Summary
نقدم بروتوكولا لتصور الأنشطة الأيضية مباشرة في الخلايا التي تنظمها الأحماض الأمينية باستخدام المجهر المجهري لتشتت رامان المحفز(DO-SRS) ، والذي يتكامل مع المجهر الفلوري ثنائي الفوتون (2PEF).
Abstract
الأحماض الأمينية العطرية الأساسية (AAAs) هي اللبنات الأساسية لتوليف كتل حيوية جديدة في الخلايا والحفاظ على الوظائف البيولوجية الطبيعية. على سبيل المثال ، يعد الإمداد الوفير من AAAs مهما للخلايا السرطانية للحفاظ على نموها السريع وانقسامها. مع هذا ، هناك طلب متزايد على نهج تصوير محدد للغاية وغير جراحي مع الحد الأدنى من تحضير العينات لتصور مباشر لكيفية تسخير الخلايا ل AAAs لعملية التمثيل الغذائي في الموقع. هنا ، نقوم بتطوير منصة تصوير بصري تجمع بين فحص أكسيد الديوتيريوم (D2O) مع تشتت رامان المحفز (DO-SRS) وتدمج DO-SRS مع مضان إثارة الفوتون (2PEF) في مجهر واحد لتصور الأنشطة الأيضية لخلايا HeLa مباشرة تحت تنظيم AAA. بشكل جماعي ، توفر منصة DO-SRS دقة مكانية عالية وخصوصية للبروتينات والدهون المركبة حديثا في وحدات خلايا HeLa المفردة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لطريقة 2PEF اكتشاف إشارات التألق الذاتي للنيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) والفلافين بطريقة خالية من الملصقات. يتوافق نظام التصوير الموصوف هنا مع كل من النماذج في المختبر وفي الجسم الحي ، وهو مرن للتجارب المختلفة. يتضمن سير العمل العام لهذا البروتوكول زراعة الخلايا ، وإعداد وسائط الثقافة ، ومزامنة الخلايا ، وتثبيت الخلية ، وتصوير العينات باستخدام طرائق DO-SRS و 2PEF.
Introduction
كونها أحماض أمينية عطرية أساسية (AAAs) ، يمكن أن يمتصها جسم الإنسان من الفينيل ألانين (Phe) والتريبتوفان (Tryp) لتجميع جزيئات جديدة للحفاظ على الوظائف البيولوجية الطبيعية1. هناك حاجة إلى Phe لتخليق البروتينات والميلانين والتيروزين ، في حين أن Tryp مطلوب لتخليق الميلاتونين والسيروتونين والنياسين2،3. ومع ذلك ، فإن الاستهلاك الزائد لهذه AAAs يمكن أن ينظم هدف الثدييات لمسار rapamycin (mTOR) ، ويمنع كيناز البروتين المنشط AMP ، ويتداخل مع استقلاب الميتوكوندريا ، ويغير بشكل جماعي التخليق الحيوي للجزيء الكبير ويؤدي إلى إنتاج السلائف الخبيثة ، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في الخلايا السليمة4،5،6. يعد التصور المباشر لديناميكيات التمثيل الغذائي المتغيرة في ظل تنظيم AAA الزائد أمرا ضروريا لفهم أدوار AAAs في تعزيز تطور السرطان ونمو الخلايا السليمة7،8،9.
تعتمد دراسات AAA التقليدية على كروماتوغرافيا الغاز (GC)10. الطرق الأخرى ، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) ، لها دقة مكانية محدودة ، مما يجعل من الصعب إجراء التحليل الخلوي ودون الخلوي للعينات البيولوجية11. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير الامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) لتوضيح دور AAAs في تخليق الدهون والبروتين في انتشار السرطان باستخدام المؤشرات الحيوية غير الغازية12،13،14. ومع ذلك ، لا تزال هذه التقنية تعاني من أعماق التصوير الضحلة ، وضعف الدقة المكانية ، وإعداد العينات على نطاق واسع. على المستوى الخلوي ، يمكن تتبع النظائر المستقرة غير السامة ، مثل النيتروجين -15 والكربون -13 ، من خلال التصوير متعدد النظائر وقياس الطيف الكتلي الأيوني الثانوي النانوي لفهم اندماجها في الجزيئات الكبيرة. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق مدمرة للعينات البيولوجية الحية15,16. مجهر القوة الذرية (AFM) هو تقنية قوية أخرى يمكنها تصور ديناميكيات التمثيل الغذائي17. من ناحية أخرى ، قد يتسبب المعدل البطيء للمسح أثناء تصوير AFM في تشويه الصورة للنتيجة الناتجة عن الانجراف الحراري.
لقد طورنا طريقة تصوير ثنائية التعامد غير جراحية عن طريق اقتران المجهر بأكسيد الديوتيريوم (D2O) الذي تم فحصه بفحص تشتت رامان المحفز (DO-SRS) والفحص المجهري الفلوري ثنائي الفوتون الخالي من الملصقات (2PEF). تحقق هذه الطريقة دقة مكانية عالية وخصوصية كيميائية عند تصوير العينات البيولوجية18،19،20،21،22،23،24. يقدم هذا البروتوكول تطبيقات DO-SRS و 2PEF لفحص الديناميات الأيضية للدهون والبروتين وتغيرات نسبة الأكسدة والاختزال أثناء تطور السرطان. نظرا لكون D2O شكلا مستقرا من نظائر الماء ، يمكن تمييز الجزيئات الحيوية الخلوية بالديوتيريوم (D) بسبب تعويضه السريع مع إجمالي ماء الجسم في الخلايا ، وتشكيل روابط الكربون والديوتيريوم (C-D) من خلال التبادل الأنزيمي21. يمكن اكتشاف روابط C-D في الجزيئات الكبيرة المركبة حديثا ، بما في ذلك الدهون والبروتينات والحمض النووي / الحمض النووي الريبي والكربوهيدرات ، في المنطقة الصامتة للخلية من طيف رامان20،21،22،25،26،27. مع اثنين من نبضات الليزر المتزامنة ، يمكن عرض روابط C-D للدهون والبروتينات المركبة حديثا على خلايا مفردة عبر التصوير الطيفي (HSI) دون استخراجها أو تمييزها بعوامل سامة للخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الفحص المجهري SRS لديه القدرة على بناء نماذج ثلاثية الأبعاد (3D) لمناطق مختارة ذات أهمية في العينات البيولوجية من خلال التقاط ودمج مجموعة من الصور المقطعية22,26. مع التصوير الحجمي فائق الطيفية و 3D ، يمكن ل DO-SRS الحصول على توزيعات مكانية للجزيئات الكبيرة المركبة حديثا في خلايا مفردة ، إلى جانب نوع العضيات التي تسهل عملية تعزيز نمو السرطان بموجب لائحة AAA22. علاوة على ذلك ، باستخدام 2PEF ، يمكننا الحصول على إشارات التألق الذاتي للفلافين والنيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) بدقة عالية وعمق اختراق عميق وتلف منخفض المستوى في العينات البيولوجية21،23،24. تم استخدام إشارات التألق الذاتي للفلافين و NADH لتوصيف توازن الأكسدة والاختزال وبيروكسيد الدهون في الخلايا السرطانية22,26. على هذا النحو ، لا يوفر اقتران DO-SRS و 2PEF تحليلا تحت خلوي لديناميكيات التمثيل الغذائي التي تنظمها AAA في الخلايا السرطانية ذات التوزيع المكاني العالي ، ومعلومات الخصوصية الكيميائية ، والحد الأدنى من تحضير العينات ، ولكن الطريقة تقلل أيضا من الحاجة إلى استخراج أو تسمية الجزيئات الداخلية بالكواشف السامة. في هذا البروتوكول ، نقدم أولا إجراءات D2O وإعداد الأحماض الأمينية ، وكذلك زراعة الخلايا السرطانية. بعد ذلك ، نعرض بروتوكولات تصوير DO-SRS وتصوير 2PEF. أخيرا ، نقدم النتائج التمثيلية لتصوير SRS و 2PEF ، والتي توضح التغيرات الأيضية التي تنظمها AAA للدهون والبروتين ، وتغيرات نسبة الأكسدة والاختزال في الخلايا السرطانية. يتم تسليط الضوء على توضيح مفصل للعملية في الشكل 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد وسائل الإعلام
- قم بإعداد 10 مل من عناصر التحكم و AAAs الزائدة في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco الذي يحتوي على 50٪ D2O.
- بالنسبة لوسائط التحكم ، قم بقياس وخلط 10 مجم من مسحوق DMEM مع 4.7 مل من الماء المقطر المزدوج (ddH2O) في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. يحتوي مسحوق DMEM على جميع الأحماض الأمينية بتركيزات قياسية. دوامة تماما وعكس الأنبوب لضمان خلط المحلول جيدا. أضف 4.7 مل من D2O ، 0.5 مل من مصل الأبقار الجنينية (5٪ FBS) ، و 0.1 مل من البنسلين / الستربتومايسين (1٪). دوامة تماما وعكس الأنبوب لضمان خلط المحلول جيدا.
- بالنسبة لوسط معالجة 15x Phe ، قم بقياس وخلط 10 ملغ من مسحوق DMEM مع 4.7 مل من ddH2O و 0.5 مل من FBS (5٪) و 0.1 مل من البنسلين / الستربتومايسين (1٪) في أنبوب مخروطي 15 مل. دوامة تماما وعكس الأنبوب لضمان خلط المحلول جيدا. أضف مسحوق Phe الزائد بتركيز 924 مجم / لتر إلى الوسط. دوامة تماما وعكس الأنبوب لضمان خلط المحلول جيدا.
- بالنسبة لوسط علاج 15x Tryp ، قم بقياس وخلط 10 ملغ من مسحوق DMEM مع 4.7 مل من ddH2O و 0.5 مل من FBS (5٪) و 0.1 مل من البنسلين / الستربتومايسين (1٪) في أنبوب مخروطي 15 مل. دوامة تماما وعكس الأنبوب لضمان خلط المحلول جيدا. أضف مسحوق تريب الزائد بتركيز 224 مجم / لتر إلى الوسط. دوامة تماما وعكس الأنبوب لضمان خلط المحلول جيدا.
- أضف الميثيونين والثريونين عند 30.0 مجم / مل و 95.0 مجم / مل ، على التوالي ، إلى جميع الأنابيب المخروطية في الخطوات السابقة. دوامة تماما وعكس الأنبوب. لا يلزم إضافة بيروفات الصوديوم إلى وسائط الاستزراع.
- قم بتصفية وسائط التحكم والمعالجة باستخدام مرشح حقنة مقاس 25 مم مع مرشحات غشاء بولي إيثر سلفون 0.22 ميكرومتر.
- أغلق جميع الأنابيب المخروطية المحتوية على الوسائط باستخدام بارافيلم واحفظها على حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع. قبل معالجة الخلايا بالوسائط ، قم بتسخين جميع الوسائط إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب قياس المسحوق والكواشف السائلة ودمجها بناء على الحجم الإجمالي لوسائط المعالجة والتحكم.
2. تحضير عينة الخلية
- الحفاظ على خلايا سرطان عنق الرحم (HeLa) في دورق مزرعة (أي T10 ، T25 ، إلخ) باستخدام DMEM القياسي المكمل ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO2).
- استزراع خلايا هيلا بنسبة انقسام 1:10 حتى تصل إلى 80٪ أو أعلى من صلاحية الخلية.
- بمجرد أن تحقق الخلايا التقاء 80٪ أو أعلى ، انتقل إلى زرع 2 × 10 5 خلايا لكل بئر على صفيحة 24 بئرا باستخدام DMEM المكمل ب0.5 ٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
- قبل بذر الخلايا ، قم بإعداد صفيحة من 24 بئرا مع أغطية مستديرة معقمة ، بولي دي ليسين ، مغلفة باللامينين ، قطرها 12 مم. اغمر أغطية الغطاء في 70٪ من الإيثانول وجففها برفق باستخدام مناديل خالية من النسالة. ضع أغطية الغطاء النظيفة في الآبار المناسبة للوحة.
- بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ في الخطوة 2.2 ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) بدون أيونات المغنيسيوم والكالسيوم.
- أضف 0.25٪ تربسين لفصل الخلايا الملتصقة عن القارورة واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 3 دقائق.
- أضف DMEM المكمل ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، ماصة بلطف لأعلى ولأسفل ، واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 3 دقائق.
- إعادة تعليق الخلايا في DMEM مع 0.5 ٪ FBS و 1 ٪ البنسلين / الستربتومايسين.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، والمجهر الضوئي ، وأزرق التريبان ، وزرع كثافة 2 × 105 خلايا لكل بئر من صفيحة 24 بئرا. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام عداد خلية آلي لحساب الخلايا.
- أعد الخلايا إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، وهز اللوحة برفق لتوزيع الخلايا بالتساوي.
- بعد 8 ساعات ، استبدل وسائط الثقافة القديمة بنسبة 50٪ D 2 O/ Phe الزائدة أو 50٪ D2O / وسائط Tryp الزائدة. أعد الخلايا إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 36 ساعة.
- بعد 36 ساعة ، قم بإصلاح الخلايا على شرائح المجهر.
- قبل التثبيت ، قم بإعداد شرائح المجهر بفواصل تصوير قطرها 9 مم ووضع 15 ميكرولتر من 1x PBS مع أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم.
- شطف الخلايا مع 1x PBS تستكمل مع أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم.
- أضف 0.5 مل من محلول بارافورمالدهايد الخالي من الميثانول (PFA) بنسبة 4٪ واترك اللوحة تحت غطاء السلامة الحيوية لمدة 15 دقيقة تقريبا.
- نضح محلول PFA واشطفه باستخدام 1x PBS مكمل بأيونات الكالسيوم والمغنيسيوم مرتين.
- أضف 1.5 مل من 1x PBS المكمل بأيونات الكالسيوم والمغنيسيوم في كل بئر.
- استخدم ملاقط معقمة لإخراج أغطية الغطاء برفق من كل بئر. اقلب وضع الجانب المحتوي على الخلية من أغطية الغطاء على فواصل التصوير للاتصال ب PBS المعد في الخطوة 2.5.1. تأكد من تعرض الجانب غير المحتوي على خلية للهواء.
- باستخدام طلاء الأظافر الشفاف ، أغلق الطبقة الخارجية من غطاء الغطاء باستخدام فاصل التصوير.
- قم بتخزين شرائح المجهر عند 4 درجات مئوية عند عدم التصوير.
3. قياس مطيافية رامان التلقائي (الشكل 2)
- استخدم مجهر رامان متحد البؤر للحصول على أطياف رامان العفوية (الشكل 2 أ).
- قم بتشغيل الليزر عن طريق تحويل المفتاح إلى وضع التشغيل .
- انقر نقرا مزدوجا فوق رمز برنامج LabSpec6 لفتح برنامج الاستحواذ.
- حمل العينة البيولوجية على حامل العينة أسفل العدسة الشيئية مباشرة.
- في البرنامج ، انقر فوق رمز الكاميرا لتشغيل كاميرا الفيديو.
- اضبط مستوى التركيز البؤري لتحديد منطقة الاهتمام باستخدام العدسة الموضوعية بمعدل 50 ضعفا. حرك عصا التحكم للتحكم في ترجمة المسوي لمرحلة XY وقم بتدوير عصا التحكم لتغيير عمق التركيز البؤري.
- بعد اختيار موضع القياس ، قم بالتبديل إلى العدسة الموضوعية 100x بقوة 40 ميجاوات من الإثارة. انقر فوق رمز الإيقاف الأحمر لإيقاف تشغيل كاميرا الفيديو.
- حدد شبكة 1800 خط / مم ، واضبط نطاق الاستحواذ من 400 سم -1 إلى 3150 سم -1.
- اضبط وقت الاستحواذ على 90 ثانية ، والتراكم على 3 ، و Binning على 4 لأقل ضوضاء وطيف أكثر دقة.
ملاحظة: يمكن تحسين معلمات التصوير هذه لتلائم التجربة. - انقر فوق رمز السهم لتشغيل العرض في الوقت الفعلي.
- اضبط إزاحة Raman (cm-1) على القيمة المفضلة لضبط مستوى التركيز البؤري بدقة.
ملاحظة: في هذه التجربة ، تم تركيز ليزر رامان على قطرات الدهون ، والتي تحتوي على تركيز عال من روابط CH2 . لذلك ، تم اختيار إزاحة رامان البالغة 2850 سم -1 والتي تتطابق مع أوضاع التمدد لرابطة CH2 لهذا الغرض. - اضبط مستوى التركيز البؤري باستخدام عصا التحكم لتحسين أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء.
- بعد اختيار مستوى التركيز ، انقر فوق رمز الإيقاف الأحمر للعرض في الوقت الفعلي.
- حدد أيقونة الدائرة لبدء اكتساب الطيف.
- بمجرد أخذ المنطقة الخلوية ، استخدم نفس مستوى التركيز لقياس الخلفية باستخدام PBS. اطرح طيف الخلفية من كل طيف مستهدف تحت خلوي باستخدام تطبيق برنامج كمبيوتر منفصل ، مثل Origin (الشكل 1B).
4. تجارب التصوير مع 2PEF و SRS
ملاحظة: يمكن العثور على أوصاف مفصلة لمحاذاة ليزر SRS في تقرير سابق28. يركز هذا البروتوكول على تشغيل نظام تصوير SRS و 2PEF متعدد الوسائط (الشكل 2C ، D).
- انقر فوق ابدأ لتسخين الليزر.
- اتبع الترتيب لضبط المفاتيح الرئيسية لوحدة التحكم والشاشة على: 1) اضغط على المفتاح الرئيسي لصندوق التحكم IX3-CBH إلى تشغيل ، 2) اضغط على المفتاح الرئيسي لوحدة التحكم في لوحة اللمس إلى تشغيل ، 3) اضغط على المفتاح الرئيسي لمحول التيار المتردد لمصدر الطاقة لجهاز التحكم عن بعد بالليزر LD OBIS 6 المتصل بمجمع الليزر الرئيسي FV31-SCOMB إلى تشغيل، و 4) اضغط على المفتاح الرئيسي لمحول التيار المتردد لمصدر الطاقة لجهاز التحكم عن بعد بالليزر LD OBIS 6 المتصل بمجمع الليزر الفرعي FV31-SCOMB إلى تشغيل.
- اضغط على المفاتيح الرئيسية لكاشف الصمام الثنائي الضوئي Si وتشغيل مضخم القفل.
- اضبط شعاع ستوكس على 1031 نانومتر ، وعرض النبض عند 6 حصان ، ومعدل التكرار عند 80 ميجاهرتز.
- إلى جانب المجهر ، اضبط نظام picoEmerald المزود بحزمة المضخة المتزامنة بطول موجي قابل للضبط من 720-990 نانومتر ، وعرض نبضة من 5-6 حصان ، ومعدل تكرار 80 ميجاهرتز. متوسط قوة الإثارة لكل من المضخة و Stokes هو 450 ميغاواط. تحسين قوة الإثارة لتقليل التلف الضوئي للعينة.
- استخدم مكثف زيت ذو فتحة رقمية عالية (NA) (أي 1.4 NA) لجمع Stokes وعوارض المضخة حيث يتم تركيب العينة عن طريق إصدار بضع قطرات على المكثف.
- قم بتركيب العينة على الزيت وضع قطرة ماء كبيرة فوق شريحة المجهر حيث يتم تثبيت العينة. هذا هو لعدسة موضوعية الغمر في الماء.
- اضبط مضخم القفل على 20 ميجاهرتز. قم بمعالجة الصورة الآن باستخدام وحدة البرامج فائقة الدقة.
- حدد 512 بكسل × 512 بكسل و 80 ميكرو ثانية / بكسل لوقت السكون.
- بمجرد تركيز المنطقة الخلوية المطلوبة بشكل صحيح ، احصل على الصورة. باستخدام برنامج الحصول على المجهر ، احفظ الصور كملف رسومي أوليمبوس .oir.
- احصل على صورة خلفية بحجم 1900 سم -1 واطرحها من جميع الصور الخلوية.
- لإجراء تصوير 2PEF ، استخدم نفس ليزر بيكو ثانية القابل للضبط ، واضبط التألق الذاتي الخالي من الملصقات للفلافين و NADH على 800 نانومتر و 780 نانومتر على التوالي.
- استخدم مكعب مرشح 460 نانومتر / 515 نانومتر لجمع انبعاث الفلورة الذاتية للفلافين و NADH.
- اضبط وقت السكون على 8 ميكرو ثانية / بكسل وحجم البكسل على 512 بكسل × 512 بكسل. اضبط معلمة طاقة مصراع الليزر على 150 ميجاوات.
- لإعادة بناء الصورة ثلاثية الأبعاد ، قم بضبط خسارة رامان المحفزة إلى 2850 سم -1 (797 نانومتر).
- بمجرد تحديد الخلايا المفردة المطلوبة ، قم بتسجيل الليزر للمسح من مستوى التركيز العلوي لاكتشاف الطبقات العلوية والسفلية لتلك الخلايا.
ملاحظة: يتم إنشاء نماذج 3D وحفظها كملفات .oir.
5. تحليل الأطياف والصور
- تحليل الأطياف
- استخدم برنامج Origin أو التطبيقات الأخرى ذات الصلة لطرح طيف الخلفية من جميع أطياف الهدف تحت الخلوي.
- استخدم عمليات النمذجة الرياضية ل MATLAB لمعالجة أطياف Raman باستخدام الوظائف المضمنة في البرنامج. يمكن أيضا استخدام Python لمعالجة الأطياف.
- تبدأ المعالجة الطيفية المسبقة بتحويل الملفات إلى مصفوفة. يتم استيفاء الأطياف عند كل سنتيمتر متبادل.
- للتحقق من الصحة ، رسم بياني للبيانات الأولية. قم بإجراء تصحيح خط الأساس على الأطياف الخام باستخدام الوظيفة المضمنة msbackadj في MATLAB. باختصار ، تقدر الدالة المضمنة نقاط خط الأساس عند قيم وحدة الفصل التي حددها المستخدمون وترجع المسافة بين النوافذ المجاورة. من نقاط خط الأساس ، قم بتقدير ورسم خط الانحدار. قم بتطبيق التنعيم لتنعيم خط الانحدار لطرح الخط الأساسي من كل طيف خام منفرد.
- قم بإجراء التطبيع min-max بقسمة شدة رامان للبروتين عند 2,930 سم -1 على شدة كل نوبة رامان. عادة ما تكون إشارة 2,930 cm-1 هي أعلى كثافة في طيف رامان. مع هذا التطبيع ، يتم تحويل القيمة القصوى إلى 1 بينما يتم تحويل القيمة الدنيا إلى 0. يتم تحويل كل قيمة أخرى إلى رقم عشري بين 0 و 1.
- متوسط الأطياف الفردية لنفس الحالة في طيف واحد لتقليل الضوضاء.
- بمجرد المعالجة ، استخدم التطبيقات ، مثل Origin ، لعرض جميع الأطياف في وقت واحد. تمثل القمم المعروضة في الأطياف رابطة كيميائية محددة أو مجموعة وظيفية.
- تحليل صورة 3D من قطرات الدهون
- استخدام برنامج FIJI-ImageJ لمعالجة جميع الصور 3D
- أداء وظائف مرشحات ممر النطاق الترددي وتنعيم لمكدسات الصور 3D.
- لتحليل الصور 3D ، قم بتعيين كل قطرة دهنية إلى درجة كروية محسوبة عن طريق قياس المسافة بين مركز كتلتها إلى السطح. قارن كل درجة كروية بنتيجة كروية لكرة مثالية على نفس الخطة الإقليدية. تخلص من قطرات الدهون ذات الدرجات الكروية المنخفضة وقم بتقييم قطرات الدهون المتبقية لحجمها وأعدادها.
- تحليل حجم وأعداد قطرات الدهون بين المعالجات المختلفة للدلالة الإحصائية على تطبيق برنامج إحصائي مناسب. هنا ، تم استخدام GraphPad Prism.
- تحليل الصور الطيفية 2D
- استخدم برنامج FIJI-ImageJ لمعالجة جميع الصور الطيفية 2D.
- حدد قناة 2,930 cm-1 لعمل صورة قناع تحتوي على قيم 0 و 1. قم بتعيين الخلفية إلى 0 والمنطقة الخلوية إلى 1.
- اطرح قناة البروتين المسمى بالديوتيريوم (2,175 سم -1) إلى قناة الخلفية (1,900 سم -1) لإزالة تأثيرات الفلورسنت.
- اقسم قناة البروتين الناتجة التي تحمل علامة الديوتيريوم على قناة البروتين (2,930 سم -1) للحصول على صور قياس معدل دوران البروتين.
- بعد ذلك ، اضرب صورة القناع التي تم إنشاؤها في الخطوة 5.3.2 في الصور التناسبية لإزالة أي ضوضاء خلفية متبقية. نتيجة لذلك ، يتم إنشاء خلفية داكنة في كل صورة نسبية.
- استخدم أداة التحديد اليدوي في FIJI-ImageJ لتقسيم وحساب كثافة البكسل المعروضة على الخلايا المفردة يدويا. تتوافق شدة البكسل مع تركيزات الرابطة الكيميائية التي يتم تصورها.
- تحليل كثافة البكسل للدلالة الإحصائية على تطبيق برنامج إحصائي مناسب. هنا ، تم استخدام GraphPad Prism. كرر هذا التحليل مع التحليل النسبي المتبقي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أدت إضافة AAAs الزائدة بتركيزات 15x إلى وسائط زراعة الخلايا المحتوية على 50٪ D2O إلى إنتاج نطاقات C-D Raman متميزة من الدهون والبروتينات المركبة حديثا في خلايا HeLa (الشكل 2B). أجريت التجارب السابقة بمستويات تركيز مختلفة ، مثل 2x و 5x ، وعلى الرغم من عدم تقديم البيانات ، إلا أن تركيز 15x أنتج نطاقات C-D Raman الأكثر تميزا من الدهون والبروتينات المركبة حديثا. على وجه التحديد ، من خلال التحقيق في قطرات الدهون (LDs) ، لاحظنا أن كلا من 15x Phe و 15x Tryp يسببان الدهون وإشارات البروتين المركبة حديثا عند 2,143 سم -1 و 2,172 سم -1 ، على التوالي. تم استخدام DO-SRS لاحقا لتصور التوزيع المكاني لإشارات C-D على الخلايا المفردة (الشكل 3). باستخدام ImageJ ، تم تقسيم كثافة البكسل للخلايا الفردية وحسابها يدويا ، كما هو موضح بالحدود البيضاء المنقطة في الشكل 3A. تعرض خلايا التحكم شرائط C-D المعتدلة من الدهون والبروتين. ومع ذلك ، فإن 15x Phe و 15x Tryp يعرضان نطاقات دهون وبروتين C-D أقوى. يشير التحليل الكمي إلى أن AAAs الزائدة قد تزيد من تنظيم تخليق الدهون بنسبة 10٪ -17٪ ولكنها تقلل من تخليق البروتين بنسبة 10٪ (الشكل 3C ، D). تشير النتائج إلى إمكانية نقص الالتهام الذاتي الذي يتراكم الدهون المركبة حديثا ، ويعزز اختلال الميتوكوندريا ، ويحفز اختلال التوازن التأكسدي في ظل تنظيم AAAالزائد 7.
تم الحصول على تصوير SRS متعدد الوسائط الخالي من الملصقات و 2PEF للدهون غير المشبعة (~ 3,011 سم -1) والدهون المشبعة (~ 2,880 سم -1) و NADH و Flavin لفهم آثار AAAs على استقلاب السرطان. وبالمثل ، تم تقسيم كثافة البكسل للخلايا الفردية يدويا وحسابها باستخدام ImageJ ، كما هو موضح بالحدود البيضاء المنقطة في الشكل 3B. يظهر التحليل النسبي للخلايا المعالجة ب AAA زيادة بنسبة 10٪ في الدهون غير المشبعة / الدهون المشبعة وزيادة بنسبة 50٪ في Flavin/Flavin + NADH (الشكل 3E ، F). في سلسلة نقل الإلكترون للميتوكوندريا ، يمكن توليد أنواع الأكسجين التفاعلية من نقل الإلكترونات من NADH و FADH2 إلى أنواع الأكسجين الجزيئي. يؤدي تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية في العديد من الخلايا السرطانية إلى اختلال التوازن التأكسدي الذي يؤكسد الأحماض الدهنية غير المشبعة ، ويعزز تخليق الأحماض الدهنية المشبعة ، ويستنزف إشارات التألق الذاتي NADH. لذلك ، فإن الزيادة الملحوظة في Flavin / Flavin + NADH هي مؤشر على ROS المتراكم الذي يقلل من إشارات التألق الذاتي NADH. استجابة لاختلال التوازن التأكسدي ، قد تقوم خلايا HeLa بتنظيم تخليق الدهون غير المشبعة لتحل محل الخلايا المؤكسدة. لم يتم ملاحظة هذه الاستجابة في خطوط الخلايا السرطانية الأخرى29 ، مما يدل على عدم التجانس الأيضي للخلايا السرطانية في ظل نظام غذائي AAA زائد30.
بالإضافة إلى التصوير متعدد الوسائط ، يمكن ل SRS إعادة بناء صور 3D خالية من الملصقات ل LDs في التحكم وخلايا HeLa المعالجة AAA. باختصار ، يولد الفحص المجهري مجموعة من الصور المقطعية في جميع أنحاء منطقة الاهتمام المحددة. في هذه الدراسة ، تم ضبط فقدان رامان المحفز (SRL) على 2,845 سم -1 ومسحه ضوئيا من الطبقة العليا إلى الطبقة السفلية بحجم خطوة 1 ميكرومتر (الشكل 4 أ). تكشف التحليلات الكمية لقطرات الدهون ثلاثية الأبعاد أن LDs انخفض حجمها ولكنها زادت في الأعداد في الخلايا المعالجة ب AAA مقارنة بالمجموعة الضابطة (الشكل 4B ، C). قد يؤدي الوجود المتزايد للأحماض الأمينية الضخمة الكارهة للماء ، مثل Tryp و Phe إلى إضعاف وظيفة بروتينات طلاء LD. هذا يقلل في النهاية من تحلل الدهون ، الذي يتراكم العديد من LDs الصغيرة. تؤكد نتائج التصوير الحجمي 3D SRS الخالية من الملصقات لهذه الدراسة الدراسات السابقة من خلال تصور أن الخلايا الزائدة المعالجة ب AAA تظهر العديد من LDs الأصغر31,32.
الشكل 1: رسم توضيحي لالتقاط الصورة وتحليلها باستخدام DO-SRS و 2PEF. (أ) إعادة بناء وتحليل صورة ثلاثية الأبعاد للحصول على عدد قطرات الدهون وحجمها ودرجتها الكروية. (ب) التصوير والتحليل فوق الطيفي للدهون الموسومة بالديوتيريوم (CDL ؛ 2,145 cm-1) ، والدهون (2,845 cm-1) ، والبروتين الموسوم بالديوتيريوم (CDP ؛ 2,175 cm-1) ، والبروتين (2,940 cm-1) ، والدهون غير المشبعة (3,011cm-1) ، والدهون المشبعة (2,880 cm-1) ، و NADH ، و Flavin. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الإعداد الفيزيائي لمطيافية رامان التلقائية ومجهر تشتت رامان المحفز . (أ) إعداد مطيافية رامان التلقائي المستخدم في هذه الدراسة. (ب) عينة من أطياف رامان العفوية لملصق القرص المضغوط (أحمر) ، بدون ملصق قرص مضغوط (أسود) ، مجموعة تحكم (أزرق ، خط متصل) ، مجموعة معالجة 15x ب Phe (أحمر ، خط منقط) ، ومجموعة معالجة ب 15x Tryp (وردي ، خط منقط). (ج) رسم تخطيطي لإعداد مجهر تشتت رامان المحفز المستخدم في هذا التحقيق. (د) إعداد مجهر تشتت رامان المحفز المستخدم كمنصة DO-SRS و 2PEF. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تصور ديناميكيات التمثيل الغذائي في خلايا هيلا باستخدام الفحص المجهري DO-SRS و 2PEF. (أ) الدهون الموصوفة بالديوتيريوم (2,145 سم -1) ، الدهون (2,845 سم -1) ، البروتين المسمى بالديوتيريوم (2,175 سم -1) ، البروتين (2,940 سم -1) المرئي في خلايا هيلا تحت السيطرة (Ctrl) ، 15x فينيل ألانين (15x Phe) ، و 15x تريبتوفان (15x Tryp) مع منصة DO-SRS. تم حساب معدل دوران الدهون ومعدل دوران البروتين على النحو 
التالي: و 
. تم طرح الصور الأولية أولا بواسطة إشارة PBS لإزالة كثافة الخلفية وإخفائها لإزالة الكثافة خارج الخلايا باستخدام ImageJ. تم إجراء القسمة بالبكسل للتحليل النسبي. (ب) قنوات NADH و Flavin المرئية باستخدام مجهر 2PEF ، والدهون غير المشبعة (3,011 سم -1) والدهون المشبعة (2,880 سم -1) المصورة باستخدام مجهر SRS الخالي من الملصقات. تم حساب نسبة الأكسدة والاختزال البصري ونسبة التشبع مع 
و 
. (سي إف) القياس الكمي للشدة النسبية لكل خلية هيلا تحت السيطرة ، 15x Phe ، و 15x Tryp الظروف. تم استخدام الفرق الإحصائي لمقارنة ظروف AAA الزائدة مع ظروف التحكم. تم حساب p < 0.0001 و ** p < 0.001 و ** p < 0.01 و * p < 0.05 من اختبار ANOVA ثنائي الاتجاه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تصور توزيع قطرات الدهون ثلاثية الأبعاد لخلية هيلا واحدة باستخدام مجهر SRS الخالي من التسمية . (أ) إسقاط حجم قطرات الدهون SRS 3D في خلايا HeLa تحت السيطرة وظروف AAA الزائدة. تم تحديد العتبة قبل التحليل ، وكشفت عن توزيع إشارة قطرات الدهون. (ب، ج) القياس الكمي لحجم قطرات الدهون وتعدادها داخل خلايا HeLa الفردية تحت مجموعة التحكم وظروف AAA الزائدة باستخدام اختبار ANOVA ثنائي الاتجاه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تطبيق تصوير DO-SRS و 2PEF للتحقيق في ديناميكيات التمثيل الغذائي في نماذج مختلفة خارج الجسم الحي ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة والأنسجة البشرية 21،22،23،24،26،27،33. تدمج طريقة التصوير المستخدمة في هذه الدراسة الفحص المجهري DO-SRS و 2PEF ، والذي يمكن أن يتفوق على طرق التصوير الأخرى الخاصة بالجزيئات من خلال القضاء على الحاجة إلى استخراج الجزيئات أو وضع العلامات باستخدام الكواشف السامة للخلايا وتتطلب الحد الأدنى من تحضير العينة. على وجه التحديد ، يتيح لنا الفحص المجهري DO-SRS التحقيق في تكوين الدهون الجديدة وتخليق البروتين في الحيوانات والخلايا وتصور ديناميكياتها الأيضية في الموقع23،27،34. يلتقط 2PEF إشارات التألق الذاتي للجزيئات الحيوية التي تحدث بشكل طبيعي ، مثل Flavin و NADH ، في العينات البيولوجية35,36. يمكن أن يصل عمق اختراق التصوير ل SRS إلى 200-500 ميكرومتر في عينات تشتت أقل37. مع طرق إزالة الأنسجة مثل اليوريا ، يمكن أن يزيد عمق الاختراق بأكثر من عشرة أضعاف37. يتيح لنا اقتران SRS مع 2PEF تصوير الفلوروفورات الداخلية مثل Flavin و NADH في العينات البيولوجية ، مما يلغي الحاجة إلى المؤشرات الحيوية الخارجية للكشف. 2PEF يمكن أن تحقق عمق اختراق 500 ميكرومتر38. بالمقارنة مع طرق التصوير المتعددة الأخرى ، مثل الفحص المجهري الفلوري أحادي الفوتون متعدد الألوان ، يمكن لكل من DO-SRS و 2PEF تحقيق عمق اختراق أكبر بكثير بدون مؤشرات حيوية خارجية سامة للخلايا.
لزيادة الدقة المكانية ل DO-SRS و 2PEF ، قمنا بتطوير أداة ما بعد المعالجة34 لتقدير العزم التكيفي (آدم) القائمة على إزالة التفاف التنقيط (A-PoD). يمكن ل A-PoD تحويل صور DO-SRS و 2PEF محدودة الحيود إلى صور فائقة الدقة دون الحاجة إلى أي تحسينات على الأجهزة. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي طيف رامان على العديد من أوضاع الاهتزاز الكيميائي المحددة التي يمكن تسخيرها لزيادة عدد الجزيئات القابلة للاكتشاف. مع الاستفادة من هذه الميزة ، أنشأ مختبرنا طريقة مطابقة مرجعية معاقب عليها (PRF) للتمييز بين أنواع الدهون المتعددة في نماذج الخلايا والأنسجة36. يفتح هذان التطوران التقنيان آفاقا جديدة لدراسة العمليات البيولوجية بمزيد من التفصيل على المستويين الخلوي وشبه الخلوي ، والتي تم استخدامها لتوصيف التغيرات الأيضية في عمليات الدماغ والسرطان والشيخوخة26،27،35.
أحد القيود الرئيسية لهذا البروتوكول هو التركيز والحضانة الزمنية للعينات الخلوية مع D2O لإنتاج نطاقات C-D Raman متميزة وقابلة للقياس الكمي. يمكن لخطوط الخلايا الأكثر قوة والنشطة أيضيا ، مثل خلايا HeLa ، دمج ذرات الديوتيريوم في جزيئات كبيرة تم تصنيعها حديثا بمعدل أسرع من خطوط خلايا الثدييات غير المريضة ، مثل خلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK) ، مما يؤدي إلى شدة C-D مختلفة لوحظت لنفس التركيز والحضانة الزمنية مع D2O في خطين مختلفينمن الخلايا 21. علاوة على ذلك ، فإن إعطاء D2O بتركيز 80٪ أو أعلى لمدة 48 ساعة قد يؤدي إلى سمية العينات الخلوية. تعد تجربة التحسين لتحديد التركيز الأمثل ل D2O والحضانة الزمنية ضرورية لتحقيق النتائج المرجوة.
أحد الجوانب الحاسمة للبروتوكول هو دمج تصوير DO-SRS و 2PEF. عادة ، تشترك طرائق DO-SRS و 2PEF في نفس ليزر الإثارة بيكو ثانية ، حيث يمكن تحسين عرض النطاق الترددي الضيق باستخدام إشارات SRS و 2PEF. على الرغم من أن تقنيتنا محلية الصنع ، إلا أن هذه المنصة متاحة تجاريا39. هناك حاجة إلى معدات إضافية ، مثل نبضتين ليزر متزامنتين مع معدل ، وكاشف الصمام الثنائي الضوئي ، ومضخم قفل ، وجهود مشتركة لمجهر المسح للكشف عن إشارة رامان. يمكن شراء D2O بسهولة من بائعي التكنولوجيا الحيوية. لذلك ، يمكن للباحثين الوصول إلى هذه التكنولوجيا بسهولة بالغة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.
Acknowledgments
نشكر الدكتور ياجوان لي وأنتوني فونغ على دعمهما الفني ، ومختبر فرالي على خط الخلايا. نحن نعترف بأموال بدء التشغيل من UCSD و NIH U54CA132378 و NIH 5R01NS111039 و NIH R21NS125395 و NIHU54DK134301 و NIHU54 HL165443 وجائزة Hellman Fellow Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer - Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
| Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
| Silicon Wafer | |||
| Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
| Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
| Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Tweezers | Kaverme - Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
| Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
References
- Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
- Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P.
- Parthasarathy, A., et al. A three-ring circus: Metabolism of the three proteogenic aromatic amino acids and their role in the health of plants and animals. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 29 (2018).
- Wang, H., et al. l-tryptophan activates mammalian target of rapamycin and enhances expression of tight junction proteins in intestinal porcine epithelial cells. The Journal of Nutrition. 145 (6), 1156-1162 (2015).
- Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
- Mossmann, D., Park, S., Hall, M. N. mTOR signalling and cellular metabolism are mutual determinants in cancer. Nature Reviews. Cancer. 18 (12), 744-757 (2018).
- Kimura, T., Watanabe, Y. Tryptophan protects hepatocytes against reactive oxygen species-dependent cell death via multiple pathways including Nrf2-dependent gene induction. Amino Acids. 48 (5), 1263-1274 (2016).
- Ma, Q., et al. Dietary supplementation with aromatic amino acids decreased triglycerides and alleviated hepatic steatosis by stimulating bile acid synthesis in mice. Food and Function. 12 (1), 267-277 (2021).
- Cheng, C., et al. Treatment implications of natural compounds targeting lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease, obesity and cancer. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1654-1663 (2019).
- Lubes, G., Goodarzi, M. GC-MS based metabolomics used for the identification of cancer volatile organic compounds as biomarkers. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 313-322 (2018).
- Di Gialleonardo, V., Wilson, D. M., Keshari, K. R.
- Bowman, A. P., et al. Evaluation of lipid coverage and high spatial resolution MALDI-imaging capabilities of oversampling combined with laser post-ionisation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2277-2289 (2020).
- Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M. Imaging of lipid species by MALDI mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 50, 317-322 (2009).
- Pirman, D. A., et al. Changes in cancer cell metabolism revealed by direct sample analysis with MALDI mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), e61379 (2013).
- Li, Z., et al. Single-cell lipidomics with high structural specificity by mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 2869 (2021).
- Miyagi, M., Kasumov, T. Monitoring the synthesis of biomolecules using mass spectrometry. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 374 (2079), 20150378 (2016).
- Wang, T., Shogomori, H., Hara, M., Yamada, T., Kobayashi, T. Nanomechanical recognition of sphingomyelin-rich membrane domains by atomic force microscopy. Biochemistry. 51 (1), 74-82 (2012).
- Fung, A. A., Shi, L. Mammalian cell and tissue imaging using Raman and coherent Raman microscopy. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 12 (6), e1501 (2020).
- Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 11 (3), 1078-1101 (2021).
- Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
- Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
- Bagheri, P., Hoang, K., Fung, A. A., Hussain, S., Shi, L. Visualizing cancer cell metabolic dynamics regulated with aromatic amino acids using DO-SRS and 2PEF microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 779702 (2021).
- Li, Y., et al. Direct imaging of lipid metabolic changes in drosophila ovary during aging using DO-SRS microscopy. Frontiers in Aging. 2, 819903 (2022).
- Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of metabolic dynamics in aging Drosophila. Analyst. 146 (24), 7510-7519 (2021).
- Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
- Fung, A. A., et al. Imaging sub-cellular methionine and insulin interplay in triple negative breast cancer lipid droplet metabolism. Frontiers in Oncology. 12, 858017 (2022).
- Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of diet regulated metabolic activities in Drosophila during aging processes. Aging Cell. 21 (4), e13586 (2022).
- Shi, L., Wei, M., Min, W. Highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes. Journal of Visualized Experiments. (182), e63547 (2022).
- Rysman, E., et al. De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation. Cancer Research. 70 (20), 8117-8126 (2010).
- Lisec, J., Jaeger, C., Rashid, R., Munir, R., Zaidi, N. Cancer cell lipid class homeostasis is altered under nutrient-deprivation but stable under hypoxia. BMC Cancer. 19 (1), 501 (2019).
- Thiam, A. R., Dugail, I. Lipid droplet-membrane contact sites - from protein binding to function. Journal of Cell Science. 132 (12), (2019).
- Schott, M. B., et al. Lipid droplet size directs lipolysis and lipophagy catabolism in hepatocytes. The Journal of Cell Biology. 218 (10), 3320-3335 (2019).
- Hoang, K., et al. Subcellular resolution DO-SRS and 2PEF imaging of metabolic dynamics regulated by L-methionine in amyotrophic lateral sclerosis. Optical Biopsy XXI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. SPIE. 1237303, 6-13 (2023).
- Jang, H., et al. Super-resolution stimulated Raman scattering microscopy with A-PoD. bioRxiv. , (2022).
- Li, Y., et al. Optical metabolic imaging uncovers sex- and diet-dependent lipid changes in aging drosophila brain. bioRxiv. , (2022).
- Zhang, W., et al.
- Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).
- Chang, T., et al. Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy. Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).
- Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope - Label Free Imaging. Leica Microsystems. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/ (2023).
