نقدم بروتوكولا لتصور الأنشطة الأيضية مباشرة في الخلايا التي تنظمها الأحماض الأمينية باستخدام المجهر المجهري لتشتت رامان المحفز(DO-SRS) ، والذي يتكامل مع المجهر الفلوري ثنائي الفوتون (2PEF).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير الكيميائي المتعامد الحيوي لعملية التمثيل الغذائي للخلايا التي تنظمها الأحماض الأمينية العطرية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الأحماض الأمينية العطرية الأساسية (AAAs) هي اللبنات الأساسية لتوليف كتل حيوية جديدة في الخلايا والحفاظ على الوظائف البيولوجية الطبيعية. على سبيل المثال ، يعد الإمداد الوفير من AAAs مهما للخلايا السرطانية للحفاظ على نموها السريع وانقسامها. مع هذا ، هناك طلب متزايد على نهج تصوير محدد للغاية وغير جراحي مع الحد الأدنى من تحضير العينات لتصور مباشر لكيفية تسخير الخلايا ل AAAs لعملية التمثيل الغذائي في الموقع. هنا ، نقوم بتطوير منصة تصوير بصري تجمع بين فحص أكسيد الديوتيريوم (D2O) مع تشتت رامان المحفز (DO-SRS) وتدمج DO-SRS مع مضان إثارة الفوتون (2PEF) في مجهر واحد لتصور الأنشطة الأيضية لخلايا HeLa مباشرة تحت تنظيم AAA. بشكل جماعي ، توفر منصة DO-SRS دقة مكانية عالية وخصوصية للبروتينات والدهون المركبة حديثا في وحدات خلايا HeLa المفردة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لطريقة 2PEF اكتشاف إشارات التألق الذاتي للنيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) والفلافين بطريقة خالية من الملصقات. يتوافق نظام التصوير الموصوف هنا مع كل من النماذج في المختبر وفي الجسم الحي ، وهو مرن للتجارب المختلفة. يتضمن سير العمل العام لهذا البروتوكول زراعة الخلايا ، وإعداد وسائط الثقافة ، ومزامنة الخلايا ، وتثبيت الخلية ، وتصوير العينات باستخدام طرائق DO-SRS و 2PEF.
المقدمة
كونها أحماض أمينية عطرية أساسية (AAAs) ، يمكن أن يمتصها جسم الإنسان من الفينيل ألانين (Phe) والتريبتوفان (Tryp) لتجميع جزيئات جديدة للحفاظ على الوظائف البيولوجية الطبيعية1. هناك حاجة إلى Phe لتخليق البروتينات والميلانين والتيروزين ، في حين أن Tryp مطلوب لتخليق الميلاتونين والسيروتونين والنياسين2،3. ومع ذلك ، فإن الاستهلاك الزائد لهذه AAAs يمكن أن ينظم هدف الثدييات لمسار rapamycin (mTOR) ، ويمنع كيناز البروتين المنشط AMP ، ويتداخل مع استقلاب الميتوكوندريا ، ويغير بشكل جماعي التخليق الحيوي للجزيء الكبير ويؤدي إلى إنتاج السلائف الخبيثة ، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في الخلايا السليم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد وسائل الإعلام
- قم بإعداد 10 مل من عناصر التحكم و AAAs الزائدة في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco الذي يحتوي على 50٪ D2O.
- بالنسبة لوسائط التحكم ، قم بقياس وخلط 10 مجم من مسحوق DMEM مع 4.7 مل من الماء المقطر المزدوج (ddH2O) في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. يحتوي مسحوق DMEM على جميع الأحماض الأمينية بتركيزات قياسية. دوامة تماما وعكس الأنبوب لضمان خلط المحلول جيدا. أضف 4.7 مل من D2O ، 0.5 مل من مصل الأبقار الجنينية (5٪ FBS) ، و 0.1 مل من البنسلين / الستربتومايسين (1٪). دوامة تماما وعكس الأنبوب لضمان خلط المحلول جيدا.
- بالنسبة لوسط معالجة 15x Phe ، قم بقياس وخلط 10 ملغ من مسحوق DMEM مع 4.7 م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أدت إضافة AAAs الزائدة بتركيزات 15x إلى وسائط زراعة الخلايا المحتوية على 50٪ D2O إلى إنتاج نطاقات C-D Raman متميزة من الدهون والبروتينات المركبة حديثا في خلايا HeLa (الشكل 2B). أجريت التجارب السابقة بمستويات تركيز مختلفة ، مثل 2x و 5x ، وعلى الرغم من عدم تقديم البيانات ، إلا أن تركيز 15x أنتج نطاقات C-D Raman الأكثر تميزا من الدهون والبروتينات المركبة حديثا. على وجه التحديد ، من خلال التحقيق في قطرات الدهون (LDs) ، لاحظنا أن كلا من 15x Phe و 15x Tryp يسببان الدهون وإشارات البروتين.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم تطبيق تصوير DO-SRS و 2PEF للتحقيق في ديناميكيات التمثيل الغذائي في نماذج مختلفة خارج الجسم الحي ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة والأنسجة البشرية 21،22،23،24،26،27،33. تدمج طريقة التصوير المستخدمة في هذه الدراسة الفحص المجهري DO-SRS و 2PEF ، والذي يمكن أن يتفوق على طرق التصوير الأخرى ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.
شكر وتقدير
نشكر الدكتور ياجوان لي وأنتوني فونغ على دعمهما الفني ، ومختبر فرالي على خط الخلايا. نحن نعترف بأموال بدء التشغيل من UCSD و NIH U54CA132378 و NIH 5R01NS111039 و NIH R21NS125395 و NIHU54DK134301 و NIHU54 HL165443 وجائزة Hellman Fellow Award.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10 مل ماصات مصلية | أفانتور (بواسطة VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطي | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16٪ فورمالديهايد ، خالي من الميثانول | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| لوحة | 24 بئراFB0112929 فيشربراند | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 | |
| فلتر حقنة 25 مم ، 2 & m PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 نانومتر مكعب تصفية | أوليمبوس | OCT-ET460 / 50M32 | |
| محولات التيار المتردد لمصدر الطاقة ل LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | إمداد الطاقة إلى مرشح تمرير النطاق الترددي | |
| بالليزر KR Electronics | KR2724 | 8 ميجا هرتز | |
| BNC 50 أوم Terminator | دوائر صغيرة | STRM-50 | |
| BNC كابل | Thorlabs | 2249-C | كابل محوري ، BNC ذكر / ذكر |
| مرآة عازلة عريضة | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 نانومتر |
| جهاز | |||
| مكثف | أوليمبوس | ||
| غطاء زجاجي | كورنينج | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| التيار المستمر التيار | TopWard | 6302D | |
| ثنائي اللون جبل | Thorlabs | KM100CL | |
| كاشف ثقافة الخلايا ثنائي ميثيل سلفوكسيد | mpbio & nbsp ؛ | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| النسر المعدل لدولبيكو s متوسط بدون ميثيونين وثريونين وبيروفات الصوديوم | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder مع بيكربونات الصوديوم وبدون ميثيونين, ثريونين, وبيروفات الصوديوم |
| دولبيكو s النسر المعدل s MT10027CV | كورنينج | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's٪20Modified٪20Eagle's٪20Medium٪20 | |
| FIJI ImageJ | ImageJ | الإصدار 1.53t 24 أغسطس 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| الماء الثقيل (أكسيد الديوتيريوم) | Isotope Laboratories، Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| خلايا هيلا | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| مقياس الدم | ميليبورسيجما | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB & gclsrc = aw.ds |
| High OD Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890 / 220m | قم بتصفية شعاع Stokes ونقل شعاع المضخة |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva ؛ | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25٪ (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| نظام ليزر SRS | المتكامل للفيزياء التطبيقية & شركة الإلكترونيات | يوفر picoEMERALD | picoEMERALD نبضة إخراج عند 1031 نانومتر مع عرض نبضة 6 ps ومعدل تكرار 80 ميجاهرتز ، والذي يعمل كشعاع Stokes. يتم استخدام شعاع التردد المزدوج عند 532 نانومتر لزرع مذبذب بارامتري بصري بيكو ثانية (OPO) بشكل متزامن لإنتاج قطار نبض مغلق بالوضع بعرض نبضة خمسة ~ 6 ps (يتم حظر شعاع المهمل ل OPO بمرشح تداخلي). الطول الموجي الناتج ل OPO قابل للضبط من 720 &ndash ؛ 950 نانومتر ، والتي تعمل كشعاع مضخة. يتم تعديل شدة شعاع ستوكس 1031 نانومتر جيبيا بواسطة EOM مدمج عند 8 ميجاهرتز بعمق تعديل يزيد عن 90٪. يتداخل شعاع المضخة مكانيا مع شعاع ستوكس باستخدام مرآة ثنائية اللون داخل picoEMERALD. يتم تحقيق التداخل الزمني بين نبضات المضخة و Stokes من خلال مرحلة تأخير مدمجة ويتم تحسينها بواسطة إشارة SRS ل D2O النقي في المجهر. |
| مجهر المسح الضوئي بالليزر المقلوب | أوليمبوس | FV1200MPE | |
| IX3-CBH صندوق التحكم | أوليمبوس | التحكم في مجهر المسح بالليزر | |
| مرآة حركية جبل | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 أدوات ضبط سداسية منخفضة |
| المستوى L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| Labالمواصفات 6 | Horiba XploRA | N / A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| قفل في مكبر للصوت | Zurich Instruments | N / A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| مقسم شعاع ثنائي اللون طويل | التمرير Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 نانومتر ليزر BrightLine أحادي الحافة ليزر ثنائي اللون مسطح |
| MATLAB | MathWorks | الإصدار: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| شرائح مجهر | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| برنامج التصوير المجهري | أوليمبوس | فلو عرض | |
| MPLN 100x, أوليمبوس | أوليمبوس | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[التركيز]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, أوليمبوس | أوليمبوس | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[التركيز]=cmsContent11363 |
| NA مكثف النفط | أوليمبوس | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| طلاء أظافر | مبلل B01EO2G5O4 وايلد | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 | |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (محلول ملحي مخزن فوسفات Dulbecco) | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| البنسلين / الستربتومايسين | Thermofischer - Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | يشمل الوحدات العلوية والسفلية ، & Oslash ؛ 1 "آخر ، وشوكة لقط. |
| نظام picoEmerald | A.P.E | N / A | |
| صندوق محمي https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ مع موصلات BNC صندوق | ألومنيوم Pomona Electronics | 2902 | مع غطاء ، كاشف الثنائي الضوئي BNC أنثى / أنثى |
| Si | منزلي بنيت | N / A | DYI |
| رقاقة | |||
| Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ | |
| التحليل الطيفي التلقائي رامان | Horiba XploRA | N / A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| الفحص المجهري المشتت رامان | المحفز المنزل المبني | N / A | |
| Touch تحكم لوحة | Olympus | التحكم في اتجاه XY لمجهر المسح بالليزر | |
| Trypan Blue 0.4٪ (0.85٪ كلوريد الصوديوم) | لونزا | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| ملاقط | كافرم - أمازون | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| اثنين من الفوتون إثارة الفحص المجهري | الفلوري المنزل المبني | N / A | |
| ورق وزن | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| برنامج Zurich LabOneQ | أدوات | زيورخ في مكبر الصوت قفل زيورخ |
المراجع
- Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
- Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P. Metabolism of amino acids in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 603837(2020).
- Parthasarathy, A., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
