Summary
目前的研究描述了一种使用实时细胞分析 （RTCA） 系统监测病毒感染期间人脐静脉内皮细胞 （HUVEC） 变化的方案。
Abstract
内皮细胞排列在所有血液和淋巴管的内表面，形成半透性屏障，调节血液或淋巴与其周围组织之间的液体和溶质交换。病毒穿过内皮屏障的能力是促进病毒在人体内传播的重要机制。据报道，许多病毒在感染期间会改变内皮通透性和/或导致内皮细胞屏障破坏，从而导致血管渗漏。目前的研究描述了一种实时细胞分析（RTCA）协议，使用商业实时细胞分析仪来监测寨卡病毒（ZIKV）感染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）期间的内皮完整性和通透性变化。将ZIKV感染前后记录的阻抗信号转换为细胞指数（CI）值并进行分析。RTCA协议允许在病毒感染期间以细胞形态变化的形式检测瞬时效应。该测定也可用于研究其他实验设置中 HUVEC 血管完整性的变化。
Introduction
内皮细胞 （EC） 排列在所有血液和淋巴管的内表面。它们通过粘附物、紧密的间隙连接连接，在血液或淋巴与周围组织之间形成半透性屏障 1,2。完整的内皮细胞-细胞连接对于调节大分子、溶质和液体的运输至关重要，对相应组织和器官的生理活动至关重要3.内皮屏障是动态的，并受特定刺激的调节 4.内皮屏障功能的破坏或丧失是许多疾病发病机制中急性和慢性炎症中疾病病理生理学的标志5,6,7，包括病毒感染8,9,10,11。对于黄病毒，发现非结构蛋白 NS1 可以改变内皮通透性，例如，由于组织蛋白酶 L、唾液酸酶和内切糖苷酶9 的表达和激活增加，通过破坏内皮糖萼样层。在疾病状态下，内皮单层的完整性受到影响，细胞间连接被破坏，这可能导致内皮损伤和功能障碍12，并最终在多个器官系统中出现广泛的病理表现13,14。EC的病毒感染导致细胞信号通路和细胞基因表达谱的变化，这可能会影响液体屏障功能，导致ECs的破坏，并诱导血管渗漏10,15。已发现 EC 的寨卡病毒 （ZIKV） 感染会破坏连接完整性，从而导致血管通透性发生变化并导致内皮屏障功能障碍，从而导致血管渗漏10,15。研究表明，寨卡病毒与严重的出生缺陷有关;然而，关于发生这种情况的确切机制知之甚少16,17。因此，了解感染期间内皮屏障的变化对于了解疾病机制至关重要。
ECs目前被用作各种生理和病理过程的重要实验性体外血管模型系统18,19,20,21。人脐静脉内皮细胞 （HUVEC） 已被广泛用作主要的非永生化细胞系统，用于研究体外血管内皮和血管生物学 22、23、24、25。HUVEC 于 1970 年代初首次从人脐带的脐静脉中分离出来用于体外培养26。HUVEC具有鹅卵石状的形态，很容易在实验室中增殖。由于长时间保持汇合状态后的剪切应力，观察到细胞形状的伸长。HUVEC 的特征是存在 Weibel 和 Palade 小体 （WPB）、松核囊泡、位于细胞核附近的少量原纤维、具有管状形状的线粒体，很少显示分支、具有浓缩染色质细颗粒图案的椭球形细胞核，以及每个细胞核中存在一到三个核仁27.尽管 HUVEC 表现出许多形态学特征，但仅通过光学检查无法实现 HUVEC 的鉴定。血管内皮 （VE）-钙粘蛋白的免疫荧光染色等检测方法通常用于监测 HUVEC 的血管完整性 28,29,30,31。
本研究描述了 HUVEC 感染的实时细胞分析 （RTCA） 方案。RTCA系统使用专门的镀金板，其中包含微电极，为电池连接提供导电表面。当电池附着在微电极表面时，会形成阻碍电子流过微电极的屏障。微电极产生的阻抗的测量可用于获取有关某些细胞过程的信息，包括细胞附着、增殖和迁移32。报告的检测是一种基于阻抗的细胞检测，与实时细胞分析仪相结合，以无创和无标记的方式连续测量活细胞增殖、形态变化（如细胞收缩）和细胞附着质量。在这项研究中，实时细胞分析仪用于监测ZIKV感染期间HUVECs的内皮完整性和形态变化。简而言之，该仪器测量在培养基（导电溶液）存在下在专门的金微电极涂层微量滴定板中传输的电子流。细胞粘附或细胞数量和形态的变化会干扰电子流并导致仪器可以捕获的阻抗变化（补充图1）。通过电阻抗信号实时记录 ZIKV 感染前后 HUVEC 生长、增殖和粘附之间的差异，然后转换为细胞指数 （CI） 值。感染前的 CI 值用作 CI 值归一化的基线。CI值的变化反映了感染时的细胞形态变化或细胞粘附性丧失33。研究结果表明，与终点测定（例如VE-钙粘蛋白的免疫荧光染色）相比，RTCA方案允许检测病毒感染期间的瞬时效应或细胞形态变化。RTCA方法可用于分析其他病毒感染后HUVEC血管完整性的变化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 细胞制备
- HUVEC的制备
- 在含有 12 mL 内皮细胞培养基 （ECM） 的 75 cm2（包被 20 μg/mL 1 型胶原蛋白）细胞培养瓶中培养 7.5 x 105 个 HUVEC 细胞/mL，其中含有 HUVEC 培养所需的生长因子、激素和蛋白质的 0.01% 内皮细胞生长补充剂 （ECGS）， 和 0.01% 青霉素-链霉素 （P/S）。在37°C的细胞培养箱中用5%CO2孵育细胞（图1）。
2. RTCA实验的设置
- 在RTCA上运行电阻器验证
- 双击桌面中的 RTCA 软件 图标以启动应用程序。将出现一个登录窗口，输入用户名和密码进行登录。
- 将 A1 孔朝内的 96 孔 RTCA 电阻板放入位于细胞培养箱中的 RTCA 站中。
- 在 RTCA 软件的 Exp Notes 选项卡中，键入实验名称、设备 SN 和设备类型（QC 板）。
- 在RTCA软件的“单元”选项卡下的“布局”选项卡中，突出显示所有孔，然后右键单击突出显示的孔，以确保所有孔都已打开（灰色显示）。
- 在 RTCA 软件的 “计划 ”选项卡中，单击“ Step_1”。输入 扫描：10 和 间隔：30 秒。单击 应用。单击软件左上角的 “开始/继续 ”以开始验证运行。
注意： 通过观察“板扫描”，确保孔与 RTCA 站的连接正常。连接正常“。
- 电阻器验证运行，用于数据分析
- 在 “单元格索引 ”选项卡中，在运行完成后检查数据。所有 CI 值都应小于 0.063。
- 在 “单元格索引 ”选项卡的下半部分，检查原始扫描数据。原始扫描数据应显示 40.0 ± 2.0（行 A 和 H）、67.5 ± 2.5（行 B 和 G）、93.6 ± 2.9（行 C 和 F）和 117.6 ± 3.2（行 D 和 E）的重复值模式。
- 要停止验证运行，请单击 “板”>“释放板”。96 孔 RTCA 电阻板现在已准备好从 RTCA 工作站中移除。
- 获取RTCA的背景资料
- 用 60 μL/孔的 Hank 平衡盐溶液（HBSS;含碳酸氢钠，不含氯化钙和硫酸镁）洗涤 1 型胶原蛋白包被的专用金微电极板（涂有 20 μg/mL 1 型胶原蛋白）2x。
- 弃去剩余的 HBSS 并加入 50 μL/孔 ECM。将含有ECM的专用金微电极板（A1孔朝内）放入位于细胞培养箱中的RTCA站中。
- 在RTCA软件的 “实验说明 ”选项卡中，键入实验名称、设备SN和设备类型（96孔格式）。
- 在RTCA软件的“单元”选项卡下的“布局”选项卡中，突出显示将使用的孔，然后右键单击突出显示的孔，以确保所有孔都已打开（灰显）。
- 在RTCA软件的 “计划 ”选项卡中，单击 “Step_1”，然后单击软件左上角的 “开始/继续 ”以获取后台读数。
注意： 通过观察“板扫描”确保孔的连接正确。连接正常“。 - 获得背景读数后，专用的金微电极板现在已准备好进行细胞接种，并准备从RTCA站中取出。
- 在专用金微电极板中制备HUVEC
- 用 50 μL/孔的条件培养基、1 x 104 个细胞/孔（条件培养基：补充有 10% FBS、0.01% ECGS 和 0.01% P/S 的 ECM）将 HUVEC 接种在专门的金微电极板中。将板放回RTCA站中，A1孔朝内，在37°C的细胞培养箱中用5%CO2孵育过夜。
注意：使用血细胞计数器对稀释因子为2的细胞悬浮液进行细胞计数。 - 在 “计划 ”选项卡中，单击左上角 的“添加步骤 ”。单击“ Step_2 ”并更改“扫描：601”和“间隔：2 分钟”，单击 “应用”。单击 “Step_2 ”，然后单击软件左上角的 “开始/继续 ”。
- 孵育 20 小时后，当 孔图 选项卡中的 CI 值显示平台期时，板已准备好感染。在 RTCA 软件的 “计划 ”选项卡中，单击“ 中止步骤”。
- 现在，专用的金微电极板已准备好从RTCA站中取出，以进行后续步骤。
- 用 50 μL/孔的条件培养基、1 x 104 个细胞/孔（条件培养基：补充有 10% FBS、0.01% ECGS 和 0.01% P/S 的 ECM）将 HUVEC 接种在专门的金微电极板中。将板放回RTCA站中，A1孔朝内，在37°C的细胞培养箱中用5%CO2孵育过夜。
3. HUVECs中的病毒感染
- 病毒稀释
- 将ZIKV原料保持在-80°C。 对于本研究，除去保存在低温小瓶中的病毒储备液，并在 1.5 mL 离心管中用无血清 ECM 稀释 ZIKV 储备液，以实现 0.1 和 1 的多重感染 （MOI）。
注意：ZIKV原液先前是通过在Vero细胞中进行繁殖并收获ZIKV上清液34来制备的。
- 将ZIKV原料保持在-80°C。 对于本研究，除去保存在低温小瓶中的病毒储备液，并在 1.5 mL 离心管中用无血清 ECM 稀释 ZIKV 储备液，以实现 0.1 和 1 的多重感染 （MOI）。
- 细胞单层感染
- 从每个孔中取出并弃去条件培养基（补充有 10% FBS、0.01% ECGS 和 0.01% P/S 的 ECM）。用 60 μL HBSS 2x 冲洗每个孔。借助孔的侧面插入HBSS;不要拍摄细胞单层。
- 从最高到最低稀释度工作，将 40 μL 每个稀释的病毒样品加入无血清 ECM 中到孔中。每次稀释将孔重复三份，并保持六个孔无感染（阴性对照和阳性对照凝血酶）。不要拍摄细胞单层;取而代之的是，借助孔的侧面添加稀释的病毒。每次插入时都使用新鲜的移液管吸头。
注意：选择凝血酶作为阳性对照，因为它可以快速增加 HUVEC 的内皮通透性。 - 将板在37°C的细胞培养箱中用5%CO2 孵育，以允许病毒吸附。每 15 分钟漱口板 5 次，以使病毒在整个细胞单层中吸附。
- 添加覆盖细胞培养基
- 孵育1小时后，从最低浓度到最高浓度除去并弃去病毒悬浮液。
- 用 60 μL HBSS 2x 洗涤感染细胞。用补充有 2% FBS 的 ECM 覆盖孔。对于阳性对照孔，用补充有 2% FBS 的 ECM 将凝血酶稀释至 20 U/mL，并用含凝血酶的 ECM 培养基覆盖孔。不要拍摄细胞单层;取而代之的是，借助孔的侧面添加覆盖介质。
- 将受感染的专用金微电极板放回RTCA站
- 在“计划”选项卡中，单击左上角的“添加步骤”。单击“Step_3”并更改“扫描：3,601”和“间隔：2分钟”。
- 在弹出的窗口中单击 “确定 ”。将受感染的专用金微电极板（A1孔朝内）放入位于细胞培养箱中的RTCA站中。
- 单击 “Step_3 ”，然后单击软件左上角的 “开始/继续 ”。
4. 数据分析和导出数据
- 添加每孔的实验信息
- 在 “布局 ”选项卡中，单击“ 单元格 ”选项卡（图 2A）。要输入目标细胞信息并确定每个孔的孔类型，请突出显示孔并在软件底部输入目标细胞名称、编号和颜色。单击 “应用 ”（图2B）。
- 要在 “单元 格”选项卡中选择和确定每个孔的孔类型，请加亮孔，选择 孔类型 （样品、阳性对照或阴性对照），然后单击 设置。
- 在 “布局 ”选项卡中，单击 “处理 ”选项卡（图2C）。要输入处理信息，请突出显示孔并输入处理名称、处理浓度、单位和颜色。单击 Apply （图 2D）。
- 要在 “处理 ”选项卡上选择和确定每个孔的孔类型，请突出显示孔，选择 孔类型 （样品、阳性对照或阴性对照），然后单击 “设置”。
注意：对于每个选择，可以同时突出显示多个孔。
- CI 值的归一化
- 右键单击“数据分析”选项卡的右侧，然后从“Y轴”下拉框中选择“归一化单元格索引”（图3A）。在底部的X轴部分，选择归一化时间作为最后测量的时间点，其中专用的金微电极板被移除以进行感染（图3B）。
注意：只要选择的归一化点是在添加病毒和/或处理之前，软件执行的归一化过程就消除了由于孔播种和附着差异而导致的大部分可变性。因此，最佳归一化时间点应该是添加病毒和/或治疗之前的最后一个时间点。可以在“Step_2”下的“计划”选项卡中检查要规范化的时间点。指示的总时间是归一化的时间点（图3C）。
- 右键单击“数据分析”选项卡的右侧，然后从“Y轴”下拉框中选择“归一化单元格索引”（图3A）。在底部的X轴部分，选择归一化时间作为最后测量的时间点，其中专用的金微电极板被移除以进行感染（图3B）。
- 使用RTCA软件绘制获得的数据
- 在 “数据分析 ”选项卡中，通过突出显示油井并单击“ 添加”<<选择要添加到图表中的油井。现在，可以复制和导出针对时间图的归一化单元格索引。确保勾选 平均 复选框。
- 使用RTCA软件导出数据
- 在RTCA软件的左上角，单击 “板”>“导出实验信息...”。选中该框以选择要导出的数据。单击 “确定”。
注意：勾选“ 单元格索引”>“全部 ”时，可以导出原始数据（原始 CI 值）。 - 选择要保存导出文件的文件夹。单击 保存。将出现一个弹出窗口，指示导出实验信息。导出完成后，将出现另一个窗口，指示导出的实验信息已准备好查看。
- 在RTCA软件的左上角，单击 “板”>“导出实验信息...”。选中该框以选择要导出的数据。单击 “确定”。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在ZIKV感染之前，在专用的金微电极包被的微量滴定板上培养的HUVEC单层记录的CI高于8，表明具有很强的粘附性。CI 指数小于 8 的板或孔应丢弃。然后以 0.1 和 1 的 MOI 感染 HUVEC 的 ZIKV，并记录细胞阻抗 7 天。与阴性感染对照组（棕线; 图4）。至于感染较高剂量ZIKV P6-740的HUVECs，MOI为1（蓝线），CI值早在11 HPI时就开始下降。在 24 HPI 时，当 EC 感染 ZIKV 时，归一化 CI 值 （0.949， 0.929） 分别下降 5% 和 7%，MOI 分别为 0.1 和 1。ZIKV感染后，在96 HPI和66.75 HPI时，标准化CI值分别降低了50%，MOI分别为0.1和1。归一化CI值达到最低点为107 HPI，ZIKV感染后分别降低51%和60%（0.4915,0.3984），MOI为0.1和1。发现归一化 CI 值从 107 HPI 开始到 168 HPI （0.5128， 0.4571） 的实验结束，分别增加了 4% 和 13%。黑线显示了用作阳性对照的凝血酶的作用，其中 CI 值在整个实验过程中保持较低，模拟紧密连接的破坏，并诱导血管渗漏35。
图 1：人脐静脉内皮细胞 （HUVEC）。 该图以 40 倍放大倍率查看汇合率。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：RTCA 软件上“布局”选项卡下的“细胞和治疗”选项卡的屏幕截图。 （A）在“布局”选项卡中，单击“单元格”选项卡。 （B） 要输入目标细胞信息并确定每个孔的孔类型，请突出显示孔并在软件底部键入目标细胞名称、编号和颜色。单击应用。（C） 单击“处理”选项卡下的“布局”选项卡。 （D） 要输入处理信息，请突出显示孔并输入处理名称、处理浓度、单位和颜色。单击应用。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：RTCA 软件中用于单元格索引归一化的“数据分析”选项卡的屏幕截图。 （A）在 Y 轴 下拉框中，选择 归一化单元格索引.（B）在 X 轴 部分，选择归一化时间。（C） RTCA 软件中“计划”选项卡的屏幕截图。归一化时间以总时间Step_2表示。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：人脐静脉内皮细胞 （HUVEC） 中寨卡病毒 （ZIKV） 感染的归一化细胞指数与时间的关系图。 专用金微电极板涂有 20 μg/mL 1 型胶原蛋白。HUVEC以1.0 x 104 个细胞/孔的密度接种。ZIKV P6-740 （MOI： 0.1， 1） 用于感染。浅蓝色：ZIKV P6-740 （MOI： 0.1）;蓝色：ZIKV P6-740 （MOI： 1）;黑色：凝血酶为阳性对照 （20 U/mL）;棕色：阴性感染控制。每个数据点表示平均值，并一式三份进行分析。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充图1：基于电生物传感器阻抗的RTCA所用技术示意图。 孔板的侧视图;在井的底部有镀金的负极和正极。当仪器在含有允许导电的培养基的微孔中测量 CI 时，电子从负极端流到正极端子。当它是空白控制时，电子流动是平滑的，因此不记录阻抗。当细胞被接种时，随着越来越多的细胞附着在井底，电子流中的阻抗就会存在并被计算机记录下来。使用该阻抗值，仪器将其转换为CI值，指示连接到孔底的电池数量（附着力）。使用 BioRender 创建。 请点击此处下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
允许细胞中的杀细胞病毒感染通常与细胞形态和生物合成的实质性变化有关36。病毒诱导的细胞形态变化，如细胞萎缩、细胞增大和/或合胞体形成，也称为细胞病变效应 （CPE），是某些病毒感染的特征37。在 EC 中，CPE 被描述为细胞的破坏和每个 EC 之间紧密连接的破坏，从而导致内皮屏障的破坏 38,39。HUVEC中的CPE可以描述为单层细胞分离并漂浮在组织培养容器中。感染的细胞形态变化，如贴壁细胞的分离和漂浮，可以使用RTCA方法连续检测。该技术基于电阻抗，可以实时监测电池，最多每隔几秒钟。它允许定量细胞增殖、形态变化，并且在 HUVEC 的情况下，它可用于监测刺激时内皮完整性和细胞屏障功能40 的变化。
在这项研究中，关键步骤是设置实验，其中使用 96 孔电阻板。这是为了确保分析仪的所有连接都很好地连接到板上。在RTCA中，测量的阻抗值被转换为CI值，以区分细胞数量、粘附度、细胞形态和细胞活力的差异41。RTCA分析仪记录的阻抗下降，转化为CI值的下降，表明细胞数量减少，粘附度减弱，细胞形态发生实质性变化42。因此，测试细胞系的适用性和用于RTCA实验的最佳细胞数量也很重要。在使用 RTCA 系统对细胞进行测试之前，确定是否可以达到所需的 CI 指数至关重要。此外，这也有助于确定RTCA系统是否适合监测所选细胞类型的细胞生长和细胞死亡谱。在我们的研究中，当 HUVEC 感染 ZIKV P6-740 时，观察到 CI 值急剧下降，MOI 为 0.1 和 1。CI值的急剧下降，因此表明感染后发生了HUVEC细胞形态变化，这导致了紧密连接和EC血管完整性的破坏。
传统上，由 体外 细胞病毒感染引起的CPEs是根据对感染细胞的显微镜观察来估计的。此外，其他一些测定，例如噬菌斑测定，允许 CPE 的可视化（例如细胞脱离），并用于测量 CPE的范围 42。然而，这些方法的局限性在于它们仅提供有关细胞形态变化的离散时间点的信息（终点测定）。其他测定，如免疫荧光染色，依赖于用荧光团标记的特异性抗体的组合来可视化形态变化43。尽管免疫荧光测定具有广泛的功能，可以可视化任何给定组织或细胞类型中的许多成分，但该技术不允许在病毒感染期间进行实时监测和检测。相比之下，RTCA系统记录了病毒感染期间的实时细胞形态变化，从而可以捕获终点测定可能遗漏的瞬时效应，例如瞬时血管渗漏。例如，终点测定无法检测到早在 60 HPI、80 HPI 和 100 HPI 时的数据和形态变化。除RTCA外，跨上皮电阻（TEER）测量是监测细胞间相互作用的另一种常用方法，其中测量细胞单层上的电阻。然而，TEER需要随着时间的推移进行多次重复测量，以监测活细胞活动，并且通常一次对少量样品或孔进行。因此，与RTCA相比，TEER的通量通常较低，RTCA可以同时运行多达96个井44。
尽管有其优点，但RTCA系统有几个局限性。RTCA系统的主要局限性是昂贵的设备和耗材。RTCA系统使用的专用金微电极板相对昂贵，一次性使用且一次性45。此外，细胞形态变化不能在记录仪（相机）上成像和捕获，测定也不能捕获病毒抗原的积累或细胞表面蛋白的变化，例如HUVECs中的VE-钙粘蛋白46。因此，RTCA无法可视化细胞形态变化，而这些变化将提供额外的有用信息来阐明疾病的发病机制。在测定或模型建立期间，额外的染色验证，例如 HUVEC 的 VE-钙粘蛋白染色，将有助于验证获得的测量结果。此外，RTCA系统仅限于贴壁细胞系，因为它需要将细胞附着在孔底部以记录阻抗。因此，所报道的测定不能用于非贴壁细胞系46。
总之，我们描述了一种使用 RTCA 仪器以 96 孔形式监测 ZIKV 感染后内皮细胞变化的实时细胞分析方案。与传统的终点检测相比，该方法具有多项优势，因为它允许采用非侵入性和非标记密集型方法，实时连续监测细胞形态变化。该测定还可用于分析不同实验设置中其他细胞系的血管完整性变化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明他们没有竞争利益。
Acknowledgments
这项研究得到了马来西亚高等教育部在高等教育卓越中心（HICoE）计划（MO002-2019）下的支持，以及长期研究资助计划（LRGS MRUN第一阶段：LRGS MRUN/F1/01/2018）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| Antibiotic solution penicillin-streptomycin (P/S) | Sciencell | 0503 | |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| Collagen Type 1 | SIgma-Aldrich | C3867 | |
| Endothelial cell growth supplement (ECGS) | Sciencell | 1052 | |
| Endothelial cell medium (ECM) | Sciencell | 1001 | |
| E-plate 96 | Agilent Technologies, Inc. | 05232368001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sciencell | 0025 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H9394 | |
| Hemocytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) | Sciencell | 8000 | |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Latitude 3520 Laptop | Dell | - | |
| Multichannel micropipette (10 - 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 - 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Reagent reservior | Tarsons | T38-524090 | |
| RTCA resistor plate 96 | Agilent Technologies, Inc. | 05232350001 | |
| RTCA Software Pro (Version 2.6.1) | Agilent Technologies, Inc. | 5454433001 | |
| Single channel pipettes (10 - 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 - 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 - 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380) | Agilent Technologies, Inc. | 00380601030 | https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232 |
References
- Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. , Garland Science. (2002).
- Pugsley, M. K., Tabrizchi, R. The vascular system: An overview of structure and function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 44 (2), 333-340 (2000).
- Stevens, T., Garcia, J. G., Shasby, D. M., Bhattacharya, J., Malik, A. B. Mechanisms regulating endothelial cell barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (3), L419-L422 (2000).
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. The Journal of Physiology. 569, 359-366 (2005).
- Boueiz, A., Hassoun, P. M. Regulation of endothelial barrier function by reactive oxygen and nitrogen species). Microvascular Research. 77 (1), 26-34 (2009).
- Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 619690 (2021).
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
- Iyer, S., Ferreri, D. M., DeCocco, N. C., Minnear, F. L., Vincent, P. A. VE-cadherin-p120 interaction is required for maintenance of endothelial barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (6), L1143-L1153 (2004).
- Puerta-Guardo, H., et al. Flavivirus NS1 triggers tissue-specific vascular endothelial dysfunction reflecting disease tropism. Cell Reports. 26 (6), 1598-1613 (2019).
- Rastogi, M., Singh, S. K. Zika virus NS1 affects the junctional integrity of human brain microvascular endothelial cells. Biochimie. 176, 52-61 (2020).
- Soe, H. J., et al. High dengue virus load differentially modulates human microvascular endothelial barrier function during early infection. Journal of General Virology. 98 (12), 2993-3007 (2017).
- Krouwer, V. J., Hekking, L. H. P., Langelaar-Makkinje, M., Regan-Klapisz, E., Post, J. A. Endothelial cell senescence is associated with disrupted cell-cell junctions and increased monolayer permeability. Vascular Cell. 4 (1), 12 (2012).
- Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
- Bryce, C., et al. Pathophysiology of SARS-CoV-2: targeting of endothelial cells renders a complex disease with thrombotic microangiopathy and aberrant immune response. The Mount Sinai COVID-19 autopsy experience. MedRxiv. , (2020).
- Khaiboullina, S., et al. Transcriptome profiling reveals pro-inflammatory cytokines and matrix metalloproteinase activation in Zika virus infected human umbilical vein endothelial cells. Frontiers in Pharmacology. 10, 642 (2019).
- Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
- Sarno, M., et al. Zika virus infection and stillbirths: a case of hydrops fetalis, hydranencephaly and fetal demise. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), e0004517 (2016).
- Dalrymple, N. A., Mackow, E. R. Virus interactions with endothelial cell receptors: implications for viral pathogenesis. Current Opinion in Virology. 7, 134-140 (2014).
- Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (1), 64-75 (2014).
- Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212 (1), 173-179 (2013).
- Vozzi, F., Bianchi, F., Ahluwalia, A., Domenici, C. Hydrostatic pressure and shear stress affect endothelin-1 and nitric oxide release by endothelial cells in bioreactors. Biotechnology Journal. 9 (1), 146-154 (2014).
- Gallinat, A., Badimon, L. DJ-1 interacts with the ectopic ATP-synthase in endothelial cells during acute ischemia and reperfusion. Scientific Reports. 12 (1), 12753 (2022).
- Jiménez, N., Krouwer, V. J. D., Post, J. A. A new, rapid and reproducible method to obtain high quality endothelium in vitro. Cytotechnology. 65 (1), 1-14 (2013).
- Latifi-Navid, H., et al. Network analysis and the impact of Aflibercept on specific mediators of angiogenesis in HUVEC cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (17), 8285-8299 (2021).
- Poulet, M., et al. PRL-2 phosphatase is required for vascular morphogenesis and angiogenic signaling. Communications Biology. 3 (1), 603 (2020).
- Laurens, N., van Hinsbergh, V. W. Isolation, purification and culture of human micro- and macrovascular endothelial cells. Methods in Endothelial Cell Biology. , Springer. 3-13 (2004).
- Haudenschild, C. C., Zahniser, D., Folkman, J., Klagsbrun, M. Human vascular endothelial cells in culture: lack of response to serum growth factors. Experimental Cell Research. 98 (1), 175-183 (1976).
- Cenni, E., Perut, F., Baldini, N. In vitro models for the evaluation of angiogenic potential in bone engineering. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (1), 21-30 (2011).
- Lau, S., Gossen, M., Lendlein, A., Jung, F. Venous and arterial endothelial cells from human umbilical cords: potential cell sources for cardiovascular research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 978 (2021).
- Marquez-Curtis, L. A., Sultani, A. B., McGann, L. E., Elliott, J. A. W. Beyond membrane integrity: Assessing the functionality of human umbilical vein endothelial cells after cryopreservation. Cryobiology. 72 (3), 183-190 (2016).
- Park, H. -J., et al. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Reviews. 2 (2), 93-102 (2006).
- Dowling, C. M., Herranz Ors, C., Kiely, P. A. Using real-time impedance-based assays to monitor the effects of fibroblast-derived media on the adhesion, proliferation, migration and invasion of colon cancer cells. Bioscience Reports. 34 (4), e00126 (2014).
- Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
- Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus propagation and cell-based colorimetric quantification. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
- Kustermann, S., et al. A real-time impedance-based screening assay for drug-induced vascular leakage. Toxicological Sciences. 138 (2), 333-343 (2014).
- Albrecht, T., Fons, M., Boldogh, I., Rabson, A. S.
- Hematian, A., et al. Traditional and modern cell culture in virus diagnosis. Osong Public Health and Research Perspectives. 7 (2), 77-82 (2016).
- Friedman, H. M. Infection of endothelial cells by common human viruses. Reviews of Infectious Diseases. 11, S700-S704 (1989).
- Friedman, H. M., Macarak, E. J., MacGregor, R. R., Wolfe, J., Kefalides, N. A.
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
- Marlina, S., Shu, M. -H., AbuBakar, S., Zandi, K. Development of a Real-Time Cell Analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8, 579 (2015).
- Liu, S., DeLalio, L. J., Isakson, B. E., Wang, T. T. AXL-mediated productive infection of human endothelial cells by Zika virus. Circulation Research. 119 (11), 1183-1189 (2016).
- Souf, S. Recent advances in diagnostic testing for viral infections. Bioscience Horizons: The International Journal of Student Research. 9, (2016).
- Sun, M., et al. A dynamic real-time method for monitoring epithelial barrier function in vitro. Analytical Biochemistry. 425 (2), 96-103 (2012).
- Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicology Reports. 7, 335-344 (2020).
- Kho, D., et al. Application of xCELLigence RTCA biosensor technology for revealing the profile and window of drug responsiveness in real time. Biosensors. 5 (2), 199-222 (2015).
