Summary
Het neusepitheel is de primaire barrièreplaats waar alle respiratoire pathogenen voorkomen. Hier schetsen we methoden om primaire neusepitheelcellen te gebruiken die zijn gekweekt als lucht-vloeistofinterface (ALI)-culturen om menselijke interacties tussen coronavirus en gastheer in een fysiologisch relevant systeem te karakteriseren.
Abstract
Drie hoogpathogene menselijke coronavirussen (HCoV's) - SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) en SARS-CoV-2 (2019) - zijn ontstaan en hebben de afgelopen 20 jaar aanzienlijke volksgezondheidscrises veroorzaakt. Vier extra HCoV's veroorzaken elk jaar een aanzienlijk deel van de verkoudheidsgevallen (HCoV-NL63, -229E, -OC43 en -HKU1), wat het belang benadrukt van het bestuderen van deze virussen in fysiologisch relevante systemen. HCoV's komen de luchtwegen binnen en brengen een infectie tot stand in het neusepitheel, de primaire plaats waar alle respiratoire pathogenen worden aangetroffen. We gebruiken een primair neusepitheelkweeksysteem waarin van patiënten afkomstige neusmonsters worden gekweekt op een lucht-vloeistofinterface (ALI) om gastheer-pathogeen interacties op deze belangrijke schildwachtplaats te bestuderen. Deze culturen recapituleren vele kenmerken van de in vivo luchtwegen, waaronder de aanwezige celtypen, ciliaire functie en slijmproductie. We beschrijven methoden om virale replicatie, gastheerceltropisme, virusgeïnduceerde cytotoxiciteit en aangeboren immuuninductie in nasale ALI-culturen na HCoV-infectie te karakteriseren, met behulp van recent werk waarin letale en seizoensgebonden HCoV's als voorbeeldworden vergeleken 1. Een beter begrip van gastheer-pathogeen interacties in de neus heeft het potentieel om nieuwe doelen te bieden voor antivirale therapieën tegen HCoV's en andere respiratoire virussen die waarschijnlijk in de toekomst zullen opduiken.
Introduction
Tot op heden zijn zeven menselijke coronavirussen (HCoV's) geïdentificeerd die een reeks aandoeningen van de luchtwegen veroorzaken2. De veel voorkomende of seizoensgebonden HCoV's (HCoV-NL63, -229E, -OC43 en -HKU1) worden doorgaans geassocieerd met pathologie van de bovenste luchtwegen en veroorzaken jaarlijks naar schatting 10%-30% van de verkoudheidsgevallen. Hoewel dit het typische klinische fenotype is dat geassocieerd wordt met de veel voorkomende HCoV's, kunnen deze virussen een significantere ziekte van de onderste luchtwegen veroorzaken bij risicopopulaties, waaronder kinderen, oudere volwassenen en immuungecompromitteerdepersonen. Drie pathogene HCoV's zijn de afgelopen 20 jaar ontstaan en hebben aanzienlijke noodsituaties op het gebied van de volksgezondheid veroorzaakt, waaronder ernstig acuut respiratoir syndroom (SARS)-CoV, Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV en SARS-CoV-2. Dodelijke HCoV's worden in verband gebracht met ernstigere pathologie van de luchtwegen, wat duidelijk wordt geïllustreerd door het sterftecijfer van >34% geassocieerd met MERS-CoV-gevallen (894 sterfgevallen op meer dan 2.500 gevallen sinds de opkomst in 2012)5,6. Het is belangrijk op te merken dat de dodelijke HCoV's ook een reeks aandoeningen van de luchtwegen veroorzaken, van asymptomatische infecties tot dodelijke longontsteking, zoals te zien is bij de aanhoudende COVID-19-pandemie7.
HCoV's komen, net als andere respiratoire pathogenen, de luchtwegen binnen en vestigen een productieve infectie in het neusepitheel8. Verspreiding naar de onderste luchtwegen wordt verondersteld geassocieerd te zijn met aspiratie van de mond-/neusholte naar de long, waar HCoV's een significantere pathologie van de onderste luchtwegen veroorzaken 9,10,11. De neus dient dus als het eerste portaal voor het binnendringen van virussen en is de primaire barrière tegen infectie met zijn robuuste mucociliaire klaringsmachinerie en unieke aangeboren immuunmechanismen die gericht zijn op het voorkomen van verdere virale verspreiding naar de lagere luchtwegen12,13. Van neusepitheelcellen is bijvoorbeeld gemeld dat ze hogere dan gemiddelde basale niveaus van antivirale interferonen en interferon-gestimuleerde genen tot expressie brengen, wat aangeeft dat neuscellen mogelijk voorbereid zijn op vroege reacties op respiratoire virussen14,15,16.
We hebben eerder van patiënten afgeleide primaire neusepitheelcellen gebruikt die zijn gekweekt op een lucht-vloeistofinterface (ALI) om HCoV-gastheerinteracties in de neus te modelleren, waar HCoV-infecties beginnen. Nasale ALI-culturen zijn tolerant voor zowel pathogene (SARS-CoV-2 en MERS-CoV) als veel voorkomende HCoV's (HCoV-NL63 en HCoV-229E) en bieden verschillende voordelen ten opzichte van traditionele luchtwegepitheelcellijnen zoals A549 (een longadenocarcinoomcellijn)16,17. Na differentiatie bevatten nasale ALI-culturen een heterogene cellulaire populatie en vertonen ze veel van de functies die van het in vivo neusepitheel worden verwacht, zoals mucociliaireklaringsmachines18. Neuscellen bieden ook voordelen ten opzichte van kweeksystemen van de lagere luchtwegen (zoals menselijke bronchiale epitheelcellen, HBEC's), aangezien de verwerving van neusepitheelcellen via cytologisch poetsen aanzienlijk minder invasief is in vergelijking met het gebruik van technieken zoals bronchoscopie voor het bereiken van HBEC's 19,20,21.
Dit artikel beschrijft methoden voor het gebruik van dit nasale ALI-kweeksysteem om HCoV-gastheerinteracties in het neusepitheel te karakteriseren. We hebben deze methoden toegepast in recent gepubliceerde werken om SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 en HCoV-229E 1,16,17 te vergelijken. Hoewel deze methoden en representatieve resultaten de nadruk leggen op de studie van HCoV's in dit neuscelmodel, is het systeem zeer aanpasbaar aan andere HCoV's en andere respiratoire pathogenen. Verder kunnen deze methoden breder worden toegepast op andere ALI-kweeksystemen om virale replicatie en cellulair tropisme te onderzoeken, evenals cytotoxiciteit en aangeboren immuuninductie na infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van neusmonsters werd goedgekeurd door de University of Pennsylvania Institutional Review Board (protocol # 800614) en de Philadelphia VA Institutional Review Board (protocol # 00781).
1. Infectie van nasale ALI-culturen
OPMERKING: Verwerving van klinische monsters, evenals groei en differentiatie van nasale ALI-culturen, valt buiten het bestek van dit artikel. Specifieke methoden voor het kweken van primaire neusepitheelcellen zijn te vinden in recent gepubliceerde werken die gebruik maken van deze culturen18,22,23. De onderstaande protocollen kunnen desgewenst ook worden toegepast op in de handel verkrijgbare nasale epitheliale ALI-culturen. De hieronder beschreven protocollen en volumes zijn van toepassing op 24-wells plaattranswell-inzetstukken (6,5 mm diameter, 0,33cm2 membraanoppervlak). Als u ALI-culturen gebruikt die op grotere transwells worden gekweekt (d.w.z. platen met 12 putjes, 12 mm diameter, 1,12cm2 oppervlak), pas dan de volumes proportioneel aan om de grootte van de transwell weer te geven.
- Dag voor infectie:
- Was ALI-culturen 3x apicaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (voeg ~200 μL opgewarmde PBS toe, plaats gedurende 5 minuten in een incubator van 37 °C, zuig PBS op en herhaal).
- Vervang het basale medium (500 μL).
- Laat culturen balanceren bij de temperatuur waarbij infecties 's nachts zullen worden uitgevoerd (d.w.z. als ze bij 33 °C infecteren, plaats dan culturen in een incubator van 33 °C na PBS-wasbeurten).
OPMERKING: HCoV's geassocieerd met verkoudheid, zoals HCoV-229E en HCoV-NL63, repliceren naar verluidt efficiënter bij 33 °C. Bovendien is de temperatuur van het in vivo neusepitheel 33 °C (dit verschilt van de temperatuur van de long, die 37 °C is).
- Verdun het virus indien nodig in serumvrije Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) om de gewenste multipliciteit van infectie (MOI) te bereiken in een totaal inoculumvolume van 50 μL.
OPMERKING: Infecties zijn meestal uitgevoerd bij MOI = 5 (hoge MOI); infecties met MOI = 0,5 (laag MOI) zijn echter ook gebruikt voor SARS-CoV-2 en verkoudheids-geassocieerde HCoV's, en deze resulteren in vergelijkbare piekvirale titers, maar met variabele kinetiek (beide MOI zijn acceptabel). - Voeg inoculum apicaal toe en plaats de culturen gedurende 1 uur terug in de incubator.
- Schud de platen voorzichtig om de 15 minuten tijdens infectie (houd de plaat stevig in beide handen, schommel naar voren en naar achteren en van links naar rechts om een gelijkmatige adsorptie van viraal inoculum te garanderen).
- Na 1 uur incubatie, het virale inoculum aspireren en elke geïnfecteerde cultuur 3x wassen met PBS om ervoor te zorgen dat het virale inoculum wordt verwijderd (voeg voor elke wasbeurt 200 μL PBS toe, incubeer gedurende 5 minuten en aspireer of verwijder met een pipet).
- Verzamel desgewenst de derde PBS-wasbeurt om te bevestigen dat het invoervirus voldoende is verwijderd.
- Vervang het basale medium tijdens infectie elke 72 uur door vers medium op geïnfecteerde ALI's.
2. Opvang van apicale oppervlaktevloeistof (ASL) en titratie van het uitgescheiden virus
- Voeg op vooraf bepaalde tijdstippen na infectie 200 μL PBS toe aan de apicale kamer van elke geïnfecteerde transwell.
OPMERKING: Relevante tijdstippen variëren afhankelijk van HCoV van belang en variëren van 24 uur tot 192 uur na infectie (zie de sectie representatieve resultaten voor virale replicatiegegevens voor verschillende HCoV's). - Pipetteer PBS 5x op en neer om een maximale opvang van apicaal uitgescheiden virus te garanderen en verzamel het volledige volume in een microcentrifugebuis (dit is het ASL-monster).
OPMERKING: ASL omvat uitgestoten virale deeltjes naast slijm en andere producten die apicaal worden uitgescheiden door ALI-culturen. - Kwantificeer infectieus virus in ASL via standaard virale plaque-assay (serieel verdunnen van virusbevattende monsters om de concentratie van virale deeltjes te kwantificeren).
OPMERKING: Celtypen en incubatietijd die worden gebruikt voor plaque-assay zijn afhankelijk van het gebruikte virus: SARS-CoV-2 (VeroE6-cellen); MERS-CoV (VeroCCL81-cellen); HCoV-NL63 (LLC-MK2-cellen); HCoV-229E (Huh7-cellen). Bijzonderheden over het uitvoeren van virale plaque-assays vallen buiten het bestek van dit manuscript, maar zijn eerder beschreven in een Journal of Visualized Experiments (JoVE) publicatie24. - Verzamel desgewenst het basale medium op verschillende tijdstippen na infectie om de afwezigheid van basaal vrijgegeven virus te bevestigen. HCoV's worden meestal apicaal vrijgegeven uit neusepitheelcellen, maar bevestigen dit via plaquetest van onverdund basaal medium.
- Bewaar ASL-monsters bij −80 °C als kwantificering door middel van plaquetest niet plaatsvindt op de dag van afname.
3. Kwantificering van intracellulair virus
- Na het verzamelen van het ASL-monster, verplaatst u elke transwell naar een schone plaat met 24 putjes die vooraf is geladen met 500 μL DMEM met 2% foetaal runderserum (FBS) basaal.
OPMERKING: DMEM met 2% FBS wordt gebruikt om het virus te stabiliseren tijdens volgende vries-dooicycli. - Was elke transwell 3x apicaal met PBS om ervoor te zorgen dat het apicaal uitgestoten virus volledig wordt verwijderd.
- Voeg na het aanzuigen om de laatste PBS-was te verwijderen 100 μL DMEM met 2% FBS toe aan het apicale compartiment.
- Verplaats de plaat met transwells met zowel apicale als basale media naar een vriezer van -80 °C en voltooi drie opeenvolgende vries-dooicycli om de cellen te lyseren.
- Na de laatste vries-dooicyclus, poolt u apicale (100 μL) en basale (500 μL) media in een schone buis.
- Centrifugeer bij 500 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C om eventuele celresten te pelleteren.
- Verzamel de supernatant. Dit is het intracellulaire virusmonster voor titratie via standaard plaquetest.
OPMERKING: Drievoudige verdunning vindt plaats tijdens het verzamelproces ten opzichte van ASL-verzameling; ASL-monsters worden verzameld in 200 μL PBS, terwijl intracellulair virusmonster wordt verzameld in een totaal volume van 600 μL.
4. Meting van de transepitheliale elektrische weerstand (TEER)
OPMERKING: Voor TEER-metingen moet PBS aangevuld met calcium en magnesium (PBS + Ca 2+/Mg2+) worden gebruikt. Er wordt gebruik gemaakt van een epitheliale volt/ohmmeter die is ingesteld om in ohm af te lezen (zie de tabel met materialen).
- Reinig, balanceer en leeg het EVOM-instrument volgens de instructies van de fabrikant; Gebruik een "lege" transwell zonder toevoeging van neuscellen voor blanking. Registreer blanco TEER-metingen.
NOTITIE: Als u meerdere virussen gebruikt, moet het EVOM-instrument tussen de omstandigheden door streng worden gereinigd om kruisbesmetting te voorkomen (wasbeurten met 70% ethanol gevolgd door gedeïoniseerd water zijn voldoende). - Verplaats elke geïnfecteerde transwell naar een vooraf geëtiketteerde, schone plaat met 24 putjes met 500 μL PBS + Ca 2+/Mg2+ basaal om het resterende basaalmedium uit de transwells te wassen.
- Voeg 200 μL PBS + Ca 2+/Mg2+ toe aan het apicale compartiment van elke transwell.
- Voeg 1 ml PBS + Ca 2+/Mg2+ toe aan de Endohm-6 meetkamer.
- Verplaats elke transwell in de Endohm-6-meetkamer en plaats het deksel van de kamer terug zodat de apicale elektrode in de 200 μL PBS in het apicale compartiment rust; de basale elektrode is ingebouwd in de bodem van de Endohm-6-kamer.
- Laat de EVOM-meting stabiliseren en registreer de onbewerkte TEER-meting.
- Verzamel het ASL-monster zoals hierboven beschreven na het uitvoeren van een TEER-meting als titeren gewenst is (verzamel in de 200 μL PBS + Ca 2+/Mg2+ die is toegevoegd voor TEER-meting).
OPMERKING: ASL-monsterafname kan microscheurtjes in de epitheelbarrière veroorzaken die TEER-metingen kunnen verstoren, dus ASL moet worden verzameld na TEER-meting. Verder mag het basale medium niet onmiddellijk vóór de TEER-metingen worden gewijzigd, omdat dit ook van invloed kan zijn op de TEER-waarden. - Om ruwe TEER-metingen om te zetten in eindmetingen in Ohm/cm2, trekt u de blanco TEER-waarde af en vermenigvuldigt u deze waarde met het oppervlak van het transwellmembraan met behulp van vergelijking (1):
TEER = [TEER-waarde - blanco TEER-waarde] × (oppervlakte van de transwell) (1) - Evalueer TEER voor HCoV's elke 24 uur of 48 uur na infectie; de kinetiek van TEER-veranderingen varieert vaak tussen virussen en vereist probleemoplossing op verschillende tijdstippen.
- Neem bij het meten van TEER altijd nep-geïnfecteerde culturen op en evalueer op elk tijdstip (negatieve controle).
OPMERKING: Voor namaakculturen moeten TEER-metingen stabiel blijven of licht toenemen ten opzichte van de uitgangswaarde nadat de differentiatie van de culturen is voltooid. Het oppervlak van membraansteunen is afhankelijk van de grootte en de fabrikant van transwells; Transwells met 24 putjes hebben doorgaans een oppervlakte van 0,33cm2.
5. Meting van cytotoxiciteit tijdens infectie via lactaatdehydrogenase (LDH)-test
OPMERKING: In dit werk werd het LDH-gehalte in ASL-monsters gekwantificeerd met behulp van een in de handel verkrijgbare cytotoxiciteitsdetectiekit. Het LDH-signaal in het basale medium lag vaak onder de detectiegrens en was vaak minder reproduceerbaar dan LDH gekwantificeerd in ASL-monsters van HCoV-geïnfecteerde culturen.
- Bereid aanvullende controles voor die nodig zijn voor de LDH-test.
- Achtergrondcontrole: gebruik PBS (gebruik PBS dat calcium en magnesium bevat als ASL-monsters op deze manier zijn verzameld).
- Positieve controle (plafondwaarde): behandel ALI's apicaal met Triton X-100. Verzamel Triton-controleputten (gebruik hiervoor meestal drie ALI-culturen op elk tijdstip).
- Voeg 200 μL 2% Triton X-100 in PBS rechtstreeks toe aan het apicale compartiment van de transwell.
- Incubeer gedurende 10-15 minuten om de cellen volledig te laten lysen.
- Verzamel het volledige volume als een Triton-plafondmonster.
- Negatieve controle (lage controle/baseline LDH-afgifte): verzamel ASL van nep-geïnfecteerde ALI-culturen afkomstig van dezelfde donor als geïnfecteerde culturen.
- Verzamel negatieve controle mock ASL volgens de ASL-verzamelprocedure hierboven.
OPMERKING: Dezelfde transwells kunnen worden gebruikt voor deze negatieve controle voor alle tijdstippen, terwijl voor elk tijdstip nieuwe transwells nodig zijn voor de Triton-controle.
- Verzamel negatieve controle mock ASL volgens de ASL-verzamelprocedure hierboven.
- Om naast de LDH-metingen van elk ASL-monster ook de kwantificering van het uitgescheiden virus mogelijk te maken, plaatst u als volgt een optisch heldere zwarte plaat met platte bodem van 96 putjes:
- Verdun alle monsters in PBS met 45 μl monster en 55 μl PBS (totaal volume van 100 μl).
- Behandel Triton positieve controle en mock achtergrondcontrole monsters op dezelfde manier.
OPMERKING: Deze verdunning maakt het mogelijk om elk experimenteel monster in drievoud te laden (45 μL x 3) en voldoende resterend ASL-volume voor titering via plaquetest. - Laad LDH-plaat in drievoud: Triton-plafond, nep-achtergrondcontrole, PBS-regeling en experimentele monsters.
- Bereid het reactiemengsel zoals aangegeven door de fabrikant (kleurstofoplossing + katalysator).
- Voeg 100 μL reactiemengsel toe aan elk putje en incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- Meet na 20 minuten de extinctie bij 492 nm.
- Bereken de procentuele cytotoxiciteit ten opzichte van de Triton-plafondwaarde met behulp van vergelijking (2).
Cytotoxiciteit (%)
(2)
(2)6. Bereiding van nasale ALI-culturen voor immunofluorescentie (IF) beeldvorming
- Verplaats de transwell naar een verse plaat met 24 putjes en was 3x apicaal met PBS (verzamel de eerste PBS-wasbeurt als ASL bij titeren; voer vervolgens twee extra PBS-wasbeurten uit om overtollig afgeworpen virus te verwijderen dat de IF-kwaliteit zou kunnen belemmeren)
- Bedek na de laatste PBS-wasbeurt de transwell apicaal en basaal met 4% PFA.
- Incubeer gedurende 30 minuten om te fixeren in 4% PFA, verwijder en was vervolgens 3x met PBS.
- Snijd de transwell-steun met de cellen weg met behulp van een geslepen scheermesje of schaar.
- Om het aantal IF-doelen voor elk transwell te verhogen, snijdt u elk membraan doormidden en kleurt u elke helft met verschillende antilichaamcombinaties.
- Permeabiliseer met 0,2% Triton X-100 in PBS gedurende 10 min.
- Blokkeer met 10% normaal ezelinnenserum en 1% BSA in PBST (PBS + 0,2% Triton X-100) gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
NOTITIE: Bescherm monsters vanaf deze stap tegen blootstelling aan licht. - Incubeer gedurende een nacht bij 4 °C in primaire antilichaamoplossing. Verdun alle antilichamen 1:1.000 in de blokkeerbuffer.
OPMERKING: Representatieve antilichamen voor HCoV-nucleocapsidekleuring, evenals markers van het epitheelceltype en cytoskeletkleuringen, worden hieronder vermeld (zie de materiaaltabel voor informatie over de fabrikant en catalogusnummers).- Gebruik voor HCoV-antigeenkleuring antilichamen die gericht zijn op SARS-CoV-2-nucleocapside, MERS-CoV-nucleocapside en HCoV-NL63-nucleocapside.
- Om epitheelceltypen te identificeren, gebruikt u antilichamen die gericht zijn op bekercelmarker MUC5AC en trilhaarcelmarker type IV β-tubuline.
- Gebruik voor cytoskeletmarkers antilichamen gericht tegen falloïdine (bindt F-actine) en epitheelceladhesiemarker: EpCAM (CD326).
- Incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur in een secundaire antilichaamoplossing; Gebruik secundaire antilichaamkleurstoffen verdund met 1:1.000 in de blokkeerbuffer.
- Nadat de kleuring is voltooid, brengt u het membraan met een spatel over op een glasplaatje, oriënteert u de transwell met de apicale zijde naar het objectglaasje en voegt u de montageoplossing toe. Laat 15-30 minuten intrekken voordat u heldere nagellak rond de randen aanbrengt.
- Verkrijg beelden met behulp van een confocale microscoop (stap van de Z-as: 0,5 μm; sequentieel scannen)1,16,17.
OPMERKING: Na fixatie van culturen in 4% PFA en wassen met PBS, kunnen gefixeerde culturen weken tot maanden bij 4 °C worden bewaard voorafgaand aan kleuring en voorbereiding voor beeldvorming. Na kleuring en montage van membranen kunnen monsters langdurig (>2 jaar) bij 4 °C in het donker worden bewaard.
7. Verzameling van intracellulair eiwit voor westerse immunoblotting of RNA voor RT-qPCR-analyse
- Verzamel ASL zoals hierboven beschreven bij het kwantificeren van virale titers (protocolsectie 2).
- Verplaats de transwell naar een schone plaat met 24 putjes, omdat het schrapen van het membraan kan leiden tot het breken van het inzetstuk.
- Verzamel voor western blot-analyse totaal eiwitlysaat in 125 μL RIPA-buffer (50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl, 0,5% deoxycholaat, 0,1% SDS, 1% NP40) aangevuld met proteaseremmers en fosfataseremmers.
- Voeg 125 μL RIPA-buffer toe aan het apicale compartiment en incubeer gedurende 5-10 minuten.
- Schraap het membraan met behulp van een P200-pipetpunt om eventuele resterende aangehechte cellen te verwijderen en verzamel het volledige volume (schraap krachtig over het hele oppervlak van het membraan en pipetteer vervolgens meerdere keren op en neer om het hele monster te verzamelen).
- Incubeer eiwitlysaatmonsters op ijs gedurende 10 minuten en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten op maximale snelheid (20.000 × g) bij 4 °C.
- Meng het supernatans met 4x Laemmli monsterbuffer met β-mercaptoethanol (reductiemiddel) volgens de protocollen van de fabrikant.
- Kook eiwitmonsters gedurende 5 minuten bij 95 °C en voer ze vervolgens uit met behulp van traditionele western blotting-protocollen 1,16,17.
- Gebruik voor het verzamelen van totaal RNA een in de handel verkrijgbare RNA-extractiekit naar keuze.
OPMERKING: Het apicale compartiment van transwell-inserts met 24 putjes heeft een maximaal volume van ~200 μL; Daarom voeren we twee opeenvolgende wasbeurten uit op elke cultuur om het totale aanbevolen volume te bereiken. De onderstaande gegevens komen overeen met de aanbevolen verzameling RNA-monsters in een totaal volume van 350 μL. - Voeg 200 μL lysisbuffer toe aan het apicale compartiment van de geïnfecteerde transwell.
- Laat 5-10 minuten zitten, schraap eventuele resterende cellen van het membraan met behulp van een pipetpunt en verzamel het volledige volume in een gelabelde microcentrifugebuis.
- Voeg 150 μl extra lysisbuffer toe aan het apicale compartiment van de transwell en pipetteer op en neer voordat u het in dezelfde microcentrifugebuis verzamelt.
- Extraheer RNA volgens het protocol van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representatieve cijfers zijn deels overgenomen uit gegevens die te vinden zijn in het manuscript Otter et al.1. Nasale ALI-culturen afkomstig van vier of zes donoren waren geïnfecteerd met een van de vier HCoV's (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 en HCoV-229E) volgens de hierboven beschreven protocollen, en de gemiddelde apicaal uitgestoten virale titers voor elk virus worden weergegeven in figuur 1A. Hoewel alle vier deze HCoV's productief repliceren in nasale ALI-culturen, repliceren SARS-CoV-2 en HCoV-229E het meest efficiënt. Merk op dat dit gemiddelde virale titers zijn en dat titers voor elke HCoV bij individuele donoren onlangs zijn gepubliceerd1. Na het wassen van nasale ALI-culturen zoals beschreven in protocolsectie 3, worden MERS-CoV-titers in apicale oppervlaktevloeistof (ASL) vergeleken met intracellulaire virale titers in figuur 1B. MERS-CoV intracellulaire en apicaal uitgescheiden virale titers zijn ongeveer hetzelfde 48 uur na infectie (hpi).
Immunofluorescentiebeeldvorming van geïnfecteerde nasale ALI-culturen is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om cellulair tropisme en andere infectieparameters te onderzoeken, zoals syncytievorming, cel-tot-celfusie en schade aan de integriteit van de epitheliale barrière. Co-kleuring van geïnfecteerde culturen met antilichamen die specifiek zijn voor virale antigenen (zoals nucleocapside of HCoV niet-structurele eiwitten) en markers voor trilhaar- of bekercellen (respectievelijk type IV β-tubuline en MUC5AC) kan cellulair tropisme bepalen voor een HCoV in nasale ALI's25,26. Figuur 2A toont representatieve beelden van neusculturen die besmet zijn met SARS-CoV-2, MERS-CoV en HCoV-NL63.
SARS-CoV-2 en HCoV-NL63 infecteren voornamelijk trilhaarcellen (wat blijkt uit de colokalisatie van virale nucleocapside-kleuring met ciliamarker type IV β-tubuline en gebrek aan colokalisatie van viraal antigeen met bekercelmarker MUC5AC). MERS-CoV infecteert voornamelijk niet-trilhaarcellen in nasale ALI-culturen, aangezien MERS-CoV het tegenovergestelde patroon vertoont, met colokalisatie van virale antigeenkleuring met MUC5AC en minimale colokalisatie van virale nucleocapsidekleuring met type IV β-tubuline. Markers zoals phalloidine, dat zich bindt aan actinefilamenten, of EpCAM, epitheelceladhesiemolecuul, kunnen worden gebruikt om het epitheliale cytoskelet te visualiseren en een verlies van de integriteit van de epitheliale barrière te detecteren27. Figuur 2B toont falloïdinekleuring in nasale ALI-culturen; panel 1 toont een intacte cytoskeletale F-actine-ultrastructuur in een nep-geïnfecteerde cultuur, en panel 2 toont een verlies van phalloidine-integriteit en suggereert mogelijke schade aan de epitheliale barrièrefunctie in een HCoV-NL63-geïnfecteerde cultuur. Epitheliale markers zoals deze kunnen worden toegepast op HCoV-infecties om de dynamiek van de epitheliale barrière tijdens infectie te karakteriseren.
Na infectie van nasale ALI-culturen met elk van de vier HCoV's werd de trans-epitheliale elektrische weerstand (TEER) gecontroleerd. Baseline TEER-metingen werden geregistreerd voorafgaand aan infectie, 0 hpi, en TEER werd opnieuw geëvalueerd voor elke transwell op 96 hpi en 192 hpi. Figuur 3 toont TEER-veranderingen voor elk van de HCoV's. Figuur 3A,B toont ΔTEER-waarden (verschillen in TEER berekend voor elke transwell door de baseline TEER op 0 hpi af te trekken van TEER gemeten op een bepaald punt). Voor SARS-CoV-2, MERS-CoV en HCoV-NL63 treden grote veranderingen in TEER laat in de infectie op (192 hpi), en figuur 3A illustreert dat SARS-CoV-2- en HCoV-NL63-infecties resulteren in negatieve ΔTEER-waarden (192 hpi - 0 hpi), terwijl MERS-CoV-infectie dat niet doet. Ter vergelijking zijn nep-ΔTEER-waarden opgenomen en illustreren dat veranderingen in TEER na MERS-CoV-infectie niet significant verschillen van die tijdens nepinfectie. Negatieve ΔTEER-waarden duiden op een afname van de integriteit van de epitheliale barrière en een aangetaste epitheliale barrièrefunctie. Figuur 3B toont ΔTEER-waarden voor HCoV-229E (berekend op basis van 96 hpi en 192 hpi). HCoV-229E veroorzaakt disfunctie van de epitheliale barrière op het eerdere tijdstip (96 hpi), maar herstel naar schijnniveaus vindt plaats op het latere tijdstip (192 hpi). Deze gegevens laten zien hoe de kinetiek van TEER tussen virussen kan verschillen. Figuur 3C,D toont TEER-sporen, die ruwe TEER-gegevens weergeven voor elke geïnfecteerde transwell in de loop van de tijd, waardoor TEER-trends in de loop van de infectie kunnen worden gevisualiseerd. Indien gewenst kan behandeling met het cytokine IL-13 worden opgenomen als positieve controle tijdens TEER-experimenten, omdat dit tight junctions schaadt, de epitheliale barrièrefunctie in gevaar brengt en zo de membraanpermeabiliteit in luchtwegepitheel verhoogt; daarom wordt verwacht dat cytokine IL-13 zal resulteren in verlagingen van TEER28,29,30.
Als aanvulling op TEER-metingen in neusculturen kan cytotoxiciteit worden gekwantificeerd via kwantificering van lactaatdehydrogenase (LDH) dat apicaal vrijkomt tijdens infectie. Figuur 4 toont gemiddelde cytotoxiciteitsgegevens bij 96 hpi en 192 hpi van culturen afkomstig van 10 donoren die besmet waren met elk van de geteste HCoV's. SARS-CoV-2, HCoV-NL63 en HCoV-229E veroorzaken significante cytotoxiciteit in neusculturen, terwijl MERS-CoV dat niet doet.
Totaal eiwit of RNA verzameld uit geïnfecteerde neusculturen kan worden gebruikt om verschillende HCoV-gastheerinteracties te onderzoeken. We behandelden neusculturen met type 2 cytokine IL-13 om bekercelhyperplasie te induceren en het weefsellandschap van een astmatische luchtweg te modelleren. Figuur 5A toont qPCR-gegevens die de mRNA-abundantie van twee belangrijke HCoV-receptoren kwantificeren na behandeling met IL-13. DPP4 is de cellulaire receptor voor MERS-CoV en ACE2 is de cellulaire receptor voor zowel SARS-CoV-2 als HCoV-NL63. Behandeling met IL-13 resulteert in een dramatisch verhoogde DPP4-expressie, maar geen significante veranderingen in ACE2-expressie. Figuur 5B toont western blot-gegevens om de eiwitovervloed na behandeling met IL-13 in niet-geïnfecteerde en SARS-CoV-2-geïnfecteerde culturen te evalueren. Behandeling met IL-13 resulteert in een significant verhoogde MUC5AC (een bekercelmarker) en een verlaagde type IV β-tubuline (een trilhaarcelmarker), wat de verwachte bekercelhyperplasie weerspiegelt die wordt veroorzaakt door deze cytokinebehandeling. Analyse op eiwitniveau toont aan dat behandeling met IL-13 de DPP4-expressie verhoogt, maar de ACE2-expressie verlaagt. Western blotting voor SARS-CoV-2 nucleocapside-eiwit onthult dat IL-13-behandeling resulteert in een lichte afname van viraal antigeen in vergelijking met schijn-behandelde culturen. Soortgelijke analyses kunnen worden uitgevoerd voor elk mRNA of eiwit dat van belang is na manipulatie van nasale ALI-culturen en/of infectie met HCoV's.
Figuur 1: HCoV-replicatie in nasale ALI-culturen. Neuskweken afkomstig van zes of vier donoren werden in drievoud geïnfecteerd met SARS-CoV-2 (6), MERS-CoV (6), HCoV-NL63 (6) of HCoV-229E (4) bij MOI = 5. Apicale oppervlaktevloeistof werd verzameld bij 0 hpi, 48 hpi, 96 hpi en 144 hpi, en infectieus virus werd gekwantificeerd door middel van plaquetest. (A) Gemiddelde virale titers van alle donoren die met elke HCoV zijn geïnfecteerd, worden weergegeven. (B) Neuskweken afkomstig van een enkele donor werden in drievoud geïnfecteerd bij MOI = 5, en ASL werd verzameld bij 48 hpi. Na ASL-verzameling werden de transwells 3x gewassen met PBS en vervolgens gelyseerd via vries-dooi om het intracellulaire virus te kwantificeren. Infectieus virus in het apicale schuurcompartiment versus in het intracellulaire compartiment werd gekwantificeerd door middel van plaquetest. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Afkortingen: ALI = lucht-vloeistofinterface; MOI = multipliciteit van infectie; ASL = apicale oppervlaktevloeistof; HPI = uur na infectie; PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing. Dit cijfer is geconstrueerd met behulp van gegevens gepubliceerd in Otter et al.1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Immunofluorescentiebeeldvorming van nasale ALI-culturen om cellulair tropisme en epitheliale integriteit te karakteriseren. (A) Nasale ALI-culturen waren geïnfecteerd met SARS-CoV-2, MERS-CoV of HCoV-NL63 bij MOI = 5 en gefixeerd in 4% paraformaldehyde bij 96 hpi. Culturen werden voorbereid voor immunofluorescentiebeeldvorming, zoals hierboven beschreven in protocolsectie 6, met behulp van primaire antilichamen tegen elk nucleocapside-eiwit van het virus (weergegeven in rood), trilhaarcelmarker type IV β-tubuline (groen) of bekercelmarker MUC5AC (groen). Merk op dat een antilichaam tegen MERS-CoV niet-structureel proteïne 8 (nsp8) werd gebruikt in plaats van een antilichaam tegen nucleocapside-eiwit vanwege soortincompatibiliteit met het MUC5AC-antilichaam. Colokalisatie tussen viraal antigeen en elk van de epitheelcelmarkers wordt gevisualiseerd als oranje/gele kleur in samengevoegde afbeeldingen voor elk virus. (B) Nasale ALI-culturen werden gekleurd met behulp van falloidine (dat actine cytoskeletfilamenten kleurt) om de integriteit van het cytoskelet te visualiseren, zoals weergegeven in roze. Hoescht-kleuring wordt in blauw weergegeven. Paneel 2B.1 toont scherpe, intacte falloidinekleuring, wat wijst op intacte cytoskeletale architectuur, terwijl paneel 2B.2 een verlies van epitheliale integriteit en vervaging van de falloïdinekleuring vertoont. Schaalbalken = (A) 50 μm, (B) 10 μm. Afkortingen: ALI = lucht-vloeistof interface; MOI = multipliciteit van infectie; HPI = uur na infectie. Dit cijfer is geconstrueerd met behulp van gegevens gepubliceerd in Otter et al. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Meting van trans-epitheliale elektrische weerstand in ALI-culturen tijdens infectie. (A) Nasale ALI-culturen afkomstig van 10 donoren waren ofwel nep-geïnfecteerd of geïnfecteerd bij MOI = 5 met SARS-CoV-2, MERS-CoV of HCoV-NL63. ΔTEER werd berekend voor elke transwell als TEER bij 192 hpi minus TEER bij 0 hpi (baseline TEER). Elke staaf illustreert de gemiddelde ΔTEER-waarde voor elk virus onder drievoudige culturen van elke donor. (B) Nasale ALI-culturen afkomstig van 8 donoren waren nep-geïnfecteerd of geïnfecteerd met HCoV-229E bij MOI = 5. ΔTEER vanaf baseline TEER werd berekend zoals in (A) met behulp van TEER bij 96 hpi of 192 hpi. (C,D) TEER-sporengegevens worden weergegeven voor nep-geïnfecteerde of HCoV-geïnfecteerde culturen die zijn afgeleid van elk van de vier donoren. Elke lijn vertegenwoordigt TEER-gegevens van een enkele transwell in de loop van de tijd (drievoudige transwells van elke donor werden getest). Donateursaantallen hebben een kleurcode en worden weergegeven in de sleutel rechts van elke grafiek. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD in paneel A en paneel B. Afkortingen: ALI = lucht-vloeistof interface; MOI = multipliciteit van infectie; HPI = uur na infectie; TEER = trans-epitheliale elektrische weerstand. Dit cijfer is geconstrueerd met behulp van gegevens gepubliceerd in Otter et al.1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kwantificering van cytotoxiciteit tijdens HCoV-infectie van nasale ALI-culturen. Neuskweken afkomstig van 10 donoren die met elke HCoV in drievoud waren geïnfecteerd bij MOI = 5 ondergingen LDH-kwantificering in ASL-monsters, zoals hierboven beschreven. Gemiddelde cytotoxiciteit bij alle geteste donoren wordt voor elke HCoV aangetoond bij 96 hpi en 192 hpi. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Afkortingen: ALI = lucht-vloeistofinterface; MOI = multipliciteit van infectie; HPI = uur na infectie; TEER = trans-epitheliale elektrische weerstand; ASL = apicale oppervlaktevloeistof; LDH = lactaatdehydrogenase. Dit cijfer is geconstrueerd met behulp van gegevens gepubliceerd in Otter et al.1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: mRNA/eiwitanalyse na infectie van neusculturen. Neuskweken behandeld met type 2 cytokine IL-13 of schijnbehandeld werden gebruikt om veranderingen in expressie van HCoV-receptoren te evalueren, evenals in trilhaar- en bekercelmarkers. (A) de mRNA-expressie van DPP4 en ACE2 werd gekwantificeerd via RT-qPCR. Gegevens voor culturen van drie donoren die met IL-13 zijn behandeld, worden weergegeven als vouwveranderingen ten opzichte van met schijn behandelde culturen die van dezelfde donoren zijn afgeleid. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD, waarbij elk punt de gemiddelde inductie van de vouwverandering voor een enkele donor vertegenwoordigt. (B) Het totale eiwit werd geoogst uit neusculturen die ofwel schijn- of IL-13 werden behandeld en ofwel nep- of SARS-CoV-2-geïnfecteerd waren. Eiwitten werden gescheiden via SDS-PAGE en immunoblotted met antilichamen tegen epitheelcelmarkers (type IV β-tubuline, MUC5AC), HCoV-receptoren (ACE2, DPP4), SARS-CoV-2 nucleocapside-eiwit en GAPDH. Afkortingen: RT-qPCR = reverse-transcriptie-kwantitatieve polymerasekettingreactie; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese. Dit cijfer is geconstrueerd met behulp van gegevens gepubliceerd in Otter et al.1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methoden beschrijven een primair epitheelkweeksysteem waarin van de patiënt afgeleide neusepitheelcellen worden gekweekt op een lucht-vloeistofinterface en worden toegepast op de studie van HCoV-gastheerinteracties. Eenmaal gedifferentieerd, recapituleren deze nasale ALI-culturen vele kenmerken van het in vivo neusepitheel, waaronder een heterogene cellulaire populatie met trilhaar-, beker- en basale cellen vertegenwoordigd, evenals intacte mucociliaire functie met robuust kloppende trilhaartjes en slijmafscheiding. Deze heterogene celpopulatie is een belangrijk voordeel van dit kweeksysteem ten opzichte van traditionele respiratoire epitheelcellijnen, omdat het de karakterisering van gastheerceltropisme tijdens virale infectie mogelijk maakt (zoals weergegeven in figuur 2). Traditionele luchtwegepitheelcellijnen missen ook functionele mucociliaire klaringsmechanismen, die een sleutelrol spelen bij de primaire afweer tegen respiratoire virussen naast aangeboren immuunroutes zoals de productie van interferon.
Kritieke stappen binnen het protocol zijn onder meer de initiële infectieprocedure; De culturen moeten bijvoorbeeld voorafgaand aan de infectie op de gewenste temperatuur worden gebalanceerd en er moet een consistente methodologie worden gebruikt om elke infectie te starten. Deze stappen zijn cruciaal om de methode te standaardiseren en reproduceerbaarheid in stroomafwaartse bevindingen te garanderen.
Misschien wel het belangrijkste deel van deze methoden is de kwantificering van apicaal vrijgegeven virus, aangezien het begrijpen van de unieke replicatiecyclus van elke HCoV helpt bij het bepalen van de tijdstippen die het beste zijn voor verdere analyse. De hierboven beschreven immunofluorescentietechnieken zijn ook van cruciaal belang, aangezien het vermogen om virale infecties te visualiseren in een in vitro neusepitheel met een representatieve heterogene cellulaire populatie een nauwkeurige beoordeling van viraal tropisme mogelijk maakt en de mogelijkheid biedt om virus-gastheerinteracties in een fysiologische setting verder te onderzoeken.
Het neusepitheel is de primaire barrièreplaats die alle respiratoire virussen tegenkomen, en daarom is het waarschijnlijk dat HCoV-infecties beginnen met primaire infectie van het neusepitheel, met het potentieel om zich via een orale-longaspiratie-as naar de onderste luchtwegen te verspreiden. Dit speelt waarschijnlijk een rol bij de ontwikkeling van ernstige longontsteking en luchtwegaandoeningen tijdens pathogene HCoV-infectie (MERS-CoV, SARS-CoV-2), terwijl de seizoensgebonden HCoV's de neiging hebben om alleen in de bovenste luchtwegen ziekte te veroorzaken. Het is van cruciaal belang om HCoV-gastheerinteracties in deze belangrijke immuunschildwachtplaats te begrijpen, en dit nasale ALI-systeem maakt karakterisering mogelijk van virale replicatie, gastheerceltropisme, evenals cytotoxiciteit en aangeboren immuuninductie tijdens HCoV-infectie.
Dit nasale ALI-kweeksysteem is ook zeer aanpasbaar en kan worden gebruikt om veel klinische ziektetoestanden te weerspiegelen. Nasale monsters verkregen van patiënten met genetische longziekten zoals cystische fibrose (veroorzaakt door een chloridekanaaldefect) of primaire ciliaire dyskinesieën (waarbij ciliaire klopmechanismen disfunctioneel zijn) kunnen worden gebruikt om nasale ALI-culturen te kweken die representatief zijn voor deze pathologieën om te begrijpen hoe deze patiënten differentieel kunnen worden beïnvloed door HCoV-infectie31,32. Bovendien kunnen verschillende cytokinebehandelingen worden gebruikt tijdens de differentiatie van nasale ALI-culturen om kenmerken van andere ziektetoestanden na te bootsen. Behandeling met IL-13 tijdens differentiatie induceert bijvoorbeeld bekercelhyperplasie en kan worden gebruikt als surrogaat voor het bestuderen van astmatische of allergische luchtwegen33,34. Dit nasale ALI-systeem is dus een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van HCoV-gastheer en andere virus-gastheerinteracties, zowel in gezonde als zieke neusluchtwegen.
Hoewel dit systeem veel voordelen biedt, ontstaan er ook enkele beperkingen bij het gebruik van nasale ALI-culturen. Hoewel neuscellen veel minder invasieve technieken vereisen voor acquisitie dan bronchiale of longcellen, vereist het kweken en differentiëren van ALI-culturen aanzienlijk meer tijd en middelen dan het gebruik van traditionele onsterfelijke cellijnen. Bovendien kan de variabiliteit van donor tot donor in termen van toegeeflijkheid voor infectie en gastheerreacties op HCoV-infectie het moeilijker maken om gegevens te reproduceren en te interpreteren (dit is de reden waarom vaak experimenten worden uitgevoerd met culturen die zijn afgeleid van 5-10 donoren, om deze problemen te verminderen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Susan Weiss is lid van de wetenschappelijke adviesraden voor Ocugen. Noam A. Cohen adviseert voor GSK, AstraZeneca, Novartis, Sanofi/Regeron en Oyster Point Pharmaceuticals en heeft een Amerikaans patent, "Therapy and Diagnostics for Respiratory Infection" (10,881,698 B2, WO20913112865), en een licentieovereenkomst met GeneOne Life Sciences.
Acknowledgments
Deze studie heeft de volgende financieringsbronnen: National Institutes of Health (NIH) R01AI 169537 (SRW en NAC), NIH R01AI 140442 (SRW), VA Merit Review CX001717 (NAC), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. en NAC), Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens (SRW), Laffey-McHugh Foundation (SRW en NAC), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) | Invitrogen | Various | |
| BSA (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Cytotoxicity detection kit | Roche | 11644793001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + calcium + magnesium | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G measurement chamber | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | HyClone | SH30071.03 | |
| FV10-ASW software for imaging | Olympus | Version 4.02 | |
| HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht stain | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli sample buffer (4x) | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 cells | ATCC | CCL-7 | To titrate HCoV-NL63 |
| MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) | BEI Resources | NR-44260 | |
| MERS-CoV nucleocapsid antibody | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC antibody | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 stain | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors) | Roche | PHOSS-RO | |
| Plate reader | Perkin Elmer | HH34000000 | Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm |
| RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) | Thermo Fisher | 89990 | Can prep in-house or purchase |
| RNeasy Plus Kit | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β- tubulin antibody | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 cells | ATCC | CCL-81 | To titrate MERS-CoV |
| VeroE6 cells | ATCC | CRL-1586 | To titrate SARS-CoV-2 |
References
- Otter, C. J., et al. Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120 (2023).
- Fehr, A., Perlman, S. Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis. Methods in Molecular Biology. 1282, 1-23 (2015).
- Gaunt, E. R., Hardie, A., Claas, E. C. J., Simmonds, P., Templeton, K. E. Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2940-2947 (2010).
- Kesheh, M. M., Hosseini, P., Soltani, S., Zandi, M. An overview on the seven pathogenic human coronaviruses. Reviews in Medical Virology. 32 (2), 2282 (2022).
- MERS-CoV Worldwide Overview. European Centre for Disease Prevention and Control. , Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update (2022).
- MERS Situation Update. World Health Organization Regional Office for the Eastern Mediterranean. , Available from: http://www.emro.who.int/health-topics/mers-cov/mers-outbreaks.html (2022).
- Cao, Y., Liu, X., Xiong, L., Cai, K. Imaging and clinical features of patients with 2019 novel coronavirus SARS-CoV-2: A systematic review and meta-analysis. Journal of Medical Virology. 92 (9), 1449-1459 (2020).
- Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses. Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).
- Farzal, Z., et al. Comparative study of simulated nebulized and spray particle deposition in chronic rhinosinusitis patients. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 746-758 (2019).
- Gaeckle, N. T., Pragman, A. A., Pendleton, K. M., Baldomero, A. K., Criner, G. J. The oral-lung axis: The impact of oral health on lung health. Respiratory Care. 65 (8), 1211-1220 (2020).
- Hou, Y., et al. SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract. Cell. 182, 429-446 (2020).
- Hariri, B. M., Cohen, N. A. New insights into upper airway innate immunity. American Journal of Rhinology and Allergy. 30 (5), 319-323 (2016).
- Hiemstra, P. S., McCray, P. B., Bals, R. The innate immune function of airway epithelial cells in inflammatory lung disease. European Respiratory Journal. 45 (4), 1150-1162 (2015).
- Hatton, C. F., et al. Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2. Nature Communications. 12 (1), 7092 (2021).
- Sungnak, W., et al. SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes. Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).
- Li, Y., et al. SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118 (2021).
- Comar, C. E., et al. MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119 (2022).
- Lee, R. J., et al. Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells. Science Signaling. 10 (495), (2017).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Comer, D. M., Elborn, J. S., Ennis, M. Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD. PLoS One. 7 (3), e32924 (2012).
- Vanders, R. L., Hsu, A., Gibson, P. G., Murphy, V. E., Wark, P. A. B. Nasal epithelial cells to assess in vitro immune responses to respiratory virus infection in pregnant women with asthma. Respiratory Research. 20 (1), 259 (2019).
- Lee, R. J., et al. Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function. Scientific Reports. 6, 33221 (2016).
- Patel, N. N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065 (2014).
- Robinot, R., et al. SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance. Nature Communications. 12 (1), 4354 (2021).
- Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).
- Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin. Journal of Cell Science. 135 (16), 259871 (2022).
- Schmidt, H., et al. IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222 (2019).
- Huang, Z. Q., et al. Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749 (2020).
- Saatian, B., et al. Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells. Tissue Barriers. 1 (2), e24333 (2013).
- Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753 (2020).
- Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. Air−liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions. Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111 (2021).
- Seibold, M. A. Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium. Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).
- Morrison, C. B., et al. SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119 (2022).
