 33 °C, placera odlingarna i en inkubator vid 33 °C efter PBS-tvätt).
OBS: HCoVs associerade med förkylning som HCoV-229E och HCoV-NL63 rapporteras replikera mer effektivt vid 33 °C. Dessutom är temperaturen i näsepitelet in vivo 33 °C (detta skiljer sig från lungans temperatur, som är 37 °C).
- Späd ut viruset efter behov i serumfritt Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) för att uppnå önskad infektionsmultiplicitet (MOI) i en total inokulumvolym på 50 μL.
OBS: Infektioner har vanligtvis utförts vid MOI = 5 (högt MOI); Infektioner vid MOI = 0,5 (lågt MOI) har dock också använts för SARS-CoV-2 och förkylningsassocierad HCoV, och dessa resulterar i jämförbara maximala virala titrar, men med varierande kinetik (båda MOI är acceptabla). - Tillsätt inokulum apikalt och lägg tillbaka kulturerna i inkubatorn i 1 timme.
- Häll plattorna försiktigt var 15:e minut under infektionen (håll plattan stadigt i båda händerna, gunga framåt och bakåt och från sida till sida för att säkerställa enhetlig adsorption av virusinokulum).
- Efter 1 timmes inkubation, aspirera virusinokulum och tvätta varje infekterad kultur 3 gånger med PBS för att säkerställa avlägsnande av virusinokulum (för varje tvätt, tillsätt 200 μL PBS, inkubera i 5 minuter och aspirera eller ta bort med en pipett).
- Om så önskas, samla in den tredje PBS-tvätten för att bekräfta adekvat avlägsnande av inmatat virus.
- Byt ut basalmediet mot färskt medium på infekterade ALI var 72:e timme under infektion.
2. Uppsamling av apikal ytvätska (ASL) och titrering av utsöndrat virus
- Vid förutbestämda tidpunkter efter infektion tillsätts 200 μl PBS till den apikala kammaren i varje infekterad transbrunn.
OBS: Relevanta tidpunkter varierar beroende på HCoV av intresse och sträcker sig från 24 timmar till 192 timmar efter infektion (se avsnittet om representativa resultat för virusreplikationsdata för olika HCoV). - Pipettera PBS upp och ner 5x för att säkerställa maximal insamling av apikalt utsöndrat virus och samla upp hela volymen i ett mikrocentrifugrör (detta är ASL-provet).
OBS: ASL innehåller utsöndrade viruspartiklar förutom slem och andra produkter som utsöndras apikalt från ALI-kulturer. - Kvantifiera infektiöst virus i ASL via standardanalys av virala plack (seriespäda virusinnehållande prover för att kvantifiera koncentrationen av viruspartiklar).
OBS: Celltyper och inkubationstid som används för plackanalys beror på vilket virus som används: SARS-CoV-2 (VeroE6-celler); MERS-CoV (VeroCCL81-celler); HCoV-NL63 (LLC-MK2-celler); HCoV-229E (Huh7-celler). Detaljer om hur man genomför virala plackanalyser ligger utanför ramen för detta manuskript men har beskrivits tidigare i en publikation i Journal of Visualized Experiments (JoVE)24. - Om så önskas, samla in basalmediet vid olika tidpunkter efter infektion för att bekräfta frånvaron av basalt frisöndrat virus. HCoVs frisätts vanligtvis apikalt från nasala epitelceller, men bekräftar detta via plackanalys av outspätt basalmedium.
- Förvara ASL-prover vid −80 °C om kvantifiering med plackanalys inte kommer att ske på insamlingsdagen.
3. Kvantifiering av intracellulärt virus
- Efter att ha samlat ASL-provetamp, flytta varje transbrunn till en ren 24-hålsplatta förladdad med 500 μL DMEM som innehåller 2 % fetalt bovint serum (FBS) basalt.
OBS: DMEM med 2 % FBS används för att stabilisera viruset under efterföljande frys-upptiningscykler. - Tvätta varje transwell 3x apikalt med PBS för att säkerställa fullständigt avlägsnande av apikalt utsöndrat virus.
- Efter aspirering för att ta bort den sista PBS-tvätten, tillsätt 100 μL DMEM med 2 % FBS till det apikala facket.
- Flytta plattan som innehåller transwells med både apikala och basala medier till en frys på −80 °C och genomför tre på varandra följande frys-upptiningscykler för att lysera cellerna.
- Efter den sista frys-upptiningscykeln, poola apikala (100 μL) och basala (500 μL) medier i ett rent rör.
- Centrifugera vid 500 × g i 10 minuter vid 4 °C för att pelletera eventuellt cellulärt skräp.
- Samla supernatanten. Detta är det intracellulära virusprovet för titrering via standardplackanalys.
OBS: Trefaldig utspädning sker under insamlingsprocessen i förhållande till ASL-insamling; ASL-prover samlas in i 200 μL PBS, medan intracellulära virusprover samlas in i en total volym på 600 μL.
4. Mätning av transepitelial elektrisk resistans (TEER)
OBS: För TEER-mätning bör PBS kompletterat med kalcium och magnesium (PBS + Ca 2+/Mg2+) användas. En epitelial volt/ohmmeter inställd på att läsa i ohm används (se materialtabellen).
- Rengör, jämvikt och töm EVOM-instrumentet enligt tillverkarens instruktioner; Använd en "tom" Transwell utan att några näsceller har tillsatts för blankning. Anteckna tom TEER-mätning.
OBS: Om du använder flera virus måste EVOM-instrumentet rengöras noggrant mellan förhållandena för att undvika korskontaminering (tvättar med 70 % etanol följt av avjoniserat vatten räcker). - Flytta varje infekterad transbrunn till en förmärkt, ren 24-hålsplatta med 500 μL PBS + Ca 2+/Mg2+ basalt för att tvätta kvarvarande basalmedium från transbrunnarna.
- Tillsätt 200 μL PBS + Ca 2+/Mg2+ till det apikala facket i varje brunn.
- Tillsätt 1 ml PBS + Ca 2+/Mg2+ till Endohm-6 mätkammaren.
- Flytta varje genomlysning till Endohm-6-mätkammaren och sätt tillbaka locket på kammaren så att den apikala elektroden vilar i 200 μL PBS i det apikala facket; basalelektroden är inbyggd i botten av Endohm-6-kammaren.
- Låt EVOM-avläsningen stabiliseras och registrera rå TEER-mätning.
- Samla ASL-prov enligt beskrivningen ovan efter TEER-mätning om titrering önskas (samla in 200 μL PBS + Ca 2+/Mg2+ som tillsattes för TEER-mätning).
OBS: ASL-provtagning kan inducera mikrorevor i epitelbarriären som kan förvirra TEER-avläsningar, så ASL måste samlas in efter TEER-mätning. Dessutom får basalmediet inte bytas omedelbart före TEER-avläsningar eftersom detta också kan påverka TEER-värdena. - För att konvertera råa TEER-avläsningar till slutliga mätningar i ohm/cm2, subtrahera blankt TEER-värde och multiplicera detta värde med ytan på transbrunnsmembranet med hjälp av ekvation (1):
TEER = [TEER-avläsning - tomt TEER-värde] × (transwell-ytan) (1) - För HCoV, utvärdera TEER var 24:e timme eller var 48:e timme efter infektion. kinetiken för TEER-förändringar varierar ofta mellan virus och kräver felsökning vid olika tidpunkter.
- När du mäter TEER ska du alltid inkludera simulerade infekterade kulturer och utvärdera vid varje tidpunkt (negativ kontroll).
OBS: För simulerade kulturer bör TEER-mätningarna förbli stabila eller kan öka något från baslinjen efter att differentieringen av kulturerna har slutförts. Membranstödens yta varierar beroende på storlek och tillverkare av transwells. Brunnar med 24 brunnar har vanligtvis en yta på 0,33cm2.
5. Mätning av cytotoxicitet under infektion med laktatdehydrogenas (LDH)
OBS: I detta arbete kvantifierades LDH-halten i ASL-prover med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit för detektion av cytotoxicitet. LDH-signalen i basalmediet låg ofta under detektionsgränsen och var ofta mindre reproducerbar än LDH kvantifierat i ASL-prover från HCoV-infekterade odlingar.
- Förbered ytterligare kontroller som är nödvändiga för LDH-analys.
- Bakgrundskontroll: använd PBS (använd PBS som innehåller kalcium och magnesium om ASL-prover samlades in på detta sätt).
- Positiv kontroll (takvärde): behandla ALI apikalt med Triton X-100. Samla Triton-kontrollbrunnar (använd vanligtvis tre ALI-kulturer för detta vid varje tidpunkt).
- Tillsätt 200 μL 2 % Triton X-100 i PBS direkt till det apikala facket på transbrunnen.
- Inkubera i 10-15 minuter så att cellerna kan lysera helt.
- Samla in hela volymen som ett Triton-takprov.
- Negativ kontroll (LDH-frisättning vid låg kontroll/baseline ): samla in ASL från simulerade ALI-kulturer som härrör från samma donator som infekterade kulturer.
- Samla in simulerad ASL med negativ kontroll enligt ASL-insamlingsproceduren ovan.
OBS: Samma transbrunnar kan användas för denna negativa kontroll för alla tidpunkter, medan nya transbrunnar kommer att behövas för varje tidpunkt för Triton-kontrollen.
- Samla in simulerad ASL med negativ kontroll enligt ASL-insamlingsproceduren ovan.
- För att möjliggöra kvantifiering av utsöndrat virus utöver LDH-avläsningar från varje ASL-prov, ladda en optiskt klar plattbottnad svart 96-brunnsplatta enligt följande:
- Späd alla prover i PBS med 45 μL prov och 55 μL PBS (100 μL total volym).
- Behandla Triton positiv kontroll och simulera bakgrundskontrollprover på samma sätt.
OBS: Denna utspädning möjliggör tredubbel laddning av varje experimentellt prov (45 μL x 3) och tillräckligt med kvarvarande ASL-volym för titrering via plackanalys. - Ladda LDH-plattan i tre exemplar: Triton-tak, skenbakgrundskontroll, PBS-kontroll och experimentella prover.
- Bered reaktionsblandningen enligt tillverkarens anvisningar (färglösning + katalysator).
- Tillsätt 100 μl reaktionsblandning till varje brunn och inkubera plattan i rumstemperatur i 20 minuter skyddad från ljus.
- Efter 20 min, mät absorbansen vid 492 nm.
- Beräkna procentuell cytotoxicitet i förhållande till Triton-takvärdet med hjälp av ekvation (2).
Cytotoxicitet (%)
(2)
(2)6. Beredning av nasala ALI-kulturer för immunofluorescens (IF) avbildning
- Flytta transwell till en ny 24-hålsplatta och tvätta 3x apikalt med PBS (samla in den första PBS-tvätten som ASL om titrering; utför sedan ytterligare två PBS-tvättar för att ta bort överflödigt utsöndrat virus som kan hindra IF-kvaliteten)
- Efter den sista PBS-tvätten, täck transbrunnen apikalt och basalt i 4 % PFA.
- Inkubera i 30 minuter för att fixera 4% PFA, ta sedan bort och tvätta 3 gånger med PBS.
- Skär bort transwell-stödet som innehåller cellerna med ett vässat rakblad eller en sax.
- För att öka antalet IF-mål för varje brunn, skär varje membran på mitten och färga varje halva med olika antikroppskombinationer.
- Permeabilisera med 0,2 % Triton X-100 i PBS i 10 min.
- Blockera med 10% normalt åsneserum och 1% BSA i PBST (PBS + 0,2% Triton X-100) i 60 min i rumstemperatur.
OBS: Skydda samples från ljusexponering från detta steg framåt. - Inkubera i primär antikroppslösning över natten vid 4 °C. Späd alla antikroppar 1:1 000 i blockerande buffert.
OBS: Representativa antikroppar för HCoV-nukleokapsidfärgning, såväl som epitelcelltypmarkörer och cytoskelettfärgningar, listas nedan (se materialtabellen för tillverkarinformation och katalognummer).- För HCoV-antigenfärgning, använd antikroppar riktade mot SARS-CoV-2-nukleokapsid, MERS-CoV-nukleokapsid och HCoV-NL63-nukleokapsid.
- För att identifiera epitelcelltyper, använd antikroppar riktade mot bägarcellsmarkören MUC5AC och cilierad cellmarkör typ IV β-tubulin.
- För cytoskelettmarkörer, använd antikroppar riktade mot falloidin (binder F-aktin) och epitelcellsadhesionsmarkör: EpCAM (CD326).
- Inkubera i sekundär antikroppslösning i 60 minuter vid rumstemperatur. Använd sekundära antikroppsfärgämnen utspädda 1:1 000 i blockerande buffert.
- När färgningen är klar, överför membranet till ett glasglas med en spatel, orientera transbrunnen med den apikala sidan mot objektglaset och tillsätt monteringslösning. Låt stå i 15-30 minuter innan du applicerar genomskinligt nagellack runt kanterna.
- Ta bilder med hjälp av ett konfokalmikroskop (Z-axelsteg: 0,5 μm; sekventiell skanning)1,16,17.
OBS: Efter fixering av kulturer i 4 % PFA och tvätt med PBS kan fasta kulturer förvaras vid 4 °C i veckor till månader före färgning och förberedelse för avbildning. Efter färgning och montering av membran kan proverna förvaras under lång tid (>2 år) vid 4 °C i mörker.
7. Insamling av intracellulärt protein för western immunoblot eller RNA för RT-qPCR-analys
- Samla ASL enligt beskrivningen ovan om du kvantifierar virala titrar (protokollavsnitt 2).
- Flytta transwell till en ren 24-hålsplatta, eftersom skrapning av membranet kan leda till att skäret går sönder.
- För western blot-analys, samla in totalt proteinlysat i 125 μl RIPA-buffert (50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 % deoxikolat, 0,1 % SDS, 1 % NP40) kompletterat med proteashämmare och fosfatashämmare.
- Tillsätt 125 μL RIPA-buffert till det apikala facket och inkubera i 5-10 minuter.
- Skrapa membranet med en P200-pipettspets för att ta bort eventuella kvarvarande celler och samla upp hela volymen (skrapa kraftigt över hela membranets yta och pipettera sedan upp och ner flera gånger för att samla upp hela provet).
- Inkubera proteinlysatprover på is i 10 minuter och centrifugera sedan med maximal hastighet (20 000 × g) i 10 minuter vid 4 °C.
- Blanda supernatanten med 4x Laemmli provbuffert med β-merkaptoetanol (reduktionsmedel) enligt tillverkarens protokoll.
- Koka proteinproverna vid 95 °C i 5 minuter och kör sedan med traditionella western blotting protocols 1,16,17.
- För insamling av totalt RNA, använd ett kommersiellt tillgängligt RNA-extraktionskit.
OBS: Det apikala facket med 24-brunnars transbrunnsinsatser har en maximal volym på ~200 μL; Därför utför vi två sekventiella tvättar på varje kultur för att nå total rekommenderad volym. Detaljerna nedan motsvarar rekommenderad insamling av RNA-prover i en total volym på 350 μL. - Tillsätt 200 μl lyseringsbuffert till det apikala facket i den infekterade transbrunnen.
- Låt sitta i 5-10 min, skrapa eventuella kvarvarande celler från membranet med en pipettspets och samla upp hela volymen i ett märkt mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 150 μL extra lysbuffert till det apikala facket i transbrunnen och pipettera upp och ner innan du samlar upp i samma mikrocentrifugrör.
- Extrahera RNA enligt tillverkarens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representativa siffrorna är delvis anpassade från data som finns i manuskriptet Otter et al.1. Nasala ALI-kulturer som härrör från fyra eller sex donatorer infekterades med en av fyra HCoVs (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 och HCoV-229E) enligt de protokoll som beskrivs ovan, och de genomsnittliga apikalt utsöndrade virustitrarna för varje virus visas i figur 1A. Medan alla dessa fyra HCoV:er replikeras produktivt i nasala ALI-kulturer, replikerar SARS-CoV-2 och HCoV-229E de mest effektivt. Observera att dessa är genomsnittliga virala titrar och att titrar för varje HCoV hos enskilda donatorer nyligen publicerades1. Efter tvättning av nasala ALI-kulturer enligt beskrivningen i protokollavsnitt 3 jämförs MERS-CoV-titrar i apikal ytvätska (ASL) med intracellulära virustitrar i figur 1B. MERS-CoV intracellulära och apikalt utsöndrade virala titrar är ungefär desamma 48 timmar efter infektion (hpi).
Immunofluorescensavbildning av infekterade nasala ALI-kulturer är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att undersöka cellulär tropism och andra infektionsparametrar, såsom syncytibildning, cell-till-cell-fusion och skador på epitelbarriärens integritet. Samfärgning av infekterade kulturer med antikroppar som är specifika för virala antigener (t.ex. icke-strukturella nukleokapsid- eller HCoV-proteiner) och markörer för cilierade celler eller bägarceller (typ IV β-tubulin respektive MUC5AC) kan bestämma cellulär tropism för en HCoV i nasala ALI25,26. Figur 2A visar representativa bilder av nasala kulturer infekterade med SARS-CoV-2, MERS-CoV och HCoV-NL63.
SARS-CoV-2 och HCoV-NL63 infekterar främst cilierade celler (vilket framgår av samlokalisering av viral nukleokapsidfärgning med cilimarkör typ IV β-tubulin och avsaknad av samlokalisering av viralt antigen med bägarcellsmarkör MUC5AC). MERS-CoV infekterar främst icke-cilierade bägarceller i nasala ALI-kulturer, eftersom MERS-CoV visar det motsatta mönstret, med samlokalisering av viral antigenfärgning med MUC5AC och minimal samlokalisering av viral nukleokapsidfärgning med typ IV β-tubulin. Markörer som falloidin, som binder till aktinfilament, eller EpCAM, epitelcellsadhesionsmolekyl, kan användas för att visualisera epitelcytoskelettet och upptäcka en förlust av epitelbarriärens integritet27. Figur 2B visar falloidinfärgning i nasala ALI-kulturer; panel 1 visar intakt cytoskelett F-aktin ultrastruktur i en simulerad infekterad kultur, och panel 2 visar en förlust av falloidinintegritet och tyder på potentiell skada på epitelbarriärfunktionen i en HCoV-NL63-infekterad kultur. Epitelmarkörer som dessa kan appliceras på HCoV-infektioner för att karakterisera epitelbarriärdynamik under infektion.
Efter infektion av nasala ALI-kulturer med var och en av de fyra HCoV:erna övervakades transepitelial elektrisk resistans (TEER). Baseline TEER-värden registrerades före infektion, 0 hpi och TEER utvärderades igen för varje transwell vid 96 hpi och 192 hpi. Figur 3 visar TEER-ändringar för var och en av HCoV:erna. Figur 3A,B visar ΔTEER-värden (skillnader i TEER beräknade för varje brunn genom att subtrahera baslinjen TEER vid 0 hpi från TEER uppmätt vid en given punkt). För SARS-CoV-2, MERS-CoV och HCoV-NL63 sker stora förändringar i TEER sent i infektionen (192 hpi), och figur 3A illustrerar att SARS-CoV-2- och HCoV-NL63-infektioner resulterar i negativa ΔTEER-värden (192 hpi - 0 hpi), medan MERS-CoV-infektion inte gör det. Simulerade ΔTEER-värden ingår för jämförelse och illustrerar att förändringar i TEER efter MERS-CoV-infektion inte skiljer sig signifikant från de som ses under simulerad infektion. Negativa ΔTEER-värden indikerar minskningar av epitelbarriärens integritet och äventyrad epitelbarriärfunktion. Figur 3B visar ΔTEER-värden för HCoV-229E (beräknat från 96 hpi och 192 hpi). HCoV-229E orsakar epitelbarriärdysfunktion vid den tidigare tidpunkten (96 hpi), men återhämtning till skennivåer sker vid den senare tidpunkten (192 hpi). Dessa data belyser hur TEER-kinetiken kan skilja sig åt mellan olika virus. Figur 3C,D visar TEER-spår, som visar råa TEER-data för varje infekterad transwell över tid, vilket möjliggör visualisering av TEER-trender under infektionsförloppet. Om så önskas kan behandling med cytokinen IL-13 inkluderas som en positiv kontroll under TEER-experiment, eftersom detta försämrar täta korsningar, äventyrar epitelbarriärfunktionen och därmed ökar membranpermeabiliteten i luftvägsepitelerna; därför förväntas cytokin IL-13 resultera i minskningar av TEER28,29,30.
För att komplettera TEER-mätningar i nasala odlingar kan cytotoxicitet kvantifieras via kvantifiering av laktatdehydrogenas (LDH) som frisätts apikalt under infektion. Figur 4 visar genomsnittliga cytotoxicitetsdata vid 96 hpi och 192 hpi från odlingar som härrör från 10 donatorer som infekterats med var och en av de HCoV-analyser som analyserats. SARS-CoV-2, HCoV-NL63 och HCoV-229E orsakar signifikant cytotoxicitet i nasala kulturer, medan MERS-CoV inte gör det.
Totalt protein eller RNA som samlats in från infekterade nasala kulturer kan användas för att undersöka olika HCoV-värdinteraktioner. Vi behandlade nasala kulturer med typ 2 cytokin IL-13 för att inducera bägarcellshyperplasi och modellera vävnadslandskapet i en astmatisk luftväg. Figur 5A visar qPCR-data som kvantifierar mRNA-förekomst av två viktiga HCoV-receptorer efter IL-13-behandling. DPP4 är den cellulära receptorn för MERS-CoV, och ACE2 är den cellulära receptorn för både SARS-CoV-2 och HCoV-NL63. IL-13-behandling resulterar i dramatiskt ökat DPP4-uttryck men inga signifikanta förändringar i ACE2-uttryck. Figur 5B visar western blot-data för att utvärdera proteinförekomst efter IL-13-behandling i oinfekterade och SARS-CoV-2-infekterade kulturer. IL-13-behandling resulterar i signifikant ökad MUC5AC (en bägarcellsmarkör) och minskad typ IV β-tubulin (en cilierad cellmarkör), vilket återspeglar den förväntade bägarcellshyperplasi orsakad av denna cytokinbehandling. Analys på proteinnivå visar att IL-13-behandling ökar DPP4-uttrycket men minskar ACE2-uttrycket. Western blotting för SARS-CoV-2-nukleokapsidprotein avslöjar att IL-13-behandling resulterar i en liten minskning av viralt antigen jämfört med skenbehandlade kulturer. Liknande analyser kan utföras för alla mRNA eller proteiner av intresse efter manipulation av nasala ALI-kulturer och/eller infektion med HCoVs.
Figur 1: HCoV-replikation i nasala ALI-odlingar. Nasala odlingar från sex eller fyra donatorer infekterades i tre exemplar med SARS-CoV-2 (6), MERS-CoV (6), HCoV-NL63 (6) eller HCoV-229E (4) vid MOI = 5. Apikal ytvätska samlades in vid 0 hpi, 48 hpi, 96 hpi och 144 hpi, och infektiöst virus kvantifierades genom plackanalys. A) Medelvärdet av virustitrar från alla givare som infekterats med varje HCoV avbildas. (B) Nasala odlingar från en enda donator infekterades i tre exemplar vid MOI = 5, och ASL samlades in vid 48 hpi. Efter ASL-insamling tvättades transwells 3 gånger med PBS och lyserades sedan via frys-upptining för att kvantifiera intracellulärt virus. Infektiöst virus i det apikala skjulet jämfört med i det intracellulära kompartmentet kvantifierades genom plackanalys. Data visas som medelvärde ± SD. Förkortningar: ALI = luft-vätskegränssnitt; MOI = multiplicitet av infektion; ASL = apikal ytvätska; HPI = timmar efter infektion; PBS = fosfatbuffrad koksaltlösning. Denna siffra konstruerades med hjälp av data som publicerats i Otter et al.1. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Immunofluorescensavbildning av nasala ALI-kulturer för att karakterisera cellulär tropism och epitelintegritet. (A) Nasala ALI-kulturer infekterades med SARS-CoV-2, MERS-CoV eller HCoV-NL63 vid MOI = 5 och fixerades i 4 % paraformaldehyd vid 96 hpi. Odlingarna bereddes för immunofluorescensavbildning, som beskrivits ovan i avsnitt 6 i protokollet, med användning av primära antikroppar mot varje virus nukleokapsidprotein (visas i rött), cilierad cellmarkör typ IV β-tubulin (grönt) eller bägarcellsmarkör MUC5AC (grönt). Värt att notera är att en antikropp mot MERS-CoV icke-strukturellt protein 8 (nsp8) användes i stället för en antikropp mot nukleokapsidprotein på grund av artinkompatibilitet med MUC5AC-antikroppen. Samlokalisering mellan viralt antigen och var och en av epitelcellmarkörerna visualiseras som orange/gul färg i sammanslagna bilder för varje virus. (B) Nasala ALI-kulturer färgades med falloidin (som färgar aktin cytoskelettfilament) för att visualisera cytoskelettets integritet, som visas i rosa. Hoescht-färgning visas i blått. Panel 2B.1 visar en skarp, intakt falloidinfärgning, vilket indikerar intakt cytoskelettarkitektur, medan panel 2B.2 visar en förlust av epitelintegritet och suddighet av falloidinfärgningen. Skalstreck = (A) 50 μm, (B) 10 μm. Förkortningar: ALI = luft-vätskegränssnitt; MOI = multiplicitet av infektion; HPI = timmar efter infektion. Denna figur konstruerades med hjälp av data som publicerats i Otter et al. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Mätning av transepitelial elektrisk resistans i ALI-kulturer under infektion. (A) Nasala ALI-odlingar från 10 donatorer var antingen skeninfekterade eller infekterade vid MOI = 5 med SARS-CoV-2, MERS-CoV eller HCoV-NL63. ΔTEER beräknades för varje transwell som TEER vid 192 hpi minus TEER vid 0 hpi (baseline TEER). Varje stapel illustrerar det genomsnittliga ΔTEER-värdet för varje virus bland tre odlingar från varje donator. (B) Nasala ALI-kulturer från 8 donatorer var skeninfekterade eller infekterade med HCoV-229E vid MOI = 5. ΔTEER från baslinjen TEER beräknades enligt (A) med användning av TEER vid antingen 96 hpi eller 192 hpi. (C,D) TEER-spårningsdata avbildas för simulerade infekterade eller HCoV-infekterade kulturer som härrör från var och en av fyra donatorer. Varje linje representerar TEER-data från en enda transbrunn över tid (tre transbrunnar från varje donator analyserades). Donatornumren är färgkodade och visas i nyckeln till höger om varje diagram. Data visas som medelvärde ± SD i panel A och panel B. Förkortningar: ALI = luft-vätskegränssnitt; MOI = multiplicitet av infektion; HPI = timmar efter infektion; TEER = transepitelial elektrisk resistans. Denna siffra konstruerades med hjälp av data som publicerats i Otter et al.1. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kvantifiering av cytotoxicitet vid HCoV-infektion av nasala ALI-odlingar. Nasala odlingar från 10 donatorer infekterade med varje HCoV i tre exemplar vid MOI = 5 genomgick LDH-kvantifiering i ASL-prover, som beskrivits ovan. Genomsnittlig cytotoxicitet bland alla testade donatorer visas för varje HCoV vid 96 hpi och 192 hpi. Data visas som medelvärde ± SD. Förkortningar: ALI = luft-vätskegränssnitt; MOI = multiplicitet av infektion; HPI = timmar efter infektion; TEER = transepitelial elektrisk resistans, ASL = apikal ytvätska; LDH = laktatdehydrogenas. Denna siffra konstruerades med hjälp av data som publicerats i Otter et al.1. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: mRNA/proteinanalys efter infektion i näsodlingar. Nasala odlingar som behandlades med typ 2-cytokin IL-13 eller skenbehandlade användes för att utvärdera förändringar i uttrycket av HCoV-receptorer, såväl som i cilierade och bägarcellsmarkörer. (A) mRNA-uttryck av DPP4 och ACE2 kvantifierades via RT-qPCR. Data för odlingar från tre donatorer som behandlats med IL-13 visas som veckförändringar jämfört med skenbehandlade odlingar från samma donatorer. Data visas som medelvärde ± SD, där varje punkt representerar genomsnittlig induktion av vikningsförändring för en enskild donator. (B) Totalt protein skördades från nasala kulturer som antingen var sken- eller IL-13-behandlade och antingen sken- eller SARS-CoV-2-infekterade. Proteiner separerades via SDS-PAGE och immunoblotades med antikroppar mot epitelcellsmarkörer (typ IV β-tubulin, MUC5AC), HCoV-receptorer (ACE2, DPP4), SARS-CoV-2 nukleokapsidprotein och GAPDH. Förkortningar: RT-qPCR = omvänd transkription-kvantitativ polymeraskedjereaktion; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores. Denna siffra konstruerades med hjälp av data som publicerats i Otter et al.1. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoderna som beskrivs här beskriver ett primärt epitelodlingssystem där nasala epitelceller från patienter odlas vid ett luft-vätskegränssnitt och tillämpas för att studera HCoV-värdinteraktioner. När de väl har differentierats rekapitulerar dessa nasala ALI-kulturer många egenskaper hos det nasala epitelet in vivo , inklusive en heterogen cellulär population med cilierade, bägare och basalceller representerade, såväl som intakt mukociliär funktion med robust slående cilier och slemutsöndring. Denna heterogena cellpopulation är en viktig fördel med detta odlingssystem jämfört med traditionella respiratoriska epitelcellinjer, eftersom det möjliggör karakterisering av värdcellens tropism under virusinfektion (som visas i figur 2). Traditionella luftvägsepitelcellinjer saknar också funktionella mukociliära clearancemekanismer, som spelar nyckelroller i det primära försvaret mot luftvägsvirus tillsammans med medfödda immunvägar som interferonproduktion.
Kritiska steg i protokollet inkluderar den initiala infektionsproceduren; Till exempel måste odlingarna utjämnas vid önskad temperatur före infektionen, och en konsekvent metod bör användas för att starta varje infektion. Dessa steg är avgörande för att standardisera metoden och säkerställa reproducerbarhet i nedströmsfynd.
Den kanske viktigaste delen av dessa metoder är kvantifieringen av apikalt frigjort virus, eftersom förståelsen av den unika replikationscykeln för varje HCoV hjälper till att bestämma de tidpunkter som kan vara bäst för vidare analys. De immunofluorescenstekniker som beskrivs ovan är också kritiska, eftersom förmågan att visualisera virusinfektioner i ett in vitro nasalt epitel med en representativ heterogen cellulär population möjliggör noggrann bedömning av viral tropism och ger möjlighet att ytterligare undersöka virus-värdinteraktioner i en fysiologisk miljö.
Näsepitelet är det primära barriärstället som alla luftvägsvirus stöter på, och därför är det troligt att HCoV-infektioner börjar med primär infektion i näsepitelet, med potential att sprida sig till de nedre luftvägarna via en oral-lunga aspirationsaxel. Detta spelar sannolikt en roll i utvecklingen av allvarlig lunginflammation och luftvägssjukdom under patogen HCoV-infektion (MERS-CoV, SARS-CoV-2), medan säsongsbetonade HCoVs tenderar att orsaka sjukdom endast i de övre luftvägarna. Det är viktigt att förstå HCoV-värdinteraktioner i denna viktiga immunvaktsplats, och detta nasala ALI-system möjliggör karakterisering av viral replikation, värdcelltropism, såväl som cytotoxicitet och medfödd immuninduktion under HCoV-infektion.
Detta nasala ALI-odlingssystem är också mycket anpassningsbart och kan användas för att spegla många kliniska sjukdomstillstånd. Nasala prover som förvärvats från patienter med genetiska lungsjukdomar såsom cystisk fibros (orsakad av en kloridkanaldefekt) eller primära ciliära dyskinesier (där ciliarslagningsmekanismerna är dysfunktionella) kan användas för att odla nasala ALI-kulturer som är representativa för dessa patologier för att förstå hur dessa patienter kan påverkas på olika sätt av HCoV-infektion31,32. Dessutom kan olika cytokinbehandlingar användas under differentieringen av nasala ALI-kulturer för att återskapa egenskaper hos andra sjukdomstillstånd. Till exempel inducerar IL-13-behandling under differentiering bägarcellshyperplasi och kan användas som ett surrogat för att studera astmatiska eller allergiska luftvägar33,34. Således är detta nasala ALI-system ett kraftfullt verktyg för att undersöka HCoV-värd såväl som andra virus-värdinteraktioner både i friska och sjuka nasala luftvägar.
Även om detta system ger många fördelar, uppstår också vissa begränsningar vid användning av nasala ALI-kulturer. Även om nasala celler kräver mycket mindre invasiva tekniker för förvärv än bronkial- eller lungceller, kräver odling och differentiering av ALI-kulturer betydligt mer tid och resurser än användningen av traditionella odödliga cellinjer. Dessutom kan variabilitet mellan donatorer när det gäller tillåtlighet för infektion samt värdsvar på HCoV-infektion göra det svårare att reproducera och tolka data (det är därför experiment ofta utförs med kulturer som härrör från 5-10 donatorer, för att mildra dessa problem).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Susan Weiss sitter i Ocugens vetenskapliga råd. Noam A. Cohen är konsult för GSK, AstraZeneca, Novartis, Sanofi/Regeron och Oyster Point Pharmaceuticals och har ett amerikanskt patent, "Therapy and Diagnostics for Respiratory Infection" (10 881 698 B2, WO20913112865), och ett licensavtal med GeneOne Life Sciences.
Acknowledgments
Denna studie har följande finansieringskällor: National Institutes of Health (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. och N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. och N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. och N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) | Invitrogen | Various | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Cytotoxicity detection kit | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + calcium + magnesium | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G measurement chamber | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW software for imaging | Olympus | Version 4.02 | |
| HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht stain | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 cells | ATCC | CCL-7 | To titrate HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) | BEI Resources | NR-44260 | |
| MERS-CoV nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC antibody | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 stain | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors) | Roche | PHOSS-RO | |
| Plate reader | Perkin Elmer | HH34000000 | Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm |
| RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Can prep in-house or purchase |
| RNeasy Plus Kit | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β- tubulin antibody | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 cells | ATCC | CCL-81 | To titrate MERS-CoV |
| VeroE6 cells | ATCC | CRL-1586 | To titrate SARS-CoV-2 |
References
- Otter, C. J., et al. Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120 (2023).
- Fehr, A., Perlman, S. Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis. Methods in Molecular Biology. 1282, 1-23 (2015).
- Gaunt, E. R., Hardie, A., Claas, E. C. J., Simmonds, P., Templeton, K. E. Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2940-2947 (2010).
- Kesheh, M. M., Hosseini, P., Soltani, S., Zandi, M. An overview on the seven pathogenic human coronaviruses. Reviews in Medical Virology. 32 (2), 2282 (2022).
- MERS-CoV Worldwide Overview. European Centre for Disease Prevention and Control. , Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update (2022).
- MERS Situation Update. World Health Organization Regional Office for the Eastern Mediterranean. , Available from: http://www.emro.who.int/health-topics/mers-cov/mers-outbreaks.html (2022).
- Cao, Y., Liu, X., Xiong, L., Cai, K. Imaging and clinical features of patients with 2019 novel coronavirus SARS-CoV-2: A systematic review and meta-analysis. Journal of Medical Virology. 92 (9), 1449-1459 (2020).
- Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses. Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).
- Farzal, Z., et al. Comparative study of simulated nebulized and spray particle deposition in chronic rhinosinusitis patients. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 746-758 (2019).
- Gaeckle, N. T., Pragman, A. A., Pendleton, K. M., Baldomero, A. K., Criner, G. J. The oral-lung axis: The impact of oral health on lung health. Respiratory Care. 65 (8), 1211-1220 (2020).
- Hou, Y., et al. SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract. Cell. 182, 429-446 (2020).
- Hariri, B. M., Cohen, N. A. New insights into upper airway innate immunity. American Journal of Rhinology and Allergy. 30 (5), 319-323 (2016).
- Hiemstra, P. S., McCray, P. B., Bals, R. The innate immune function of airway epithelial cells in inflammatory lung disease. European Respiratory Journal. 45 (4), 1150-1162 (2015).
- Hatton, C. F., et al. Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2. Nature Communications. 12 (1), 7092 (2021).
- Sungnak, W., et al. SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes. Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).
- Li, Y., et al. SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118 (2021).
- Comar, C. E., et al. MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119 (2022).
- Lee, R. J., et al. Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells. Science Signaling. 10 (495), (2017).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Comer, D. M., Elborn, J. S., Ennis, M. Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD. PLoS One. 7 (3), e32924 (2012).
- Vanders, R. L., Hsu, A., Gibson, P. G., Murphy, V. E., Wark, P. A. B. Nasal epithelial cells to assess in vitro immune responses to respiratory virus infection in pregnant women with asthma. Respiratory Research. 20 (1), 259 (2019).
- Lee, R. J., et al. Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function. Scientific Reports. 6, 33221 (2016).
- Patel, N. N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065 (2014).
- Robinot, R., et al. SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance. Nature Communications. 12 (1), 4354 (2021).
- Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).
- Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin. Journal of Cell Science. 135 (16), 259871 (2022).
- Schmidt, H., et al. IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222 (2019).
- Huang, Z. Q., et al. Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749 (2020).
- Saatian, B., et al. Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells. Tissue Barriers. 1 (2), e24333 (2013).
- Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753 (2020).
- Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. Air−liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions. Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111 (2021).
- Seibold, M. A. Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium. Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).
- Morrison, C. B., et al. SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119 (2022).
