Summary
Presentiamo un metodo per raccogliere parassiti marini isopodi isopodi utilizzando trappole luminose posizionate nei siti di campo tramite immersioni in apnea o immersioni subacquee.
Abstract
Viene presentato un metodo per raccogliere parassiti marini isopodi isopodi con l'uso di trappole leggere. Gli isopodi gnatiidi sono un importante gruppo di parassiti marini che si nutrono di sangue e fluidi dai pesci ospiti, soprattutto di notte. Come zecche e zanzare sulla terraferma, si associano solo temporaneamente con il loro ospite e trascorrono la maggior parte della loro vita vivendo liberi nel benthos. Data la loro elevata mobilità e l'associazione transitoria e prevalentemente notturna con gli ospiti, non possono essere facilmente raccolti catturando ospiti che vivono liberi. Tuttavia, sono prontamente attratti dalle fonti di luce subacquee, creando l'opportunità di raccoglierli in trappole di luce. Qui vengono delineati il design e le singole fasi coinvolte nell'implementazione e nell'elaborazione di trappole luminose appositamente adattate per la raccolta di stadi di vita libera di isopodi gnathiidi. Vengono presentati e discussi i risultati dei campioni e le possibili modifiche del protocollo di base per una varietà di diverse esigenze di campionamento.
Introduction
I crostacei parassiti sono importanti nell'ecologia e nelle storie di vita dei pesci di barriera. La biomassa e l'energia che rimuovono dai loro ospiti sono considerevoli e influenzano il comportamento, la fisiologia e la sopravvivenza1. I crostacei isopodi gnatidi rappresentano il gruppo più importante di parassiti dei pesci nei sistemi di barriera tropicale e subtropicale, dove sono abbondanti e diversificati 2,3 e sono il principale alimento dei pesci più puliti 4,5. Gli gnatidi hanno generalmente dimensioni di 1-3 mm. Hanno storie di vita insolite in cui solo i tre stadi giovanili si nutrono del sangue e dei fluidi corporei dei pesci 6,7. Sono più attivi di notte 8,9, e mentre la visione sembra giocare un certo ruolo, la ricerca dell'ospite 10 si basa fortemente sui segnali olfattivi per trovare gli ospiti11,12. Ciascuna delle tre fasi di alimentazione del novellame si nutre di un singolo pesce ospite, con ogni alimentazione separata da una fase di muta. Dopo l'alimentazione finale, le larve del terzo stadio si trasformano in adulti non nutrienti, che si riproducono e poi muoiono. Dato che l'alimentazione richiede solo una breve associazione con l'ospite, mentre ogni intervallo di interalimentazione dura giorni, gli gnatidi trascorrono la maggior parte della loro vita vivendo liberi nel benthos.
Gli gnatidi influenzano gli host in diversi modi1. A parte il loro ruolo come driver delle interazioni tra pesci più puliti e clienti 13,14,15, gli gnatidi possono aumentare i livelli di cortisolo e diminuire l'ematocrito negli ospiti adulti di pesci16 e in numero elevato, possono persino causare la morte 17. Per i pesci giovani, anche un singolo gnathiide può essere fatale18,19,20, e anche se il pesce sopravvive, la sua capacità di competere per lo spazio e sfuggire ai predatori è compromessa20,21,22. Evitare gli gnatidi può anche costituire uno dei benefici della migrazione notturna in alcuni pesci di barriera23.
Oltre ai pesci più puliti, le popolazioni gnatidi possono essere influenzate da altri micro pesci carnivori24, così come dai coralli25,26. Il riscaldamento degli oceani e la conseguente perdita di coralli vivi sembrano avere impatti opposti sugli gnatidi27,28,29.
Data la loro chiara importanza ecologica e la probabile influenza del cambiamento ambientale antropogenico sulle loro popolazioni, ci sono ragioni convincenti per includerli negli studi ecologici delle barriere coralline. Tuttavia, la loro storia di vita unica e il piccolo numero di ricercatori che li studiano creano una barriera allo sviluppo, all'implementazione e alla diffusione di metodi di campionamento affidabili e riproducibili per raccoglierli per la ricerca.
Le trappole luminose sono state a lungo utilizzate per raccogliere piccoli organismi marini di notte30,31. Sfruttano e si basano sul fatto che molti organismi notturni attivi, compresi gli artropodi, sono attratti dalla luce. Tradizionalmente sono stati utilizzati per raccogliere organismi planctonici nella colonna d'acqua30. Tuttavia, i principi di base possono essere applicati alla raccolta di organismi che nuotano liberamente che sono attivi vicino al benthos. Qui presentiamo un metodo di cattura della luce adattato per la raccolta di stadi di vita libera di isopodi gnatidi vicino al fondo dell'oceano in ambienti remoti della barriera corallina come le Filippine. Per la raccolta in aree remote, queste trappole luminose (Figura 1) offrono alcuni vantaggi rispetto ad altri metodi sviluppati per la raccolta di questi organismi32. Sono altamente portatili e durevoli, richiedono solo tre parti, che sono facilmente ottenibili e poco costose. Sono anche negativamente galleggianti, poiché quando vengono distribuiti, sono completamente riempiti di acqua di mare. Poiché dipendono dalla luce per l'attrazione, sono efficaci solo di notte per la raccolta di specie attive di notte. Inoltre attirano più delle specie bersaglio, richiedendo lo smistamento dei campioni sotto un ambito di dissezione per ottenere gli organismi bersaglio. Tre metodi sono stati finora utilizzati dal nostro team e dai nostri collaboratori per raccogliere gnatiidi nei sistemi di barriera corallina in tutto il mondo32. Questi includono trappole di emergenza, trappole vive con esca per pesci e trappole leggere, ognuna con vantaggi e limitazioni.
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Protocol
La raccolta di campioni è stata autorizzata dal Dipartimento dell'agricoltura-Ufficio della pesca e delle risorse acquatiche (0154-18 DA-BFAR) in conformità con le leggi e i regolamenti filippini (RA 9147; FAO 233) e approvato dal comitato per l'etica animale della Silliman University (SU).
1. Trappole luminose
- Costruzione
- Costruisci trappole luminose da tubi commerciali in cloruro di polivinile (PVC) originariamente progettati per l'impianto idraulico. Utilizzare PVC di 10-15 cm di diametro tagliato a 30-40 cm di lunghezza (Figura 1).
- Ad entrambe le estremità dei tubi, aggiungere "tappi" in PVC con un imbuto acrilico trasparente inserito al centro dell'apertura e incollare in posizione con colla epossidica trasparente (Figura 1). Lasciate asciugare.
- Assicurarsi che un'estremità del tubo abbia un coperchio avvitabile o altrimenti rimovibile e che entrambe le estremità siano a tenuta stagna quando la trappola è "chiusa" (ad esempio, con l'aggiunta di un O-ring).
- Sorgente luminosa
- Prima dell'installazione, accendere una luce/torcia subacquea (vedere Tabella dei materiali) e posizionarla nel tubo, di fronte a uno degli imbuti trasparenti, in modo che la luce della torcia subacquea illumini l'area davanti a un lato del tubo. Se necessario, i bastoncini luminosi chimici possono essere utilizzati al posto delle torce subacquee, sebbene la loro intensità luminosa sia inferiore.
NOTA: La luce attira una varietà di piccoli organismi notturni31, compresi gli gnatiidi, e li spinge a nuotare nel tubo attraverso l'imbuto trasparente. Una volta entrati nel tubo, non sono in grado di fuggire a causa della geometria della trappola di luce (piccola apertura a imbuto) e della presenza continua di una fonte di luce.
- Prima dell'installazione, accendere una luce/torcia subacquea (vedere Tabella dei materiali) e posizionarla nel tubo, di fronte a uno degli imbuti trasparenti, in modo che la luce della torcia subacquea illumini l'area davanti a un lato del tubo. Se necessario, i bastoncini luminosi chimici possono essere utilizzati al posto delle torce subacquee, sebbene la loro intensità luminosa sia inferiore.
- Collocamento
- Quando sei in acqua nel sito di distribuzione, riempi le trappole luminose, con la luce accesa, con acqua di mare e fissa entrambe le estremità. Per garantire che la torcia non sia sotto o non blocchi la punta dell'imbuto, inclinare la "parte anteriore" del tubo verso l'alto per consentire alla torcia di scivolare indietro lontano dall'imbuto.
- Posiziona trappole sul fondo del mare, nella sabbia o nelle macerie, accanto a teste di corallo o altre strutture complesse note per attirare i pesci. Focalizzare il cono di luce "verso l'interno", verso le aree in cui i pesci si aggregano.
NOTA: In acque poco profonde, le trappole possono essere posizionate con immersioni in apnea. Una distribuzione più profonda richiede immersioni.
- Recupero
- Immediatamente prima di recuperare la trappola, sigillare le aperture di entrambi gli imbuti (su entrambe le estremità del tubo) con un pezzo di argilla modellante o tappo di gomma sigillante, mantenendo tutta l'acqua di mare e gli organismi contenuti all'interno.
NOTA: Gli organismi rimarranno nella trappola una volta che le batterie delle luci saranno scadute e la luce non sarà più accesa. Ciò fornisce flessibilità quando le trappole vengono recuperate ("tempo di immersione"). I fattori da considerare quando si decide il tempo di ammollo sono presentati di seguito (vedi Discussione).
- Immediatamente prima di recuperare la trappola, sigillare le aperture di entrambi gli imbuti (su entrambe le estremità del tubo) con un pezzo di argilla modellante o tappo di gomma sigillante, mantenendo tutta l'acqua di mare e gli organismi contenuti all'interno.
- Trasporto
- Una volta che le trappole sono state recuperate dal fondo, portatele su una barca o nuotate a riva.
- Mantenere le trappole vicino alla temperatura ambiente dell'acqua di mare una volta rimosse dall'oceano.
- Trasportarli in laboratorio per la lavorazione il prima possibile poiché non avverrà alcuno scambio di gas o acqua una volta rimossi dall'oceano.
2 Elaborazione in laboratorio
- Conservazione e filtraggio dei campioni
- Una volta che le trappole luminose vengono rimosse dall'oceano e riportate al laboratorio, svuotare il loro contenuto in secchi con acqua di mare fresca.
- Aggiungere aerazione per mantenere in vita gli organismi fino al filtraggio.
- Filtrare il contenuto del secchio versando attraverso un imbuto rivestito con una rete di plancton da 50-100 μm, quindi svuotare il contenuto in un contenitore da 100 ml di acqua di mare fresca.
- Utilizzare una pipetta per attingere da questo contenitore più piccolo per posizionare le aliquote del campione in una capsula di Petri per la microscopia. Ripetere l'operazione fino a quando l'intero campione non è stato elaborato.
- Identificazione e allevamento degli isopodi gnatidi
- Poiché i campioni di trappole luminose attirano più specie di piccoli invertebrati, esaminare attentamente i campioni per identificare e rimuovere gli isopodi gnathiidi. L'ingrandimento 10-20x è il migliore per questo compito (Figura 2).
NOTA: L'identificazione degli gnatidi a livello familiare non richiede esemplari viventi. Tuttavia, gli gnatidi adulti, che raramente vengono catturati in trappole luminose, sono necessari per l'identificazione morfologica delle specie e l'allevamento (vedi riferimento 1,3,9 per una metodologia per l'allevamento e l'allevamento degli gnatidi in cattività). - Nei casi in cui gli gnatidi devono essere tenuti in vita per l'allevamento, rimuoverli delicatamente con una pipetta e metterli in piccoli contenitori di plastica di acqua di mare fresca.
- Poiché i campioni di trappole luminose attirano più specie di piccoli invertebrati, esaminare attentamente i campioni per identificare e rimuovere gli isopodi gnathiidi. L'ingrandimento 10-20x è il migliore per questo compito (Figura 2).
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Representative Results
Per il campionamento nelle Filippine centrali, è stato utilizzato il disegno della trappola delineato (Figura 1). Quando 36 trappole sono state posizionate durante la notte (in un sito), sono stati raccolti da 1 a 1343 gnatidi per trappola (275 ± 54). Questi includevano sia stadi giovanili alimentati che non nutriti (Figura 2; Tabella 1, 2). Questi risultati dimostrano l'efficacia delle trappole luminose per la raccolta di isopodi gnatidi nelle condizioni di studio. La figura 3 mostra il posizionamento della trappola sott'acqua.
Questo metodo per la raccolta degli gnatidi è efficace e sufficientemente flessibile per vari siti di campo e questioni scientifiche. Ad esempio, il riferimento29 ha utilizzato trappole luminose per quantificare gli effetti della copertura corallina e della biomassa dei pesci sull'abbondanza di gnatidi (Figura 4) e il riferimento33 ha utilizzato trappole simili per quantificare gli effetti degli uragani sugli aplotipi genetici (Figura 5). Mentre altre tecniche sono state sviluppate e utilizzate per la raccolta di gnatidi32, questa tecnica è particolarmente efficiente (Tabella 3). Le trappole di emergenza, le "tende" fatte di rete di plancton32 richiedono grandi piattaforme per il trasporto, sono difficili da dispiegare e si strappano facilmente, richiedendo riparazioni continue. Inoltre, raramente raccolgono stadi giovanili nutriti. Le trappole innescate con pesci vivi32 (necessarie perché gli gnathiidi non si nutrono di pesci morti), richiedono la cattura e l'alloggiamento di pesci vivi. Ciò rende il loro uso più difficile in luoghi remoti. Inoltre, la loro efficacia si basa su segnali olfattivi11,12, che sono influenzati dalle dimensioni del pesce, dalla dimensione delle aperture della trappola e dalle correnti d'acqua. Tendono a raccogliere meno gnathiidi, sono più difficili da recuperare rispetto alle trappole leggere e raccolgono solo stadi nutriti.
Figura 1: Tubi in PVC con trappola leggera. A destra: vista dall'alto, con l'imbuto traslucido incollato nel tubo con colla acrilica, visibile. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Un isopode gnathiide in una capsula di Petri dopo la cattura. Nota il fluido corporeo trasparente del pesce e il sangue di pesce rosso brunastro nell'intestino dello gnathiide. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Una trappola luminosa modificata (primo piano) in cui la luce è diretta verso il basso. Questo design può essere utilizzato in condizioni di mare calmo per campionare più direttamente il substrato sotto la trappola. Le trappole di emergenza sono mostrate sullo sfondo. Questa figura è ristampata con il permesso del riferimento32. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Boxplot che mostrano le differenze nella distribuzione. Grafici di scatola che mostrano le differenze nella distribuzione (A) dell'abbondanza gnatide del primo stadio, (B) dell'abbondanza del primo stadio, (C) dell'abbondanza totale e (D) del volume di sangue estratto per biomassa ittica. La dimensione del campione per ciascun sottogruppo è mostrata tra parentesi sotto ogni media di sottogruppo. Le caselle mostrano i bordi del primo e del terzo quartile, mentre i baffi mostrano il terzo quartile più 1,5 volte l'intervallo interquartile. Per (C), le cerniere sono un'approssimazione dell'intervallo di confidenza del 95%. Le differenze osservate in (A), (B) e (C) sono significative; cfr. appendice S1: tabella S7 in riferimento29. Questa figura è ristampata con il permesso del riferimento29. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Reti di aplotipi che rappresentano la diversità genetica di Gnathia marleyi e la sua distribuzione spaziale prima e dopo gli uragani del 2017. I set di dati pre e post-uragano sono indicati rispettivamente nei pannelli I e II. Gli aplotipi trovati nei set di dati pre e post-uragano sono indicati dal numero di aplotipi. Gli aplogruppi A, B e C sono indicati da caselle tratteggiate. Questa figura è ristampata con il permesso del riferimento33. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Conteggio gnathiide | Trappole luminose (n) | Conteggio totale | Significare | Mediano | Minimo (per trappola) | Massimo (per trappola) | Errore standard (+-) |
| Totale | 34 | 9336 | 275 | 191 | 1 | 1343 | 54 |
| Vivere | 34 | 6605 | 206 | 114 | 4 | 1226 | 46 |
| Morto | 34 | 2667 | 86 | 42 | 1 | 659 | 24 |
Tabella 1: Statistiche riassuntive per i conteggi degli gnatidi da 36 trappole luminose dispiegate da immersioni in apnea durante la notte nella barriera corallina di Bantayan, nelle Filippine, da luglio a settembre 2017. Il valore numerico nella colonna Live si riferisce agli gnatidi della trappola di luce che erano vivi al momento del conteggio, la colonna Dead si riferisce agli gnatiidi che erano morti e la colonna Totale è la somma totale dei conteggi degli gnatidi morti e vivi.
| Conteggio gnathiide | N | Conteggio totale | Significare |
| Totale | 10 | 434 | 43 |
Tabella 2: statistiche riassuntive per i conteggi gnatidi da trappole luminose dispiegate per 3 ore nella barriera corallina di Bantayan, provincia di Negros Oriental, Filippine, da luglio ad agosto 2022.
| Tipo di trappola | Conta mediana | IC al 95% | |
| Abbassare | Superiore | ||
| Emergenza non adescata | 0.31 | 0.04 | 0.81 |
| Emergenza con esca di pesce | 0.42 | 0.19 | 0.69 |
| Treppiede con esca di pesce | 0.92 | 0.46 | 1.46 |
| Fish-baited a maglia aperta | 1.5 | 0.35 | 3.54 |
| Trappola per plancton illuminata | 5.69 | 2.69 | 9.58 |
Tabella 3: Sono state confrontate le prestazioni di diversi progetti di trappole, comprese le trappole luminose, nei Caraibi. Le stime della conta mediana per campione e gli intervalli di confidenza del 95% per ciascun progetto di trappola sono stati valutati nel confronto multi-trap. Le stime sono state derivate da 10.000 iterazioni di bootstrap disegnando con la sostituzione dai 26 conteggi dei campioni per ciascun tipo di trap. Questa tabella è adattata con il permesso del riferimento32.
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Discussion
Le trappole luminose tradizionali, come quelle utilizzate per la raccolta dei pesci larvali, sono di grandi dimensioni e sono sospese nella colonna d'acqua34. Al contrario, le trappole luminose qui descritte sono piccole e dispiegate sul fondo del mare. Queste trappole possono essere facilmente trasportate e rapidamente dispiegate. Possono essere posizionati con apnea (libera) in siti poco profondi (come in questo studio) o immersioni in siti più profondi, e attirano sia nutriti che non nutriti.
stadi giovanili.
Le variazioni delle trappole di luce bentonica qui descritte per lo studio degli gnatidi sono state utilizzate per una varietà di scopi dal nostro team e dai collaboratori, e le modifiche possono essere apportate al design o al protocollo, a seconda dello scopo specifico (Figura 3). Questi sono descritti di seguito.
Alcuni studi richiedono gnatidi vivi. Questi includono studi che identificano la fonte (specie ittiche) di farine di sangue35,36 o studi che richiedono l'allevamento. Le trappole luminose in questo studio erano lunghe 30 cm, con un diametro di 10,16 cm, e quindi un volume di ~ 1,3 L. Quando diventano eccessivamente affollati di organismi, la domanda di ossigeno all'interno del tubo può superare la consegna di ossigeno attraverso le porte, causando la morte degli organismi e aggravando il problema. Per evitare ciò, la trappola può essere utilizzata per periodi più brevi o modificata aumentando il suo volume (PVC di diametro maggiore) o aggiungendo ulteriori fori coperti con rete di plancton 9,29,32. Si noti che mentre il PVC di diametro maggiore può essere utilizzato per aumentare il volume, ciò avviene al costo di una minore portabilità, con conseguente trasporto di un minor numero di trappole al sito sul campo. Ciò è particolarmente preoccupante quando il trasporto comporta lunghe nuotate di superficie e/o l'uso di piccole imbarcazioni con spazio di stoccaggio limitato.
In alternativa, o in aggiunta, la trappola può essere distribuita per una durata più breve. Uno dei principali vantaggi di questo design è che mentre la trappola raccoglie organismi solo di notte (quando la luce è efficace), può essere impostata in qualsiasi momento e recuperata in qualsiasi momento. Per raccogliere il maggior numero possibile di gnathiidi, abbiamo piazzato trappole prima del tramonto e le abbiamo recuperate poco dopo l'alba del giorno seguente. Tuttavia, per massimizzare il numero di gnatidi vivi, limitiamo la distribuzione a 3-4 ore di oscurità. Un breve tempo di impostazione riduce anche la quantità di "catture accessorie" che devono essere selezionate per estrarre gli gnatiidi.
Le trappole qui descritte giacciono orizzontalmente, con il fascio di luce che punta in una direzione. Pertanto, il segnale di stimolo si estende fino a quando la luce brillerà, di solito attraversando più tipi di substrato, e un po 'di luce viene emessa anche dall'imbuto posteriore. Per focalizzare il campionamento su un particolare substrato a breve distanza dalla trappola, la trappola può essere modificata per posizionarsi verticalmente, con la luce rivolta verso il basso (Figura 3). Ciò si ottiene aggiungendo "gambe" per formare un treppiede29,32. Tuttavia, questo tipo di trappola luminosa è utile solo in situazioni di bassa corrente.
La torcia che abbiamo usato (vedi tabella materiali) richiede quattro (4) batterie AAA. Utilizziamo batterie ricaricabili per ridurre i costi e gli sprechi. Il tempo di combustione per queste luci è di circa 12 ore, il che consente loro di funzionare durante la notte. Tuttavia, un sostituto adatto è "glowsticks". Questi sono particolarmente utili quando si ambienta in acque più profonde, come le barriere mesofotiche.
Mentre le trappole luminose qui descritte attirano una vasta gamma di piccoli invertebrati mobili, la composizione di questa cattura accidentale è molto variabile. Tuttavia, quando si trovano in un habitat che include macerie e pesci, gli gnathiidi vengono catturati costantemente. Sebbene questo studio dimostrativo si sia concentrato su siti nelle Filippine, trappole di design simile sono state utilizzate con successo anche per studi in siti nella regione dei Caraibi e nella Grande Barriera Corallina.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcuna divulgazione da fare.
Acknowledgments
Il finanziamento è stato fornito dalla US National Science Foundation (NSF OCE 2023420 e DEB 2231250, P. Sikkel PI). Ringraziamo il comune di Dumaguete City, Negros Oriental, Filippine, per il permesso di condurre questo studio. Ringraziamo anche i numerosi volontari per la loro assistenza sul campo e lo staff e i nostri colleghi dell'Istituto universitario Silliman per le scienze ambientali e marine per il loro supporto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buckets, small sample containers | hardware store | ||
| Funnels | Supplier No. 2209-03 | Funnels: AMERICAN SCIENTIFIC LLC SE - 75 mm (3”) | https://us.vwr.com/store/product/8884369/plastic-funnels |
| Main body of light traps (made from commercially available PVC sanitarty pipes) | (SKU 145640) | Alasco Sanitary uPVC Pipes Series 1000 107mm/4' | https://alascopvcpipes.com/product/alasco-standard-sanitary-upvc-pipe-series-1000/. This brand can be found in the Philippines. Other simular brands can also be used |
| Modeling clay | Can be found in art suppliy and childreans toy stores | To seal the funnel after retreival | |
| Plankton mesh (50-100 µm) | any reputable brand and source | https://www.adkinstruments.in/products/plankton-nets-in-various-mesh-size-1633936883 | |
| Screw on lids for the light trap | Alasco Sanitary Clean-Out 4" | https://alascopvcpipes.com/product/alasco-standard-sanitary-upvc-clean-out/. This brand can be found in the Philippines. Other simular brands can also be used | |
| Scuba/snorkel equipment | any reputable brand and source | ||
| Stereo-microscopes | Scientific suppliers | ||
| Underwater touches | Princeton Tec Ecoflare or Fantasea Nanospotter 6023 |
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