Summary
L'epitelio nasale è il sito di barriera primario incontrato da tutti i patogeni respiratori. Qui, descriviamo i metodi per utilizzare le cellule epiteliali nasali primarie cresciute come colture di interfaccia aria-liquido (ALI) per caratterizzare le interazioni coronavirus-ospite umano in un sistema fisiologicamente rilevante.
Abstract
Negli ultimi 20 anni sono emersi tre coronavirus umani ad alta patogenicità (HCoV) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) e SARS-CoV-2 (2019) - che hanno causato significative crisi di salute pubblica. Quattro HCoV aggiuntivi causano una parte significativa dei casi di raffreddore comune ogni anno (HCoV-NL63, -229E, -OC43 e -HKU1), evidenziando l'importanza di studiare questi virus in sistemi fisiologicamente rilevanti. Gli HCoV entrano nel tratto respiratorio e stabiliscono l'infezione nell'epitelio nasale, il sito primario incontrato da tutti i patogeni respiratori. Utilizziamo un sistema di coltura epiteliale nasale primaria in cui i campioni nasali derivati dal paziente vengono coltivati in un'interfaccia aria-liquido (ALI) per studiare le interazioni ospite-patogeno in questo importante sito sentinella. Queste colture ricapitolano molte caratteristiche delle vie aeree in vivo , compresi i tipi di cellule presenti, la funzione ciliare e la produzione di muco. Descriviamo i metodi per caratterizzare la replicazione virale, il tropismo della cellula ospite, la citotossicità indotta dal virus e l'induzione immunitaria innata in colture nasali di ALI a seguito di infezione da HCoV, utilizzando un recente lavoro che confronta HCoV letali e stagionali come esempio1. Una maggiore comprensione delle interazioni ospite-patogeno nel naso ha il potenziale per fornire nuovi bersagli per terapie antivirali contro HCoV e altri virus respiratori che probabilmente emergeranno in futuro.
Introduction
Ad oggi sono stati identificati sette coronavirus umani (HCoV) che causano una serie di malattie respiratorie2. Gli HCoV comuni o stagionali (HCoV-NL63, -229E, -OC43 e -HKU1) sono tipicamente associati alla patologia del tratto respiratorio superiore e causano circa il 10%-30% dei casi di raffreddore comuni ogni anno. Sebbene questo sia il tipico fenotipo clinico associato ai comuni HCoV, questi virus possono causare malattie più significative del tratto respiratorio inferiore nelle popolazioni a rischio, inclusi bambini, anziani e individui immunocompromessi 3,4. Negli ultimi 20 anni sono emersi tre HCoV patogeni che hanno causato significative emergenze di salute pubblica, tra cui la sindrome respiratoria acuta grave (SARS)-CoV, la sindrome respiratoria mediorientale (MERS)-CoV e SARS-CoV-2. Gli HCoV letali sono associati a una patologia del tratto respiratorio più grave, il che è chiaramente illustrato dal tasso di mortalità del >34% associato ai casi di MERS-CoV (894 decessi su oltre 2.500 casi dalla sua comparsa nel 2012)5,6. È importante notare che gli HCoV letali causano anche una serie di malattie del tratto respiratorio, dalle infezioni asintomatiche alla polmonite letale, come si è visto con la pandemia di COVID-19 in corso7.
Gli HCoV, come altri patogeni respiratori, entrano nel tratto respiratorio e stabiliscono un'infezione produttiva nell'epitelio nasale8. Si ritiene che la diffusione alle vie aeree inferiori sia associata all'aspirazione dalla cavità orale/nasale al polmone, dove gli HCoV causano una patologia più significativa del tratto respiratorio inferiore 9,10,11. Pertanto, il naso funge da portale iniziale per l'ingresso virale ed è la barriera primaria all'infezione con il suo robusto meccanismo di clearance mucociliare e meccanismi immunitari innati unici volti a prevenire un'ulteriore diffusione virale alle vie aeree inferiori12,13. Ad esempio, è stato riportato che le cellule epiteliali nasali esprimono livelli basali superiori alla media di interferoni antivirali e geni stimolati dall'interferone, indicando che le cellule nasali possono essere innescate per risposte precoci ai virus respiratori14,15,16.
In precedenza abbiamo utilizzato cellule epiteliali nasali primarie derivate da pazienti cresciute in un'interfaccia aria-liquido (ALI) per modellare le interazioni HCoV-ospite nel naso, dove iniziano le infezioni da HCoV. Le colture nasali di ALI sono permissive sia per gli HCoV patogeni (SARS-CoV-2 e MERS-CoV) che per quelli comuni (HCoV-NL63 e HCoV-229E) e offrono vari vantaggi rispetto alle tradizionali linee cellulari epiteliali delle vie aeree come A549 (una linea cellulare di adenocarcinoma polmonare)16,17. Dopo il differenziamento, le colture nasali di ALI contengono una popolazione cellulare eterogenea e presentano molte delle funzioni attese dall'epitelio nasale in vivo, come il meccanismo di clearance mucociliare18. Le cellule nasali offrono anche vantaggi rispetto ai sistemi di coltura delle vie aeree inferiori (come le cellule epiteliali bronchiali umane, HBEC), poiché l'acquisizione di cellule epiteliali nasali tramite spazzolamento citologico è significativamente meno invasiva rispetto all'utilizzo di tecniche come la broncoscopia per ottenere HBEC 19,20,21.
Questo documento descrive i metodi per l'utilizzo di questo sistema di coltura ALI nasale per caratterizzare le interazioni HCoV-ospite nell'epitelio nasale. Abbiamo applicato questi metodi in lavori pubblicati di recente per confrontare SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 e HCoV-229E 1,16,17. Sebbene questi metodi e risultati rappresentativi enfatizzino lo studio degli HCoV in questo modello di cellule nasali, il sistema è altamente adattabile ad altri HCoV, così come ad altri patogeni respiratori. Inoltre, questi metodi possono essere applicati in modo più ampio ad altri sistemi di coltura ALI al fine di studiare la replicazione virale e il tropismo cellulare, nonché la citotossicità e l'induzione immunitaria innata a seguito di infezione.
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Protocol
L'uso di campioni nasali è stato approvato dall'Institutional Review Board dell'Università della Pennsylvania (protocollo # 800614) e dal Philadelphia VA Institutional Review Board (protocollo # 00781).
1. Infezione delle colture nasali di ALI
NOTA: L'acquisizione di campioni clinici, così come la crescita e la differenziazione di colture ALI nasali, non rientrano nell'ambito di questo documento. Metodi specifici per la coltura di cellule epiteliali nasali primarie possono essere trovati in lavori pubblicati di recente che utilizzano queste colture 18,22,23. I protocolli seguenti possono essere applicati anche alle colture ALI epiteliali nasali disponibili in commercio, se lo si desidera. I protocolli e i volumi descritti di seguito sono applicabili agli inserti transwell su piastra a 24 pozzetti (diametro 6,5 mm, superficie della membrana 0,33 cm2). Se si utilizzano colture ALI coltivate su pozzetti più grandi (ad es. piastre a 12 pozzetti, diametro 12 mm, superficie 1,12 cm2), regolare i volumi proporzionalmente per riflettere la dimensione del pozzetto.
- Il giorno prima dell'infezione:
- Lavare le colture ALI 3 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per via apicale (aggiungere ~200 μL di PBS riscaldato, porre in incubatore a 37 °C per 5 minuti, aspirare PBS e ripetere).
- Sostituire il terreno basale (500 μL).
- Lasciare che le colture si equilibrino alla temperatura alla quale verranno condotte le infezioni durante la notte (cioè, se si infetta a 33 °C, posizionare le colture in un incubatore a 33 °C dopo i lavaggi PBS).
NOTA: È stato riportato che gli HCoV associati al comune raffreddore come HCoV-229E e HCoV-NL63 si replicano in modo più efficiente a 33 °C. Inoltre, la temperatura dell'epitelio nasale in vivo è di 33 °C (questo differisce dalla temperatura del polmone, che è di 37 °C).
- Diluire il virus secondo necessità nel terreno di Dulbecco modificato (DMEM) privo di siero per ottenere la molteplicità di infezione (MOI) desiderata in un volume totale di inoculo di 50 μL.
NOTA: Le infezioni sono state in genere condotte a MOI = 5 (MOI alto); tuttavia, le infezioni a MOI = 0,5 (MOI basso) sono state utilizzate anche per SARS-CoV-2 e HCoV associati al raffreddore comune, e queste si traducono in titoli virali di picco comparabili, ma con cinetica variabile (entrambi i MOI sono accettabili). - Aggiungere l'inoculo per via apicale e rimettere le colture nell'incubatrice per 1 ora.
- Scuotere delicatamente le piastre ogni 15 minuti durante l'infezione (tenendo saldamente la piastra con entrambe le mani, oscillare avanti e indietro e da un lato all'altro per garantire un adsorbimento uniforme dell'inoculo virale).
- Dopo 1 ora di incubazione, aspirare l'inoculo virale e lavare ogni coltura infetta 3 volte con PBS per garantire la rimozione dell'inoculo virale (per ogni lavaggio, aggiungere 200 μL di PBS, incubare per 5 minuti e aspirare o rimuovere con una pipetta).
- Se lo si desidera, raccogliere il terzo lavaggio PBS per confermare l'adeguata rimozione del virus in ingresso.
- Sostituire il terreno basale con terreno fresco sugli ALI infetti ogni 72 ore durante l'infezione.
2. Prelievo del liquido superficiale apicale (ASL) e titolazione del virus
- In momenti predeterminati dopo l'infezione, aggiungere 200 μL di PBS alla camera apicale di ciascun transwell infetto.
NOTA: I punti temporali rilevanti variano a seconda dell'HCoV di interesse e vanno da 24 ore a 192 ore dopo l'infezione (vedere la sezione dei risultati rappresentativi per i dati di replicazione virale per vari HCoV). - Pipettare il PBS su e giù 5 volte per garantire la massima raccolta del virus apicalmente e raccogliere l'intero volume in una provetta per microcentrifuga (questo è il campione ASL).
NOTA: L'ASL include le particelle virali sparse oltre al muco e ad altri prodotti secreti apicalmente dalle colture ALI. - Quantificare il virus infettivo nell'ASL tramite il test standard della placca virale (diluire in serie campioni contenenti virus per quantificare la concentrazione di particelle virali).
NOTA: I tipi di cellule e il periodo di incubazione utilizzati per il test della placca dipenderanno dal virus utilizzato: SARS-CoV-2 (cellule VeroE6); MERS-CoV (cellule VeroCCL81); HCoV-NL63 (cellule LLC-MK2); HCoV-229E (cellule Huh7). Le specifiche su come condurre i saggi delle placche virali esulano dallo scopo di questo manoscritto, ma sono state dettagliate in precedenza in una pubblicazione del Journal of Visualized Experiments (JoVE)24. - Se lo si desidera, raccogliere il terreno basale in vari momenti dopo l'infezione per confermare l'assenza di virus rilasciato per via basale. Gli HCoV sono tipicamente rilasciati apicalmente dalle cellule epiteliali nasali, ma lo confermano attraverso il dosaggio della placca del terreno basale non diluito.
- Conservare i campioni ASL a -80 °C se il giorno del prelievo non si verifica la quantificazione mediante test della placca.
3. Quantificazione del virus intracellulare
- Dopo aver raccolto il campione di ASL, spostare ciascun transwell in una piastra pulita a 24 pozzetti precaricata con 500 μL di DMEM contenente il 2% di siero fetale bovino (FBS) per via basale.
NOTA: DMEM con FBS al 2% viene utilizzato per stabilizzare il virus durante i successivi cicli di gelo-disgelo. - Lavare ogni transwell 3 volte per via apicale con PBS per garantire la completa rimozione del virus apicale.
- Dopo l'aspirazione per rimuovere il lavaggio finale del PBS, aggiungere 100 μL di DMEM con FBS al 2% nello scomparto apicale.
- Spostare la piastra contenente i pozzetti con terreni apicali e basali in un congelatore a -80 °C e completare tre cicli consecutivi di gelo-disgelo per lisare le cellule.
- Dopo l'ultimo ciclo di gelo-disgelo, raggruppare i terreni apicali (100 μL) e basali (500 μL) in una provetta pulita.
- Centrifugare a 500 × g per 10 minuti a 4 °C per pellettare eventuali detriti cellulari.
- Raccogli il surnatante. Questo è il campione di virus intracellulare per la titolazione tramite il test della placca standard.
NOTA: Durante il processo di raccolta si verifica una diluizione tripla rispetto alla raccolta ASL; I campioni di ASL vengono raccolti in 200 μL di PBS, mentre i campioni di virus intracellulari vengono raccolti in un volume totale di 600 μL.
4. Misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER)
NOTA: Per la misurazione del TEER, è necessario utilizzare PBS integrato con calcio e magnesio (PBS + Ca 2+/Mg2+). Viene utilizzato un volt/ohmmetro epiteliale impostato per leggere in ohm (vedere la tabella dei materiali).
- Pulire, equilibrare e svuotare lo strumento EVOM secondo le istruzioni del produttore; Utilizzare un pozzetto "vuoto" senza cellule nasali aggiunte per il blanking. Registrare la misurazione del TEER in bianco.
NOTA: Se si utilizzano più virus, lo strumento EVOM deve essere pulito rigorosamente tra una condizione e l'altra per evitare la contaminazione incrociata (sono sufficienti lavaggi con etanolo al 70% seguiti da acqua deionizzata). - Spostare ciascun transwell infetto in una piastra a 24 pozzetti pulita e premarcata con 500 μL di PBS + Ca 2+/Mg2+ per via basale per lavare il terreno basale residuo dai pozzetti.
- Aggiungere 200 μL di PBS + Ca 2+/Mg2+ al compartimento apicale di ciascun transwell.
- Aggiungere 1 mL di PBS + Ca 2+/Mg2+ alla camera di misurazione Endohm-6.
- Spostare ciascun transwell nella camera di misura Endohm-6 e riposizionare il coperchio della camera in modo che l'elettrodo apicale poggi nei 200 μL di PBS nel compartimento apicale; l'elettrodo basale è integrato nella parte inferiore della camera Endohm-6.
- Consenti alla lettura EVOM di stabilizzarsi e registra la misurazione TEER grezza.
- Raccogliere il campione ASL come descritto sopra dopo aver effettuato la misurazione del TEER, se si desidera titolare (raccogliere i 200 μL di PBS + Ca 2+/Mg2+ che sono stati aggiunti per la misurazione del TEER).
NOTA: La raccolta del campione ASL può indurre micro-lacerazioni nella barriera epiteliale che possono confondere le letture TEER, quindi l'ASL deve essere raccolto dopo la misurazione del TEER. Inoltre, il terreno basale non deve essere cambiato immediatamente prima delle letture TEER, in quanto ciò potrebbe influire sui valori TEER. - Per convertire le letture TEER grezze in misurazioni finali in Ohm/cm2, sottrarre il valore TEER vuoto e moltiplicare questo valore per l'area della superficie della membrana del pozzetto utilizzando l'equazione (1):
TEER = [Lettura TEER - valore TEER in bianco] × (superficie del pozzetto) (1) - Per gli HCoV, valutare il TEER ogni 24 o 48 ore dopo l'infezione; la cinetica delle modifiche di TEER spesso varia tra i virus e richiede la risoluzione dei problemi in vari momenti.
- Quando si misura il TEER, includere sempre colture finte infette e valutarle in ogni momento (controllo negativo).
NOTA: Per le colture simulate, le misurazioni TEER devono rimanere stabili o possono aumentare leggermente rispetto al basale dopo il completamento della differenziazione delle colture. L'area superficiale dei supporti a membrana varia a seconda delle dimensioni e del produttore dei pozzetti; I transwell a 24 pozzetti hanno in genere una superficie di 0,33 cm2.
5. Misurazione della citotossicità durante l'infezione tramite il saggio della lattato deidrogenasi (LDH)
NOTA: In questo lavoro, il contenuto di LDH nei campioni di ASL è stato quantificato utilizzando un kit di rilevamento della citotossicità disponibile in commercio. Il segnale LDH in terreno basale era spesso al di sotto del limite di rilevabilità e spesso meno riproducibile rispetto all'LDH quantificato nei campioni ASL provenienti da colture infette da HCoV.
- Preparare i controlli aggiuntivi necessari per il dosaggio dell'LDH.
- Controllo di fondo: utilizzare PBS (utilizzare PBS contenente calcio e magnesio se i campioni ASL sono stati raccolti in questo modo).
- Controllo positivo (valore massimo): trattare gli ALI apicalmente con Triton X-100. Raccogliere i pozzi di controllo Triton (in genere utilizzare tre colture ALI per questo in ogni punto temporale).
- Aggiungere 200 μL di Triton X-100 al 2% in PBS direttamente nel compartimento apicale del transwell.
- Incubare per 10-15 minuti per consentire alle cellule di lisarsi completamente.
- Raccogli l'intero volume come campione di soffitto Triton.
- Controllo negativo (basso controllo/rilascio basale di LDH): raccogliere ASL da colture ALI finte-infette derivate dallo stesso donatore di colture infette.
- Raccogliere l'ASL simulato del controllo negativo seguendo la procedura di raccolta ASL di cui sopra.
NOTA: Gli stessi transwell possono essere utilizzati per questo controllo negativo per tutti i punti temporali, mentre saranno necessari nuovi transwell per ogni punto temporale per il controllo Triton.
- Raccogliere l'ASL simulato del controllo negativo seguendo la procedura di raccolta ASL di cui sopra.
- Per consentire la quantificazione del virus sparso oltre alle letture LDH da ciascun campione ASL, caricare una piastra nera a 96 pozzetti a fondo piatto otticamente trasparente come segue:
- Diluire tutti i campioni in PBS, utilizzando 45 μL di campione e 55 μL di PBS (100 μL di volume totale).
- Trattare allo stesso modo i campioni di controllo positivo Triton e di controllo dello sfondo simulato.
NOTA: Questa diluizione consente il carico triplicato di ciascun campione sperimentale (45 μL x 3) e un volume ASL residuo sufficiente per la titolazione tramite il test della placca. - Caricare la piastra LDH in triplice: soffitto Triton, controllo dello sfondo simulato, controllo PBS e campioni sperimentali.
- Preparare la miscela di reazione come indicato dal produttore (soluzione colorante + catalizzatore).
- Aggiungere 100 μL di miscela di reazione a ciascun pozzetto e incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 minuti al riparo dalla luce.
- Dopo 20 minuti, misurare l'assorbanza a 492 nm.
- Calcolare la percentuale di citotossicità rispetto al valore del limite di Triton utilizzando l'equazione (2).
Citotossicità (%)
(2)
(2)6. Preparazione di colture nasali di ALI per l'imaging in immunofluorescenza (IF)
- Spostare il transwell in una nuova piastra a 24 pozzetti e lavare 3 volte apicalmente con PBS (raccogliere il primo lavaggio PBS come ASL se si titolano; quindi, eseguire altri due lavaggi PBS per rimuovere il virus in eccesso che potrebbe ostacolare la qualità del digiuno intermittente)
- Dopo il lavaggio finale del PBS, coprire il transwell apicale e basale con PFA al 4%.
- Incubare per 30 minuti per fissare in PFA al 4%, quindi rimuovere e lavare 3 volte con PBS.
- Eseguire l'asportazione del supporto del pozzetto contenente le celle utilizzando una lama di rasoio affilata o delle forbici.
- Per aumentare il numero di bersagli IF per ciascun transwell, tagliare ciascuna membrana a metà e colorare ogni metà con diverse combinazioni di anticorpi.
- Permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,2% in PBS per 10 min.
- Bloccare con il 10% di siero d'asina normale e l'1% di BSA in PBST (PBS + 0,2% Triton X-100) per 60 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Proteggere i campioni dall'esposizione alla luce da questo passaggio in avanti. - Incubare in soluzione di anticorpi primari per una notte a 4 °C. Diluire tutti gli anticorpi 1:1.000 in tampone bloccante.
NOTA: Di seguito sono elencati gli anticorpi rappresentativi per la colorazione del nucleocapside HCoV, nonché i marcatori del tipo di cellula epiteliale e le colorazioni del citoscheletro (vedere la Tabella dei materiali per le informazioni sul produttore e i numeri di catalogo).- Per la colorazione dell'antigene HCoV, utilizzare anticorpi mirati al nucleocapside SARS-CoV-2, al nucleocapside MERS-CoV e al nucleocapside HCoV-NL63.
- Per identificare i tipi di cellule epiteliali, utilizzare anticorpi che hanno come bersaglio il marcatore delle cellule caliciformi MUC5AC e il marcatore delle cellule ciliate di tipo IV β-tubulina.
- Per i marcatori del citoscheletro, utilizzare anticorpi diretti contro la falloidina (lega la F-actina) e il marcatore di adesione delle cellule epiteliali: EpCAM (CD326).
- Incubare in soluzione anticorpale secondaria per 60 minuti a temperatura ambiente; Utilizzare coloranti anticorpali secondari diluiti 1:1.000 in tampone bloccante.
- Al termine della colorazione, trasferire la membrana su un vetrino con una spatola, orientare il pozzetto con il lato apicale verso il vetrino e aggiungere la soluzione di montaggio. Lasciare riposare per 15-30 minuti prima di applicare lo smalto trasparente intorno ai bordi.
- Acquisizione di immagini con microscopio confocale (passo dell'asse Z: 0,5 μm; scansione sequenziale)1,16,17.
NOTA: Dopo la fissazione delle colture in PFA al 4% e il lavaggio con PBS, le colture fissate possono essere conservate a 4 °C per settimane o mesi prima della colorazione e della preparazione per l'imaging. Dopo la colorazione e il montaggio delle membrane, i campioni possono essere conservati a lungo termine (>2 anni) a 4 °C al buio.
7. Raccolta di proteine intracellulari per l'immunoblotting occidentale o di RNA per l'analisi RT-qPCR
- Raccogliere l'ASL come descritto sopra se si quantificano i titoli virali (sezione 2 del protocollo).
- Spostare il pozzetto su una piastra pulita a 24 pozzetti, poiché la raschiatura della membrana può portare alla rottura dell'inserto.
- Per l'analisi western blot, raccogliere il lisato proteico totale in 125 μL di tampone RIPA (50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 0,5% desossicolato, 0,1% SDS, 1% NP40) integrato con inibitori della proteasi e della fosfatasi.
- Aggiungere 125 μL di tampone RIPA al compartimento apicale e incubare per 5-10 minuti.
- Raschiare la membrana utilizzando un puntale per pipetta P200 per rimuovere eventuali cellule attaccate rimanenti e raccogliere l'intero volume (raschiare energicamente su tutta la superficie della membrana, quindi pipettare su e giù più volte per raccogliere l'intero campione).
- Incubare i campioni di lisato proteico su ghiaccio per 10 minuti, quindi centrifugare alla massima velocità (20.000 × g) per 10 minuti a 4 °C.
- Miscelare il surnatante con 4 tamponi per campioni Laemmli con β-mercaptoetanolo (agente riducente) secondo i protocolli del produttore.
- Far bollire i campioni proteici a 95 °C per 5 minuti, quindi eseguire utilizzando i tradizionali protocolli di western blotting 1,16,17.
- Per la raccolta dell'RNA totale, utilizzare un kit di estrazione dell'RNA disponibile in commercio a scelta.
NOTA: Il compartimento apicale degli inserti transwell a 24 pozzetti ha un volume massimo di ~200 μL; Pertanto, eseguiamo due lavaggi sequenziali su ciascuna coltura per raggiungere il volume totale raccomandato. I dettagli riportati di seguito corrispondono alla raccolta raccomandata di campioni di RNA in un volume totale di 350 μL. - Aggiungere 200 μL di tampone di lisi al compartimento apicale del pozzetto infetto.
- Lasciare riposare per 5-10 minuti, raschiare le cellule rimanenti dalla membrana utilizzando un puntale per pipette e raccogliere l'intero volume in una provetta per microcentrifuga etichettata.
- Aggiungere 150 μL di tampone di lisi aggiuntivo al compartimento apicale del transwell e pipettare su e giù prima di raccogliere nella stessa provetta per microcentrifuga.
- Estrarre l'RNA secondo il protocollo del produttore.
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Representative Results
Le cifre rappresentative sono parzialmente adattate dai dati che si possono trovare nel manoscritto Otter et al.1. Le colture nasali di ALI derivate da quattro o sei donatori sono state infettate con uno dei quattro HCoV (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 e HCoV-229E) secondo i protocolli sopra descritti e i titoli virali medi apicali per ciascun virus sono illustrati nella Figura 1A. Mentre tutti e quattro questi HCoV si replicano in modo produttivo nelle colture ALI nasali, SARS-CoV-2 e HCoV-229E si replicano in modo più efficiente. Si noti che si tratta di titoli virali medi e che i titoli per ciascun HCoV nei singoli donatori sono stati recentemente pubblicati1. Dopo aver lavato le colture nasali di ALI come descritto nella sezione 3 del protocollo, i titoli di MERS-CoV nel liquido di superficie apicale (ASL) vengono confrontati con i titoli virali intracellulari nella Figura 1B. I titoli virali intracellulari e apicali di MERS-CoV sono approssimativamente gli stessi a 48 ore dall'infezione (hpi).
L'imaging a immunofluorescenza di colture ALI nasali infette è un potente strumento che può essere utilizzato per sondare il tropismo cellulare e altri parametri di infezione, come la formazione di sincizi, la fusione cellula-cellula e il danno all'integrità della barriera epiteliale. La co-colorazione di colture infette con anticorpi specifici per antigeni virali (come proteine non strutturali nucleocapside o HCoV) e marcatori per cellule ciliate o caliciate (tipo IV β-tubulina e MUC5AC, rispettivamente) può determinare il tropismo cellulare per un HCoV negli ALI nasali25,26. La Figura 2A mostra immagini rappresentative di colture nasali infettate da SARS-CoV-2, MERS-CoV e HCoV-NL63.
SARS-CoV-2 e HCoV-NL63 infettano principalmente le cellule ciliate (evidenziata dalla colocalizzazione della colorazione del nucleocapside virale con il marcatore delle ciglia di tipo IV β-tubulina e dalla mancanza di colocalizzazione dell'antigene virale con il marcatore delle cellule caliciformi MUC5AC). MERS-CoV infetta prevalentemente le cellule caliciformi non ciliate nelle colture nasali di ALI, poiché MERS-CoV mostra il modello opposto, con colocalizzazione della colorazione dell'antigene virale con MUC5AC e minima colocalizzazione della colorazione del nucleocapside virale con β-tubulina di tipo IV. Marcatori come la falloidina, che si lega ai filamenti di actina, o l'EpCAM, molecola di adesione delle cellule epiteliali, possono essere utilizzati per visualizzare il citoscheletro epiteliale e rilevare una perdita di integrità della barriera epiteliale27. La Figura 2B mostra la colorazione della falloidina nelle colture ALI nasali; Il pannello 1 mostra l'ultrastruttura della F-actina del citoscheletro intatta in una coltura infettata da finta e il pannello 2 mostra una perdita di integrità della falloidina e suggerisce un potenziale danno alla funzione della barriera epiteliale in una coltura infetta da HCoV-NL63. Marcatori epiteliali come questi possono essere applicati alle infezioni da HCoV al fine di caratterizzare la dinamica della barriera epiteliale durante l'infezione.
Dopo l'infezione delle colture nasali di ALI con ciascuno dei quattro HCoV, è stata monitorata la resistenza elettrica transepiteliale (TEER). Le letture di TEER al basale sono state registrate prima dell'infezione, 0 hpi, e il TEER è stato nuovamente valutato per ciascun transwell a 96 hpi e 192 hpi. La Figura 3 illustra le modifiche del TEER per ciascuno degli HCoV. Le Figure 3A,B mostrano i valori di ΔTEER (differenze nel TEER calcolate per ciascun transwell sottraendo il TEER basale a 0 hpi dal TEER misurato in un dato punto). Per SARS-CoV-2, MERS-CoV e HCoV-NL63, i principali cambiamenti nel TEER si verificano nelle fasi avanzate dell'infezione (192 hpi) e la Figura 3A illustra che le infezioni da SARS-CoV-2 e HCoV-NL63 provocano valori ΔTEER negativi (192 hpi - 0 hpi), mentre l'infezione da MERS-CoV no. I valori di ΔTEER fittizi sono inclusi per il confronto e illustrano che i cambiamenti nel TEER dopo l'infezione da MERS-CoV non sono significativamente diversi da quelli osservati durante l'infezione simulata. Valori negativi di ΔTEER indicano una diminuzione dell'integrità della barriera epiteliale e una compromissione della funzione della barriera epiteliale. La Figura 3B mostra i valori di ΔTEER per HCoV-229E (calcolati da 96 hpi e 192 hpi). HCoV-229E causa una disfunzione della barriera epiteliale nel punto temporale precedente (96 hpi), ma il recupero ai livelli simulati si verifica nel punto temporale successivo (192 hpi). Questi dati evidenziano come la cinetica di TEER possa differire tra i virus. La Figura 3C,D mostra le tracce di TEER, che rappresentano i dati grezzi di TEER per ogni transwell infetto nel tempo, consentendo così la visualizzazione delle tendenze di TEER nel corso dell'infezione. Se lo si desidera, il trattamento con la citochina IL-13 può essere incluso come controllo positivo durante gli esperimenti TEER, poiché ciò compromette le giunzioni strette, compromette la funzione della barriera epiteliale e, quindi, aumenta la permeabilità della membrana negli epiteli delle vie aeree; pertanto, ci si aspetta che la citochina IL-13 provochi una diminuzione del TEER28,29,30.
A complemento delle misurazioni TEER nelle colture nasali, la citotossicità può essere quantificata attraverso la quantificazione della lattato deidrogenasi (LDH) rilasciata apicalmente durante l'infezione. La Figura 4 mostra i dati medi di citotossicità a 96 hpi e 192 hpi da colture derivate da 10 donatori infettati con ciascuno degli HCoV analizzati. SARS-CoV-2, HCoV-NL63 e HCoV-229E causano una citotossicità significativa nelle colture nasali, mentre MERS-CoV no.
La proteina totale o l'RNA raccolto da colture nasali infette può essere utilizzato per esaminare varie interazioni HCoV-ospite. Abbiamo trattato colture nasali con citochina di tipo 2 IL-13 al fine di indurre l'iperplasia delle cellule caliciformi e modellare il paesaggio tissutale di una via aerea asmatica. La Figura 5A mostra i dati della qPCR che quantificano l'abbondanza di mRNA dei due principali recettori HCoV dopo il trattamento con IL-13. DPP4 è il recettore cellulare per MERS-CoV e ACE2 è il recettore cellulare sia per SARS-CoV-2 che per HCoV-NL63. Il trattamento con IL-13 provoca un drammatico aumento dell'espressione di DPP4, ma nessun cambiamento significativo nell'espressione di ACE2. La Figura 5B mostra i dati di western blot per valutare l'abbondanza proteica dopo il trattamento con IL-13 in colture non infette e infette da SARS-CoV-2. Il trattamento con IL-13 provoca un aumento significativo di MUC5AC (un marcatore delle cellule caliciformi) e una diminuzione della β-tubulina di tipo IV (un marcatore delle cellule ciliate), riflettendo l'iperplasia prevista delle cellule caliciformi causata da questo trattamento con citochine. L'analisi a livello proteico mostra che il trattamento con IL-13 aumenta l'espressione di DPP4 ma diminuisce l'espressione di ACE2. Il Western blotting per la proteina nucleocapside SARS-CoV-2 rivela che il trattamento con IL-13 provoca una leggera diminuzione dell'antigene virale rispetto alle colture trattate con sham. Analisi simili possono essere eseguite per qualsiasi mRNA o proteina di interesse a seguito di manipolazione di colture nasali di ALI e/o infezione da HCoV.
Figura 1: Replicazione dell'HCoV in colture ALI nasali. Le colture nasali derivate da sei o quattro donatori sono state infettate in triplice copia con SARS-CoV-2 (6), MERS-CoV (6), HCoV-NL63 (6) o HCoV-229E (4) a MOI = 5. Il liquido superficiale apicale è stato raccolto a 0 hpi, 48 hpi, 96 hpi e 144 hpi e il virus infettivo è stato quantificato mediante test di placca. (A) Sono rappresentati i titoli virali medi di tutti i donatori infettati da ciascun HCoV. (B) Le colture nasali derivate da un singolo donatore sono state infettate in triplice copia a MOI = 5 e l'ASL è stato raccolto a 48 hpi. Dopo la raccolta dell'ASL, i transwell sono stati lavati 3 volte con PBS e poi lisati tramite gelo-disgelo al fine di quantificare il virus intracellulare. Il virus infettivo nel compartimento apicale rispetto al compartimento intracellulare è stato quantificato mediante test di placca. I dati vengono visualizzati come media ± SD. Abbreviazioni: ALI = interfaccia aria-liquido; MOI = molteplicità di infezione; ASL = liquido superficiale apicale; HPI = ore dopo l'infezione; PBS = soluzione salina tamponata con fosfati. Questa cifra è stata costruita utilizzando i dati pubblicati su Otter et al.1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Imaging in immunofluorescenza di colture ALI nasali per caratterizzare il tropismo cellulare e l'integrità epiteliale. (A) Le colture nasali di ALI sono state infettate con SARS-CoV-2, MERS-CoV o HCoV-NL63 a MOI = 5 e fissate in paraformaldeide al 4% a 96 hpi. Le colture sono state preparate per l'imaging a immunofluorescenza, come descritto sopra nella sezione 6 del protocollo, utilizzando anticorpi primari contro ciascuna proteina nucleocapside del virus (mostrata in rosso), marcatore cellulare ciliato di tipo IV β-tubulina (verde) o marcatore di cellule caliciformi MUC5AC (verde). Da notare che un anticorpo contro la proteina non strutturale MERS-CoV 8 (nsp8) è stato utilizzato al posto di un anticorpo contro la proteina nucleocapside a causa dell'incompatibilità della specie con l'anticorpo MUC5AC. La colocalizzazione tra l'antigene virale e ciascuno dei marcatori delle cellule epiteliali viene visualizzata come colore arancione/giallo nelle immagini unite per ciascun virus. (B) Le colture nasali di ALI sono state colorate utilizzando falloidina (che colora i filamenti del citoscheletro di actina) al fine di visualizzare l'integrità del citoscheletro, come mostrato in rosa. La colorazione di Hoescht è mostrata in blu. Il pannello 2B.1 mostra una colorazione di falloidina nitida e intatta, che indica un'architettura citoscheletrica intatta, mentre il pannello 2B.2 mostra una perdita di integrità epiteliale e una sfocatura della colorazione di falloidina. Barre di scala = (A) 50 μm, (B) 10 μm. Abbreviazioni: ALI = interfaccia aria-liquido; MOI = molteplicità di infezione; HPI = ore dopo l'infezione. Questa figura è stata costruita utilizzando i dati pubblicati su Otter et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Misurazione della resistenza elettrica transepiteliale nelle colture di ALI durante l'infezione. (A) Le colture nasali di ALI derivate da 10 donatori sono state infettate da simulazioni o infettate a MOI = 5 da SARS-CoV-2, MERS-CoV o HCoV-NL63. Il ΔTEER è stato calcolato per ciascun transwell come TEER a 192 hpi meno TEER a 0 hpi (TEER basale). Ogni barra illustra il valore medio di ΔTEER per ciascun virus tra le colture triplicate di ciascun donatore. (B) Le colture nasali di ALI derivate da 8 donatori sono state infettate con simulazione o infettate con HCoV-229E a MOI = 5. Il ΔTEER dal TEER basale è stato calcolato come in (A) utilizzando il TEER a 96 hpi o 192 hpi. (C,D) I dati delle tracce di TEER sono rappresentati per colture fintamente infette o infette da HCoV derivate da ciascuno dei quattro donatori. Ogni linea rappresenta i dati TEER di un singolo transwell nel tempo (sono stati analizzati transwell triplicati da ciascun donatore). I numeri dei donatori sono codificati a colori e mostrati nella chiave a destra di ogni grafico. I dati vengono visualizzati come media ± SD nel pannello A e nel pannello B. Abbreviazioni: ALI = interfaccia aria-liquido; MOI = molteplicità di infezione; HPI = ore dopo l'infezione; TEER = resistenza elettrica transepiteliale. Questa cifra è stata costruita utilizzando i dati pubblicati su Otter et al.1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Quantificazione della citotossicità durante l'infezione da HCoV di colture nasali di ALI. Le colture nasali derivate da 10 donatori infettati da ciascun HCoV in triplice copia a MOI = 5 sono state sottoposte a quantificazione di LDH in campioni ASL, come descritto sopra. La citotossicità media tra tutti i donatori testati è mostrata per ciascun HCoV a 96 hpi e 192 hpi. I dati vengono visualizzati come media ± SD. Abbreviazioni: ALI = interfaccia aria-liquido; MOI = molteplicità di infezione; HPI = ore dopo l'infezione; TEER = resistenza elettrica transepiteliale; ASL = liquido superficiale apicale; LDH = lattato deidrogenasi. Questa cifra è stata costruita utilizzando i dati pubblicati su Otter et al.1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: analisi di mRNA/proteine a seguito di infezione di colture nasali. Le colture nasali trattate con citochina di tipo 2 IL-13 o trattate con sham sono state utilizzate per valutare i cambiamenti nell'espressione dei recettori HCoV, nonché nei marcatori delle cellule ciliate e caliciate. (A) L'espressione dell'mRNA di DPP4 e ACE2 è stata quantificata tramite RT-qPCR. I dati per le colture di tre donatori trattati con IL-13 sono mostrati come cambiamenti di piega rispetto alle colture trattate con sham derivate dagli stessi donatori. I dati vengono visualizzati come media ± DS, con ogni punto che rappresenta l'induzione media del cambiamento di piega per un singolo donatore. (B) La proteina totale è stata raccolta da colture nasali che sono state trattate con sham o IL-13 e infettate da SARS-CoV-2 o simulate. Le proteine sono state separate tramite SDS-PAGE e immunoblottes con anticorpi contro marcatori di cellule epiteliali (β-tubulina di tipo IV, MUC5AC), recettori HCoV (ACE2, DPP4), proteina nucleocapside SARS-CoV-2 e GAPDH. Abbreviazioni: RT-qPCR = reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa e quantitativa; SDS-PAGE = elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecilsolfato. Questa cifra è stata costruita utilizzando i dati pubblicati su Otter et al.1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I metodi qui descritti descrivono un sistema di coltura epiteliale primaria in cui le cellule epiteliali nasali derivate dal paziente vengono coltivate ad un'interfaccia aria-liquido e applicate allo studio delle interazioni HCoV-ospite. Una volta differenziate, queste colture nasali di ALI ricapitolano molte caratteristiche dell'epitelio nasale in vivo, tra cui una popolazione cellulare eterogenea con cellule ciliate, caliciformi e basali rappresentate, nonché una funzione mucociliare intatta con ciglia e secrezione di muco che battono in modo robusto. Questa popolazione cellulare eterogenea è un vantaggio chiave di questo sistema di coltura rispetto alle tradizionali linee cellulari epiteliali respiratorie, in quanto consente la caratterizzazione del tropismo della cellula ospite durante l'infezione virale (come mostrato nella Figura 2). Le linee cellulari epiteliali tradizionali delle vie aeree mancano anche di meccanismi funzionali di clearance mucociliare, che svolgono un ruolo chiave nella difesa primaria contro i virus respiratori insieme alle vie immunitarie innate come la produzione di interferone.
I passaggi critici all'interno del protocollo includono la procedura di infezione iniziale; Ad esempio, le colture devono essere bilanciate alla temperatura desiderata prima dell'infezione e deve essere utilizzata una metodologia coerente per avviare ogni infezione. Questi passaggi sono fondamentali per standardizzare il metodo e garantire la riproducibilità nei risultati a valle.
Forse la parte più importante di questi metodi è la quantificazione del virus rilasciato apicamente, poiché la comprensione del ciclo di replicazione unico di ciascun HCoV aiuta a determinare i punti temporali che potrebbero essere i migliori per ulteriori analisi. Anche le tecniche di immunofluorescenza sopra descritte sono fondamentali, in quanto la capacità di visualizzare le infezioni virali in un epitelio nasale in vitro con una popolazione cellulare eterogenea rappresentativa consente una valutazione accurata del tropismo virale e fornisce la possibilità di interrogare ulteriormente le interazioni virus-ospite in un contesto fisiologico.
L'epitelio nasale è il sito di barriera primario incontrato da tutti i virus respiratori e, quindi, è probabile che le infezioni da HCoV inizino con l'infezione primaria dell'epitelio nasale, con il potenziale di diffondersi alle vie aeree inferiori attraverso un asse di aspirazione orale-polmonare. Questo probabilmente gioca un ruolo nello sviluppo di polmonite grave e malattie respiratorie durante l'infezione patogena da HCoV (MERS-CoV, SARS-CoV-2), mentre gli HCoV stagionali tendono a causare la malattia solo nelle vie aeree superiori. È fondamentale comprendere le interazioni HCoV-ospite in questo importante sito sentinella immunitaria e questo sistema ALI nasale consente la caratterizzazione della replicazione virale, del tropismo delle cellule ospiti, nonché della citotossicità e dell'induzione immunitaria innata durante l'infezione da HCoV.
Questo sistema di coltura nasale ALI è anche altamente adattabile e può essere utilizzato per rispecchiare molti stati patologici clinici. I campioni nasali acquisiti da pazienti con malattie polmonari genetiche come la fibrosi cistica (causata da un difetto del canale del cloro) o le discinesie ciliari primarie (in cui i meccanismi di battimento ciliare sono disfunzionali) possono essere utilizzati per far crescere colture nasali di ALI rappresentative di queste patologie per capire come questi pazienti possono essere influenzati in modo differenziato dall'infezione da HCoV31,32. Inoltre, vari trattamenti con citochine possono essere utilizzati durante la differenziazione delle colture nasali di ALI per ricreare le caratteristiche di altri stati patologici. Ad esempio, il trattamento con IL-13 durante il differenziamento induce iperplasia a cellule caliciformi e può essere utilizzato come surrogato per lo studio delle vie aeree asmatiche o allergiche33,34. Pertanto, questo sistema ALI nasale è un potente strumento per sondare l'HCoV-ospite e altre interazioni virus-ospite sia nelle vie aeree nasali sane che in quelle malate.
Sebbene questo sistema offra molti vantaggi, alcune limitazioni sorgono anche con l'uso di colture ALI nasali. Sebbene le cellule nasali richiedano tecniche molto meno invasive per l'acquisizione rispetto alle cellule bronchiali o polmonari, la crescita e la differenziazione delle colture di ALI richiedono molto più tempo e risorse rispetto all'uso delle tradizionali linee cellulari immortalizzate. Inoltre, la variabilità da donatore a donatore in termini di permissività all'infezione e di risposte dell'ospite all'infezione da HCoV può rendere più difficile la riproduzione e l'interpretazione dei dati (questo è il motivo per cui gli esperimenti sono spesso condotti con colture derivate da 5-10 donatori, al fine di mitigare questi problemi).
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Disclosures
Susan Weiss fa parte del comitato consultivo scientifico di Ocugen. Noam A. Cohen è consulente per GSK, AstraZeneca, Novartis, Sanofi/Regeron e Oyster Point Pharmaceuticals e ha un brevetto statunitense, "Therapy and Diagnostics for Respiratory Infection" (10.881.698 B2, WO20913112865), e un accordo di licenza con GeneOne Life Sciences.
Acknowledgments
Questo studio ha le seguenti fonti di finanziamento: National Institutes of Health (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. e N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. e N.A.C.), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (S.R.W.), Laffey-McHugh Foundation (S.R.W. e N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) | Invitrogen | Various | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Cytotoxicity detection kit | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + calcium + magnesium | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G measurement chamber | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW software for imaging | Olympus | Version 4.02 | |
| HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht stain | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 cells | ATCC | CCL-7 | To titrate HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) | BEI Resources | NR-44260 | |
| MERS-CoV nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC antibody | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 stain | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors) | Roche | PHOSS-RO | |
| Plate reader | Perkin Elmer | HH34000000 | Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm |
| RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Can prep in-house or purchase |
| RNeasy Plus Kit | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β- tubulin antibody | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 cells | ATCC | CCL-81 | To titrate MERS-CoV |
| VeroE6 cells | ATCC | CRL-1586 | To titrate SARS-CoV-2 |
References
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