Summary
우리는 이광자 여기 형광 현미경(2PEF)과 통합된 산화중수소(중수D2O) 탐침 자극 라만 산란(DO-SRS) 현미경을 사용하여 아미노산에 의해 조절되는 세포에서 대사 활동을 직접 시각화하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
필수 방향족 아미노산(AAA)은 세포에서 새로운 바이오매스를 합성하고 정상적인 생물학적 기능을 유지하기 위한 빌딩 블록입니다. 예를 들어, AAA의 풍부한 공급은 암세포가 빠른 성장과 분열을 유지하는 데 중요합니다. 이를 통해 세포가 현장에서 대사를 위해 AAA를 활용하는 방법을 직접 시각화하기 위해 최소한의 샘플 준비로 매우 특이적이고 비침습적인 이미징 접근 방식에 대한 수요가 증가하고 있습니다. 여기에서 우리는 산화중수소(D2O) 프로빙과 유도 라만 산란(DO-SRS)을 결합하고 DO-SRS와 이광자 여기 형광(2PEF)을 단일 현미경에 통합하여 AAA 조절 하에 HeLa 세포의 대사 활동을 직접 시각화하는 광학 이미징 플랫폼을 개발합니다. 종합적으로, DO-SRS 플랫폼은 단일 HeLa 세포 단위에서 새로 합성된 단백질과 지질의 높은 공간 분해능과 특이성을 제공합니다. 또한, 2PEF 양식은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH) 및 플라빈의 자가형광 신호를 무표지 방식으로 검출할 수 있습니다. 여기에 설명된 이미징 시스템은 시험관 내 및 생체 내 모델 모두와 호환되며, 이는 다양한 실험에 유연합니다. 이 프로토콜의 일반적인 워크플로에는 세포 배양, 배양 배지 준비, 세포 동기화, 세포 고정, DO-SRS 및 2PEF 양식을 사용한 샘플 이미징이 포함됩니다.
Introduction
필수 방향족 아미노산인 페닐알라닌(Phe)과 트립토판(Tryp)은 인체에 흡수되어 정상적인 생물학적 기능을 유지하기 위한 새로운 분자를 합성할 수 있습니다1. Phe는 단백질, 멜라닌 및 티로신의 합성에 필요하고 Tryp은 멜라토닌, 세로토닌 및 니아신 2,3의 합성에 필요합니다. 그러나 이러한 AAA의 과도한 섭취는 포유류의 라파마이신(mTOR) 경로 표적을 상향 조절하고, AMP 활성화 단백질 키나아제를 억제하며, 미토콘드리아 대사를 방해하여 거대분자 생합성을 집합적으로 변화시키고 건강한 세포에서 활성 산소종(ROS)과 같은 악성 전구체의 생성을 유도할 수 있습니다 4,5,6. 과도한 AAA 조절 하에서 변화된 대사 역학의 직접적인 시각화는 암 발병과 건강한 세포의 성장을 촉진하는 AAA의 역할을 이해하는 데 필수적입니다 7,8,9.
전통적인 AAA 연구는 가스 크로마토그래피(GC)에 의존합니다10. 자기공명영상(MRI)과 같은 다른 방법들은 제한된 공간 분해능을 가지며, 이는 생물학적 샘플의 세포 및 준세포 분석을 수행하기 어렵게 만든다11. 최근에, 비침습적 바이오마커12,13,14를 사용하여 암 증식에서 지질 및 단백질 합성에서 AAA의 역할을 설명하기 위해 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI)가 개발되었습니다. 그러나 이 기술은 여전히 얕은 이미징 깊이, 열악한 공간 해상도 및 광범위한 샘플 준비로 어려움을 겪고 있습니다. 세포 수준에서 질소-15 및 탄소-13과 같은 무독성 안정 동위원소는 다중 동위원소 이미징 및 나노 스케일 2차 이온 질량 분석법으로 추적하여 거대분자로의 결합을 이해할 수 있습니다. 그러나, 이들 방법은 살아있는 생물학적 샘플(15,16)을 파괴한다. 원자력 현미경(Atomic force microscopy, AFM)은 대사 역학을 시각화할 수 있는 또 다른 강력한 기술이다17. 반면에 AFM 이미징 중 스캔 속도가 느리면 열 드리프트로 인한 이미지 왜곡이 발생할 수 있습니다.
우리는 중수소-산화물(D2O) 프로브 자극 라만 산란(DO-SRS) 현미경 및 무표지 이광자 여기 형광 현미경(2PEF)을 결합하여 비침습적 쌍직교 이미징 방식을 개발했습니다. 이 양식은 생물학적 샘플 18,19,20,21,22,23,24를 이미징 할 때 높은 공간 분해능 및 화학적 특이성을 달성합니다. 이 프로토콜은 암 진행 중 지질, 단백질 및 산화 환원 비율 변화의 대사 역학을 조사하기 위해 DO-SRS 및 2PEF의 응용 프로그램을 소개합니다. D2O가 안정한 동위원소 형태의 물이기 때문에, 세포 내 총 체수분으로 빠르게 보상되어 효소 교환을 통해 탄소-중수소(C-D) 결합을 형성하기 때문에 세포 생체 분자를 중수소(D)로 표지할 수 있습니다21. 지질, 단백질, DNA/RNA 및 탄수화물을 포함하여 새로 합성된 거대분자의 C-D 결합은 라만 스펙트럼20,21,22,25,26,27의 세포 침묵 영역에서 검출될 수 있습니다. 두 개의 동기화된 레이저 펄스를 사용하면 새로 합성된 지질과 단백질의 C-D 결합을 추출하거나 세포독성제로 표지하지 않고도 초분광 이미징(HSI)을 통해 단일 세포에 표시할 수 있습니다. 또한, SRS 현미경은 일련의 단면 이미지(22,26)를 캡처하고 조합함으로써 생물학적 샘플에서 선택된 관심 영역의 3차원(3D) 모델을 구성할 수 있는 능력을 갖는다. 초분광 및 3D 체적 이미징을 통해 DO-SRS는 AAA 규정22에 따라 암 성장을 촉진하는 과정을 촉진하는 세포 기관 유형과 함께 단일 세포에서 새로 합성된 거대분자의 공간 분포를 얻을 수 있습니다. 또한, 2PEF를 사용하여, 우리는 생물학적 샘플21,23,24에서 고해상도, 깊은 침투 깊이 및 낮은 수준의 손상을 갖는 플라빈 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)의 자가형광 신호를 얻을 수 있습니다. Flavin 및 NADH 자가형광 신호는 암세포에서 산화환원 항상성 및 지질 과산화를 특성화하는 데 사용되었습니다22,26. 따라서 DO-SRS와 2PEF의 결합은 높은 공간 분포, 화학적 특이성 정보 및 최소한의 샘플 준비로 암세포에서 AAA 조절 대사 역학의 세포 내 분석을 제공할 뿐만 아니라 이 방법은 독성 시약으로 내인성 분자를 추출하거나 라벨링할 필요성을 줄여줍니다. 이 프로토콜에서 우리는 먼저 D2O 및 아미노산 준비뿐만 아니라 암 세포 배양의 절차를 제시합니다. 그런 다음 DO-SRS 이미징 및 2PEF 이미징의 프로토콜을 보여줍니다. 마지막으로 지질과 단백질의 AAA 조절 대사 변화와 암세포의 산화환원 비율 변화를 보여주는 SRS 및 2PEF 이미징의 대표적인 결과를 제시합니다. 프로세스에 대한 자세한 그림은 그림 1에 강조 표시되어 있습니다.
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Protocol
1. 매체 준비
- 50%D2O를 함유하는 Dulbecco's modified Eagle 배지(DMEM)에서 10mL의 대조군 및 과잉 AAA를 준비합니다.
- 대조군 배지의 경우, 15 mL 코니컬 튜브에서 10 mg의 DMEM 분말과 4.7 mL의 이중 증류수(ddH2O)를 측정하고 혼합한다. DMEM 분말은 표준 농도의 모든 아미노산을 함유하고 있습니다. 용액이 잘 섞이도록 튜브를 완전히 소용돌이 치고 뒤집습니다. 4.7mL의 D2O, 0.5mL의 소 태아 혈청(5% FBS), 0.1mL의 페니실린/스트렙토마이신(1%)을 추가합니다. 용액이 잘 섞이도록 튜브를 완전히 소용돌이 치고 뒤집습니다.
- 15x Phe 처리 배지의 경우 15mL 원뿔형 튜브에서 10mg의 DMEM 분말과 4.7mL의 ddH2O, 0.5mL의 FBS(5%) 및 0.1mL의 페니실린/스트렙토마이신(1%)을 측정하고 혼합합니다. 용액이 잘 섞이도록 튜브를 완전히 소용돌이 치고 뒤집습니다. 924mg/L 농도의 과잉 Phe 분말을 배지에 첨가합니다. 용액이 잘 섞이도록 튜브를 완전히 소용돌이 치고 뒤집습니다.
- 15x Tryp 처리 배지의 경우 15mL 원뿔형 튜브에서 10mg의 DMEM 분말과 4.7mL의 ddH2O, 0.5mL의 FBS(5%) 및 0.1mL의 페니실린/스트렙토마이신(1%)을 측정하고 혼합합니다. 용액이 잘 섞이도록 튜브를 완전히 소용돌이 치고 뒤집습니다. 224 mg/L의 농도에 과잉 Tryp 분말을 매체에 추가하십시오. 용액이 잘 섞이도록 튜브를 완전히 소용돌이 치고 뒤집습니다.
- 메티오닌과 트레오닌을 각각 30.0 mg/mL 및 95.0 mg/mL로 이전 단계의 모든 원추형 튜브에 추가합니다. 튜브를 완전히 소용돌이 치고 뒤집습니다. 피루브산 나트륨은 배양 배지에 첨가 할 필요가 없습니다.
- 0.22μm 폴리에테르설폰 멤브레인 필터가 있는 25mm 실린지 필터로 제어 및 처리 매체를 필터링합니다.
- 배지가 포함된 모든 원뿔형 튜브를 파라필름으로 밀봉하고 4°C에서 최대 3주 동안 보관합니다. 세포를 배지로 처리하기 전에 모든 배지를 37°C로 따뜻하게 합니다.
참고: 분말 및 액체 시약은 처리 및 대조 배지의 총 부피를 기준으로 측정 및 결합해야 합니다.
2. 세포 시료 준비
- 37°C 및 5% 이산화탄소(CO2)에서 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 표준 DMEM을 사용하여 배양 플라스크(즉, T10, T25 등)에서 자궁경부암(HeLa) 세포를 유지합니다.
- HeLa 세포를 80% 이상의 세포 생존율에 도달할 때까지 1:10의 분할 비율로 계대 배양합니다.
- 세포가 80% 이상의 밀도에 도달하면 0.5% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM을 사용하여 웰당 2 x 105 개의 세포를 24웰 플레이트에 시딩합니다.
- 세포 파종 전에 멸균된 폴리-d-라이신, 라미닌 코팅, 직경 12mm의 원형 커버슬립이 있는 24웰 플레이트를 준비합니다. 커버슬립을 70% 에탄올에 담그고 보푸라기가 없는 물티슈로 부드럽게 말립니다. 깨끗한 커버슬립을 플레이트의 적절한 웰에 놓습니다.
- 2.2단계에서 세포가 80% 밀도에 도달하면 마그네슘 및 칼슘 이온 없이 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 한 번 세척합니다.
- 0.25% 트립신을 첨가하여 부착 세포를 플라스크로부터 해리시키고 37°C 및 5%CO2 에서 3분 동안 배양한다.
- 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM을 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅한 다음 실온(RT)에서 300 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다.
- 0.5% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 세포를 재현탁합니다.
- 혈구계, 광학 현미경 및 트리판 블루를 사용하여 세포를 계수하고, 24-웰 플레이트의 웰 당 2 x 105 세포의 밀도를 시딩하였다. 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수할 수 있습니다.
- 세포를 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터로 되돌리고, 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포가 고르게 분포되도록 한다.
- 8시간 후, 기존 배양 배지를 50% D2O/초과 Phe 또는 50%D2O/초과Tryp 배지로 교체합니다. 세포를 37°C 및 5%CO2에서 36시간 동안 인큐베이터로 되돌린다.
- 36시간 후, 현미경 슬라이드에 세포를 고정한다.
- 고정하기 전에 직경 9mm의 이미징 스페이서가 있는 현미경 슬라이드를 준비하고 칼슘과 마그네슘 이온이 보충된 1x PBS 15μL를 배치합니다.
- 칼슘과 마그네슘 이온이 보충된 1x PBS로 세포를 헹굽니다.
- 0.5mL의 4% 메탄올이 없는 파라포름알데히드(PFA) 용액을 추가하고 플레이트를 약 15분 동안 생물안전 후드 아래에 둡니다.
- PFA 용액을 흡인하고 칼슘과 마그네슘 이온이 보충된 1x PBS로 두 번 헹굽니다.
- 칼슘과 마그네슘 이온이 보충된 1x PBS 1.5mL를 각 웰에 추가합니다.
- 멸균 핀셋을 사용하여 각 우물에서 커버 슬립을 부드럽게 잡습니다. 커버슬립의 세포 함유 면을 뒤집어 이미징 스페이서 위에 놓고 2.5.1단계에서 준비된 PBS와 접촉시킵니다. 비 세포 함유 측이 공기에 노출되었는지 확인하십시오.
- 투명 매니큐어를 사용하여 커버슬립의 바깥층을 이미징 스페이서로 밀봉합니다.
- 이미징을 하지 않을 때는 현미경 슬라이드를 4°C에서 보관하십시오.
3. 자발적 라만 분광법 측정(그림 2)
- 컨포칼 라만 현미경을 사용하여 자발적인 라만 스펙트럼을 얻을 수 있습니다(그림 2A).
- 키를 ON 위치로 돌려 레이저를 켭니다.
- LabSpec6 소프트웨어 아이콘을 더블 클릭하여 수집 소프트웨어를 엽니다.
- 생물학적 샘플을 대물 렌즈 바로 아래에 있는 샘플 홀더에 로드합니다.
- 소프트웨어에서 카메라 아이콘을 클릭하여 비디오 카메라를 켭니다.
- 초점 평면을 조정하여 50x 대물 렌즈로 관심 영역을 식별합니다. 조이스틱을 움직여 XY s의 평면 이동을 제어합니다.tage 조이스틱을 돌려 초점 심도를 변경합니다.
- 측정 위치를 선택한 후 40mW의 여기 파워를 가진 100x 대물 렌즈로 전환합니다. 빨간색 중지 아이콘을 클릭하여 비디오 카메라를 끕니다.
- 1800 lines/mm의 격자를 선택하고 획득 범위를 400cm-1에서 3,150cm-1로 설정합니다.
- Acquisition Time을 90초로, Accumulation을 3으로, Binning을 4로 설정하여 노이즈를 최소화하고 스펙트럼을 가장 정확하게 측정합니다.
참고: 이러한 이미징 매개변수는 실험에 맞게 최적화할 수 있습니다. - 화살표 아이콘을 클릭하여 실시간 디스플레이를 켭니다.
- 라만 시프트(cm-1)를 선택한 값으로 조정하여 초점 평면을 미세 조정합니다.
참고: 이 실험에서 라만 레이저는 고농도의CH2 결합을 포함하는 지질 방울에 초점을 맞췄습니다. 따라서,CH2 결합의 연신 모드와 일치하는 2,850 cm-1의 라만 시프트가 목적을 위해 선택되었다. - 조이스틱으로 초점면을 조정하여 최상의 신호 대 잡음비를 최적화합니다.
- 초점 평면을 선택한 후 빨간색 중지 아이콘을 클릭하면 실시간 디스플레이가 표시됩니다.
- Circle 아이콘을 선택하여 스펙트럼 수집을 시작합니다.
- 세포 영역을 촬영한 후에는 동일한 초점 평면을 사용하여 PBS로 배경을 측정합니다. Origin과 같은 별도의 컴퓨터 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 각 세포 내 타겟 스펙트럼에서 배경 스펙트럼을 뺍니다(그림 1B).
4. 2PEF 및 SRS를 사용한 이미징 실험
참고: SRS 레이저 정렬에 대한 자세한 설명은 이전 보고서28에서 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜은 다중 모드 SRS 및 2PEF 이미징 시스템의 작동에 중점을 둡니다(그림 2C, D).
- 시작을 클릭하여 레이저를 예열합니다.
- 1) 컨트롤 박스 IX3-CBH의 메인 스위치를 On으로 누르고, 2) 터치 패널 컨트롤러의 메인 스위치를 On으로 누르고, 3) 메인 레이저 결합기 FV31-SCOMB에 연결된 LD OBIS 6 Laser Remote용 전원 공급 장치의 AC 어댑터 메인 스위치를 On으로 누릅니다., 4) 서브 레이저 결합기 FV31-SCOMB에 연결된 LD OBIS 6 Laser Remote용 전원 공급 장치의 AC 어댑터 메인 스위치를 On으로 누릅니다.
- Si 포토다이오드 검출기와 락인(lock-in)의 메인 스위치를 누릅니다.
- 스톡스 빔을 1,031nm, 펄스 폭을 6ps, 반복률을 80MHz로 설정합니다.
- 현미경에 결합하여 720-990nm의 조정 가능한 파장 , 5-6ps의 펄스 폭 및 80MHz의 반복률 로 동기화된 펌프 빔과 함께 제공되는 picoEmerald 시스템을 설정합니다. 펌프와 Stokes의 평균 여기 전력은 450mW입니다. 여기 파워를 최적화하여 시료의 광손상을 최소화합니다.
- 높은 개구수(NA) 오일 콘덴서(즉, 1.4NA)를 사용하여 스톡스를 수집하고 콘덴서에 몇 방울을 떨어뜨려 샘플이 장착된 빔을 펌핑합니다.
- 오일에 샘플을 장착하고 샘플이 고정된 현미경 슬라이드 위에 큰 물방울을 놓습니다. 이것은 침수 대물 렌즈용입니다.
- 락인앰플리파이어를 20MHz로 설정합니다. 이제 초고해상도 소프트웨어 모듈을 사용하여 이미지를 처리합니다.
- 체류 시간으로 512 픽셀 x 512 픽셀 및 80 μs/픽셀을 선택합니다.
- 원하는 세포 영역에 초점이 맞춰지면 이미지를 획득합니다. 현미경의 수집 소프트웨어를 사용하여 이미지를 Olympus .oir 그래픽 파일로 저장합니다.
- 1,900cm-1에서 배경 이미지를 획득하고 모든 셀룰러 이미지에서 뺍니다.
- 2PEF 이미징을 수행하려면 동일한 조정 가능한 피코초 레이저를 사용하고 Flavin 및 NADH의 무표지 자가형광을 각각 800nm 및 780nm로 설정합니다.
- 460nm/515nm 필터 큐브를 사용하여 Flavin 및 NADH 자가형광 후방 산란 방출을 수집합니다.
- 체류 시간을 8μs/픽셀로 조정하고 픽셀 크기를 512픽셀 x 512픽셀로 조정합니다. 레이저 셔터 출력 매개변수를 150mW로 설정합니다.
- 3D 이미지 재구성을 위해 자극된 라만 손실을 2,850cm-1(797nm)로 조정합니다.
- 원하는 단일 세포가 식별되면 레이저를 등록하여 상단 초점 평면에서 스캔하여 해당 셀의 상단 및 하단 레이어를 감지합니다.
참고: 3D 모델이 생성되어 .oir 파일로 저장됩니다.
5. 스펙트럼 및 이미지 분석
- 스펙트럼 분석
- Origin 소프트웨어 또는 기타 관련 응용 프로그램을 사용하여 모든 세포 내 표적 스펙트럼에서 배경 스펙트럼을 뺍니다.
- MATLAB의 수학적 모델링 연산을 사용하여 소프트웨어에 내장된 함수로 라만 스펙트럼을 처리할 수 있습니다. Python은 스펙트럼 처리에도 사용할 수 있습니다.
- 스펙트럼 전처리는 파일을 배열로 변환하는 것으로 시작됩니다. 스펙트럼은 매 역수 센티미터에서 보간됩니다.
- 검증을 위해 원시 데이터를 그래프로 표시합니다. MATLAB에 내장된 함수 msbackadj 를 사용하여 원시 스펙트럼에 대한 기준선 보정을 수행합니다. 간단히 말해서 기본 제공 함수는 사용자가 식별한 분리 단위 값에서 기준점을 추정하고 인접한 창 사이의 거리를 반환합니다. 기준선에서 회귀선을 추정하고 그립니다. Apply Smoothing(스무딩) 을 적용하여 회귀선을 평활화하여 각 개별 원시 스펙트럼에서 기준선을 뺍니다.
- 2,930cm-1에서 단백질의 라만 강도를 각 라만 시프트의 강도로 나누어 최소-최대 정규화를 수행합니다. 2,930cm-1 신호는 일반적으로 라만 스펙트럼에서 가장 높은 강도입니다. 이 정규화를 사용하면 최대값은 1로 변환되고 최소값은 0으로 변환됩니다. 다른 모든 값은 0과 1 사이의 10진수로 변환됩니다.
- 노이즈를 줄이기 위해 동일한 조건의 개별 스펙트럼을 단일 스펙트럼으로 평균화합니다.
- 처리가 완료되면 Origin과 같은 응용 프로그램을 사용하여 모든 스펙트럼을 동시에 표시합니다. 스펙트럼에 표시된 피크는 특정 화학 결합 또는 작용기를 나타냅니다.
- 지질 방울의 3D 이미지 분석
- FIJI-ImageJ 소프트웨어를 사용하여 모든 3D 이미지 처리
- 3D 이미지 스택에 대해 대역통과 필터 및 스무딩 기능을 수행합니다.
- 3D 이미지 분석의 경우 각 지질 방울을 질량 중심과 표면 사이의 거리를 측정하여 계산된 구형 점수에 할당합니다. 각 구형 점수를 동일한 유클리드 평면도에서 완벽한 구의 구형 점수와 비교합니다. 구형 점수가 낮은 지질 방울을 버리고 나머지 지질 방울의 부피와 개수를 평가합니다.
- 적절한 통계 소프트웨어 응용 프로그램에서 통계적 유의성을 위해 서로 다른 처리 사이의 지질 방울의 양과 개수를 분석합니다. 여기서는 GraphPad Prism을 사용했습니다.
- 2D 초분광 이미지 분석
- FIJI-ImageJ 소프트웨어를 사용하여 모든 2D 초분광 이미지를 처리할 수 있습니다.
- 2,930cm-1 채널을 선택하여 0과 1 값을 포함하는 마스크 이미지를 만듭니다. 배경을 0에 할당하고 셀룰러 영역을 1에 할당합니다.
- 중수소 표지 단백질 채널(2,175 cm-1)을 배경 채널(1,900 cm-1)에서 빼서 형광 효과를 제거합니다.
- 생성된 중수소 표지 단백질 채널을 단백질 채널(2,930cm-1)로 나누어 단백질 회전율 비율계량 이미지를 얻습니다.
- 그런 다음 5.3.2단계에서 만든 마스크 이미지에 비율계량 이미지를 곱하여 남아 있는 배경 소음을 제거합니다. 그 결과, 어두운 배경이 각 비율계량 이미지에 생성됩니다.
- FIJI-ImageJ의 자유형 선택 도구를 사용하여 단일 셀에 표시되는 픽셀 강도를 수동으로 분할하고 계산할 수 있습니다. 픽셀 강도는 시각화되는 화학 결합의 농도에 해당합니다.
- 적절한 통계 소프트웨어 응용 프로그램에서 통계적 유의성을 위해 픽셀 강도를 분석합니다. 여기서는 GraphPad Prism을 사용했습니다. 나머지 비율계량 분석과 함께 이 분석을 반복합니다.
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Representative Results
50%D2O-함유 세포 배양 배지에 15x 농도의 과량의 AAA를 첨가하면 HeLa 세포에서 새로 합성된 지질 및 단백질의 뚜렷한 C-D 라만 밴드가 생성되었습니다(그림 2B). 이전 실험은 2x 및 5x와 같은 다양한 농도 수준으로 수행되었으며 데이터가 제시되지는 않았지만 15x 농도는 새로 합성된 지질 및 단백질의 가장 뚜렷한 C-D 라만 밴드를 생성했습니다. 구체적으로, 지질 방울(LD)을 조사함으로써 15x Phe와 15x Tryp 모두 각각 2,143cm-1 및 2,172cm-1에서 새로 합성된 지질과 단백질 신호를 유도한다는 것을 발견했습니다. DO-SRS는 이후 단일 셀에서 C-D 신호의 공간 분포를 시각화하는 데 사용되었습니다(그림 3). ImageJ를 사용하여 그림 3A에서 흰색 점선 테두리로 표시된 대로 개별 셀의 픽셀 강도를 수동으로 분할하고 계산했습니다. 대조군 세포는 중간 정도의 C-D 지질 및 단백질 밴드를 나타냅니다. 그러나 15x Phe 및 15x Tryp은 더 강한 C-D 지질 및 단백질 밴드를 나타냅니다. 정량 분석에 따르면 과도한 AAA는 지질 합성을 10%-17% 상향 조절할 수 있지만 단백질 합성은 10% 하향 조절할 수 있습니다(그림 3C, D). 결과는 새로 합성된 지질을 축적하고, 미토콘드리아 기능 장애를 촉진하며, 과도한 AAA 조절7 하에서 산화 불균형을 유발하는 자가포식의 부족 가능성을 추론합니다.
불포화 지질(~3,011 cm-1), 포화 지질(~2,880 cm-1) 및 NADH, Flavin의 무표지 다중 모드 SRS 및 2PEF 이미징을 획득하여 AAA가 암 대사에 미치는 영향을 이해했습니다. 마찬가지로, 개별 셀의 픽셀 강도는 그림 3B에서 흰색 점선 테두리로 표시된 것처럼 ImageJ를 사용하여 수동으로 분할되고 계산되었습니다. AAA 처리 세포의 비율계량 분석은 불포화 지질/포화 지질이 10% 증가하고 플라빈/플라빈 + NADH가 50% 증가한 것으로 나타났습니다(그림 3E,F). 미토콘드리아의 전자 수송 사슬에서, ROS는 NADH 및 FADH2로부터 분자 산소 종으로의 전자의 전달로부터 생성될 수 있다. 많은 암세포에서 ROS의 축적은 불포화 지방산을 산화시키고 포화 지방산 합성을 촉진하며 NADH 자가형광 신호를 고갈시키는 산화적 불균형을 초래합니다. 따라서 Flavin/Flavin + NADH의 관찰된 증가는 NADH 자가형광 신호를 감소시키는 축적된 ROS의 지표입니다. 산화 불균형에 대한 반응으로 HeLa 세포는 산화된 지질 합성을 대체하기 위해 불포화 지질 합성을 상향 조절할 수 있습니다. 이 반응은 다른 암 세포주(29)에서는 관찰되지 않으며, 이는 과잉 AAA 식이(30) 하에서 암세포의 대사 이질성을 의미한다.
다중 모드 이미징 외에도 SRS는 대조군 및 AAA 처리된 HeLa 세포에서 LD의 라벨 없는 3D 이미지를 재구성할 수 있습니다. 간단히 말해서, 현미경은 선택한 관심 영역 전체에 걸쳐 일련의 단면 이미지를 생성합니다. 이 연구에서는 자극된 라만 손실(SRL)을 2,845cm-1로 조정하고 1μm의 단계 크기로 최상층에서 최하층으로 스캔했습니다(그림 4A). 3D 지질 방울의 정량적 분석은 LD가 대조군에 비해 AAA 처리 세포에서 크기가 감소했지만 개수가 증가했음을 보여줍니다(그림 4B,C). Tryp 및 Phe와 같은 부피가 큰 소수성 아미노산의 존재가 증가하면 LD 코팅 단백질의 기능이 손상될 수 있습니다. 이것은 궁극적으로 수많은 작은 LD를 축적하는 지방 분해를 감소시킵니다. 이 연구의 무표지 3D SRS 체적 이미징 결과는 과도한 AAA 처리된 세포가 수많은 더 작은 LD를 나타낸다는 것을 시각화함으로써 이전 연구와 확증합니다31,32.
그림 1: DO-SRS 및 2PEF를 사용한 이미지 획득 및 분석의 그림. (A) 지질 액적 수, 부피 및 구형 점수를 획득하기 위한 3D 이미지 재구성 및 분석. (B) 중수소 표지 지질(CDL; 2,145 cm-1), 지질(2,845 cm-1), 중수소 표지 단백질(CDP; 2,175 cm-1), 단백질(2,940 cm-1), 불포화 지질(3,011cm-1), 포화 지질(2,880 cm-1), NADH 및 Flavin. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 자발적 라만 분광법과 자극 라만 산란 현미경의 물리적 설정. (A) 이 연구에 사용된 자발적 라만 분광법 설정. (B) CD 라벨(빨간색), CD 라벨 없음(검은색), 대조군(파란색, 실선), 15x Phe 처리군(빨간색, 점선) 및 15x Tryp 처리군(분홍색, 점선)에 대한 샘플 자발적 라만 스펙트럼. (C) 이 조사에 사용된 자극 라만 산란 현미경 설정의 개략도. (D) DO-SRS 및 2PEF 플랫폼으로 사용되는 유도 라만 산란 현미경 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: DO-SRS 및 2PEF 현미경을 사용하여 HeLa 세포의 대사 역학을 시각화합니다. (A) 중수소 표지 지질(2,145 cm-1), 지질(2,845 cm-1), 중수소 표지 단백질(2,175 cm-1), 단백질(2,940 cm-1) 제어 하에 있는 HeLa 세포에서 시각화(Ctrl), 15x 페닐알라닌(15x Phe) 및 15x 트립토판(15x Tryp) DO-SRS 플랫폼으로. 지질 회전율과 단백질 회전율은 로 
계산 
하였다. Raw 이미지는 먼저 PBS 신호로 빼서 배경 강도를 제거하고 ImageJ를 사용하여 셀 외부의 강도를 제거하기 위해 마스킹되었습니다. 비율계량 분석을 위해 픽셀별 분할을 수행하였다. (B) 2PEF 현미경으로 시각화된 NADH 및 Flavin 채널, 라벨이 없는 SRS 현미경으로 시각화된 불포화 지질(3,011cm-1) 및 포화 지질(2,880cm-1). 광학 산화 환원 비율 및 포화 비율은 및 로 
계산 
되었습니다. (C-F) 대조군, 15x Phe 및 15x Tryp 조건 하에서 각 HeLa 세포에 대한 비율계량 강도의 정량화. 통계적 차이는 과잉 AAA 조건과 대조군 조건을 비교하는 데 사용되었습니다. p< 0.0001, ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05는 양방향 ANOVA 검정으로부터 계산하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 무표지 SRS 현미경을 사용한 단일 HeLa 세포의 3D 지질 액적 분포 시각화. (A) 대조군 및 과잉 AAA 조건 하에서 HeLa 세포에서의 SRS 3D 지질 액적 부피 투영. 임계값은 분석 전에 정의되어 지질 액적 신호 분포를 나타냅니다. (나,씨) 양방향 ANOVA 테스트를 사용하여 대조군 및 과잉 AAA 조건 하에서 개별 HeLa 세포 내의 지질 액적 부피 및 계수를 정량화합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
DO-SRS 및 2PEF 이미징은 초파리 및 인간 조직 21,22,23,24,26,27,33을 포함한 다양한 생체 외 모델에서 대사 역학을 조사하기 위해 적용되었습니다. 이 연구에 사용된 이미징 양식은 DO-SRS 및 2PEF 현미경을 통합하여 분자 추출 또는 세포독성 시약으로 라벨링할 필요가 없고 최소한의 샘플 준비가 필요하므로 다른 분자별 이미징 방법을 능가할 수 있습니다. 특히, DO-SRS 현미경을 통해 동물과 세포에서 새로운 지방 생성 및 단백질 합성을 조사하고 현장에서 대사 역학을 시각화할 수 있습니다23,27,34. 2PEF는 생물학적 샘플35,36에서 플라빈(Flavin) 및 NADH와 같은 자연 발생 생체분자의 자가형광 신호를 포착한다. SRS의 이미징 침투 깊이는 더 적은 산란 샘플(37)에서 최대 200-500 μm를 달성할 수 있다. 요소와 같은 조직 투명 방법을 사용하면 침투 깊이가 10배 이상 증가할 수 있다(37). SRS와 2PEF의 결합을 통해 생물학적 샘플에서 Flavin 및 NADH와 같은 내인성 형광단을 이미지화할 수 있으므로 검출을 위한 외인성 바이오마커의 필요성이 더욱 제거됩니다. 2PEF는 500μm38의 침투 깊이를 달성할 수 있다. 다색 단일 광자 컨포칼 형광 현미경과 같은 다른 다중 이미징 방식과 비교할 때 DO-SRS와 2PEF는 모두 세포독성 외인성 바이오마커 없이 훨씬 더 큰 침투 깊이를 달성할 수 있습니다.
DO-SRS 및 2PEF의 공간 해상도를 증가시키기 위해, 본 발명자들은 적응 모멘트 추정(Adam)-기반 점묘법 디콘볼루션(A-PoD) 이미지 후처리 도구(34)를 개발하였다. A-PoD는 하드웨어 개선 없이 회절 제한 DO-SRS 및 2PEF 이미지를 초해상도 이미지로 변환할 수 있습니다. 또한 라만 스펙트럼에는 검출 가능한 분자의 수를 늘리는 데 활용할 수 있는 많은 특정 화학적 진동 모드가 포함되어 있습니다. 이러한 이점을 이용하여 우리 연구실은 세포 및 조직 모델36에서 여러 지질 종을 구별하기 위해 PRF(penalized reference matching) 방법을 추가로 생성했습니다. 이 두 가지 기술 개발은 뇌, 암 및 노화 과정의 대사 변화를 특성화하는 데 사용 된 세포 및 하위 세포 수준에서 생물학적 과정을보다 자세히 연구하기위한 새로운 길을 열어줍니다26,27,35.
이 프로토콜의 한 가지 주요 한계는 뚜렷하고 정량화 가능한 C-D 라만 밴드를 생성하기 위해D2O를 사용한 세포 샘플의 농도 및 시간 배양입니다. HeLa 세포와 같은 보다 견고하고 대사적으로 활성인 세포주는 인간 배아 신장(HEK) 세포와 같은 병에 걸리지 않은 포유동물 세포주보다 더 빠른 속도로 새로 합성된 거대분자에 중수소 원자를 통합할 수 있으며, 이는 2개의 상이한 세포주에서D2O와 동일한 농도 및 시간 배양에 대해 관찰된 다양한 C-D 강도를 유도한다21. 또한, 48시간 동안 80% 또는 그 이상의 농도로D2O를 투여하면 세포 샘플에 독성이 도입될 수 있다. 최적의D2O농도 및 인큐베이션 시간을 확인하기 위한 최적화 실험은 바람직한 결과를 얻기 위해 필요하다.
프로토콜의 중요한 측면은 DO-SRS와 2PEF 이미징의 통합입니다. 일반적으로 DO-SRS 및 2PEF 양식은 SRS 및 2PEF 신호로 좁은 대역폭을 최적화할 수 있기 때문에 동일한 피코초 여기 레이저를 공유합니다. 우리의 기술은 자체 제작되었지만 이 플랫폼은 상업적으로 이용 가능합니다39. 라만 신호를 검출하기 위해서는 변조기, 포토다이오드 검출기, 락인앰플리파이어 및 스캐닝 현미경의 공동 노력이 있는 두 개의 동기화된 레이저 펄스와 같은 추가 장비가 필요합니다. D2O는 생명공학 벤더로부터 쉽게 구입할 수 있다. 따라서 연구자들은 이 기술에 매우 쉽게 접근할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이해 관계나 기타 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
기술 지원을 해주신 Yajuan Li 박사와 Anthony Fung, 세포주에 대해 Fraley 연구실에 감사드립니다. 우리는 UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 및 Hellman Fellow Award의 창업 자금을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer - Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
| Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
| Silicon Wafer | |||
| Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
| Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
| Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Tweezers | Kaverme - Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
| Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
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