Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Monitoring van veranderingen in endotheelcellen van de menselijke navelstrengader bij virale infectie met behulp van op impedantie gebaseerde real-time celanalyse

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64887
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

De huidige studie beschrijft een protocol om de veranderingen in endotheelcellen van de menselijke navelstrengader (HUVEC's) tijdens virale infectie te volgen met behulp van een real-time celanalysesysteem (RTCA).

Abstract

Endotheelcellen bekleden het binnenoppervlak van alle bloed- en lymfevaten en creëren een semi-permeabele barrière die de uitwisseling van vocht en opgeloste stoffen tussen bloed of lymfe en de omliggende weefsels reguleert. Het vermogen van een virus om de endotheelbarrière te passeren is een belangrijk mechanisme dat de verspreiding van virussen in het menselijk lichaam vergemakkelijkt. Van veel virussen wordt gemeld dat ze de permeabiliteit van het endotheel veranderen en/of verstoring van de barrière van endotheelcellen veroorzaken tijdens infectie, wat vasculaire lekkage kan veroorzaken. De huidige studie beschrijft een real-time celanalyse (RTCA) -protocol, waarbij gebruik wordt gemaakt van een commerciële real-time celanalysator om de endotheelintegriteit en permeabiliteitsveranderingen te bewaken tijdens Zika-virus (ZIKV)-infectie van de endotheelcellen van de menselijke navelstrengader (HUVEC's). De impedantiesignalen die voor en na ZIKV-infectie werden geregistreerd, werden vertaald naar celindexwaarden (CI) en geanalyseerd. Het RTCA-protocol maakt de detectie mogelijk van voorbijgaande effecten in de vorm van celmorfologische veranderingen tijdens een virale infectie. Deze test zou ook nuttig kunnen zijn voor het bestuderen van veranderingen in de vasculaire integriteit van HUVEC's in andere experimentele opstellingen.

Introduction

Endotheelcellen (EC's) bekleden het binnenoppervlak van alle bloed- en lymfevaten. Ze zijn verbonden door adherens, tight gap junctions, waardoor een semi-permeabele barrière ontstaat tussen bloed of lymfe en de omliggende weefsels 1,2. De intacte endotheelcel-celverbindingen zijn van cruciaal belang voor het reguleren van het transport van macromoleculen, opgeloste stoffen en vloeistoffen, cruciaal voor de fysiologische activiteiten van de overeenkomstige weefsels en organen. De endotheelbarrière is dynamisch en wordt gemoduleerd door specifieke stimuli4. Verstoring of verlies van de endotheliale barrièrefunctie is een kenmerk van de pathofysiologie van de ziekte bij acute en chronische ontsteking in de pathogenese van vele ziekten 5,6,7, waaronder virale infectie 8,9,10,11. Voor flavivirussen werd gevonden dat het niet-structurele eiwit NS1 de endotheliale permeabiliteit kan veranderen, bijvoorbeeld via verstoring van de endotheliale glycocalyx-achtige laag als gevolg van verhoogde expressie en activering van cathepsine L, sialidasen en endoglycosidase heparinase9. In de ziektetoestand wordt de integriteit van de endotheliale monolaag aangetast en worden cel-celverbindingen verstoord, wat kan leiden tot endotheelletsel en disfunctie12 en uiteindelijk wijdverspreide pathologische manifestaties in meerdere orgaansystemen 13,14. Virale infectie van EC's resulteert in veranderingen in de celsignaleringsroutes en het cellulaire genexpressieprofiel, wat de vloeistofbarrièrefuncties kan beïnvloeden, verstoring van de EC's kan veroorzaken en vasculaire lekkage kan veroorzaken10,15. Het is gebleken dat infectie met het Zika-virus (ZIKV) van EC's de junctie-integriteit verstoort die veranderingen in de vasculaire permeabiliteit veroorzaakt en leidt tot disfunctie van de endotheelbarrière, wat resulteert in vasculaire lekkage10,15. Studies hebben aangetoond dat ZIKV verband houdt met ernstige geboorteafwijkingen; Er is echter niet veel bekend over het exacte mechanisme waarmee dit gebeurt16,17. Het begrijpen van veranderingen in de endotheliale barrière tijdens een infectie is daarom van cruciaal belang om het ziektemechanisme te begrijpen.

EC's worden momenteel gebruikt als een belangrijk experimenteel in vitro vasculair modelsysteem voor verschillende fysiologische en pathologische processen 18,19,20,21. Menselijke endotheelcellen van de navelstrengader (HUVEC's) zijn op grote schaal gebruikt als een primair, niet-onsterfelijk celsysteem om het vasculaire endotheel en de vasculaire biologie in vitro te bestuderen 22,23,24,25. HUVEC's werden voor het eerst geïsoleerd voor in-vitrokweek in de vroege jaren 1970 uit de navelstrengader van de menselijke navelstreng26. HUVEC's hebben een geplaveide morfologie die gemakkelijk in het laboratorium kan worden verspreid. Als gevolg van schuifspanning na lange perioden in confluente toestand te zijn gehouden, wordt verlenging van de celvorm waargenomen. HUVEC's kunnen worden gekenmerkt door de aanwezigheid van Weibel- en Palade-lichamen (WPB), pinocytische blaasjes, kleine hoeveelheden fibrillen in de buurt van de kern, mitochondriën met buisvormige vormen die zelden vertakkingen vertonen, een ellipsoïde kern met een fijn korrelig patroon van gecondenseerd chromatine en één tot drie nucleoli aanwezig in elke kern27. Hoewel HUVEC's talrijke morfologische kenmerken vertonen, kan de identificatie van HUVEC's niet worden bereikt door alleen optisch onderzoek. Assays, zoals immunofluorescentiekleuring van vasculaire endotheliale (VE)-cadherine, worden vaak gebruikt voor de monitoring van vasculaire integriteit in HUVEC's 28,29,30,31.

Deze studie beschrijft het real-time celanalyse (RTCA) protocol van de infectie van HUVEC's. Het RTCA-systeem maakt gebruik van gespecialiseerde met goud beklede platen met micro-elektroden die een geleidend oppervlak bieden voor de celbevestiging. Wanneer de cellen zich hechten aan het oppervlak van de micro-elektrode, wordt een barrière gevormd die de elektronenstroom door de micro-elektroden belemmert. Meting van de impedantie die wordt gegenereerd door micro-elektroden kan worden gebruikt om informatie te verkrijgen over sommige cellulaire processen, waaronder celaanhechtingen, proliferatie en migratie32. De gerapporteerde test is een op impedantie gebaseerde cellulaire test die, in combinatie met een real-time celanalysator, continue meting biedt van de proliferatie van levende cellen, morfologische veranderingen (zoals celkrimp) en celhechtingskwaliteit op een niet-invasieve en labelvrije manier. In deze studie wordt de real-time celanalysator gebruikt om de endotheelintegriteit en morfologische veranderingen van HUVEC's tijdens ZIKV-infectie te monitoren. In het kort meet het instrument de elektronenstroom die wordt overgebracht in gespecialiseerde met goud met micro-elektroden gecoate microtiterplaten in aanwezigheid van een kweekmedium (elektrisch geleidende oplossing). Celhechting of veranderingen in het aantal cellen en de morfologie verstoren de elektronenstroom en veroorzaken impedantievariaties die door het instrument kunnen worden opgevangen (aanvullende figuur 1). Het verschil tussen HUVEC-groei, proliferatie en therapietrouw voor en na ZIKV-infectie wordt in realtime geregistreerd door een elektrisch impedantiesignaal en vervolgens vertaald naar celindex (CI)-waarde. De CI-waarde van de pre-infectie wordt gebruikt als basislijn voor normalisatie van de CI-waarde. De veranderingen in CI-waarden weerspiegelen cellulaire morfologische veranderingen of verlies van celhechting bij de infectie33. De onderzoeksresultaten tonen aan dat het RTCA-protocol de detectie van voorbijgaande effecten of celmorfologische veranderingen tijdens virale infectie mogelijk maakt in vergelijking met een eindpunttest, zoals immunofluorescentiekleuring van VE-cadherine. De RTCA-methode zou nuttig kunnen zijn voor het analyseren van de veranderingen in de vasculaire integriteit van HUVEC bij infectie door andere virussen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van de cel

  1. Voorbereiding van HUVEC's
    1. Kweek 7,5 x 105 HUVEC-cellen/ml in een celkweekkolf van 75 cm2 (gecoat met 20 μg/ml collageen type 1) met 12 ml endotheelcelmedium (ECM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 0,01% endotheelcelgroeisupplement (ECGS) dat groeifactoren, hormonen en eiwitten bevat die nodig zijn voor de kweek van HUVEC's, en 0,01% penicilline-streptomycine (P/S). Incubeer de cellen in een celkweekincubator bij 37 °C met 5% CO2 (figuur 1).

2. Opzet van het RTCA-experiment

  1. Weerstandsverificatie uitgevoerd op RTCA
    1. Dubbelklik op het RTCA-softwarepictogram op het bureaublad om de applicatie te starten. Er verschijnt een inlogvenster, typ de gebruikersnaam en het wachtwoord in om in te loggen.
    2. Plaats een RTCA-weerstandsplaat met 96 putjes met de A1-put naar binnen gericht in het RTCA-station in de celkweekincubator.
    3. Typ op het tabblad Exp-notities van de RTCA-software de naam van het experiment, de SN van het apparaat en het apparaattype (QC-plaat).
    4. Markeer op het tabblad Lay-out onder het tabblad Cel van de RTCA-software alle putten en klik met de rechtermuisknop op de gemarkeerde putten om ervoor te zorgen dat alle putten zijn ingeschakeld (grijs).
    5. Klik op het tabblad Schema van de RTCA-software op Step_1. Voer sweeps in: 10 en interval: 30 s. Klik op Toepassen. Klik op Start/Doorgaan in de linkerbovenhoek van de software om de verificatierun te starten.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de aansluiting van de putten op het RTCA-station in orde is door te kijken naar "Plate Scanned. Aansluitingen OK" onderaan de pagina.
  2. Weerstandsverificatie uitgevoerd voor gegevensanalyse
    1. Controleer op het tabblad Celindex de gegevens na voltooiing van de uitvoering. Alle CI-waarden moeten lager zijn dan 0,063.
    2. Controleer in het onderste gedeelte van het tabblad Celindex de onbewerkte scangegevens. De onbewerkte scangegevens moeten herhaalde waardepatronen vertonen van 40,0 ± 2,0 (rijen A en H), 67,5 ± 2,5 (rijen B en G), 93,6 ± 2,9 (rijen C en F) en 117,6 ± 3,2 (rijen D en E).
    3. Als u de verificatierun wilt stoppen, klikt u op Plate > Release Plate. De RTCA-weerstandsplaat met 96 putjes is nu klaar om van het RTCA-station te worden verwijderd.
  3. Achtergrondinformatie verkrijgen over RTCA
    1. Was de collageen type 1 gecoate gespecialiseerde goud-micro-elektrodeplaat (gecoat met 20 μg/ml collageen type 1) met 60 μL/putje van Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS; met natriumbicarbonaat, zonder calciumchloride en magnesiumsulfaat) 2x.
    2. Gooi de resterende HBSS weg en voeg 50 μL/putje ECM toe. Plaats de gespecialiseerde gouden micro-elektrodeplaat met ECM met de A1-put naar binnen gericht in het RTCA-station in de celkweekincubator.
    3. Typ op het tabblad Exp Notes van de RTCA-software de naam van het experiment, de SN van het apparaat en het apparaattype (indeling met 96 putjes).
    4. Markeer op het tabblad Lay-out onder het tabblad Cel van de RTCA-software de putten die zullen worden gebruikt en klik met de rechtermuisknop op de gemarkeerde putten om ervoor te zorgen dat alle putten zijn ingeschakeld (grijs).
    5. Klik op het tabblad Schema van de RTCA-software op Step_1 en klik op Start/Doorgaan in de linkerbovenhoek van de software om een achtergrondinformatie te verkrijgen.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de aansluiting van de putten correct is door te kijken naar "Plate Scanned. Aansluitingen OK" onderaan de pagina.
    6. Zodra de achtergrondmeting is verkregen, is de gespecialiseerde gouden micro-elektrodeplaat nu klaar voor celzaaien en klaar om te worden verwijderd uit het RTCA-station.
  4. HUVEC-bereiding in de gespecialiseerde goud-micro-elektrodeplaat
    1. Zaai de HUVEC's in de gespecialiseerde goud-micro-elektrodeplaat met 50 μL/putje geconditioneerd medium, 1 x 104 cellen/putje (geconditioneerd medium: ECM aangevuld met 10% FBS, 0,01% ECGS en 0,01% P/S). Plaats de plaat terug in het RTCA-station met de A1-put naar binnen gericht voor een nachtelijke incubatie in een celkweekincubator bij 37 °C met 5% CO2.
      OPMERKING: Er werd een celtelling uitgevoerd op de celsuspensie met een verdunningsfactor van twee met behulp van een hemocytometer.
    2. Klik op het tabblad Planning op Een stap toevoegen in de linkerbovenhoek. Klik op Step_2 en wijzig de Sweeps: 601 en Interval: 2 min. Klik op Toepassen. Klik op Step_2 en klik op Start/Doorgaan in de linkerbovenhoek van de software.
    3. Na 20 uur incubatie en wanneer de CI-waarden in het tabblad Well Graph een plateau laten zien, is de plaat klaar voor infectie. Klik op het tabblad Schema van de RTCA-software op Stap afbreken.
    4. De gespecialiseerde gouden micro-elektrodeplaat is nu klaar om uit het RTCA-station te worden verwijderd voor verdere stappen.

3. Virale infectie bij HUVEC's

  1. Verdunning van het virus
    1. De ZIKV-stamcultuur wordt op -80 °C gehouden. Verwijder voor dit onderzoek de virusvoorraad die in de cryogene injectieflacons wordt bewaard en verdun de ZIKV-voorraad met serumvrije ECM in centrifugebuisjes van 1,5 ml om een multipliciteit van infecties (MOI's) van 0,1 en 1 te bereiken.
      OPMERKING: De ZIKV-voorraad werd eerder bereid door vermeerdering uit te voeren in Vero-cellen en het ZIKV-supernatans34 te oogsten.
  2. Infectie van de celmonolaag
    1. Verwijder het geconditioneerde medium (ECM aangevuld met 10% FBS, 0,01% ECGS en 0,01% P/S) uit elk putje en gooi het weg. Spoel elk putje 2x met 60 μL HBSS. Plaats de HBSS met behulp van de zijkant van het putje; Schiet niet op de monolaag van de cel.
    2. Werk van de hoogste naar de laagste verdunning en voeg 40 μL van elk verdund virusmonster in serumvrije ECM toe aan het putje. Verdrievoudig het putje voor elke verdunning en behoud zes putjes zonder infectie (negatieve controle en positieve controle trombine). Schiet niet op de monolaag van de cel; Voeg in plaats daarvan het verdunde virus toe met behulp van de zijkant van het putje. Gebruik voor elke inbrenging een nieuwe pipetpunt.
      OPMERKING: Trombine werd gekozen als positieve controle omdat het de endotheelpermeabiliteit van HUVEC's snel kan verhogen.
    3. Incubeer de plaat in een celkweekincubator bij 37 °C met 5% CO2 om virusadsorptie mogelijk te maken. Draai de plaat 5x per 15 minuten om virusadsorptie door de monolaag van de cel mogelijk te maken.
  3. Toevoeging van het overlay celkweekmedium
    1. Verwijder na 1 uur incubatie de virussuspensie van de laagste concentratie naar de hoogste concentratie en gooi deze weg.
    2. Was de geïnfecteerde cellen met 60 μL HBSS 2x. Bedek het putje met ECM aangevuld met 2% FBS. Verdun voor de positieve controleputjes de trombine tot 20 E/ml met ECM aangevuld met 2% FBS en bedek de putjes met trombinehoudend ECM-medium. Schiet niet op de monolaag van de cel; Voeg in plaats daarvan overlay-media toe met behulp van de zijkant van de put.
  4. Plaatsing van de geïnfecteerde gespecialiseerde goud-micro-elektrodeplaat terug in het RTCA-station
    1. Klik op het tabblad Planning op Een stap toevoegen in de linkerbovenhoek. Klik op Step_3 en wijzig de Sweeps: 3.601 en Interval: 2 min. Klik op Toepassen.
    2. Klik op OK in het pop-upvenster dat verschijnt. Plaats de geïnfecteerde gespecialiseerde gouden micro-elektrodeplaat met de A1-put naar binnen gericht in het RTCA-station in de celkweekincubator.
    3. Klik op Step_3 en klik op Start/Doorgaan in de linkerbovenhoek van de software.

4. Data-analyse en data-export

  1. Toevoeging van experimentele informatie van elk putje
    1. Klik op het tabblad Lay-out op het tabblad Cel (Figuur 2A). Om de informatie over de doelcel in te voeren en het puttype voor elk putje te bepalen, markeert u het putje en typt u de naam, het nummer en de kleur van de doelcel onder aan de software. Klik op Toepassen (Afbeelding 2B).
    2. Als u het puttype voor elk putje op het tabblad Cel wilt selecteren en bepalen, markeert u het putje , selecteert u het puttype (monster, positieve controle of negatieve controle) en klikt u op Instellen.
    3. Klik in het tabblad Lay-out op het tabblad Behandeling (Figuur 2C). Om behandelingsinformatie in te voeren, markeert u het putje en typt u de naam van de behandeling, de concentratie van de behandeling, de eenheid en de kleur in. Klik op Toepassen (Afbeelding 2D).
    4. Als u het puttype voor elk putje op het tabblad Behandeling wilt selecteren en bepalen, markeert u het putje, selecteert u het puttype (monster, positieve controle of negatieve controle) en klikt u op Instellen.
      OPMERKING: Voor elke selectie kunnen meerdere putjes tegelijkertijd worden gemarkeerd.
  2. Normalisatie van CI-waarde
    1. Klik met de rechtermuisknop op het tabblad Gegevensanalyse en selecteer Genormaliseerde celindex in de vervolgkeuzelijst Y-as (Afbeelding 3A). Selecteer in het gedeelte X-as onderaan de genormaliseerde tijd als het laatst gemeten tijdstip waarop de gespecialiseerde gouden micro-elektrodeplaat is verwijderd voor infectie (Figuur 3B).
      OPMERKING: Het normalisatieproces dat door de software wordt uitgevoerd, verwijdert het grootste deel van de variabiliteit als gevolg van de verschillen in putzaaiing en aanhechting, zolang het gekozen normalisatiepunt vóór de toevoeging van het virus en/of de behandeling ligt. Daarom moet het optimale normalisatietijdstip het laatste tijdstip zijn vóór toevoeging van het virus en/of de behandeling. Het tijdstip waarop moet worden genormaliseerd, kan worden gecontroleerd op het tabblad Planning onder Step_2. De totale aangegeven tijd is het tijdstip waarop moet worden genormaliseerd (Figuur 3C).
  3. Verkregen gegevens plotten met behulp van RTCA-software
    1. Selecteer op het tabblad Gegevensanalyse de putten die aan de grafiek moeten worden toegevoegd door de putten te markeren en op << Toevoegen te klikken. De genormaliseerde celindex ten opzichte van de tijdgrafiek is nu klaar om te worden gekopieerd en geëxporteerd. Zorg ervoor dat u het selectievakje Gemiddeld aanvinkt.
  4. Gegevens exporteren met RTCA-software
    1. Klik in de linkerbovenhoek van de RTCA-software op Plate > Export Experiment Info.... Vink het vakje aan om de gegevens te selecteren die u wilt exporteren. Klik op OK.
      OPMERKING: Onbewerkte gegevens (onbewerkte CI-waarden) kunnen worden geëxporteerd wanneer Celindex > Alles is aangevinkt.
    2. Selecteer de map om het exportbestand op te slaan. Klik op OPSLAAN. Er verschijnt een pop-upvenster dat het exporteren van experimentele informatie aangeeft. Zodra het exporteren is voltooid, verschijnt er een ander venster dat aangeeft dat de geëxporteerde experimentinformatie klaar is om te worden bekeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vóór de ZIKV-infectie was de CI die werd geregistreerd voor de HUVEC-monolaag gekweekt op een gespecialiseerde met goud met micro-elektrode gecoate microtiterplaat hoger dan 8, wat wijst op sterke hechtingseigenschappen. Platen of putjes met een CI-index van minder dan 8 moeten worden weggegooid. De HUVEC's werden vervolgens geïnfecteerd met ZIKV met een MOI van 0,1 en 1, en de celimpedantie werd gedurende 7 dagen geregistreerd. De CI-waarde van HUVEC's geïnfecteerd met ZIKV P6-740 bij een MOI van 0,1 (lichtblauwe lijn) begon 15 uur na infectie (HPI) te dalen, vergeleken met de negatieve infectiecontrole (bruine lijn; Figuur 4). Wat betreft HUVEC's die zijn geïnfecteerd met een hogere dosis ZIKV P6-740 bij een MOI van 1 (blauwe lijn), begon de CI-waarde al te dalen bij 11 HPI. Bij 24 HPI was er een daling van 5% en 7% in de genormaliseerde CI-waarde (0,949, 0,929) wanneer EC's werden geïnfecteerd met ZIKV met een MOI van respectievelijk 0,1 en 1. Een vermindering van 50% van de genormaliseerde CI-waarde werd geregistreerd bij 96 HPI en bij 66,75 HPI bij ZIKV-infectie bij een MOI van respectievelijk 0,1 en 1. De genormaliseerde CI-waarde bereikte zijn laagste punt bij 107 HPI, waar er een reductie was van 51% en 60% (0,4915, 0,3984) bij ZIKV-infectie bij een MOI van respectievelijk 0,1 en 1. De genormaliseerde CI-waarde bleek een toename van 4% en 13% te hebben vanaf 107 HPI tot het einde van het experiment bij 168 HPI (0,5128, 0,4571). De zwarte lijn toont de effecten van trombine die als positieve controle werd gebruikt, waarbij de CI-waarden gedurende het hele experiment laag bleven, waardoor de verstoring van tight junctions werd nagebootst en vasculaire lekkage werd geïnduceerd35.

Figure 1
Figuur 1: Menselijke endotheelcellen van de navelstrengader (HUVEC's). De afbeelding is in een vergroting van 40x om de snelheid van samenvloeiing te bekijken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Afbeelding 2: Screenshots van het tabblad Cel en behandeling onder het tabblad Lay-out van de RTCA-software. (A) Klik op het tabblad Lay-out op het tabblad Cel . (B) Om informatie over de doelcel in te voeren en het puttype voor elk putje te bepalen, markeert u het putje en typt u de naam, het nummer en de kleur van de doelcel onder aan de software. Klik op Toepassen. (C) Klik op het tabblad Lay-out onder het tabblad Behandeling . (D) Om behandelingsinformatie in te voeren, markeert u het putje en typt u de naam van de behandeling, de concentratie van de behandeling, de eenheid en de kleur in. Klik op Toepassen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Screenshots van het tabblad Data-analyse in de RTCA-software voor normalisatie van de celindex. (A) Selecteer in de vervolgkeuzelijst Y-as de optie Genormaliseerde celindex. (B) Selecteer in het gedeelte X-as de normalisatietijd. (C) Schermafbeelding van het tabblad Schema in de RTCA-software. De normalisatietijd wordt aangegeven bij de Step_2 totale tijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Genormaliseerde celindex versus tijdgrafiek van Zika-virus (ZIKV)-infectie in endotheelcellen van de menselijke navelstrengader (HUVEC's). De gespecialiseerde gouden micro-elektrodeplaat werd gecoat met 20 μg/ml collageen type 1. De HUVEC's werden gezaaid met een dichtheid van 1,0 x 104 cellen/put. ZIKV P6-740 (MOI: 0,1, 1) werd gebruikt voor infectie. Lichtblauw: ZIKV P6-740 (MOI: 0.1); blauw: ZIKV P6-740 (MOI: 1); zwart: trombine als positieve controle (20 E/ml); Bruin: Negatieve infectiecontrole. Elk datapunt staat voor het gemiddelde en werd in drievoud geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Schematische tekening van de techniek die wordt gebruikt in de op impedantie gebaseerde RTCA op basis van elektrische biosensoren. Een zijaanzicht van de putplaat; Op de bodem van de putten bevinden zich vergulde negatieve en positieve polen. Terwijl het instrument CI meet in de microwell die kweekmedia bevat die het mogelijk maken om elektriciteit te geleiden, stroomt het elektron van de negatieve naar de positieve pool. Wanneer het een blanco regeling is, is de elektronenstroom soepel, vandaar dat er geen impedantie wordt geregistreerd. Wanneer de cellen zijn gezaaid, en naarmate meer en meer cellen zich aan de bodem van de put hechten, is impedantie in de elektronenstroom aanwezig en geregistreerd door de computer. Met behulp van deze impedantiewaarde zet het instrument deze om in een CI-waarde, die het aantal cellen aangeeft dat aan de bodem van de put is bevestigd (adhesie). Gemaakt met BioRender. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cytocide virale infectie in permissieve cellen wordt meestal geassocieerd met substantiële veranderingen in celmorfologie en biosynthese36. De door het virus geïnduceerde cellulaire morfologische veranderingen, zoals celkrimp, celvergroting en/of syncytievorming, staan ook bekend als cytopathische effecten (CPE's), kenmerkend voor bepaalde viraleinfecties37. In EC's werd de CPE beschreven als de vernietiging van cellen en de afbraak van de tight junctions tussen elke EC, waardoor de endotheelbarrière werd afgebroken 38,39. CPE's in HUVEC's kunnen worden omschreven als monolaagse celloslating en drijven uit het weefselkweekvat. De morfologische veranderingen van geïnfecteerde cellen, zoals loslating en zweven van aanhangende cellen, kunnen continu worden gedetecteerd met behulp van de RTCA-methode. Deze techniek is gebaseerd op elektrische impedantie, waardoor cellen tot om de paar seconden in realtime kunnen worden gemonitord. Het maakt de kwantificering van celproliferatie en morfologische veranderingen mogelijk, en in het geval van HUVEC's kan het worden gebruikt om veranderingen in de endotheelintegriteit en celbarrièrefunctie40 bij stimulatie te volgen.

In deze studie is de cruciale stap het opzetten van een experiment, waarbij de weerstandsplaat met 96 putjes wordt gebruikt. Dit is om ervoor te zorgen dat alle aansluitingen van de analysator goed zijn aangesloten op de plaat. In RTCA wordt de gemeten impedantiewaarde omgezet in een CI-waarde om de verschillen in celaantal, adhesiegraad, cellulaire morfologie en cellevensvatbaarheid te differentiëren41. De daling van de geregistreerde impedantie door de RTCA-analysator, die zich vertaalt in een daling van de CI-waarde, suggereert een verminderd aantal cellen, een zwakkere adhesiegraad en substantiële veranderingen in de cellulaire morfologie42. Daarom is het ook belangrijk om de geschiktheid van cellijnen en optimale celaantallen te testen om in het RTCA-experiment te worden gebruikt. Het is van cruciaal belang om te bepalen of de gewenste CI-index kan worden bereikt voordat tests op de cellen worden uitgevoerd met behulp van het RTCA-systeem. Bovendien helpt dit ook om te bepalen of het RTCA-systeem geschikt is om celgroei- en celdoodprofielen van geselecteerde celtypen te monitoren. In onze studie werd een sterke daling van de CI-waarden waargenomen wanneer HUVEC's werden geïnfecteerd met ZIKV P6-740 bij een MOI van 0,1 en 1. De sterke daling van de CI-waarde, wat suggereert dat HUVEC cellulaire morfologische veranderingen optraden na infectie, en dit leidde tot de verstoring van tight junctions en de vasculaire integriteit van de EC.

Conventioneel worden CPE's veroorzaakt door de virale infectie van cellen in vitro geschat op basis van microscopische observatie van de geïnfecteerde cellen. Bovendien maken sommige andere tests, zoals de plaque-assay, de visualisatie van CPE's mogelijk (zoals celloslating) en worden ze gebruikt om de omvang van de CPE's te meten42. Deze methoden hebben echter beperkingen in die zin dat ze alleen informatie verschaffen over discrete tijdstippen van de cellulaire morfologische veranderingen (eindpuntassays). Andere testen, zoals immunofluorescentiekleuring, zijn gebaseerd op combinaties van specifieke antilichamen die zijn gelabeld met een fluorofoor om de morfologische veranderingen te visualiseren43. Hoewel de immunofluorescentietest een breed vermogen heeft dat de visualisatie van veel componenten in een bepaald weefsel- of celtype mogelijk maakt, maakt deze techniek geen real-time monitoring en detectie tijdens virale infectie mogelijk. Het RTCA-systeem daarentegen registreert de real-time celmorfologische veranderingen tijdens de virale infectie, waardoor voorbijgaande effecten, zoals voorbijgaande vasculaire lekkage, kunnen worden vastgelegd die door eindpuntassays kunnen worden gemist. Eindpunttesten zouden bijvoorbeeld de gegevens en morfologische veranderingen niet al bij 60 HPI, 80 HPI en 100 HPI detecteren. Naast RTCA is trans-epitheliale elektrische weerstandsmeting (TEER) een andere veelgebruikte methode om cel-tot-celinteracties te monitoren, waarbij de elektrische weerstand over de celmonolaag wordt gemeten. De TEER vereist echter verschillende herhaalde metingen in de loop van de tijd om de activiteiten van levende cellen te volgen en wordt vaak uitgevoerd op een kleiner aantal monsters of putten tegelijk. Als gevolg hiervan heeft TEER doorgaans een lagere doorvoer in vergelijking met RTCA, die tot 96 putten tegelijk kan draaien44.

Ondanks de voordelen heeft het RTCA-systeem verschillende beperkingen. De belangrijkste beperking van het RTCA-systeem zijn de dure apparatuur en verbruiksartikelen. De gespecialiseerde gouden micro-elektrodeplaten die door het RTCA-systeem worden gebruikt, zijn relatief duur, voor eenmalig gebruik en wegwerpbaar45. Bovendien kunnen de morfologische veranderingen van de cel niet worden afgebeeld en vastgelegd op een recorder (camera), noch kan de test de accumulatie van het virusantigeen of veranderingen in het celoppervlakte-eiwit, zoals VE-cadherine in HUVEC's46, vastleggen. Als gevolg hiervan kan de RTCA de morfologische veranderingen in de cel niet visualiseren die aanvullende nuttige informatie zouden opleveren om de pathogenese van de ziekte op te helderen. Tijdens de bepaling of het modelopstellen zou aanvullende kleuringsverificatie, zoals VE-cadherinekleuring voor HUVEC's, nuttig zijn om de verkregen metingen te valideren. Bovendien is het RTCA-systeem beperkt tot hechtende cellijnen, omdat het de bevestiging van cellen op de bodem van de putjes vereist om de impedantie te registreren. Daarom kan de gerapporteerde test niet worden gebruikt voor niet-hechtende cellijnen46.

Concluderend hebben we een real-time celanalyseprotocol beschreven met behulp van het RTCA-instrument om veranderingen in endotheelcellen na ZIKV-infectie te volgen in 96-wells formaat. Deze methode biedt verschillende voordelen ten opzichte van conventionele eindpunttesten, in die zin dat het een niet-invasieve en niet-labelintensieve aanpak mogelijk maakt voor het continu monitoren van cellulaire morfologische veranderingen in realtime. Deze test kan ook worden gebruikt om vasculaire integriteitsveranderingen van andere cellijnen in verschillende experimentele opstellingen te analyseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdige belangen hebben.

Acknowledgments

Dit onderzoek kreeg steun van het Ministerie van Hoger Onderwijs Maleisië in het kader van het Higher Institution Centre of Excellence (HICoE)-programma (MO002-2019) en financiering in het kader van de Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
Antibiotic solution penicillin-streptomycin (P/S) Sciencell 0503
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
Collagen Type 1 SIgma-Aldrich C3867
Endothelial cell growth supplement (ECGS) Sciencell 1052
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
E-plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232368001
Fetal bovine serum (FBS) Sciencell 0025
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich H9394
Hemocytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) Sciencell 8000
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Latitude 3520 Laptop Dell  -
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Reagent reservior Tarsons T38-524090
RTCA resistor plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232350001
RTCA Software Pro (Version 2.6.1) Agilent Technologies, Inc. 5454433001
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380) Agilent Technologies, Inc. 00380601030 https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. , Garland Science. (2002).
  2. Pugsley, M. K., Tabrizchi, R. The vascular system: An overview of structure and function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 44 (2), 333-340 (2000).
  3. Stevens, T., Garcia, J. G., Shasby, D. M., Bhattacharya, J., Malik, A. B. Mechanisms regulating endothelial cell barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (3), L419-L422 (2000).
  4. Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. The Journal of Physiology. 569, 359-366 (2005).
  5. Boueiz, A., Hassoun, P. M. Regulation of endothelial barrier function by reactive oxygen and nitrogen species). Microvascular Research. 77 (1), 26-34 (2009).
  6. Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 619690 (2021).
  7. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  8. Iyer, S., Ferreri, D. M., DeCocco, N. C., Minnear, F. L., Vincent, P. A. VE-cadherin-p120 interaction is required for maintenance of endothelial barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (6), L1143-L1153 (2004).
  9. Puerta-Guardo, H., et al. Flavivirus NS1 triggers tissue-specific vascular endothelial dysfunction reflecting disease tropism. Cell Reports. 26 (6), 1598-1613 (2019).
  10. Rastogi, M., Singh, S. K. Zika virus NS1 affects the junctional integrity of human brain microvascular endothelial cells. Biochimie. 176, 52-61 (2020).
  11. Soe, H. J., et al. High dengue virus load differentially modulates human microvascular endothelial barrier function during early infection. Journal of General Virology. 98 (12), 2993-3007 (2017).
  12. Krouwer, V. J., Hekking, L. H. P., Langelaar-Makkinje, M., Regan-Klapisz, E., Post, J. A. Endothelial cell senescence is associated with disrupted cell-cell junctions and increased monolayer permeability. Vascular Cell. 4 (1), 12 (2012).
  13. Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
  14. Bryce, C., et al. Pathophysiology of SARS-CoV-2: targeting of endothelial cells renders a complex disease with thrombotic microangiopathy and aberrant immune response. The Mount Sinai COVID-19 autopsy experience. MedRxiv. , (2020).
  15. Khaiboullina, S., et al. Transcriptome profiling reveals pro-inflammatory cytokines and matrix metalloproteinase activation in Zika virus infected human umbilical vein endothelial cells. Frontiers in Pharmacology. 10, 642 (2019).
  16. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  17. Sarno, M., et al. Zika virus infection and stillbirths: a case of hydrops fetalis, hydranencephaly and fetal demise. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), e0004517 (2016).
  18. Dalrymple, N. A., Mackow, E. R. Virus interactions with endothelial cell receptors: implications for viral pathogenesis. Current Opinion in Virology. 7, 134-140 (2014).
  19. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (1), 64-75 (2014).
  20. Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212 (1), 173-179 (2013).
  21. Vozzi, F., Bianchi, F., Ahluwalia, A., Domenici, C. Hydrostatic pressure and shear stress affect endothelin-1 and nitric oxide release by endothelial cells in bioreactors. Biotechnology Journal. 9 (1), 146-154 (2014).
  22. Gallinat, A., Badimon, L. DJ-1 interacts with the ectopic ATP-synthase in endothelial cells during acute ischemia and reperfusion. Scientific Reports. 12 (1), 12753 (2022).
  23. Jiménez, N., Krouwer, V. J. D., Post, J. A. A new, rapid and reproducible method to obtain high quality endothelium in vitro. Cytotechnology. 65 (1), 1-14 (2013).
  24. Latifi-Navid, H., et al. Network analysis and the impact of Aflibercept on specific mediators of angiogenesis in HUVEC cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (17), 8285-8299 (2021).
  25. Poulet, M., et al. PRL-2 phosphatase is required for vascular morphogenesis and angiogenic signaling. Communications Biology. 3 (1), 603 (2020).
  26. Laurens, N., van Hinsbergh, V. W. Isolation, purification and culture of human micro- and macrovascular endothelial cells. Methods in Endothelial Cell Biology. , Springer. 3-13 (2004).
  27. Haudenschild, C. C., Zahniser, D., Folkman, J., Klagsbrun, M. Human vascular endothelial cells in culture: lack of response to serum growth factors. Experimental Cell Research. 98 (1), 175-183 (1976).
  28. Cenni, E., Perut, F., Baldini, N. In vitro models for the evaluation of angiogenic potential in bone engineering. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (1), 21-30 (2011).
  29. Lau, S., Gossen, M., Lendlein, A., Jung, F. Venous and arterial endothelial cells from human umbilical cords: potential cell sources for cardiovascular research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 978 (2021).
  30. Marquez-Curtis, L. A., Sultani, A. B., McGann, L. E., Elliott, J. A. W. Beyond membrane integrity: Assessing the functionality of human umbilical vein endothelial cells after cryopreservation. Cryobiology. 72 (3), 183-190 (2016).
  31. Park, H. -J., et al. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Reviews. 2 (2), 93-102 (2006).
  32. Dowling, C. M., Herranz Ors, C., Kiely, P. A. Using real-time impedance-based assays to monitor the effects of fibroblast-derived media on the adhesion, proliferation, migration and invasion of colon cancer cells. Bioscience Reports. 34 (4), e00126 (2014).
  33. Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
  34. Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus propagation and cell-based colorimetric quantification. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
  35. Kustermann, S., et al. A real-time impedance-based screening assay for drug-induced vascular leakage. Toxicological Sciences. 138 (2), 333-343 (2014).
  36. Albrecht, T., Fons, M., Boldogh, I., Rabson, A. S. Effects on cells. Medical Microbiology. 4th Edition. , (1996).
  37. Hematian, A., et al. Traditional and modern cell culture in virus diagnosis. Osong Public Health and Research Perspectives. 7 (2), 77-82 (2016).
  38. Friedman, H. M. Infection of endothelial cells by common human viruses. Reviews of Infectious Diseases. 11, S700-S704 (1989).
  39. Friedman, H. M., Macarak, E. J., MacGregor, R. R., Wolfe, J., Kefalides, N. A. Virus infection of endothelial cells. The Journal of Infectious Diseases. 143 (2), 266-273 (1981).
  40. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  41. Marlina, S., Shu, M. -H., AbuBakar, S., Zandi, K. Development of a Real-Time Cell Analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8, 579 (2015).
  42. Liu, S., DeLalio, L. J., Isakson, B. E., Wang, T. T. AXL-mediated productive infection of human endothelial cells by Zika virus. Circulation Research. 119 (11), 1183-1189 (2016).
  43. Souf, S. Recent advances in diagnostic testing for viral infections. Bioscience Horizons: The International Journal of Student Research. 9, (2016).
  44. Sun, M., et al. A dynamic real-time method for monitoring epithelial barrier function in vitro. Analytical Biochemistry. 425 (2), 96-103 (2012).
  45. Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicology Reports. 7, 335-344 (2020).
  46. Kho, D., et al. Application of xCELLigence RTCA biosensor technology for revealing the profile and window of drug responsiveness in real time. Biosensors. 5 (2), 199-222 (2015).

Tags

Biologie Nummer 195 Menselijke navelstrengader endotheelcellen Virale infectie impedantie-gebaseerde Real-time celanalyse Endotheelcellen Barrière Vloeistofuitwisseling Uitwisseling van opgeloste stoffen Virusverspreiding Endotheliale permeabiliteit Verstoring van de endotheelcelbarrière Vasculaire lekkage Real-time celanalysator Zika-virus (ZIKV)-infectie Celindex (CI) Voorbijgaande effecten Celmorfologische veranderingen Vasculaire integriteit
Monitoring van veranderingen in endotheelcellen van de menselijke navelstrengader bij virale infectie met behulp van op impedantie gebaseerde real-time celanalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar,… More

Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Monitoring Changes in Human Umbilical Vein Endothelial Cells upon Viral Infection Using Impedance-Based Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (195), e64887, doi:10.3791/64887 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter