Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Overvågning af ændringer i humane navlestrengendototelceller ved virusinfektion ved hjælp af impedansbaseret celleanalyse i realtid

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64887
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

Den aktuelle undersøgelse beskriver en protokol til overvågning af ændringer i humane navlestrengendotelceller (HUVEC'er) under virusinfektion ved hjælp af et realtidscelleanalysesystem (RTCA).

Abstract

Endotelceller linjer den indre overflade af alt blod og lymfekar, hvilket skaber en semipermeabel barriere, der regulerer væske og opløst stofudveksling mellem blod eller lymfe og deres omgivende væv. En viruss evne til at krydse endotelbarrieren er en vigtig mekanisme, der letter virusspredning i menneskekroppen. Mange vira rapporteres at ændre endotelpermeabilitet og / eller forårsage endotelcellebarriereforstyrrelse under infektion, hvilket er i stand til at forårsage vaskulær lækage. Den aktuelle undersøgelse beskriver en realtidscelleanalyseprotokol (RTCA) ved hjælp af en kommerciel realtidscelleanalysator til overvågning af endotelintegritet og permeabilitetsændringer under Zika-virus (ZIKV) infektion i de humane navlestrengendotelceller (HUVEC'er). Impedanssignalerne optaget før og efter ZIKV-infektion blev oversat til celleindeksværdier (CI) og analyseret. RTCA-protokollen tillader påvisning af forbigående virkninger i form af cellemorfologiske ændringer under en virusinfektion. Dette assay kan også være nyttigt til at studere ændringer i HUVECs vaskulære integritet i andre eksperimentelle opsætninger.

Introduction

Endotelceller (EC'er) linjer den indre overflade af alle blod og lymfekar. De er forbundet med adhærens, tætte mellemrumskryds, hvilket skaber en semipermeabel barriere mellem blod eller lymfe og det omgivende væv 1,2. De intakte endotelcelle-celle-krydsninger er afgørende for regulering af transporten af makromolekyler, opløste stoffer og væsker, afgørende for de fysiologiske aktiviteter i de tilsvarende væv og organer3. Endotelbarrieren er dynamisk og moduleret af specifikke stimuli4. Forstyrrelse eller tab af endotelbarrierefunktion er et kendetegn ved sygdomspatofysiologi ved akut og kronisk inflammation i patogenesen af mange sygdomme 5,6,7, herunder virusinfektion 8,9,10,11. For flavivirus blev det fundet, at det ikke-strukturelle protein NS1 kan ændre endotelpermeabiliteten, for eksempel via forstyrrelse af det endotelglycocalyxlignende lag som følge af øget ekspression og aktivering af cathepsin L, sialidaser og endoglycosidaseheparinase9. I sygdomstilstanden påvirkes integriteten af endotelmonolaget, og celle-celle-krydsninger forstyrres, hvilket kan føre til endotelskade og dysfunktion12 og til sidst udbredte patologiske manifestationer på tværs af flere organsystemer13,14. Viral infektion af EC'er resulterer i ændringer i cellesignalveje og cellulær genekspressionsprofil, hvilket kan påvirke væskebarrierefunktionerne, forårsage forstyrrelse af EC'erne og inducere vaskulær lækage10,15. Zikavirus (ZIKV) infektion af EC'er har vist sig at forstyrre den junctionale integritet, der forårsager ændringer i vaskulær permeabilitet og fører til endotelbarrieredysfunktion, hvilket resulterer i vaskulær lækage10,15. Undersøgelser har vist, at ZIKV er forbundet med alvorlige fødselsdefekter; Imidlertid vides der ikke meget om den nøjagtige mekanisme, hvormed dette sker 16,17. Forståelse af endotelbarriereændringer under en infektion er derfor afgørende for at forstå sygdomsmekanismen.

EC'er anvendes i øjeblikket som et vigtigt eksperimentelt in vitro vaskulært modelsystem til forskellige fysiologiske og patologiske processer 18,19,20,21. Humane navlestrengendotelceller (HUVEC'er) er blevet anvendt i vid udstrækning som et primært, ikke-udødeliggjort cellesystem til at studere det vaskulære endotel og vaskulære biologi in vitro 22,23,24,25. HUVEC'er blev først isoleret til in vitro-kultur i begyndelsen af 1970'erne fra navlestrengen i den menneskelige navlestreng26. HUVEC'er har en brostenslignende morfologi, der let kan bringes til at sprede sig i laboratoriet. På grund af forskydningsspænding efter at være blevet opretholdt i lange perioder i sammenflydende tilstand observeres forlængelse af celleformen. HUVEC'er kan karakteriseres ved tilstedeværelsen af Weibel- og Palade-legemer (WPB), pinocytiske vesikler, små mængder fibriller placeret nær kernen, mitokondrier med rørformede former, der sjældent viser forgreninger, en ellipsoid kerne med et fint granulært mønster af kondenseret kromatin og en til tre nukleoler til stede i hver kerne27. Selv om HUVEC'er udviser talrige morfologiske karakteristika, kan identifikation af HUVEC'er ikke opnås ved optisk undersøgelse alene. Assays, såsom immunofluorescensfarvning af vaskulær endotelial (VE)-cadherin, anvendes almindeligvis til overvågning af vaskulær integritet i HUVECs 28,29,30,31.

Denne undersøgelse beskriver realtidscelleanalyseprotokollen (RTCA) for infektion af HUVEC'er. RTCA-systemet bruger specialiserede guldbelagte plader indeholdende mikroelektroder, der giver en ledende overflade til cellefastgørelsen. Når cellerne fastgøres til mikroelektrodeoverfladen, dannes en barriere, der forhindrer elektronstrømmen gennem mikroelektroderne. Måling af impedansen genereret af mikroelektroder kan bruges til at få information om nogle cellulære processer, herunder cellevedhæftninger, proliferation og migration32. Det rapporterede assay er et impedansbaseret cellulært assay, der kombineret med en realtidscelleanalysator giver kontinuerlig måling af levende celleproliferation, morfologiændringer (såsom cellekrympning) og cellevedhæftningskvalitet på en ikke-invasiv og etiketfri måde. I denne undersøgelse anvendes realtidscelleanalysatoren til at overvåge endotelintegriteten og morfologiske ændringer af HUVEC'er under ZIKV-infektion. Kort fortalt måler instrumentet elektronstrømmen transmitteret i specialiserede guld-mikroelektrodebelagte mikrotiterplader i nærværelse af et kulturmedium (elektrisk ledende opløsning). Celleadhærens eller ændringer i celleantal og morfologi forstyrrer elektronstrømmen og forårsager impedansvariationer, der kan fanges af instrumentet (supplerende figur 1). Forskellen mellem HUVEC-vækst, spredning og vedhæftning før og efter ZIKV-infektion registreres i realtid af et elektrisk impedanssignal og oversættes derefter til celleindeks (CI) værdi. CI-værdien fra præinfektionen bruges som baseline for CI-værdinormalisering. Ændringerne i CI-værdier afspejler cellulære morfologiske ændringer eller celleadhærenstab ved infektionen33. Undersøgelsesresultaterne viser, at RTCA-protokollen tillader påvisning af forbigående virkninger eller cellemorfologiske ændringer under virusinfektion sammenlignet med et endepunktsassay, såsom immunofluorescensfarvning af VE-cadherin. RTCA-metoden kan være nyttig til analyse af HUVEC vaskulære integritetsændringer ved infektion med andre vira.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Celle forberedelse

  1. Udarbejdelse af HUVEC'er
    1. Der dyrkes 7,5 x 105 HUVEC-celler/ml i en 75 cm2 (belagt med 20 μg/ml kollagen type 1) cellekulturkolbe indeholdende 12 ml endotelcellemedium (ECM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 0,01% endotelcellevæksttilskud (EKG'er), der indeholder vækstfaktorer, hormoner og proteiner, der er nødvendige for dyrkning af HUVEC'er, og 0,01% penicillin-streptomycin (P/S). Cellerne inkuberes i en cellekulturkuvøse ved 37 °C med 5 % CO2 (figur 1).

2. Opsætning af RTCA-eksperiment

  1. Modstandsbekræftelse kører på RTCA
    1. Dobbeltklik på RTCA-softwareikonet på skrivebordet for at starte programmet. Et login-vindue vises, indtast brugernavnet og adgangskoden for at logge ind.
    2. Placer en 96-brønds RTCA-modstandsplade med A1-brønden vendt indad i RTCA-stationen placeret i cellekulturinkubatoren.
    3. På fanen Exp Notes i RTCA-softwaren skal du skrive eksperimentnavnet, enheds-SN og enhedstype (QC-plade).
    4. På fanen Layout under fanen Celle i RTCA-softwaren skal du fremhæve alle brøndene og højreklikke på de fremhævede brønde for at sikre, at alle brøndene er tændt (nedtonet).
    5. På fanen Planlæg i RTCA-softwaren skal du klikke på Step_1. Indtast Oprydning: 10 og Interval: 30 sekunder. Klik på Anvend. Klik på Start/Fortsæt i øverste venstre hjørne af softwaren for at starte bekræftelseskørslen.
      BEMÆRK: Sørg for, at forbindelsen af brøndene til RTCA-stationen er okay ved at observere "Plade scannet. Tilslutninger OK" nederst på siden.
  2. Modstandsverifikation kørt til dataanalyse
    1. På fanen Celleindeks skal du kontrollere dataene, når kørslen er afsluttet. Alle CI-værdier skal være mindre end 0,063.
    2. I den nederste del af fanen Celleindeks skal du kontrollere de rå scanningsdata. De rå scanningsdata skal udvise gentagne værdimønstre på 40,0 ± 2,0 (række A og H), 67,5 ± 2,5 (række B og G), 93,6 ± 2,9 (række C og F) og 117,6 ± 3,2 (række D og E).
    3. Hvis du vil stoppe bekræftelseskørslen, skal du klikke på Plade > udløserplade. RTCA-modstandspladen med 96 brønde er nu klar til at blive fjernet fra RTCA-stationen.
  3. Indhentning af baggrundslæsning på RTCA
    1. Vask kollagen type 1-belagt specialiseret guld-mikroelektrodeplade (belagt med 20 μg/ml kollagen type 1) med 60 μL/hul af Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS; med natriumbicarbonat, uden calciumchlorid og magnesiumsulfat) 2x.
    2. Kassér den resterende HBSS, og tilsæt 50 μL/hul ECM. Placer den specialiserede guld-mikroelektrodeplade, der indeholder ECM, med A1-brønden vendt indad i RTCA-stationen placeret i cellekulturinkubatoren.
    3. På fanen Exp Notes i RTCA-softwaren skal du skrive eksperimentnavnet, enhedens SN og enhedstype (96-well-format).
    4. På fanen Layout under fanen Celle i RTCA-softwaren skal du fremhæve de brønde, der skal bruges, og højreklikke på de fremhævede brønde for at sikre, at alle brøndene er tændt (nedtonet).
    5. På fanen Tidsplan i RTCA-softwaren skal du klikke på Step_1 og klikke på Start/Fortsæt i øverste venstre hjørne af softwaren for at få en baggrundslæsning.
      BEMÆRK: Sørg for, at forbindelsen af brøndene er korrekt ved at observere "Plade scannet. Tilslutninger OK" nederst på siden.
    6. Når baggrundsaflæsningen er opnået, er den specialiserede guld-mikroelektrodeplade nu klar til cellesåning og klar til at blive fjernet fra RTCA-stationen.
  4. HUVEC forberedelse i den specialiserede guld-mikroelektrode plade
    1. HUVEC'erne frøs i den specialiserede guldmikroelektrodeplade med 50 μL/brønd konditioneret medium, 1 x 104 celler/brønd (konditioneret medium: ECM suppleret med 10% FBS, 0,01% EKG og 0,01% P/S). Pladen anbringes tilbage i RTCA-stationen med A1-brønden vendt indad til inkubation natten over i en cellekulturkuvøse ved 37 °C med 5 % CO2.
      BEMÆRK: Der blev udført en celletælling på cellesuspensionen med en fortyndingsfaktor på to under anvendelse af et hæmocytometer.
    2. På fanen Planlæg skal du klikke på Tilføj et trin i øverste venstre hjørne. Klik på Step_2 og skift Oprydning: 601 og Interval: 2 min. Klik på Anvend. Klik på Step_2 og klik på Start / Fortsæt i øverste venstre hjørne af softwaren.
    3. Efter 20 timers inkubation, og når CI-værdierne under fanen Brønddiagram viser et plateau, er pladen klar til infektion. På fanen Planlæg i RTCA-softwaren skal du klikke på Afbryd trin.
    4. Den specialiserede guld-mikroelektrodeplade er nu klar til at blive fjernet fra RTCA-stationen for efterfølgende trin.

3. Virusinfektion i HUVEC'er

  1. Virus fortynding
    1. ZIKV-stamkulturen opbevares ved -80 °C. Til dette studie fjernes virusstammen i de kryogene hætteglas, og ZIKV-stammen fortyndes med serumfri ECM i 1,5 ml centrifugeglas for at opnå en mangfoldighed af infektioner (MOI'er) på 0,1 og 1.
      BEMÆRK: ZIKV-stammen blev tidligere fremstillet ved formering i Vero-celler og høstning af ZIKV-supernatant34.
  2. Infektion af cellemonolaget
    1. Fjern og kassér det konditionerede medium (ECM suppleret med 10% FBS, 0,01% EKG og 0,01% P/S) fra hvert hul. Hvert hul skylles med 60 μL HBSS 2x. Indsæt HBSS ved hjælp af siden af brønden; Skyd ikke cellemonolaget.
    2. Fra den højeste til laveste fortynding tilsættes 40 μL af hver fortyndet virusprøve i serumfri ECM i brønden. Brønden tredobles for hver fortynding, og der opretholdes seks huller uden infektion (negativ kontrol og positiv kontrol thrombin). Skyd ikke cellemonolaget; I stedet tilsættes den fortyndede virus ved hjælp af siden af brønden. Brug en frisk pipetspids til hver indsættelse.
      BEMÆRK: Trombin blev valgt som den positive kontrol, da det hurtigt kan øge endotelpermeabiliteten af HUVEC'er.
    3. Pladen inkuberes i en cellekulturkuvøse ved 37 °C med 5 % CO2 for at tillade virusadsorption. Sving pladen 5x hvert 15. minut for at tillade virusadsorption i hele cellemonolaget.
  3. Tilsætning af overlaycellekulturmediet
    1. Efter 1 times inkubation fjernes og kasseres virussuspensionen fra den laveste koncentration til den højeste.
    2. Vask de inficerede celler med 60 μL HBSS 2x. Overlejr brønden med ECM suppleret med 2% FBS. For de positive kontrolhuller fortyndes trombinet til 20 E/ml med ECM suppleret med 2% FBS, og hullerne overlejres med thrombinholdigt ECM-medium. Skyd ikke cellemonolaget; Tilføj i stedet overlejringsmedier ved hjælp af siden af brønden.
  4. Placering af den inficerede specialiserede guld-mikroelektrodeplade tilbage i RTCA-stationen
    1. På fanen Planlæg skal du klikke på Tilføj et trin i øverste venstre hjørne. Klik på Step_3 og skift Sweeps: 3.601 og Interval: 2 min. Klik på Anvend.
    2. Klik på OK i pop op-vinduet, der vises. Placer den inficerede specialiserede guld-mikroelektrodeplade med A1-brønden vendt indad i RTCA-stationen placeret i cellekulturinkubatoren.
    3. Klik på Step_3 og klik på Start / Fortsæt i øverste venstre hjørne af softwaren.

4. Dataanalyse og eksport af data

  1. Tilføjelse af eksperimentelle oplysninger om hver brønd
    1. På fanen Layout skal du klikke på fanen Celle (figur 2A). Hvis du vil indtaste målcelleoplysningerne og bestemme brøndtypen for hver brønd, skal du fremhæve brønden og indtaste målcellenavnet, nummeret og farven nederst i softwaren. Klik på Anvend (figur 2B).
    2. Hvis du vil markere og bestemme brøndtypen for hvert felt under fanen Celle , skal du markere brøndtypen, vælge brøndtype (eksempel, positivt kontrolelement eller negativt kontrolelement) og klikke på Indstil.
    3. På fanen Layout skal du klikke på fanen Behandling (figur 2C). For at indtaste behandlingsoplysninger skal du fremhæve brønden og indtaste behandlingsnavn, koncentration af behandling, enhed og farve. Klik på Anvend (figur 2D).
    4. Hvis du vil vælge og bestemme brøndtypen for hver brønd under fanen Behandling , skal du markere brønden, vælge brøndtype (prøve, positiv kontrol eller negativ kontrol) og klikke på Indstil.
      BEMÆRK: For hvert valg kan flere brønde fremhæves på samme tid.
  2. Normalisering af CI-værdi
    1. Højreklik til højre for fanen Dataanalyse , og vælg Normaliseret celleindeks i rullemenuen Y-akse (figur 3A). I afsnittet X-aksen nederst skal du vælge den normaliserede tid som det sidste målte tidspunkt, hvor den specialiserede guld-mikroelektrodeplade blev fjernet for infektion (figur 3B).
      BEMÆRK: Normaliseringsprocessen, der udføres af softwaren, fjerner det meste af variabiliteten på grund af forskellene i brøndsåning og fastgørelse, så længe det valgte normaliseringspunkt er før tilsætning af virus og / eller behandling. Derfor bør det optimale normaliseringstidspunkt være det sidste tidspunkt før virus og / eller behandlingstilsætning. Tidspunktet for normalisering kan kontrolleres under fanen Planlæg under Step_2. Den samlede tid, der er angivet, er tidspunktet for normalisering (figur 3C).
  3. Plotning af opnåede data ved hjælp af RTCA-software
    1. Under fanen Dataanalyse skal du vælge de brønde, der skal føjes til grafen, ved at fremhæve brøndene og klikke på << Tilføj. Det normaliserede celleindeks i forhold til tidsdiagrammet er nu klar til at blive kopieret og eksporteret. Sørg for at markere afkrydsningsfeltet Gennemsnit .
  4. Eksport af data ved hjælp af RTCA-software
    1. I øverste venstre hjørne af RTCA-softwaren skal du klikke på Plade > Eksporter eksperimentoplysninger.... Markér afkrydsningsfeltet for at vælge de data, der skal eksporteres. Klik på OK.
      BEMÆRK: Rådata (rå CI-værdier) kan eksporteres, når Celleindeks > Alle er markeret.
    2. Vælg mappen for at gemme eksportfilen. Klik på GEM. Der vises et pop op-vindue, der angiver eksport af eksperimentel information. Når eksporten er udført, vises et andet vindue, der angiver, at de eksporterede eksperimentoplysninger er klar til at blive vist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før ZIKV-infektion var CI registreret for HUVEC monolayer dyrket på en specialiseret guld-mikroelektrodebelagt mikrotiterplade over 8, hvilket tyder på stærke vedhæftningsegenskaber. Plader eller brønde med et CI-indeks på mindre end 8 skal kasseres. HUVEC'erne blev derefter inficeret med ZIKV ved en MOI på 0,1 og 1, og celleimpedansen blev registreret i 7 dage. CI-værdien af HUVEC'er inficeret med ZIKV P6-740 ved en MOI på 0,1 (lyseblå linje) begyndte at falde 15 timer efter infektion (HPI) sammenlignet med den negative infektionskontrol (brun linje; Figur 4). Hvad angår HUVEC'er inficeret med en højere dosis ZIKV P6-740 ved en MOI på 1 (blå linje), begyndte CI-værdien at falde så tidligt som ved 11 HPI. Ved 24 HPI var der et fald på 5% og 7% i den normaliserede CI-værdi (0,949, 0,929), når EC'er blev inficeret med ZIKV ved en MOI på henholdsvis 0,1 og 1. En 50% reduktion i den normaliserede CI-værdi blev registreret ved 96 HPI og ved 66,75 HPI ved ZIKV-infektion ved en MOI på henholdsvis 0,1 og 1. Den normaliserede CI-værdi nåede sit laveste punkt ved 107 HPI, hvor der var en reduktion på 51% og 60% (0,4915, 0,3984) ved ZIKV-infektion ved en MOI på henholdsvis 0,1 og 1. Den normaliserede CI-værdi viste sig at have en stigning på 4% og 13% fra 107 HPI og frem til afslutningen af eksperimentet ved 168 HPI (0,5128, 0,4571). Den sorte linje viser virkningerne af thrombin anvendt som en positiv kontrol, hvor CI-værdierne forblev lave under hele eksperimentet, efterligner forstyrrelsen af tætte kryds og induceret vaskulær lækage35.

Figure 1
Figur 1: Humane navlestrengsendotelceller (HUVEC'er). Figuren er i 40x forstørrelse for at se sammenløbshastigheden. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Skærmbilleder af fanen Celle og behandling under fanen Layout i RTCA-softwaren. (A) I Layout fanen, klik på celle fane. (B) For at indtaste målcelleoplysninger og bestemme brøndtypen for hver brønd skal du fremhæve brønden og skrive målcellenavnet, nummeret og farven i bunden af softwaren. Klik på Anvend. (C) Klik på fanen Layout under fanen Behandling . (D) For at indtaste behandlingsoplysninger skal du fremhæve brønden og indtaste behandlingsnavn, behandlingskoncentration, enhed og farve. Klik på Anvend. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Skærmbilleder af fanen Dataanalyse i RTCA-softwaren til normalisering af celleindeks. (A) I rullemenuen Y-akse skal du vælge Normaliseret celleindeks. (B) I afsnittet X-akse skal du vælge normaliseringstiden. (C) Skærmbillede af fanen Tidsplan i RTCA-softwaren. Normaliseringstiden er angivet til den Step_2 samlede tid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Normaliseret celleindeks versus tidsplot af Zika-virus (ZIKV) infektion i humane navlestrengendotelceller (HUVEC'er). Den specialiserede guld-mikroelektrodeplade blev belagt med 20 μg/ml kollagen type 1. HUVEC'erne blev podet med en tæthed på 1,0 x 104 celler / brønd. ZIKV P6-740 (MOI: 0,1, 1) blev brugt til infektion. Lyseblå: ZIKV P6-740 (MOI: 0,1); blå: ZIKV P6-740 (MOI: 1); sort: thrombin som positiv kontrol (20 E/ml); Brun: negativ infektionskontrol. Hvert datapunkt angiver gennemsnittet og blev analyseret i tre eksemplarer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Skematisk tegning på den teknik, der anvendes i den elektriske biosensorimpedansbaserede RTCA. Et sidebillede af brøndpladen; I bunden af brøndene er der forgyldte negative og positive terminaler. Da instrumentet måler CI i mikrobrønden, der indeholder kulturmedier, der gør det muligt at lede elektricitet, strømmer elektronen fra den negative til den positive terminal. Når det er en tom kontrol, er elektronstrømmen glat, og der registreres derfor ingen impedans. Når cellerne er podet, og efterhånden som flere og flere celler fastgøres til bunden af brønden, er impedans i elektronstrømmen til stede og registreres af computeren. Ved hjælp af denne impedansværdi konverterer instrumentet den til en CI-værdi, hvilket angiver antallet af celler, der er fastgjort til bunden af brønden (vedhæftning). Oprettet med BioRender. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cytocid virusinfektion i permissive celler er normalt forbundet med betydelige ændringer i cellemorfologi og biosyntese36. De virusinducerede cellulære morfologiske ændringer, såsom cellekrympning, celleforstørrelse og / eller syncytiadannelse, er også kendt som cytopatiske virkninger (CPE'er), der er karakteristiske for visse virusinfektioner37. I EC'er blev CPE beskrevet som ødelæggelse af celler og nedbrydning af de tætte kryds mellem hver EC, hvilket forårsagede nedbrydning af endotelbarrieren38,39. CPE'er i HUVEC'er kan beskrives som enkeltlagscellefrigørelse og flydende fra vævskulturbeholderen. De inficerede cellemorfologiske ændringer, såsom løsrivelse og flydende af klæbende celler, kan kontinuerligt detekteres ved hjælp af RTCA-metoden. Denne teknik er baseret på elektrisk impedans, som muliggør overvågning af celler i realtid op til hvert par sekunder. Det tillader kvantificering af celleproliferation, morfologiske ændringer, og i tilfælde af HUVEC'er kan det bruges til at overvåge ændringer i endotelintegritet og cellebarrierefunktion40 efter stimulering.

I denne undersøgelse er det kritiske trin opsætningen af eksperimentet, hvor 96-brønds modstandspladen udnyttes. Dette er for at sikre, at alle analysatorens forbindelser er godt forbundet med pladen. I RTCA konverteres den målte impedansværdi som en CI-værdi for at differentiere forskellene i celleantal, vedhæftningsgrad, cellulær morfologi og cellelevedygtighed41. Faldet i RTCA-analysatorens registrerede impedans, som oversættes til et fald i CI-værdien, antyder et reduceret celleantal, svagere vedhæftningsgrad og væsentlige ændringer i cellulær morfologi42. Derfor er det også vigtigt at teste cellelinjernes egnethed og optimale celletal, der skal bruges i RTCA-eksperimentet. Det er afgørende at afgøre, om det ønskede CI-indeks kan opnås før udførelsen af test på cellerne ved hjælp af RTCA-systemet. Derudover hjælper dette også med at afgøre, om RTCA-systemet er egnet til at overvåge cellevækst og celledødsprofiler for udvalgte celletyper. I vores undersøgelse blev der observeret et kraftigt fald i CI-værdier, når HUVEC'er blev inficeret med ZIKV P6-740 ved MOI på 0,1 og 1. Det bratte fald i CI-værdien, hvilket tyder på, at HUVEC-cellulære morfologiske ændringer opstod efter infektion, og dette førte til forstyrrelse af tætte kryds og EC-vaskulær integritet.

Konventionelt estimeres CPE'er forårsaget af viral infektion i celler in vitro baseret på mikroskopisk observation af de inficerede celler. Derudover tillader nogle andre assays, såsom plaque-assayet, visualisering af CPE'er (såsom celleløsrivelse) og bruges til at måle omfanget af CPE'erne42. Disse metoder har imidlertid begrænsninger, idet de kun giver information om diskrete tidspunkter for de cellulære morfologiske ændringer (endepunktsassays). Andre assays, såsom immunofluorescensfarvning, er afhængige af kombinationer af specifikke antistoffer mærket med en fluorofor for at visualisere de morfologiske ændringer43. Selvom immunofluorescensanalysen har en bred kapacitet, der tillader visualisering af mange komponenter i et givet væv eller celletype, tillader denne teknik ikke realtidsovervågning og påvisning under virusinfektion. I modsætning hertil registrerer RTCA-systemet de cellemorfologiske ændringer i realtid under virusinfektionen, hvilket muliggør indfangning af forbigående virkninger, såsom forbigående vaskulær lækage, der kan overses af endepunktsanalyser. For eksempel vil endpoint-assays ikke detektere data og morfologiske ændringer så tidligt som 60 HPI, 80 HPI og 100 HPI. Ud over RTCA er måling af transepitelial elektrisk modstand (TEER) en anden almindeligt anvendt metode til overvågning af celle-til-celle-interaktioner, hvor den elektriske modstand over cellemonolaget måles. TEER kræver imidlertid flere gentagne målinger over tid for at overvåge levende celleaktiviteter og udføres ofte på et mindre antal prøver eller brønde ad gangen. Som følge heraf har TEER typisk lavere gennemstrømning sammenlignet med RTCA, som kan køre op til 96 brønde samtidigt44.

På trods af fordelene har RTCA-systemet flere begrænsninger. Den største begrænsning af RTCA-systemet er det dyre udstyr og forbrugsstoffer. De specialiserede guld-mikroelektrodeplader, der anvendes af RTCA-systemet, er relativt dyre, engangs- og engangsplader45. Derudover kan de cellemorfologiske ændringer ikke afbildes og fanges på en optager (kamera), og analysen kan heller ikke fange akkumuleringen af virusantigenet eller ændringer i celleoverfladeproteinet, såsom VE-cadherin i HUVEC'er46. Som følge heraf kan RTCA ikke visualisere de cellemorfologiske ændringer, der ville give yderligere nyttige oplysninger til belysning af sygdomspatogenesen. Under analysen eller modeletableringen ville yderligere farvningsverifikation, såsom VE-cadherinfarvning for HUVEC'er, være nyttig for at validere de opnåede målinger. Desuden er RTCA-systemet begrænset til klæbende cellelinjer, da det kræver fastgørelse af celler i bunden af brøndene, for at impedansen kan registreres. Derfor kan det rapporterede assay ikke anvendes til ikke-klæbende cellelinjer46.

Afslutningsvis har vi beskrevet en realtidscelleanalyseprotokol ved hjælp af RTCA-instrumentet til at overvåge ændringer i endotelceller ved ZIKV-infektion i 96-brøndformat. Denne metode giver flere fordele i forhold til konventionelle endepunktsassays, idet den giver mulighed for en ikke-invasiv og ikke-etiketintensiv tilgang til kontinuerlig overvågning af cellulære morfologiske ændringer i realtid. Dette assay kan også bruges til at analysere vaskulære integritetsændringer af andre cellelinjer i forskellige eksperimentelle opsætninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Denne forskning modtog støtte fra ministeriet for videregående uddannelse Malaysia under Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) -programmet (MO002-2019) og finansiering under Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN fase 1: LRGS MRUN / F1/01/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
Antibiotic solution penicillin-streptomycin (P/S) Sciencell 0503
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
Collagen Type 1 SIgma-Aldrich C3867
Endothelial cell growth supplement (ECGS) Sciencell 1052
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
E-plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232368001
Fetal bovine serum (FBS) Sciencell 0025
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich H9394
Hemocytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) Sciencell 8000
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Latitude 3520 Laptop Dell  -
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Reagent reservior Tarsons T38-524090
RTCA resistor plate 96 Agilent Technologies, Inc. 05232350001
RTCA Software Pro (Version 2.6.1) Agilent Technologies, Inc. 5454433001
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380) Agilent Technologies, Inc. 00380601030 https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. , Garland Science. (2002).
  2. Pugsley, M. K., Tabrizchi, R. The vascular system: An overview of structure and function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 44 (2), 333-340 (2000).
  3. Stevens, T., Garcia, J. G., Shasby, D. M., Bhattacharya, J., Malik, A. B. Mechanisms regulating endothelial cell barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (3), L419-L422 (2000).
  4. Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. The Journal of Physiology. 569, 359-366 (2005).
  5. Boueiz, A., Hassoun, P. M. Regulation of endothelial barrier function by reactive oxygen and nitrogen species). Microvascular Research. 77 (1), 26-34 (2009).
  6. Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 619690 (2021).
  7. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  8. Iyer, S., Ferreri, D. M., DeCocco, N. C., Minnear, F. L., Vincent, P. A. VE-cadherin-p120 interaction is required for maintenance of endothelial barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (6), L1143-L1153 (2004).
  9. Puerta-Guardo, H., et al. Flavivirus NS1 triggers tissue-specific vascular endothelial dysfunction reflecting disease tropism. Cell Reports. 26 (6), 1598-1613 (2019).
  10. Rastogi, M., Singh, S. K. Zika virus NS1 affects the junctional integrity of human brain microvascular endothelial cells. Biochimie. 176, 52-61 (2020).
  11. Soe, H. J., et al. High dengue virus load differentially modulates human microvascular endothelial barrier function during early infection. Journal of General Virology. 98 (12), 2993-3007 (2017).
  12. Krouwer, V. J., Hekking, L. H. P., Langelaar-Makkinje, M., Regan-Klapisz, E., Post, J. A. Endothelial cell senescence is associated with disrupted cell-cell junctions and increased monolayer permeability. Vascular Cell. 4 (1), 12 (2012).
  13. Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
  14. Bryce, C., et al. Pathophysiology of SARS-CoV-2: targeting of endothelial cells renders a complex disease with thrombotic microangiopathy and aberrant immune response. The Mount Sinai COVID-19 autopsy experience. MedRxiv. , (2020).
  15. Khaiboullina, S., et al. Transcriptome profiling reveals pro-inflammatory cytokines and matrix metalloproteinase activation in Zika virus infected human umbilical vein endothelial cells. Frontiers in Pharmacology. 10, 642 (2019).
  16. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  17. Sarno, M., et al. Zika virus infection and stillbirths: a case of hydrops fetalis, hydranencephaly and fetal demise. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), e0004517 (2016).
  18. Dalrymple, N. A., Mackow, E. R. Virus interactions with endothelial cell receptors: implications for viral pathogenesis. Current Opinion in Virology. 7, 134-140 (2014).
  19. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (1), 64-75 (2014).
  20. Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212 (1), 173-179 (2013).
  21. Vozzi, F., Bianchi, F., Ahluwalia, A., Domenici, C. Hydrostatic pressure and shear stress affect endothelin-1 and nitric oxide release by endothelial cells in bioreactors. Biotechnology Journal. 9 (1), 146-154 (2014).
  22. Gallinat, A., Badimon, L. DJ-1 interacts with the ectopic ATP-synthase in endothelial cells during acute ischemia and reperfusion. Scientific Reports. 12 (1), 12753 (2022).
  23. Jiménez, N., Krouwer, V. J. D., Post, J. A. A new, rapid and reproducible method to obtain high quality endothelium in vitro. Cytotechnology. 65 (1), 1-14 (2013).
  24. Latifi-Navid, H., et al. Network analysis and the impact of Aflibercept on specific mediators of angiogenesis in HUVEC cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (17), 8285-8299 (2021).
  25. Poulet, M., et al. PRL-2 phosphatase is required for vascular morphogenesis and angiogenic signaling. Communications Biology. 3 (1), 603 (2020).
  26. Laurens, N., van Hinsbergh, V. W. Isolation, purification and culture of human micro- and macrovascular endothelial cells. Methods in Endothelial Cell Biology. , Springer. 3-13 (2004).
  27. Haudenschild, C. C., Zahniser, D., Folkman, J., Klagsbrun, M. Human vascular endothelial cells in culture: lack of response to serum growth factors. Experimental Cell Research. 98 (1), 175-183 (1976).
  28. Cenni, E., Perut, F., Baldini, N. In vitro models for the evaluation of angiogenic potential in bone engineering. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (1), 21-30 (2011).
  29. Lau, S., Gossen, M., Lendlein, A., Jung, F. Venous and arterial endothelial cells from human umbilical cords: potential cell sources for cardiovascular research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 978 (2021).
  30. Marquez-Curtis, L. A., Sultani, A. B., McGann, L. E., Elliott, J. A. W. Beyond membrane integrity: Assessing the functionality of human umbilical vein endothelial cells after cryopreservation. Cryobiology. 72 (3), 183-190 (2016).
  31. Park, H. -J., et al. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Reviews. 2 (2), 93-102 (2006).
  32. Dowling, C. M., Herranz Ors, C., Kiely, P. A. Using real-time impedance-based assays to monitor the effects of fibroblast-derived media on the adhesion, proliferation, migration and invasion of colon cancer cells. Bioscience Reports. 34 (4), e00126 (2014).
  33. Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
  34. Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus propagation and cell-based colorimetric quantification. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
  35. Kustermann, S., et al. A real-time impedance-based screening assay for drug-induced vascular leakage. Toxicological Sciences. 138 (2), 333-343 (2014).
  36. Albrecht, T., Fons, M., Boldogh, I., Rabson, A. S. Effects on cells. Medical Microbiology. 4th Edition. , (1996).
  37. Hematian, A., et al. Traditional and modern cell culture in virus diagnosis. Osong Public Health and Research Perspectives. 7 (2), 77-82 (2016).
  38. Friedman, H. M. Infection of endothelial cells by common human viruses. Reviews of Infectious Diseases. 11, S700-S704 (1989).
  39. Friedman, H. M., Macarak, E. J., MacGregor, R. R., Wolfe, J., Kefalides, N. A. Virus infection of endothelial cells. The Journal of Infectious Diseases. 143 (2), 266-273 (1981).
  40. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  41. Marlina, S., Shu, M. -H., AbuBakar, S., Zandi, K. Development of a Real-Time Cell Analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8, 579 (2015).
  42. Liu, S., DeLalio, L. J., Isakson, B. E., Wang, T. T. AXL-mediated productive infection of human endothelial cells by Zika virus. Circulation Research. 119 (11), 1183-1189 (2016).
  43. Souf, S. Recent advances in diagnostic testing for viral infections. Bioscience Horizons: The International Journal of Student Research. 9, (2016).
  44. Sun, M., et al. A dynamic real-time method for monitoring epithelial barrier function in vitro. Analytical Biochemistry. 425 (2), 96-103 (2012).
  45. Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicology Reports. 7, 335-344 (2020).
  46. Kho, D., et al. Application of xCELLigence RTCA biosensor technology for revealing the profile and window of drug responsiveness in real time. Biosensors. 5 (2), 199-222 (2015).

Tags

Biologi udgave 195 Human navlestrengendotelceller Virusinfektion Impedansbaseret Celleanalyse i realtid Endotelceller Barriere Væskeudveksling Opløst stofudveksling Virusformidling Endotelpermeabilitet Endotelcellebarriereforstyrrelse Vaskulær lækage Celleanalysator i realtid Zikavirus (ZIKV) infektion Celleindeks (CI) Transiente virkninger Cellemorfologiske ændringer Vaskulær integritet
Overvågning af ændringer i humane navlestrengendototelceller ved virusinfektion ved hjælp af impedansbaseret celleanalyse i realtid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar,… More

Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Monitoring Changes in Human Umbilical Vein Endothelial Cells upon Viral Infection Using Impedance-Based Real-Time Cell Analysis. J. Vis. Exp. (195), e64887, doi:10.3791/64887 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter