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Biology

Monitoraggio dei cambiamenti nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana in seguito a infezione virale utilizzando l'analisi cellulare in tempo reale basata sull'impedenza

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64887
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

L'attuale studio descrive un protocollo per monitorare i cambiamenti nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) durante l'infezione virale utilizzando un sistema di analisi cellulare in tempo reale (RTCA).

Abstract

Le cellule endoteliali rivestono la superficie interna di tutti i vasi sanguigni e linfatici, creando una barriera semipermeabile che regola lo scambio di fluidi e soluti tra il sangue o la linfa e i tessuti circostanti. La capacità di un virus di attraversare la barriera endoteliale è un meccanismo importante che facilita la diffusione del virus nel corpo umano. Molti virus alterano la permeabilità endoteliale e/o causano l'interruzione della barriera cellulare endoteliale durante l'infezione, che è in grado di causare perdite vascolari. L'attuale studio descrive un protocollo di analisi cellulare in tempo reale (RTCA), utilizzando un analizzatore cellulare in tempo reale commerciale per monitorare l'integrità endoteliale e i cambiamenti di permeabilità durante l'infezione da virus Zika (ZIKV) delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). I segnali di impedenza registrati prima e dopo l'infezione da ZIKV sono stati tradotti in valori di indice cellulare (CI) e analizzati. Il protocollo RTCA consente di rilevare effetti transitori sotto forma di cambiamenti morfologici cellulari durante un'infezione virale. Questo saggio potrebbe anche essere utile per studiare i cambiamenti nell'integrità vascolare degli HUVEC in altre configurazioni sperimentali.

Introduction

Le cellule endoteliali (EC) rivestono la superficie interna di tutti i vasi sanguigni e linfatici. Sono collegati da aderenti, giunzioni a fessura stretta, che creano una barriera semipermeabile tra il sangue o la linfa e i tessuti circostanti 1,2. Le giunzioni endoteliali intatte cellula-cellula sono fondamentali per regolare il trasporto di macromolecole, soluti e fluidi, cruciali per le attività fisiologiche dei tessuti e degli organi corrispondenti3. La barriera endoteliale è dinamica e modulata da stimoli specifici4. L'interruzione o la perdita della funzione della barriera endoteliale è un segno distintivo della fisiopatologia della malattia nell'infiammazione acuta e cronica nella patogenesi di molte malattie 5,6,7, inclusa l'infezione virale 8,9,10,11. Per i flavivirus, è stato riscontrato che la proteina non strutturale NS1 può alterare la permeabilità endoteliale, ad esempio, attraverso la rottura dello strato simile al glicocalice endoteliale a seguito dell'aumento dell'espressione e dell'attivazione della catepsina L, delle sialidasi e dell'endoglicosidasi eparinasi9. Nello stato di malattia, l'integrità del monostrato endoteliale è compromessa e le giunzioni cellula-cellula sono interrotte, il che può portare a lesioni e disfunzioni endoteliali12 e, infine, a manifestazioni patologiche diffuse in più sistemi di organi13,14. L'infezione virale delle EC provoca cambiamenti nelle vie di segnalazione cellulare e nel profilo di espressione genica cellulare, che possono influenzare le funzioni di barriera dei fluidi, causare l'interruzione delle EC e indurre perdite vascolari10,15. È stato riscontrato che l'infezione da virus Zika (ZIKV) delle EC interrompe l'integrità giunzionale che causa cambiamenti nella permeabilità vascolare e porta a disfunzione della barriera endoteliale, con conseguente perdita vascolare10,15. Gli studi hanno dimostrato che ZIKV è legato a gravi difetti alla nascita; Tuttavia, non si sa molto sull'esatto meccanismo attraverso il quale ciò avviene16,17. Comprendere i cambiamenti della barriera endoteliale durante un'infezione è quindi fondamentale per comprendere il meccanismo della malattia.

Le EC sono attualmente utilizzate come un importante sistema sperimentale di modelli vascolari in vitro per vari processi fisiologici e patologici 18,19,20,21. Le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) sono state ampiamente utilizzate come sistema cellulare primario e non immortalizzato per studiare l'endotelio vascolare e la biologia vascolare in vitro 22,23,24,25. Gli HUVEC sono stati isolati per la prima volta per la coltura in vitro all'inizio degli anni '70 dalla vena ombelicale del cordone ombelicale umano26. Gli HUVEC hanno una morfologia simile a quella di un ciottolo che viene facilmente fatta proliferare in laboratorio. A causa dello sforzo di taglio dopo essere stato mantenuto per lunghi periodi allo stato confluente, si osserva un allungamento della forma cellulare. Le HUVEC possono essere caratterizzate dalla presenza di corpi di Weibel e Palade (WPB), vescicole pinocitiche, piccole quantità di fibrille situate vicino al nucleo, mitocondri con forme tubolari che raramente mostrano ramificazioni, un nucleo ellissoide con un sottile pattern granulare di cromatina condensata e da uno a tre nucleoli presenti in ciascun nucleo27. Sebbene gli HUVEC mostrino numerose caratteristiche morfologiche, l'identificazione degli HUVEC non può essere ottenuta con il solo esame ottico. I saggi, come la colorazione in immunofluorescenza dell'endotelio vascolare (VE)-caderina, sono comunemente usati per il monitoraggio dell'integrità vascolare negli HUVEC 28,29,30,31.

Questo studio descrive il protocollo di analisi cellulare in tempo reale (RTCA) dell'infezione da HUVEC. Il sistema RTCA utilizza speciali piastre rivestite in oro contenenti microelettrodi che forniscono una superficie conduttiva per l'attacco della cella. Quando le cellule si attaccano alla superficie del microelettrodo, si forma una barriera che impedisce il flusso di elettroni attraverso i microelettrodi. La misurazione dell'impedenza generata dai microelettrodi può essere utilizzata per ottenere informazioni su alcuni processi cellulari, tra cui l'attaccamento cellulare, la proliferazione e la migrazione32. Il test riportato è un test cellulare basato sull'impedenza che, abbinato a un analizzatore cellulare in tempo reale, fornisce una misurazione continua della proliferazione delle cellule vive, dei cambiamenti morfologici (come il restringimento cellulare) e della qualità dell'attacco cellulare in modo non invasivo e privo di marcatura. In questo studio, l'analizzatore cellulare in tempo reale viene utilizzato per monitorare l'integrità endoteliale e i cambiamenti morfologici degli HUVEC durante l'infezione da ZIKV. In breve, lo strumento misura il flusso di elettroni trasmesso in piastre specializzate per microtitolazione rivestite con microelettrodo in oro in presenza di un terreno di coltura (soluzione elettricamente conduttiva). L'aderenza delle cellule o i cambiamenti nel numero e nella morfologia delle cellule disturbano il flusso di elettroni e causano variazioni di impedenza che possono essere catturate dallo strumento (Figura 1 supplementare). La differenza tra la crescita, la proliferazione e l'aderenza di HUVEC prima e dopo l'infezione da ZIKV viene registrata in tempo reale da un segnale di impedenza elettrica e quindi tradotta in valore dell'indice cellulare (CI). Il valore di CI della pre-infezione viene utilizzato come linea di base per la normalizzazione del valore di CI. Le variazioni dei valori di CI riflettono i cambiamenti morfologici cellulari o la perdita di aderenza cellulare in seguito all'infezione33. I risultati dello studio mostrano che il protocollo RTCA consente di rilevare effetti transitori o cambiamenti morfologici cellulari durante l'infezione virale rispetto a un test endpoint, come la colorazione in immunofluorescenza della VE-caderina. Il metodo RTCA potrebbe essere utile per analizzare i cambiamenti dell'integrità vascolare HUVEC in seguito all'infezione da parte di altri virus.

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Protocol

1. Preparazione delle cellule

  1. Preparazione di HUVEC
    1. Coltivare 7,5 x 105 cellule HUVEC/mL in un matraccio di coltura cellulare da 75cm2 (rivestito con 20 μg/mL di collagene di tipo 1) contenente 12 mL di terreno endoteliale (ECM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 0,01% di integratore per la crescita delle cellule endoteliali (ECGS) che contiene fattori di crescita, ormoni e proteine necessari per la coltura di HUVEC, e 0,01% penicillina-streptomicina (P/S). Incubare le cellule in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO2 (Figura 1).

2. Messa a punto dell'esperimento RTCA

  1. Verifica del resistore eseguita su RTCA
    1. Fare doppio clic sull'icona del software RTCA sul desktop per avviare l'applicazione. Apparirà una finestra di accesso, digita il nome utente e la password per accedere.
    2. Posizionare una piastra resistiva RTCA a 96 pozzetti con il pozzetto A1 rivolto verso l'interno nella stazione RTCA situata nell'incubatore per colture cellulari.
    3. Nella scheda Note esperienza del software RTCA, digitare il nome dell'esperimento, il numero di serie del dispositivo e il tipo di dispositivo (piastra QC).
    4. Nella scheda Layout sotto la scheda Cella del software RTCA, evidenziare tutti i pozzetti e fare clic con il pulsante destro del mouse sui pozzetti evidenziati per assicurarsi che tutti i pozzetti siano accesi (disattivati).
    5. Nella scheda Pianificazione del software RTCA, fare clic su Step_1. Immettere Sweep: 10 e Intervallo: 30 s. Fare clic su Applica. Fare clic su Start/Continua nell'angolo in alto a sinistra del software per avviare l'esecuzione della verifica.
      NOTA: Assicurarsi che il collegamento dei pozzetti alla stazione RTCA sia corretto osservando "Scansione su piastra. Connessioni OK" in fondo alla pagina.
  2. Esecuzione di verifica del resistore per l'analisi dei dati
    1. Nella scheda Indice cella controllare i dati al termine dell'esecuzione. Tutti i valori CI devono essere inferiori a 0,063.
    2. Nella parte inferiore della scheda Indice cella , controllare i dati di scansione grezzi. I dati di analisi non elaborati devono presentare modelli di valori ripetuti di 40,0 ± 2,0 (righe A e H), 67,5 ± 2,5 (righe B e G), 93,6 ± 2,9 (righe C e F) e 117,6 ± 3,2 (righe D ed E).
    3. Per interrompere l'esecuzione della verifica, fare clic su Piastra > Piastra di rilascio. La piastra del resistore RTCA a 96 pozzetti è ora pronta per essere rimossa dalla stazione RTCA.
  3. Ottenere la lettura di base su RTCA
    1. Lavare la piastra con microelettrodo in oro specializzato rivestita di collagene di tipo 1 (rivestita con 20 μg/mL di collagene di tipo 1) con 60 μL/pozzetto di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS; con bicarbonato di sodio, senza cloruro di calcio e solfato di magnesio) 2 volte.
    2. Scartare l'HBSS rimanente e aggiungere 50 μL/pozzetto di ECM. Posizionare la piastra specializzata in microelettrodo d'oro contenente ECM con il pozzetto A1 rivolto verso l'interno nella stazione RTCA situata nell'incubatore per colture cellulari.
    3. Nella scheda Note esperienza del software RTCA, digitare il nome dell'esperimento, il numero di serie del dispositivo e il tipo di dispositivo (formato a 96 pozzetti).
    4. Nella scheda Layout sotto la scheda Cella del software RTCA, evidenziare i pozzetti che verranno utilizzati e fare clic con il pulsante destro del mouse sui pozzetti evidenziati per assicurarsi che tutti i pozzetti siano accesi (in grigio).
    5. Nella scheda Pianificazione del software RTCA, fare clic su Step_1 e fare clic su Avvia/Continua nell'angolo in alto a sinistra del software per ottenere una lettura di base.
      NOTA: Assicurarsi che il collegamento dei pozzetti sia corretto osservando "Scansione della piastra. Connessioni OK" in fondo alla pagina.
    6. Una volta ottenuta la lettura di fondo, la piastra specializzata in oro-microelettrodo è ora pronta per la semina cellulare e pronta per essere rimossa dalla stazione RTCA.
  4. Preparazione di HUVEC nella piastra specializzata per microelettrodi in oro
    1. Seminare gli HUVEC nella piastra specializzata del microelettrodo in oro con 50 μL/pozzetto di terreno condizionato, 1 x 104 cellule/pozzetto (terreno condizionato: ECM integrato con 10% di FBS, 0,01% di ECGS e 0,01% di P/S). Riposizionare la piastra nella stazione RTCA con il pozzetto A1 rivolto verso l'interno per l'incubazione notturna in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO2 .
      NOTA: È stato eseguito un conteggio cellulare sulla sospensione cellulare con un fattore di diluizione di due utilizzando un emocitometro.
    2. Nella scheda Pianificazione , fai clic su Aggiungi un passaggio nell'angolo in alto a sinistra. Fare clic su Step_2 e modificare le sweep: 601 e l'intervallo: 2 min. Fare clic su Applica. Fare clic su Step_2 e fare clic su Start/Continua nell'angolo in alto a sinistra del software.
    3. Dopo 20 ore di incubazione e quando i valori di CI nella scheda Grafico pozzetti mostrano un plateau, la piastra è pronta per l'infezione. Nella scheda Pianificazione del software RTCA, fare clic su Interrompi passaggio.
    4. La piastra specializzata in microelettrodo d'oro è ora pronta per essere rimossa dalla stazione RTCA per le fasi successive.

3. Infezione virale negli HUVEC

  1. Diluizione del virus
    1. La coltura del brodo ZIKV viene mantenuta a -80 °C. Per questo studio, rimuovere lo stock di virus conservato nelle fiale criogeniche e diluire lo stock di ZIKV con ECM senza siero in provette da centrifuga da 1,5 mL per ottenere una molteplicità di infezioni (MOI) di 0,1 e 1.
      NOTA: Il brodo ZIKV è stato precedentemente preparato eseguendo la propagazione in cellule Vero e raccogliendo il surnatante ZIKV34.
  2. Infezione del monostrato cellulare
    1. Rimuovere ed eliminare il terreno condizionato (ECM integrato con il 10% di FBS, lo 0,01% di ECGS e lo 0,01% di P/S) da ciascun pozzetto. Risciacquare ogni pozzetto con 60 μL di HBSS 2x. Inserire l'HBSS con l'ausilio del lato del pozzetto; Non sparare al monostrato di celle.
    2. Procedendo dalla diluizione più alta a quella più bassa, aggiungere 40 μL di ciascun campione di virus diluito in ECM senza siero nel pozzetto. Triplicare il pozzetto per ogni diluizione e mantenere sei pozzetti senza infezione (controllo negativo e controllo positivo trombina). Non sparare al monostrato cellulare; Invece, aggiungi il virus diluito con l'aiuto del lato del pozzetto. Utilizzare un puntale di pipetta nuovo per ogni inserimento.
      NOTA: La trombina è stata scelta come controllo positivo in quanto può aumentare rapidamente la permeabilità endoteliale degli HUVEC.
    3. Incubare la piastra in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO2 per consentire l'adsorbimento del virus. Agitare la piastra 5 volte ogni 15 minuti per consentire l'adsorbimento del virus in tutto il monostrato cellulare.
  3. Aggiunta del terreno di coltura cellulare di copertura
    1. Dopo 1 ora di incubazione, rimuovere ed eliminare la sospensione virale dalla concentrazione più bassa a quella più alta.
    2. Lavare le cellule infette con 60 μL di HBSS 2x. Sovrapporre il pozzetto con ECM integrato con FBS al 2%. Per i pozzetti di controllo positivo, diluire la trombina a 20 U/mL con ECM integrata con FBS al 2% e sovrapporre i pozzetti con terreno ECM contenente trombina. Non sparare al monostrato cellulare; Invece, aggiungi il supporto di sovrapposizione con l'aiuto del lato del pozzetto.
  4. Posizionamento della piastra specializzata infetta con microelettrodo d'oro nella stazione RTCA
    1. Nella scheda Pianificazione , fai clic su Aggiungi un passaggio nell'angolo in alto a sinistra. Fare clic su Step_3 e modificare le sweep: 3.601 e l'intervallo: 2 min. Fare clic su Applica.
    2. Fare clic su OK nella finestra pop-up visualizzata. Posizionare la piastra specializzata in microelettrodo d'oro infetto con il pozzetto A1 rivolto verso l'interno nella stazione RTCA situata nell'incubatore per colture cellulari.
    3. Fare clic su Step_3 e fare clic su Start/Continua nell'angolo in alto a sinistra del software.

4. Analisi ed esportazione dei dati

  1. Aggiunta di informazioni sperimentali di ogni pozzo
    1. Nella scheda Layout , fare clic sulla scheda Cella (Figura 2A). Per immettere le informazioni sulla cella di destinazione e determinare il tipo di pozzetto per ciascun pozzetto, evidenziare il pozzetto e digitare il nome, il numero e il colore della cella di destinazione nella parte inferiore del software. Fare clic su Applica (Figura 2B).
    2. Per selezionare e determinare il tipo di pozzetto per ciascun pozzetto nella scheda Cella , evidenziare il pozzetto, selezionare il tipo di pozzetto (campione, controllo positivo o controllo negativo) e fare clic su Imposta.
    3. Nella scheda Layout , fare clic sulla scheda Trattamento (Figura 2C). Per inserire le informazioni sul trattamento, evidenziare il pozzetto e digitare il nome del trattamento, la concentrazione del trattamento, l'unità e il colore. Fare clic su Applica (Figura 2D).
    4. Per selezionare e determinare il tipo di pozzetto per ciascun pozzetto nella scheda Trattamento , evidenziare il pozzetto, selezionare il tipo di pozzetto (campione, controllo positivo o controllo negativo) e fare clic su Imposta.
      NOTA: Per ogni selezione, è possibile evidenziare più pozzetti contemporaneamente.
  2. Normalizzazione del valore CI
    1. Fare clic con il pulsante destro del mouse a destra della scheda Analisi dati e selezionare Indice cella normalizzato dalla casella a discesa Asse Y (Figura 3A). Nella sezione Asse X in basso, selezionare il tempo normalizzato come ultimo punto temporale misurato in cui la piastra del microelettrodo d'oro specializzato è stata rimossa per l'infezione (Figura 3B).
      NOTA: Il processo di normalizzazione effettuato dal software rimuove la maggior parte della variabilità dovuta alle differenze di semina e attaccamento del pozzo, purché il punto di normalizzazione scelto sia prima dell'aggiunta del virus e/o del trattamento. Pertanto, il punto temporale di normalizzazione ottimale dovrebbe essere l'ultimo punto temporale prima dell'aggiunta del virus e/o del trattamento. Il punto temporale da normalizzare può essere controllato nella scheda Pianificazione in Step_2. Il tempo totale indicato è il punto di tempo per la normalizzazione (Figura 3C).
  3. Rappresentazione grafica dei dati ottenuti con il software RTCA
    1. Nella scheda Analisi dati , selezionare i pozzetti da aggiungere al grafico evidenziando i pozzetti e facendo clic << Aggiungi. L'indice di cella normalizzato rispetto al grafico temporale è ora pronto per essere copiato ed esportato. Assicurati di selezionare la casella di controllo Media .
  4. Esportazione dei dati con il software RTCA
    1. Nell'angolo in alto a sinistra del software RTCA, fare clic su Piastra > Esporta informazioni sull'esperimento.... Selezionare la casella per selezionare i dati da esportare. Fare clic su OK.
      NOTA: i dati grezzi (valori CI grezzi) possono essere esportati quando l'opzione Indice cella > Tutto è selezionata.
    2. Selezionare la cartella in cui salvare il file di esportazione. Fare clic su SALVA. Apparirà una finestra pop-up che indica l'esportazione delle informazioni sperimentali. Una volta terminata l'esportazione, verrà visualizzata un'altra finestra che indica che le informazioni dell'esperimento esportate sono pronte per essere visualizzate.

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Representative Results

Prima dell'infezione da ZIKV, l'IC registrato per il monostrato HUVEC coltivato su una piastra microtitolante rivestita con microelettrodo in oro era superiore a 8, suggerendo forti proprietà di aderenza. Le piastre o i pozzetti con un indice CI inferiore a 8 devono essere scartati. Gli HUVEC sono stati quindi infettati con ZIKV a un MOI di 0,1 e 1 e l'impedenza cellulare è stata registrata per 7 giorni. Il valore di CI degli HUVEC infettati con ZIKV P6-740 a un MOI di 0,1 (linea azzurra) ha iniziato a scendere a 15 ore dopo l'infezione (HPI), rispetto al controllo negativo dell'infezione (linea marrone; Figura 4). Per quanto riguarda gli HUVEC infettati con una dose più elevata di ZIKV P6-740 a un MOI di 1 (linea blu), il valore dell'IC ha iniziato a scendere già a 11 HPI. A 24 HPI, c'è stato un calo del 5% e del 7% del valore di IC normalizzato (0,949, 0,929) quando gli EC sono stati infettati da ZIKV a un MOI di 0,1 e 1, rispettivamente. Una riduzione del 50% del valore dell'IC normalizzato è stata registrata a 96 HPI e a 66,75 HPI dopo l'infezione da ZIKV con un MOI di 0,1 e 1, rispettivamente. Il valore di CI normalizzato ha raggiunto il suo punto più basso a 107 HPI, dove c'è stata una riduzione del 51% e del 60% (0,4915, 0,3984) dopo l'infezione da ZIKV con un MOI di 0,1 e 1, rispettivamente. Il valore di IC normalizzato è risultato avere un aumento del 4% e del 13% da 107 HPI in poi fino alla fine dell'esperimento a 168 HPI (0,5128, 0,4571). La linea nera mostra gli effetti della trombina utilizzata come controllo positivo, in cui i valori di IC sono rimasti bassi per tutta la durata dell'esperimento, imitando l'interruzione delle giunzioni strette e la perdita vascolare indotta35.

Figure 1
Figura 1: Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). La figura è ingrandita 40x per visualizzare il tasso di confluenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Screenshot della scheda Cell and Treatment (Cella e trattamento) nella scheda Layout del software RTCA. (A) Nella scheda Layout , fare clic sulla scheda Cella . (B) Per immettere le informazioni sulla cella di destinazione e determinare il tipo di pozzetto per ciascun pozzetto, evidenziare il pozzetto e digitare il nome, il numero e il colore della cella di destinazione nella parte inferiore del software. Fare clic su Applica. (C) Fare clic sulla scheda Layout nella scheda Trattamento . (D) Per inserire le informazioni sul trattamento, evidenziare il pozzetto e digitare il nome del trattamento, la concentrazione del trattamento, l'unità e il colore. Fare clic su Applica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Screenshot della scheda Analisi dati nel software RTCA per la normalizzazione dell'indice delle celle. (A) Nella casella a discesa Asse Y , selezionare Indice cella normalizzato. (B) Nella sezione Asse X , selezionare il tempo di normalizzazione. (C) Screenshot della scheda Schedule nel software RTCA. Il tempo di normalizzazione è indicato al tempo totale Step_2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Indice cellulare normalizzato in funzione del grafico temporale dell'infezione da virus Zika (ZIKV) nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). La piastra specializzata in microelettrodo d'oro è stata rivestita con 20 μg/mL di collagene di tipo 1. Gli HUVEC sono stati seminati con una densità di 1,0 x 104 cellule/pozzetto. ZIKV P6-740 (MOI: 0.1, 1) è stato utilizzato per l'infezione. Azzurro: ZIKV P6-740 (MOI: 0.1); blu: ZIKV P6-740 (MOI: 1); nero: trombina come controllo positivo (20 U/mL); Marrone: controllo negativo dell'infezione. Ogni punto dati indica la media ed è stato analizzato in triplice copia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare: Disegno schematico della tecnica utilizzata nell'RTCA basato sull'impedenza del biosensore elettrico. Una vista laterale della piastra del pozzetto; Sul fondo dei pozzi ci sono terminali negativi e positivi placcati in oro. Poiché lo strumento misura l'IC nel micropozzetto che contiene terreni di coltura che consentono di condurre l'elettricità, l'elettrone fluisce dal terminale negativo a quello positivo. Quando si tratta di un controllo in bianco, il flusso di elettroni è regolare, quindi non viene registrata alcuna impedenza. Quando le cellule vengono seminate e man mano che sempre più cellule si attaccano al fondo del pozzo, l'impedenza nel flusso di elettroni è presente e registrata dal computer. Utilizzando questo valore di impedenza, lo strumento lo converte in un valore CI, indicando il numero di celle attaccate al fondo del pozzetto (adesione). Creato con BioRender. Fare clic qui per scaricare il file.

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Discussion

L'infezione virale citocida nelle cellule permissive è solitamente associata a cambiamenti sostanziali nella morfologia e nella biosintesi cellulare36. I cambiamenti morfologici cellulari indotti dal virus, come il restringimento cellulare, l'allargamento cellulare e/o la formazione di sincizi, sono anche noti come effetti citopatici (CPE), caratteristici di alcune infezioni virali37. Nelle EC, la CPE è stata descritta come la distruzione delle cellule e la rottura delle giunzioni strette tra ciascuna EC, causando così la rottura della barriera endoteliale38,39. I CPE negli HUVEC possono essere descritti come distacco cellulare monostrato e galleggiamento dal recipiente di coltura tissutale. I cambiamenti morfologici delle cellule infette, come il distacco e il galleggiamento delle cellule aderenti, possono essere rilevati in modo continuo utilizzando il metodo RTCA. Questa tecnica si basa sull'impedenza elettrica, che consente il monitoraggio delle celle in tempo reale fino a pochi secondi. Consente di quantificare la proliferazione cellulare, i cambiamenti morfologici e, nel caso degli HUVEC, può essere utilizzato per monitorare i cambiamenti nell'integrità endoteliale e nella funzione di barriera cellulare40 dopo stimolazione.

In questo studio, il passaggio critico è l'impostazione dell'esperimento, in cui viene utilizzata la piastra resistiva a 96 pozzetti. Questo per garantire che tutte le connessioni dell'analizzatore siano ben collegate alla piastra. In RTCA, il valore di impedenza misurato viene convertito in un valore CI per differenziare le differenze nel numero di cellule, nel grado di adesione, nella morfologia cellulare e nella vitalità cellulare41. Il calo dell'impedenza registrata dall'analizzatore RTCA, che si traduce in un calo del valore CI, suggerisce un numero di cellule ridotto, un grado di adesione più debole e cambiamenti sostanziali nella morfologia cellulare42. Pertanto, è anche importante testare l'idoneità delle linee cellulari e il numero di cellule ottimali da utilizzare nell'esperimento RTCA. È fondamentale determinare se l'indice CI desiderato può essere raggiunto prima dell'esecuzione del test sulle celle utilizzando il sistema RTCA. Inoltre, questo aiuta anche a determinare se il sistema RTCA è adatto a monitorare la crescita cellulare e i profili di morte cellulare di tipi cellulari selezionati. Nel nostro studio, è stato osservato un forte calo dei valori di CI quando gli HUVEC sono stati infettati con ZIKV P6-740 a MOI di 0,1 e 1. Il forte calo del valore di IC, suggerendo quindi che i cambiamenti morfologici cellulari di HUVEC si sono verificati in seguito all'infezione, e questo ha portato alla rottura delle giunzioni strette e dell'integrità vascolare dell'EC.

Convenzionalmente, le CPE causate dall'infezione virale delle cellule in vitro sono stimate sulla base dell'osservazione microscopica delle cellule infette. Inoltre, alcuni altri saggi, come il test della placca, consentono la visualizzazione dei CPE (come il distacco cellulare) e vengono utilizzati per misurare l'estensione dei CPE42. Tuttavia, questi metodi hanno dei limiti in quanto forniscono solo informazioni su punti temporali discreti dei cambiamenti morfologici cellulari (saggi endpoint). Altri saggi, come la colorazione in immunofluorescenza, si basano su combinazioni di anticorpi specifici marcati con un fluoroforo per visualizzare i cambiamenti morfologici43. Sebbene il test di immunofluorescenza abbia un'ampia capacità che consente la visualizzazione di molti componenti in un dato tessuto o tipo di cellula, questa tecnica non consente il monitoraggio e il rilevamento in tempo reale durante l'infezione virale. Al contrario, il sistema RTCA registra i cambiamenti morfologici delle cellule in tempo reale durante l'infezione virale, consentendo la cattura di effetti transitori, come la perdita vascolare transitoria, che potrebbero non essere rilevati dai saggi endpoint. Ad esempio, i test endpoint non riuscirebbero a rilevare i dati e i cambiamenti morfologici già a 60 HPI, 80 HPI e 100 HPI. Oltre all'RTCA, la misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) è un altro metodo comunemente usato per monitorare le interazioni cellula-cellula, in cui viene misurata la resistenza elettrica attraverso il monostrato cellulare. Tuttavia, il TEER richiede diverse misurazioni ripetute nel tempo per monitorare le attività delle cellule vive e viene spesso eseguito su un numero minore di campioni o pozzetti alla volta. Di conseguenza, TEER ha in genere una produttività inferiore rispetto a RTCA, che può eseguire fino a 96 pozzi contemporaneamente44.

Nonostante i suoi vantaggi, il sistema RTCA presenta diverse limitazioni. Il limite principale del sistema RTCA sono le costose attrezzature e materiali di consumo. Le piastre specializzate per microelettrodi in oro utilizzate dal sistema RTCA sono relativamente costose, monouso e monouso45. Inoltre, i cambiamenti morfologici cellulari non possono essere visualizzati e catturati su un registratore (telecamera), né il test può catturare l'accumulo dell'antigene virale o i cambiamenti nella proteina della superficie cellulare, come la VE-caderina negli HUVEC46. Di conseguenza, l'RTCA non è in grado di visualizzare i cambiamenti morfologici cellulari che fornirebbero ulteriori informazioni utili per chiarire la patogenesi della malattia. Durante il test o la creazione del modello, un'ulteriore verifica della colorazione, come la colorazione VE-caderina per gli HUVEC, sarebbe utile per convalidare le misurazioni ottenute. Inoltre, il sistema RTCA è limitato alle linee cellulari aderenti, in quanto richiede l'attacco di cellule sul fondo dei pozzetti per la registrazione dell'impedenza. Pertanto, il test riportato non può essere utilizzato per linee cellulari non aderenti46.

In conclusione, abbiamo descritto un protocollo di analisi cellulare in tempo reale utilizzando lo strumento RTCA per monitorare i cambiamenti nelle cellule endoteliali dopo l'infezione da ZIKV in formato a 96 pozzetti. Questo metodo offre diversi vantaggi rispetto ai saggi convenzionali di endpoint, in quanto consente un approccio non invasivo e non intensivo per il monitoraggio continuo dei cambiamenti morfologici cellulari in tempo reale. Questo test può essere utilizzato anche per analizzare i cambiamenti di integrità vascolare di altre linee cellulari in diverse configurazioni sperimentali.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Acknowledgments

Questa ricerca ha ricevuto il sostegno del Ministero dell'Istruzione Superiore della Malesia nell'ambito del programma Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019) e il finanziamento nell'ambito del Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
Antibiotic solution penicillin-streptomycin (P/S) Sciencell 0503
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
Collagen Type 1 SIgma-Aldrich C3867
Endothelial cell growth supplement (ECGS) Sciencell 1052
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
E-plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232368001
Fetal bovine serum (FBS) Sciencell 0025
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich H9394
Hemocytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) Sciencell 8000
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Latitude 3520 Laptop Dell  -
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Reagent reservior Tarsons T38-524090
RTCA resistor plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232350001
RTCA Software Pro (Version 2.6.1) Agilent Technologies, Inc. 5454433001
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380) Agilent Technologies, Inc. 00380601030 https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232

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Biologia Numero 195 Cellule endoteliali della vena ombelicale umana Infezione virale Basato sull'impedenza Analisi cellulare in tempo reale Cellule endoteliali Barriera Scambio di fluidi Scambio di soluti Disseminazione del virus Permeabilità endoteliale Interruzione della barriera cellulare endoteliale Perdita vascolare Analizzatore cellulare in tempo reale Infezione da virus Zika (ZIKV) Indice cellulare (CI) Effetti transitori Cambiamenti morfologici cellulari Integrità vascolare
Monitoraggio dei cambiamenti nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana in seguito a infezione virale utilizzando l'analisi cellulare in tempo reale basata sull'impedenza
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