Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Мониторинг изменений эндотелиальных клеток пупочной вены человека при вирусной инфекции с использованием импедансного клеточного анализа в режиме реального времени

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64887
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

В настоящем исследовании описывается протокол мониторинга изменений в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC) во время вирусной инфекции с использованием системы клеточного анализа в реальном времени (RTCA).

Abstract

Эндотелиальные клетки выстилают внутреннюю поверхность всех кровеносных и лимфатических сосудов, создавая полупроницаемый барьер, регулирующий обмен жидкости и растворенных веществ между кровью или лимфой и окружающими их тканями. Способность вируса преодолевать эндотелиальный барьер является важным механизмом, облегчающим распространение вируса в организме человека. Сообщается, что многие вирусы изменяют проницаемость эндотелия и/или вызывают нарушение барьера эндотелиальных клеток во время инфекции, что может вызвать утечку из сосудов. В настоящем исследовании описывается протокол клеточного анализа в режиме реального времени (RTCA), использующий коммерческий клеточный анализатор в режиме реального времени для мониторинга изменений целостности и проницаемости эндотелия эндотелия и проницаемости эндотелиальных клеток пупочной вены человека вирусом Зика (ZIKV). Сигналы импеданса, зарегистрированные до и после заражения ZIKV, были переведены в значения клеточного индекса (ДИ) и проанализированы. Протокол RTCA позволяет выявлять транзиторные эффекты в виде морфологических изменений клеток при вирусной инфекции. Этот анализ также может быть полезен для изучения изменений в сосудистой целостности HUVEC в других экспериментальных установках.

Introduction

Эндотелиальные клетки (ЭК) выстилают внутреннюю поверхность всех кровеносных и лимфатических сосудов. Они соединены между собой плотными щелевыми соединениями, создающими полупроницаемый барьер между кровью или лимфой и окружающими тканями 1,2. Интактные эндотелиальные межклеточные соединения имеют решающее значение для регуляции транспорта макромолекул, растворенных веществ и жидкостей, имеют решающее значение для физиологической деятельности соответствующих тканей и органов3. Эндотелиальный барьер динамичен и модулируется специфическими стимулами4. Нарушение или потеря барьерной функции эндотелия является отличительной чертой патофизиологии заболевания при остром и хроническом воспалении в патогенезе многих заболеваний 5,6,7, в том числе вирусной инфекции 8,9,10,11. Для флавивирусов было обнаружено, что неструктурный белок NS1 может изменять проницаемость эндотелия, например, через нарушение эндотелиального гликокаликс-подобного слоя в результате увеличения экспрессии и активации катепсина L, сиалидаз и эндогликозидазыгепариназы 9. В болезненном состоянии нарушается целостность монослоя эндотелия и нарушаются межклеточные соединения, что может привести к повреждению и дисфункции эндотелия12 и, в конечном итоге, к распространенным патологическим проявлениям во многих системах органов13,14. Вирусная инфекция ЭК приводит к изменениям в клеточных сигнальных путях и профиле экспрессии клеточных генов, что может влиять на барьерные функции жидкости, вызывать нарушение ЭК и индуцировать сосудистую утечку10,15. Было обнаружено, что инфицирование ЭК вирусом Зика (ZIKV) нарушает целостность соединений, что вызывает изменения проницаемости сосудов и приводит к дисфункции эндотелиального барьера, что приводит к утечке сосудов10,15. Исследования показали, что ZIKV связан с тяжелыми врожденными дефектами; Однако не так много известно о точном механизме, с помощью которого это происходит16,17. Поэтому понимание изменений эндотелиального барьера во время инфекции имеет решающее значение для понимания механизма заболевания.

В настоящее время ЭК используются в качестве важной экспериментальной системы моделирования сосудов in vitro для различных физиологических и патологических процессов 18,19,20,21. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) широко используются в качестве первичной, неиммортализированной клеточной системы для изучения эндотелия сосудов и сосудистой биологии in vitro 22,23,24,25. HUVEC были впервые выделены для культивирования in vitro в начале 1970-х годов из пуповинной вены пуповины человека26. HUVEC имеют морфологию, похожую на булыжник, которую легко заставить размножаться в лаборатории. Из-за напряжения сдвига после длительного поддержания в состоянии слияния наблюдается удлинение формы ячейки. HUVEC можно охарактеризовать наличием телец Вейбеля и Палада (WPB), пиноцитарных везикул, небольшого количества фибрилл, расположенных вблизи ядра, митохондрий трубчатой формы, которые редко имеют разветвления, эллипсоидного ядра с мелким зернистым рисунком конденсированного хроматина и от одного до трех ядрышек, присутствующих в каждом ядре27. Несмотря на то, что HUVEC обладают многочисленными морфологическими характеристиками, идентификация HUVEC не может быть достигнута только с помощью оптического исследования. Такие анализы, как иммунофлуоресцентное окрашивание эндотелия сосудов (VE)-кадгерина, обычно используются для мониторинга целостности сосудов в HUVEC 28,29,30,31.

В этом исследовании описывается протокол клеточного анализа в реальном времени (RTCA) инфекции HUVEC. В системе RTCA используются специализированные пластины с золотым напылением, содержащие микроэлектроды, которые обеспечивают токопроводящую поверхность для крепления ячейки. Когда ячейки прикрепляются к поверхности микроэлектрода, образуется барьер, препятствующий прохождению электронов через микроэлектроды. Измерение импеданса, генерируемого микроэлектродами, может быть использовано для получения информации о некоторых клеточных процессах, включая прикрепление клеток, пролиферацию и миграцию32. Представленный анализ представляет собой клеточный анализ на основе импеданса, который в сочетании с клеточным анализатором в режиме реального времени обеспечивает непрерывное измерение пролиферации живых клеток, морфологических изменений (таких как уменьшение клеток) и качества прикрепления клеток неинвазивным и безметочным способом. В данном исследовании клеточный анализатор в режиме реального времени используется для мониторинга целостности эндотелия и морфологических изменений HUVEC при инфицировании вирусом ZIKV. Вкратце, прибор измеряет поток электронов, передаваемых в специализированных микротитровых планшетах с покрытием из микроэлектродов золота в присутствии питательной среды (электропроводящего раствора). Адгезия клеток или изменения в количестве и морфологии клеток нарушают поток электронов и вызывают изменения импеданса, которые могут быть зафиксированы прибором (дополнительный рисунок 1). Разница между ростом, пролиферацией и приверженностью к HUVEC до и после заражения ZIKV регистрируется в режиме реального времени с помощью сигнала электрического импеданса, а затем переводится в значение клеточного индекса (CI). Значение КЕ, полученное до заражения, используется в качестве базового уровня для нормализации значений КЕ. Изменения значений ДИ отражают морфологические изменения клеток или потерю клеточной адгезии при инфицировании33. Результаты исследования показывают, что протокол RTCA позволяет выявлять транзиторные эффекты или морфологические изменения клеток во время вирусной инфекции по сравнению с анализом конечной точки, таким как иммунофлуоресцентное окрашивание VE-кадгерина. Метод RTCA может быть полезен для анализа изменений целостности сосудов HUVEC при заражении другими вирусами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка клеток

  1. Приготовление HUVEC
    1. Выращивание 7,5 x 105 клеток HUVEC/мл в колбе для клеточной культуры размером 75см2 (покрытой коллагеном типа 1 типа 20 мкг/мл), содержащей 12 мл эндотелиальной клеточной среды (ECM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 0,01% добавкой для роста эндотелиальных клеток (ECGS), которая содержит факторы роста, гормоны и белки, необходимые для культивирования HUVEC, и 0,01% пенициллин-стрептомицин (P/S). Инкубируют клетки в инкубаторе клеточных культур при температуре 37 °C с 5%CO2 (рис. 1).

2. Постановка эксперимента RTCA

  1. Проверка резисторов на RTCA
    1. Дважды щелкните значок программного обеспечения RTCA на рабочем столе, чтобы запустить приложение. Появится окно входа, введите логин и пароль для входа.
    2. Поместите 96-луночную пластину резистора RTCA лункой A1 внутрь в станцию RTCA, расположенную в инкубаторе клеточных культур.
    3. На вкладке Exp Notes программного обеспечения RTCA введите название эксперимента, серийный номер устройства и тип устройства (пластина контроля качества).
    4. На вкладке «Компоновка » на вкладке «Ячейка » программного обеспечения RTCA выделите все скважины и щелкните правой кнопкой мыши по выделенным лункам, чтобы убедиться, что все колодцы включены (выделены серым цветом).
    5. На вкладке «Расписание » программного обеспечения RTCA нажмите кнопку Step_1. Введите Sweeps: 10 и Interval: 30 s. Нажмите кнопку Применить. Нажмите «Начать/Продолжить » в левом верхнем углу программного обеспечения, чтобы начать проверку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что подключение скважин к станции RTCA в порядке, наблюдая за «Пластина отсканирована. Подключения в порядке» внизу страницы.
  2. Прогон проверки резисторов для анализа данных
    1. На вкладке Индекс ячейки проверьте данные по завершении прогона. Все значения ДИ должны быть меньше 0,063.
    2. В нижней части вкладки Индекс ячейки проверьте необработанные данные сканирования. Необработанные данные сканирования должны иметь повторяющиеся значения 40,0 ± 2,0 (строки A и H), 67,5 ± 2,5 (строки B и G), 93,6 ± 2,9 (строки C и F) и 117,6 ± 3,2 (строки D и E).
    3. Чтобы остановить проверочный запуск, нажмите кнопку Пластина > Освободить пластину. Теперь 96-луночная пластина резистора RTCA готова к снятию со станции RTCA.
  3. Получение справочных материалов по RTCA
    1. Специализированную пластину с золотым микроэлектродом типа 1, покрытую коллагеном типа 1 (покрытую коллагеном типа 1 20 мкг/мл) 60 мкл/лунку сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS; с бикарбонатом натрия, без хлорида кальция и сульфата магния) промыть 2 раза.
    2. Выбросьте оставшийся HBSS и добавьте 50 мкл/лунку ECM. Поместите специализированную золотую микроэлектродную пластину, содержащую ECM, лункой A1 внутрь в станцию RTCA, расположенную в инкубаторе клеточных культур.
    3. На вкладке Exp Notes программного обеспечения RTCA введите название эксперимента, серийный номер устройства и тип устройства (96-луночный формат).
    4. На вкладке «Компоновка » на вкладке «Ячейка » программного обеспечения RTCA выделите скважины, которые будут использоваться, и щелкните правой кнопкой мыши по выделенным лункам, чтобы убедиться, что все колодцы включены (выделены серым цветом).
    5. На вкладке «Расписание » программного обеспечения RTCA нажмите Step_1 и нажмите «Начать/Продолжить» в левом верхнем углу программного обеспечения, чтобы получить фоновое чтение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что соединение лунок правильное, наблюдая за «Пластина отсканирована. Подключения в порядке» внизу страницы.
    6. После получения фоновых показаний специализированная пластина с золотым микроэлектродом готова к засеиванию клеток и готова к извлечению со станции RTCA.
  4. Приготовление HUVEC в специализированной золотисто-микроэлектродной пластине
    1. Засейте HUVEC в специализированную золотую микроэлектродную пластину с 50 мкл/лунку кондиционированной среды, 1 x 104 ячеек на лунку (кондиционированная среда: ECM с добавлением 10% FBS, 0,01% ECGS и 0,01% P/S). Поместите планшет обратно в станцию RTCA лункой A1 внутрь для ночной инкубации в инкубаторе клеточных культур при температуре 37 °C с 5%CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчет клеток проводили на клеточной суспензии с коэффициентом разведения 2 с помощью гемоцитометра.
    2. На вкладке «Расписание » нажмите «Добавить шаг » в левом верхнем углу. Нажмите на Step_2 и измените Sweeps: 601 и Interval: 2 min. Нажмите Apply. Нажмите на Step_2 и нажмите «Начать/Продолжить» в левом верхнем углу программы.
    3. После 20 ч инкубации, когда значения ДИ на вкладке «График скважин » показывают плато, планшет готов к заражению. На вкладке «Расписание » программного обеспечения RTCA нажмите кнопку « Прервать шаг».
    4. Теперь специализированная пластина с золотым микроэлектродом готова к извлечению из станции RTCA для последующих этапов.

3. Вирусная инфекция в HUVEC

  1. Разбавление вируса
    1. Культуру заготовки ZIKV хранят при температуре -80 °C. Для этого исследования удаляют запас вируса, хранящийся в криогенных флаконах, и разбавляют запас ZIKV безсывороточным ВКМ в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл для достижения кратности инфекций (MOI) 0,1 и 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подвой ZIKV был предварительно подготовлен путем размножения в клетках Vero и сбора надосадочной жидкости ZIKV34.
  2. Инфицирование клеточного монослоя
    1. Удалите и выбросьте кондиционированную среду (ECM с добавлением 10% FBS, 0,01% ECGS и 0,01% P/S) из каждой лунки. Промойте каждую лунку 60 мкл HBSS 2x. Вставьте HBSS с помощью боковой стороны лунки; Не снимайте однослойную клетку.
    2. Работая от самого высокого к самому низкому разведению, добавьте в лунку 40 мкл каждого разбавленного образца вируса в безсывороточном ECM. Утроите лунку для каждого разведения и поддерживайте шесть лунок без инфекции (отрицательный контроль и положительный контроль тромбина). Не снимайте однослойную клетку; Вместо этого добавьте разбавленный вирус с помощью боковой стороны лунки. Используйте свежий наконечник для каждой инъекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тромбин был выбран в качестве положительного контроля, поскольку он может быстро увеличивать эндотелиальную проницаемость HUVEC.
    3. Инкубируйте планшет в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C с 5%CO2 , чтобы обеспечить адсорбцию вируса. Прополощите планшет 5 раз каждые 15 минут, чтобы обеспечить адсорбцию вируса по всему монослою клетки.
  3. Добавление оверлейной клеточной питательной среды
    1. Через 1 ч инкубации удалить и утилизировать вирусную суспензию от самой низкой концентрации до самой высокой.
    2. Промойте инфицированные клетки 60 мкл HBSS 2x. Наложите на скважину ECM с добавлением 2% FBS. Для положительных контрольных лунок разбавляют тромбин до 20 ЕД/мл ЭКМ с добавлением 2% ФБС и накладывают на лунки тромбинсодержащую среду ВКМ. Не снимайте однослойную клетку; Вместо этого добавьте оверлейный материал с помощью боковой стороны лунки.
  4. Размещение инфицированной специализированной золотисто-микроэлектродной пластины обратно на станцию RTCA
    1. На вкладке «Расписание » нажмите «Добавить шаг » в левом верхнем углу. Нажмите на Step_3 и измените параметры Sweeps: 3,601 и Interval: 2 min. Нажмите Apply.
    2. Нажмите OK в появившемся всплывающем окне. Поместите инфицированную специализированную золотую микроэлектродную пластину лункой А1 внутрь в станцию RTCA, расположенную в инкубаторе клеточных культур.
    3. Нажмите на Step_3 и нажмите «Начать/Продолжить» в левом верхнем углу программного обеспечения.

4. Анализ и экспорт данных

  1. Добавление экспериментальной информации по каждой скважине
    1. На вкладке Layout перейдите на вкладку Cell (рисунок 2A). Чтобы ввести информацию о целевой ячейке и определить тип скважины для каждой скважины, выделите скважину и введите имя, номер и цвет целевой ячейки в нижней части программного обеспечения. Нажмите кнопку Apply (рисунок 2B).
    2. Чтобы выбрать и определить тип скважины для каждой скважины, на вкладке Ячейка выделите скважину, выберите тип скважины (проба, положительный контроль или отрицательный контроль) и нажмите кнопку Установить.
    3. На вкладке Layout перейдите на вкладку Treatment (рисунок 2C). Чтобы ввести информацию о лечении, выделите лунку и введите название препарата, концентрацию препарата, единицу измерения и цвет. Нажмите кнопку Apply (рисунок 2D).
    4. Чтобы выбрать и определить тип скважины для каждой скважины, на вкладке Обработка выделите скважину, выберите тип скважины (проба, положительный контроль или отрицательный контроль) и нажмите кнопку Установить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого выбора можно выделить несколько лунок одновременно.
  2. Нормализация значения CI
    1. Щелкните правой кнопкой мыши справа на вкладке Анализ данных и выберите Normalized Cell Index из выпадающего списка Y Axis (Ось Y ) (рисунок 3A). В разделе «Ось X » в нижней части выберите нормализованное время в качестве последней измеренной точки времени, когда специализированная пластина с золотым микроэлектродом была удалена из-за инфекции (рис. 3B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс нормализации, выполняемый программным обеспечением, устраняет большую часть изменчивости, вызванной различиями в засеве и присоединении скважины, при условии, что выбранная точка нормализации находится до добавления вируса и/или лечения. Следовательно, оптимальным моментом нормализации должен быть последний момент времени перед добавлением вируса и/или лечения. Точку времени для нормализации можно проверить на вкладке «Расписание » в разделе Step_2. Указанное общее время является моментом времени для нормализации (рис. 3C).
  3. Построение графиков полученных данных с помощью программного обеспечения RTCA
    1. На вкладке Анализ данных выберите скважины, которые нужно добавить на график, выделив их и нажав кнопку << Добавить. Нормализованный индекс ячейки по отношению к графику времени теперь готов к копированию и экспорту. Не забудьте поставить галочку в поле Среднее .
  4. Экспорт данных с помощью программного обеспечения RTCA
    1. В левом верхнем углу программного обеспечения RTCA нажмите кнопку Пластина > Экспорт информации об эксперименте.... Установите флажок, чтобы выбрать данные для экспорта. Нажмите кнопку ОК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанные данные (необработанные значения CI) могут быть экспортированы, если установлен флажок Индекс ячейки > Все .
    2. Выберите папку для сохранения файла экспорта. Нажмите кнопку СОХРАНИТЬ. Появится всплывающее окно, указывающее на экспорт экспериментальной информации. После завершения экспорта появится еще одно окно, в котором будет указано, что экспортированная информация об эксперименте готова к просмотру.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

До инфицирования вирусом ZIKV КИ, зарегистрированный для монослоя HUVEC, культивируемого на специализированной микротитровой пластине, покрытой золотом и микроэлектродом, был выше 8, что свидетельствует о сильных адгезионных свойствах. Планшеты или лунки с индексом CI менее 8 должны быть отброшены. Затем HUVEC инфицировали ZIKV при MOI 0,1 и 1, и клеточный импеданс регистрировали в течение 7 дней. Значение ДИ HUVEC, инфицированных ZIKV P6-740 при MOI 0,1 (светло-голубая линия), начало снижаться через 15 ч после заражения (HPI) по сравнению с отрицательным инфекционным контролем (коричневая линия; Рисунок 4). Что касается HUVEC, инфицированных более высокой дозой ZIKV P6-740 при MOI 1 (синяя линия), то значение CI начало снижаться уже при 11 HPI. При 24 HPI наблюдалось снижение нормализованного значения ДИ на 5% и 7% (0,949, 0,929) при инфицировании ЭК вирусом ZIKV при MOI 0,1 и 1 соответственно. Снижение нормализованного значения ДИ на 50% было зарегистрировано при 96 HPI и 66,75 HPI при инфицировании ZIKV при MOI 0,1 и 1 соответственно. Нормализованное значение ДИ достигло самой низкой точки на уровне 107 HPI, где наблюдалось снижение на 51% и 60% (0,4915, 0,3984) при инфицировании ZIKV при MOI 0,1 и 1 соответственно. Было обнаружено, что нормализованное значение ДИ увеличилось на 4% и 13% от 107 HPI до конца эксперимента при 168 HPI (0,5128, 0,4571). Черная линия показывает эффекты тромбина, используемого в качестве положительного контроля, где значения ДИ оставались низкими на протяжении всего эксперимента, имитируя разрушение плотных соединений и индуцированную сосудистую утечку35.

Figure 1
Рисунок 1: Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs). На рисунке показано 40-кратное увеличение для просмотра скорости слияния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Скриншоты вкладки Cell and Treatment на вкладке Layout в программном обеспечении RTCA. (A) На вкладке «Макет » перейдите на вкладку «Ячейка ». (B) Чтобы ввести информацию о целевой ячейке и определить тип скважины для каждой скважины, выделите лунку и введите имя, номер и цвет целевой ячейки в нижней части программного обеспечения. Нажмите кнопку Применить. (C) Перейдите на вкладку «Макет » на вкладке «Обработка ». (D) Чтобы ввести информацию об обработке, выделите лунку и введите название обработки, концентрацию обработки, единицу измерения и цвет. Нажмите кнопку Применить. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Скриншоты вкладки Data Analysis в программном обеспечении RTCA для нормализации индекса ячеек. (A) В ниспадающем списке Ось Y выберите Нормализованный индекс ячейки. (B) В разделе "Ось X " выберите время нормализации. (C) Снимок экрана вкладки «Расписание» в программном обеспечении RTCA. Время нормализации указывается на Step_2 общее время. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Нормализованный клеточный индекс в зависимости от временного графика инфекции вируса Зика (ZIKV) в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVECs). Специализированная золотая микроэлектродная пластина была покрыта коллагеном 1-го типа в концентрации 20 мкг/мл. HUVEC высевали с плотностью 1,0 x 104 клетки на лунку. Для заражения использовали ZIKV P6-740 (MOI: 0,1, 1). Светло-голубой: ZIKV P6-740 (MOI: 0.1); синий: ZIKV P6-740 (MOI: 1); черный: тромбин как положительный контроль (20 Ед/мл); Коричневый: отрицательный инфекционный контроль. Каждая точка данных означает среднее значение и анализируется в трех экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Схематическое изображение технологии, используемой в электрическом биосенсоре на основе импеданса RTCA. Вид сбоку на скважинную плиту; На дне колодцев расположены позолоченные отрицательные и плюсовые клеммы. По мере того, как прибор измеряет CI в микролунке, содержащей питательную среду, позволяющую проводить электричество, электрон течет от отрицательной клеммы к положительной. Когда это холостой регулятор, поток электронов плавный, поэтому импеданс не регистрируется. Когда ячейки засеяны, и по мере того, как все больше и больше клеток прикрепляются к дну лунки, присутствует импеданс в потоке электронов и регистрируется компьютером. Используя это значение импеданса, прибор преобразует его в значение CI, показывающее количество ячеек, прикрепленных к забою скважины (адгезия). Создано с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Цитозидная вирусная инфекция в пермиссивных клетках обычно ассоциируется со значительными изменениями в морфологии и биосинтезе клеток36. Вызванные вирусом клеточные морфологические изменения, такие как уменьшение клеток, увеличение клеток и/или образование синцитии, также известны как цитопатические эффекты (CPE), характерные для некоторых вирусных инфекций37. При ЭК ЦПД описывался как разрушение клеток и разрушение плотных соединений между каждым ЭК, что приводит к разрушению эндотелиального барьера38,39. CPE в HUVEC можно описать как отслоение монослойных клеток и всплытие из сосуда для культуры тканей. Морфологические изменения инфицированных клеток, такие как отслоение и всплытие адгезивных клеток, могут быть непрерывно обнаружены с помощью метода RTCA. Этот метод основан на электрическом импедансе, что позволяет осуществлять мониторинг клеток в режиме реального времени с точностью до нескольких секунд. Он позволяет количественно оценить пролиферацию клеток, морфологические изменения, а в случае HUVEC может быть использован для мониторинга изменений целостности эндотелия и барьерной функции клеток40 при стимуляции.

В данном исследовании критическим этапом является постановка эксперимента, в котором используется 96-луночная резисторная пластина. Это необходимо для того, чтобы все соединения анализатора были надежно соединены с пластиной. В RTCA измеренное значение импеданса преобразуется в значение CI для дифференциации различий в количестве клеток, степени адгезии, морфологии клеток и жизнеспособности клеток41. Снижение импеданса, регистрируемого анализатором RTCA, которое приводит к снижению значения CI, свидетельствует об уменьшении числа клеток, более слабой степени адгезии и существенных изменениях в клеточной морфологии42. Поэтому также важно проверить пригодность клеточных линий и оптимальное количество клеток для использования в эксперименте RTCA. Очень важно определить, может ли быть достигнут желаемый индекс CI, прежде чем проводить тестирование на клетках с помощью системы RTCA. Кроме того, это также помогает определить, подходит ли система RTCA для мониторинга клеточного роста и профилей клеточной гибели выбранных типов клеток. В нашем исследовании резкое падение значений ДИ наблюдалось при инфицировании HUVEC вирусом ZIKV P6-740 при MOI 0,1 и 1. Резкое падение значения ДИ позволяет предположить, что клеточные морфологические изменения HUVEC произошли после инфекции, и это привело к нарушению плотных соединений и целостности сосудов EC.

Обычно ЦПЭ, вызванные вирусной инфекцией клеток in vitro , оценивают на основе микроскопического наблюдения за инфицированными клетками. Кроме того, некоторые другие анализы, такие как анализ бляшек, позволяют визуализировать CPE (например, отслоение клеток) и используются для измерения протяженности CPE42. Однако эти методы имеют ограничения, заключающиеся в том, что они дают информацию только о дискретных временных моментах морфологических изменений клеток (анализы конечных точек). Другие анализы, такие как иммунофлуоресцентное окрашивание, основаны на комбинациях специфических антител, помеченных флуорофором, для визуализации морфологических изменений43. Несмотря на то, что иммунофлуоресцентный анализ обладает широкими возможностями, позволяющими визуализировать многие компоненты в любой ткани или типе клеток, этот метод не позволяет осуществлять мониторинг и обнаружение вирусной инфекции в режиме реального времени. В отличие от этого, система RTCA регистрирует морфологические изменения клеток в режиме реального времени во время вирусной инфекции, что позволяет фиксировать преходящие эффекты, такие как преходящая сосудистая утечка, которые могут быть пропущены анализами конечных точек. Например, анализы на конечных точках не смогут обнаружить данные и морфологические изменения уже при 60 HPI, 80 HPI и 100 HPI. В дополнение к RTCA, измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) является еще одним широко используемым методом мониторинга межклеточных взаимодействий, при котором измеряется электрическое сопротивление через монослой клетки. Тем не менее, TEER требует нескольких повторных измерений в течение долгого времени для мониторинга активности живых клеток и часто выполняется на меньшем количестве образцов или лунок одновременно. В результате, TEER, как правило, имеет более низкую пропускную способность по сравнению с RTCA, которая может одновременно работать на 96 скважинах и44 скважинах.

Несмотря на свои преимущества, система RTCA имеет ряд ограничений. Основным ограничением системы RTCA является дорогостоящее оборудование и расходные материалы. Специализированные золотисто-микроэлектродные пластины, используемые системой RTCA, являются относительно дорогими, одноразовыми иодноразовыми45. Кроме того, морфологические изменения клеток не могут быть визуализированы и зафиксированы на регистраторе (камере), а также анализ не может зафиксировать накопление вирусного антигена или изменения в белке клеточной поверхности, такие как VE-кадгерин вHUVECs 46. В результате RTCA не может визуализировать морфологические изменения клеток, которые могли бы предоставить дополнительную полезную информацию для выяснения патогенеза заболевания. Во время анализа или создания модели для валидации полученных измерений было бы полезно провести дополнительную проверку окрашивания, например, окрашивание VE-кадгерином для HUVEC. Кроме того, система RTCA ограничена адгезивными клеточными линиями, так как для регистрации импеданса требуется присоединение ячеек на дне лунок. Таким образом, представленный анализ не может быть использован для неадгезивных клеточных линий46.

В заключение мы описали протокол анализа клеток в режиме реального времени с использованием инструмента RTCA для мониторинга изменений в эндотелиальных клетках при инфицировании ZIKV в 96-луночном формате. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами анализа конечных точек, поскольку он позволяет использовать неинвазивный и не требующий использования этикеток подход для непрерывного мониторинга морфологических изменений клеток в режиме реального времени. Этот анализ также может быть использован для анализа изменений целостности сосудов других клеточных линий в различных экспериментальных установках.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Это исследование получило поддержку Министерства высшего образования Малайзии в рамках программы Центра передового опыта высших учебных заведений (HICoE) (MO002-2019) и финансирование в рамках Схемы долгосрочных исследовательских грантов (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
Antibiotic solution penicillin-streptomycin (P/S) Sciencell 0503
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
Collagen Type 1 SIgma-Aldrich C3867
Endothelial cell growth supplement (ECGS) Sciencell 1052
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
E-plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232368001
Fetal bovine serum (FBS) Sciencell 0025
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich H9394
Hemocytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) Sciencell 8000
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Latitude 3520 Laptop Dell  -
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Reagent reservior Tarsons T38-524090
RTCA resistor plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232350001
RTCA Software Pro (Version 2.6.1) Agilent Technologies, Inc. 5454433001
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380) Agilent Technologies, Inc. 00380601030 https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. , Garland Science. (2002).
  2. Pugsley, M. K., Tabrizchi, R. The vascular system: An overview of structure and function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 44 (2), 333-340 (2000).
  3. Stevens, T., Garcia, J. G., Shasby, D. M., Bhattacharya, J., Malik, A. B. Mechanisms regulating endothelial cell barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (3), L419-L422 (2000).
  4. Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. The Journal of Physiology. 569, 359-366 (2005).
  5. Boueiz, A., Hassoun, P. M. Regulation of endothelial barrier function by reactive oxygen and nitrogen species). Microvascular Research. 77 (1), 26-34 (2009).
  6. Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 619690 (2021).
  7. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  8. Iyer, S., Ferreri, D. M., DeCocco, N. C., Minnear, F. L., Vincent, P. A. VE-cadherin-p120 interaction is required for maintenance of endothelial barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (6), L1143-L1153 (2004).
  9. Puerta-Guardo, H., et al. Flavivirus NS1 triggers tissue-specific vascular endothelial dysfunction reflecting disease tropism. Cell Reports. 26 (6), 1598-1613 (2019).
  10. Rastogi, M., Singh, S. K. Zika virus NS1 affects the junctional integrity of human brain microvascular endothelial cells. Biochimie. 176, 52-61 (2020).
  11. Soe, H. J., et al. High dengue virus load differentially modulates human microvascular endothelial barrier function during early infection. Journal of General Virology. 98 (12), 2993-3007 (2017).
  12. Krouwer, V. J., Hekking, L. H. P., Langelaar-Makkinje, M., Regan-Klapisz, E., Post, J. A. Endothelial cell senescence is associated with disrupted cell-cell junctions and increased monolayer permeability. Vascular Cell. 4 (1), 12 (2012).
  13. Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
  14. Bryce, C., et al. Pathophysiology of SARS-CoV-2: targeting of endothelial cells renders a complex disease with thrombotic microangiopathy and aberrant immune response. The Mount Sinai COVID-19 autopsy experience. MedRxiv. , (2020).
  15. Khaiboullina, S., et al. Transcriptome profiling reveals pro-inflammatory cytokines and matrix metalloproteinase activation in Zika virus infected human umbilical vein endothelial cells. Frontiers in Pharmacology. 10, 642 (2019).
  16. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  17. Sarno, M., et al. Zika virus infection and stillbirths: a case of hydrops fetalis, hydranencephaly and fetal demise. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), e0004517 (2016).
  18. Dalrymple, N. A., Mackow, E. R. Virus interactions with endothelial cell receptors: implications for viral pathogenesis. Current Opinion in Virology. 7, 134-140 (2014).
  19. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (1), 64-75 (2014).
  20. Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212 (1), 173-179 (2013).
  21. Vozzi, F., Bianchi, F., Ahluwalia, A., Domenici, C. Hydrostatic pressure and shear stress affect endothelin-1 and nitric oxide release by endothelial cells in bioreactors. Biotechnology Journal. 9 (1), 146-154 (2014).
  22. Gallinat, A., Badimon, L. DJ-1 interacts with the ectopic ATP-synthase in endothelial cells during acute ischemia and reperfusion. Scientific Reports. 12 (1), 12753 (2022).
  23. Jiménez, N., Krouwer, V. J. D., Post, J. A. A new, rapid and reproducible method to obtain high quality endothelium in vitro. Cytotechnology. 65 (1), 1-14 (2013).
  24. Latifi-Navid, H., et al. Network analysis and the impact of Aflibercept on specific mediators of angiogenesis in HUVEC cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (17), 8285-8299 (2021).
  25. Poulet, M., et al. PRL-2 phosphatase is required for vascular morphogenesis and angiogenic signaling. Communications Biology. 3 (1), 603 (2020).
  26. Laurens, N., van Hinsbergh, V. W. Isolation, purification and culture of human micro- and macrovascular endothelial cells. Methods in Endothelial Cell Biology. , Springer. 3-13 (2004).
  27. Haudenschild, C. C., Zahniser, D., Folkman, J., Klagsbrun, M. Human vascular endothelial cells in culture: lack of response to serum growth factors. Experimental Cell Research. 98 (1), 175-183 (1976).
  28. Cenni, E., Perut, F., Baldini, N. In vitro models for the evaluation of angiogenic potential in bone engineering. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (1), 21-30 (2011).
  29. Lau, S., Gossen, M., Lendlein, A., Jung, F. Venous and arterial endothelial cells from human umbilical cords: potential cell sources for cardiovascular research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 978 (2021).
  30. Marquez-Curtis, L. A., Sultani, A. B., McGann, L. E., Elliott, J. A. W. Beyond membrane integrity: Assessing the functionality of human umbilical vein endothelial cells after cryopreservation. Cryobiology. 72 (3), 183-190 (2016).
  31. Park, H. -J., et al. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Reviews. 2 (2), 93-102 (2006).
  32. Dowling, C. M., Herranz Ors, C., Kiely, P. A. Using real-time impedance-based assays to monitor the effects of fibroblast-derived media on the adhesion, proliferation, migration and invasion of colon cancer cells. Bioscience Reports. 34 (4), e00126 (2014).
  33. Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
  34. Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus propagation and cell-based colorimetric quantification. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
  35. Kustermann, S., et al. A real-time impedance-based screening assay for drug-induced vascular leakage. Toxicological Sciences. 138 (2), 333-343 (2014).
  36. Albrecht, T., Fons, M., Boldogh, I., Rabson, A. S. Effects on cells. Medical Microbiology. 4th Edition. , (1996).
  37. Hematian, A., et al. Traditional and modern cell culture in virus diagnosis. Osong Public Health and Research Perspectives. 7 (2), 77-82 (2016).
  38. Friedman, H. M. Infection of endothelial cells by common human viruses. Reviews of Infectious Diseases. 11, S700-S704 (1989).
  39. Friedman, H. M., Macarak, E. J., MacGregor, R. R., Wolfe, J., Kefalides, N. A. Virus infection of endothelial cells. The Journal of Infectious Diseases. 143 (2), 266-273 (1981).
  40. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  41. Marlina, S., Shu, M. -H., AbuBakar, S., Zandi, K. Development of a Real-Time Cell Analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8, 579 (2015).
  42. Liu, S., DeLalio, L. J., Isakson, B. E., Wang, T. T. AXL-mediated productive infection of human endothelial cells by Zika virus. Circulation Research. 119 (11), 1183-1189 (2016).
  43. Souf, S. Recent advances in diagnostic testing for viral infections. Bioscience Horizons: The International Journal of Student Research. 9, (2016).
  44. Sun, M., et al. A dynamic real-time method for monitoring epithelial barrier function in vitro. Analytical Biochemistry. 425 (2), 96-103 (2012).
  45. Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicology Reports. 7, 335-344 (2020).
  46. Kho, D., et al. Application of xCELLigence RTCA biosensor technology for revealing the profile and window of drug responsiveness in real time. Biosensors. 5 (2), 199-222 (2015).

Tags

Биология выпуск 195 Эндотелиальные клетки пупочной вены человека Вирусная инфекция Импедансный анализ Анализ клеток в реальном времени Эндотелиальные клетки Барьер Обмен жидкости Обмен растворенных веществ Распространение вируса Проницаемость эндотелия Нарушение барьера эндотелиальных клеток Сосудистая утечка Анализатор клеток в режиме реального времени Инфекция вызванная вирусом Зика (ZIKV) Клеточный индекс (ДИ) Транзиторные эффекты Морфологические изменения клеток Целостность сосудов
Мониторинг изменений эндотелиальных клеток пупочной вены человека при вирусной инфекции с использованием импедансного клеточного анализа в режиме реального времени
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar,… More

Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Monitoring Changes in Human Umbilical Vein Endothelial Cells upon Viral Infection Using Impedance-Based Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (195), e64887, doi:10.3791/64887 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter