Summary
Vi presenterer en protokoll for direkte å visualisere metabolske aktiviteter i celler regulert av aminosyrer ved bruk av deuteriumoksid (tungtvann D2O) probed stimulert Raman-spredning (DO-SRS) mikroskopi, som er integrert med to-foton eksitasjonsfluorescensmikroskopi (2PEF).
Abstract
Essensielle aromatiske aminosyrer (AAA) er byggesteiner for å syntetisere nye biomasser i celler og opprettholde normale biologiske funksjoner. For eksempel er en rikelig tilførsel av AAA viktig for kreftceller for å opprettholde sin raske vekst og deling. Med dette er det en økende etterspørsel etter en svært spesifikk, ikke-invasiv bildebehandling tilnærming med minimal prøveforberedelse for direkte å visualisere hvordan celler utnytter AAA for deres metabolisme in situ. Her utvikler vi en optisk bildebehandlingsplattform som kombinerer deuteriumoksid (D2O) sondering med stimulert Raman-spredning (DO-SRS) og integrerer DO-SRS med to-foton eksitasjonsfluorescens (2PEF) i et enkelt mikroskop for direkte å visualisere de metabolske aktivitetene til HeLa-celler under AAA-regulering. Samlet gir DO-SRS-plattformen høy romlig oppløsning og spesifisitet av nylig syntetiserte proteiner og lipider i enkelt HeLa-celleenheter. I tillegg kan 2PEF-modaliteten oppdage autofluorescenssignaler av nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) og Flavin på en etikettfri måte. Avbildningssystemet beskrevet her er kompatibelt med både in vitro - og in vivo-modeller , som er fleksibelt for ulike eksperimenter. Den generelle arbeidsflyten til denne protokollen inkluderer cellekultur, forberedelse av kulturmedier, cellesynkronisering, cellefiksering og prøveavbildning med DO-SRS- og 2PEF-modaliteter.
Introduction
Å være essensielle aromatiske aminosyrer (AAA), fenylalanin (Phe) og tryptofan (Tryp) kan absorberes av menneskekroppen for å syntetisere nye molekyler for å opprettholde normale biologiske funksjoner1. Phe er nødvendig for syntese av proteiner, melanin og tyrosin, mens Tryp er nødvendig for syntesen av melatonin, serotonin og niacin 2,3. Imidlertid kan overskytende forbruk av disse AAAene oppregulere pattedyrmålet for rapamycin (mTOR) -banen, hemme AMP-aktivert proteinkinase og forstyrre mitokondriell metabolisme, kollektivt endre makromolekylbiosyntese og føre til produksjon av ondartede forløpere, slik som reaktive oksygenarter (ROS) i friske celler 4,5,6. Direkte visualisering av endret metabolsk dynamikk under overflødig AAA-regulering er avgjørende for å forstå AAAs roller i å fremme kreftutvikling og vekst av friske celler 7,8,9.
Tradisjonelle AAA-studier er avhengige av gasskromatografi (GC)10. Andre metoder, som magnetisk resonansavbildning (MR), har begrensede romlige oppløsninger, noe som gjør det vanskelig å utføre cellulær og subcellulær analyse av biologiske prøver11. Nylig har matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering (MALDI) blitt utviklet for å belyse AAAs rolle i lipid- og proteinsynteser i kreftproliferasjon med ikke-invasive biomarkører12,13,14. Imidlertid lider denne teknikken fortsatt av grunne bildedybder, dårlig romlig oppløsning og omfattende prøvepreparering. På mobilnivå kan ikke-toksiske stabile isotoper, som nitrogen-15 og karbon-13, spores med multi-isotopavbildning og nanoskala sekundærionmassespektrometri for å forstå deres innlemmelse i makromolekyler. Disse metodene er imidlertid ødeleggende for levende biologiske prøver15,16. Atomkraftmikroskopi (AFM) er en annen kraftig teknikk som kan visualisere metabolsk dynamikk17. Den langsomme skannehastigheten under AFM-avbildning kan derimot forårsake bildeforvrengning av resultatet fra termisk drift.
Vi utviklet en ikke-invasiv biortogonal avbildningsmodalitet ved å koble deuteriumoksid (D2O) probed stimulert Raman-spredning (DO-SRS) mikroskopi og etikettfri to-foton eksitasjonsfluorescensmikroskopi (2PEF). Denne modaliteten oppnår en høy romlig oppløsning og kjemisk spesifisitet ved avbildning av biologiske prøver 18,19,20,21,22,23,24. Denne protokollen introduserer anvendelsene av DO-SRS og 2PEF for å undersøke den metabolske dynamikken til lipider, protein og redoksforhold under kreftprogresjoner. Med D2O som en stabil isotopform av vann, kan cellulære biomolekyler merkes med deuterium (D) på grunn av sin raske kompensasjon med totalt kroppsvann i celler, og danner karbon-deuterium (C-D) bindinger gjennom enzymatisk utveksling21. C-D-bindingene i nylig syntetiserte makromolekyler, inkludert lipider, proteiner, DNA / RNA og karbohydrater, kan detekteres i den cellestille regionen av Raman-spekteret 20,21,22,25,26,27. Med to synkroniserte laserpulser kan C-D-bindinger av nylig syntetiserte lipider og proteiner vises på enkeltceller via hyperspektral avbildning (HSI) uten å ekstrahere eller merke dem med cytotoksiske midler. I tillegg har SRS-mikroskopi evnen til å konstruere tredimensjonale (3D) modeller av utvalgte regioner av interesse for biologiske prøver ved å fange og kombinere et sett med tverrsnittsbilder22,26. Med hyperspektral og 3D volumetrisk avbildning kan DO-SRS oppnå romlige fordelinger av nylig syntetiserte makromolekyler i enkeltceller, sammen med typen organeller som letter prosessen med å fremme kreftvekst under AAA-regulering22. Videre kan vi ved hjelp av 2PEF oppnå autofluorescenssignaler av Flavin og nikotinamid-adenindinukleotid (NADH) med høy oppløsning, dyp penetrasjonsdybde og lavnivåskade i biologiske prøver21,23,24. Flavin og NADH autofluorescenssignaler har blitt brukt til å karakterisere redokshomeostase og lipidperoksidasjon i kreftceller22,26. Som sådan gir ikke bare koblingen av DO-SRS og 2PEF subcellulær analyse av AAA-regulert metabolsk dynamikk i kreftceller med høy romlig fordeling, kjemisk spesifisitetsinformasjon og minimal prøvepreparering, men metoden reduserer også behovet for å trekke ut eller merke endogene molekyler med giftige reagenser. I denne protokollen presenterer vi først prosedyrene forD2O- og aminosyrepreparat, samt kreftcellekultur. Deretter viser vi protokollene til DO-SRS-avbildning og 2PEF-bildebehandling. Til slutt presenterer vi de representative resultatene av SRS og 2PEF-avbildning, som viser AAA-regulerte metabolske endringer av lipider og protein, og endringer i redoksforhold i kreftceller. En detaljert illustrasjon av prosessen er uthevet i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Media forberedelse
- Klargjør 10 ml kontroll og overflødig AAA i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) som inneholder 50 % D2O.
- For kontrollmediet måles og blandes 10 mg DMEM pulver med 4,7 ml dobbeltdestillert vann (ddH2O) i et 15 ml konisk rør. DMEM-pulveret inneholder alle aminosyrene ved standardkonsentrasjoner. Virvel grundig og snu røret for å sikre at oppløsningen er godt blandet. Tilsett 4,7 ml D2O, 0,5 ml føtal bovint serum (5% FBS) og 0,1 ml penicillin / streptomycin (1%). Virvel grundig og snu røret for å sikre at oppløsningen er godt blandet.
- For 15x Phe behandlingsmedium, måle og blande 10 mg DMEM pulver med 4,7 ml ddH2O, 0,5 ml FBS (5%) og 0,1 ml penicillin / streptomycin (1%) i en 15 ml konisk rør. Virvel grundig og snu røret for å sikre at oppløsningen er godt blandet. Legg overflødig Phe pulver i en konsentrasjon på 924 mg / l til mediet. Virvel grundig og snu røret for å sikre at oppløsningen er godt blandet.
- For 15x Tryp behandlingsmedium, mål og bland 10 mg DMEM pulver med 4,7 ml ddH2O, 0,5 ml FBS (5%) og 0,1 ml penicillin / streptomycin (1%) i et 15 ml konisk rør. Virvel grundig og snu røret for å sikre at oppløsningen er godt blandet. Tilsett overflødig tryppulver i en konsentrasjon på 224 mg / l til mediet. Virvel grundig og snu røret for å sikre at oppløsningen er godt blandet.
- Tilsett metionin og treonin ved henholdsvis 30,0 mg / ml og 95,0 mg / ml til alle koniske rør i de foregående trinnene. Virvel grundig og inverter røret. Det er ikke nødvendig å tilsette natriumpyruvat i dyrkningsmediet.
- Filtrer kontroll- og behandlingsmediet med et 25 mm sprøytefilter med 0,22 μm polyetersulfonmembranfiltre.
- Forsegle alle koniske tuber med parafilm og oppbevares ved 4 °C i opptil 3 uker. Før cellene behandles med medier, varm alle mediene til 37 °C.
MERK: Pulver- og væskereagensene skal måles og kombineres basert på det totale volumet av behandlings- og kontrollmedier.
2. Forberedelse av celleprøver
- Opprettholde livmorhalskreft (HeLa) celler i en kultur kolbe (dvs. T10, T25, etc.) ved hjelp av standard DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin ved 37 ° C og 5% karbondioksid (CO2).
- Subkultur HeLa-cellene i et delt forhold på 1:10 til de når 80% eller høyere cellelevedyktighet.
- Når cellene oppnår 80% eller høyere konfluens, fortsett til frø 2 x 10 5 celler per brønn på en 24-brønnplate ved bruk av DMEM supplert med0,5 % FBS og 1% penicillin / streptomycin.
- Før cellesåing, lag en 24-brønnsplate med sterilisert, poly-d-lysin, lamininbelagte, runde deksler, 12 mm i diameter. Senk dekslene i 70 % etanol og tørk forsiktig med lofrie våtservietter. Plasser de rene dekslene i passende brønner på platen.
- Når cellene når 80% konfluens i trinn 2.2, vask cellene en gang med 1x fosfatbufret saltvann (PBS) uten magnesium og kalsiumioner.
- Tilsett 0,25% trypsin for å dissosiere de adherente cellene fra kolben og inkubere ved 37 ° C og 5% CO2 i 3 minutter.
- Tilsett DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin, pipetter forsiktig opp og ned, og samle cellene ved sentrifugering ved 300 x g ved romtemperatur (RT) i 3 minutter.
- Resuspendere cellene i DMEM supplert med 0,5% FBS og 1% penicillin / streptomycin.
- Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer, lysmikroskop og trypanblått, og frø en tetthet på 2 x 105 celler per brønn på en 24-brønnsplate. Alternativt kan en automatisert celleteller brukes til å telle cellene.
- Sett cellene tilbake til inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2, og rist forsiktig platen for å fordele cellene jevnt.
- Etter 8 timer, erstatt det gamle kulturmediet med 50% D 2O / overflødig Phe eller 50% D2O / overflødig Tryp media. Returner cellene til inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2 i 36 timer.
- Etter 36 timer, fest cellene på lysbildene i mikroskopet.
- Før fiksering, klargjør mikroskoplysbilder med bildeavstandsstykker 9 mm i diameter og plasser 15 μL 1x PBS supplert med kalsium- og magnesiumioner.
- Skyll cellene med 1x PBS supplert med kalsium- og magnesiumioner.
- Tilsett 0,5 ml 4 % metanolfri paraformaldehydoppløsning (PFA) og la platen ligge under biosikkerhetshetten i ca. 15 minutter.
- Aspirer PFA-løsningen og skyll med 1x PBS tilsatt kalsium- og magnesiumioner to ganger.
- Tilsett 1,5 ml 1x PBS supplert med kalsium- og magnesiumioner i hver brønn.
- Bruk steril pinsett til å ta forsiktig tak i dekslene ut av hver brønn. Inverter og plasser den celleholdige siden av dekslene på bildeavstandsstykkene for å kontakte PBS forberedt i trinn 2.5.1. Forsikre deg om at den ikke-celleholdige siden er utsatt for luft.
- Bruk gjennomsiktig neglelakk til å forsegle det ytre laget av dekselet med avstandsstykket.
- Oppbevar mikroskoplysbildene ved 4 °C når du ikke avbilder.
3. Spontan Raman-spektroskopimåling (figur 2)
- Bruk et konfokal Raman-mikroskop for å oppnå spontane Raman-spektra (figur 2A).
- Slå på laseren ved å vri nøkkelen til PÅ-posisjon .
- Dobbeltklikk på LabSpec6-programvareikonet for å åpne anskaffelsesprogramvaren.
- Legg den biologiske prøven på prøveholderen rett under objektivlinsen.
- I programvaren klikker du på Kamera ikonet for å slå på videokameraet.
- Juster fokusplanet for å identifisere et interesseområde med 50x objektivlinsen. Beveg joysticken for å kontrollere høveloversettelsen av XY-trinnet, og roter joysticken for å endre fokusdybden.
- Etter å ha valgt posisjon for måling, bytt til 100x objektivlinsen med 40 mW eksitasjonseffekt. Klikk på det røde Stopp-ikonet for å slå av videokameraet.
- Velg et gitter på 1800 linjer/mm, og sett oppsamlingsområdet fra 400 cm-1 til 3 150 cm-1.
- Sett innsamlingstiden til 90 s, akkumuleringen til 3 og binning til 4 for minst støy og mest nøyaktig spektrum.
MERK: Disse bildeparameterne kan optimaliseres for å passe til eksperimentet. - Klikk på pilikonet for å slå på sanntidsvisningen.
- Still inn Raman-skiftet (cm-1) til en valgfri verdi for å finjustere fokusplanet.
MERK: I dette eksperimentet ble Raman-laseren fokusert på lipiddråpene, som inneholdt en høy konsentrasjon avCH2-bindinger . Derfor ble et Raman-skift på 2,850 cm-1 som matchet strekkmodusene tilCH2-bindingen valgt for formålet. - Juster fokusplanet med joysticken for å optimalisere det beste signal-støy-forholdet.
- Når du har valgt fokusplan, klikker du på det røde Stopp-ikonet for visning i sanntid.
- Velg sirkelikonet for å starte spektrumregistreringen.
- Når mobilregionen er tatt, bruk det samme fokusplanet for å måle bakgrunnen med PBS. Trekk bakgrunnsspekteret fra hvert subcellulære målspekter ved hjelp av et separat dataprogram, for eksempel Origin (figur 1B).
4. Bildeeksperimenter med 2PEF og SRS
MERK: Detaljerte beskrivelser av SRS-laserjustering finnes i en tidligere rapport28. Denne protokollen fokuserer på driften av et multimodalt SRS- og 2PEF-bildesystem (figur 2C, D).
- Klikk på Start for å varme opp laseren.
- Følg rekkefølgen for å stille hovedbryterne til kontrollenheten og skjermen på: 1) trykk hovedbryteren til kontrollboksen IX3-CBH til På, 2) trykk hovedbryteren på berøringspanelkontrolleren til På, 3) trykk på hovedbryteren til strømadapteren til strømforsyningen for LD OBIS 6 laserfjernkontroll koblet til hovedlaserkombinatoren FV31-SCOMB til På, og 4) trykk på hovedbryteren på strømadapteren til strømforsyningen for LD OBIS 6 laserfjernkontroll koblet til sublaserkombinatoren FV31-SCOMB til På.
- Trykk på hovedbryterne til Si-fotodiodedetektoren og innlåsingsforsterkeren På.
- Sett Stokes-strålen på 1,031 nm, pulsbredde på 6 ps og repetisjonshastighet på 80 MHz.
- Koblet til mikroskopet, sett picoEmerald-systemet som følger med den synkroniserte pumpestrålen med en justerbar bølgelengde fra 720-990 nm, en pulsbredde på 5-6 ps og en repetisjonsfrekvens på 80 MHz. Den gjennomsnittlige eksitasjonseffekten til både pumpen og Stokes er 450 mW. Optimaliser eksitasjonskraften for å minimere fotoskader for prøven.
- Bruk en oljekondensator med høy numerisk blenderåpning (NA) (dvs. 1,4 NA) for å samle Stokes og pumpebjelker der prøven er montert ved å avgi noen dråper på kondensatoren.
- Monter prøven på oljen og legg en stor vanndråpe på toppen av mikroskopglasset der prøven er festet. Dette er for vann-nedsenking objektivlinsen.
- Sett innlåsingsforsterkeren til 20 MHz. Behandle bildet nå ved hjelp av programvaremodulen med superoppløsning.
- Velg 512 piksler x 512 piksler og 80 μs/piksel for oppholdstiden.
- Når ønsket mobilregion er fokusert riktig, skaff deg bildet. Bruk mikroskopets anskaffelsesprogramvare til å lagre bildene som en Olympus .oir-grafikkfil.
- Skaff deg et bakgrunnsbilde på 1,900 cm-1 og trekk det fra alle mobilbilder.
- For å utføre 2PEF-avbildning, bruk den samme justerbare picosekundlaseren, og sett den etikettfrie autofluorescensen til Flavin og NADH til henholdsvis 800 nm og 780 nm.
- Bruk en 460 nm / 515 nm filterkube for å samle Flavin og NADH autofluorescens tilbakespredt utslipp.
- Juster oppholdstiden til 8 μs/piksel og pikselstørrelsen til 512 piksler x 512 piksler. Sett laserlukkereffektparameteren til 150 mW.
- For rekonstruksjon av 3D-bilder, juster det stimulerte Raman-tapet til 2,850 cm-1 (797 nm).
- Når de ønskede enkeltcellene er identifisert, registrerer du laseren for å skanne fra toppfokusplanet for å oppdage topp- og bunnlagene i disse cellene.
MERK: 3D-modeller genereres og lagres som OIR-filer.
5. Spektra og bildeanalyse
- Spektra analyse
- Bruk Origin-programvaren eller andre relevante applikasjoner for å trekke bakgrunnsspekteret fra alle subcellulære målspektra.
- Bruk MATLABs matematiske modelleringsoperasjoner til å behandle Raman-spektrene med programvarens innebygde funksjoner. Python kan også brukes til spektrabehandling.
- Spektral forbehandling begynner med å konvertere filene til en matrise. Spektrene interpoleres ved hver gjensidig centimeter.
- For validering, graf rådataene. Utfør baselinekorreksjonen på råspektrene ved hjelp av den innebygde funksjonen msbackadj i MATLAB. Kort fortalt estimerer den innebygde funksjonen grunnlinjepunkter ved separasjonsenhetsverdier identifisert av brukere, og returnerer avstanden mellom tilstøtende vinduer. Fra utgangspunktene estimerer og tegner du en regresjonslinje. Bruk Utjevning til å jevne ut regresjonslinjen for å trekke grunnlinjen fra hvert enkelt råspektrum.
- Utfør min-max normalisering ved å dele Raman-intensiteten til proteinet ved 2,930 cm-1 med intensiteten til hvert Raman-skift . 2,930 cm-1-signalet er vanligvis den høyeste intensiteten på Raman-spekteret. Med denne normaliseringen blir maksimumsverdien transformert til en 1 mens minimumsverdien blir transformert til en 0. Hver annen verdi blir transformert til et desimal mellom 0 og 1.
- Gjennomsnittlig de enkelte spektrene av samme tilstand i et enkelt spekter for å redusere støy.
- Når de er behandlet, bruk applikasjoner, for eksempel Origin, for å vise alle spektrene samtidig. Toppene som vises i spektrene representerer en bestemt kjemisk binding eller funksjonell gruppe.
- 3D-bildeanalyse av lipiddråper
- Bruk FIJI-ImageJ-programvaren til å behandle alle 3D-bilder
- Utfør funksjonene Båndpassfiltre og Utjevning for 3D-bildestakkene.
- For 3D-bildeanalyse, tilordne hver lipiddråpe til en sfærisk poengsum beregnet ved å måle avstanden mellom massesenteret til overflaten. Sammenlign hver sfæriske poengsum med en sfærisk poengsum av en perfekt sfære på samme euklidske plan. Kast lipiddråper med lave sfæriske score og evaluer de resterende lipiddråpene for volum og telling.
- Analysere volum og antall lipiddråper mellom ulike behandlinger for statistisk signifikans på en passende statistisk programvare. Her ble GraphPad Prism brukt.
- 2D hyperspektral bildeanalyse
- Bruk FIJI-ImageJ-programvaren til å behandle alle 2D hyperspektrale bilder.
- Velg kanalen på 2 930 cm-1 for å lage et maskebilde som inneholder 0- og 1-verdier. Tilordne bakgrunnen til 0 og mobilområdet til 1.
- Trekk den deuteriummerkede proteinkanalen (2,175 cm-1) til bakgrunnskanalen (1,900 cm-1) for å fjerne fluorescerende effekter.
- Del den resulterende deuteriummerkede proteinkanalen med proteinkanalen (2,930 cm-1) for å oppnå proteinomsetningshastighetsforholdsmetriske bilder.
- Deretter multipliserer du maskebildet som ble laget i trinn 5.3.2 med de ratiometriske bildene for å fjerne gjenværende bakgrunnsstøy. Som et resultat genereres en mørk bakgrunn i hvert forholdsmetrisk bilde.
- Bruk frihåndsmarkeringsverktøyet i FIJI-ImageJ til å segmentere og beregne bildepunktintensiteter som vises på enkeltceller manuelt. Pikselintensitetene tilsvarer konsentrasjonene av den kjemiske bindingen som visualiseres.
- Analyser pikselintensitetene for statistisk signifikans på et passende statistisk program. Her ble GraphPad Prism brukt. Gjenta denne analysen med den gjenværende ratiometriske analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tilsetningen av overskytende AAA ved 15x konsentrasjoner til 50% D2O-holdige cellekulturmedier produserte distinkte C-D Raman-bånd av nylig syntetiserte lipider og proteiner i HeLa-celler (figur 2B). Tidligere eksperimenter ble utført med forskjellige konsentrasjonsnivåer, for eksempel 2x og 5x, og selv om dataene ikke presenteres, produserte 15x-konsentrasjonen de mest distinkte C-D Raman-båndene av nylig syntetiserte lipider og proteiner. Spesielt, ved å undersøke lipiddråper (LDs), la vi merke til at både 15x Phe og 15x Tryp induserte nylig syntetiserte lipider og proteinsignaler ved henholdsvis 2,143 cm-1 og 2,172 cm-1. DO-SRS ble senere brukt til å visualisere den romlige fordelingen av C-D-signaler på enkeltceller (figur 3). Ved hjelp av ImageJ ble bildepunktintensiteten til individuelle celler manuelt segmentert og beregnet, som indikert av stiplede hvite kantlinjer i figur 3A. Kontrollcellene viser moderate C-D lipid- og proteinbånd; Imidlertid viser 15x Phe og 15x Tryp sterkere C-D lipid- og proteinbånd. Kvantitativ analyse indikerer at overskytende AAA kan oppregulere lipidsyntesen med 10% -17%, men nedregulere proteinsyntesen med 10% (figur 3C, D). Resultatene antyder muligheten for mangel på autofagi som akkumulerer nylig syntetiserte lipider, fremmer mitokondriell dysfunksjon og induserer oksidativ ubalanse under overflødig AAA-regulering7.
Etikettfri multimodal SRS og 2PEF-avbildning av umettet lipid (~ 3,011 cm-1), mettet lipid (~ 2,880 cm-1) og NADH, Flavin ble anskaffet for å forstå effekten av AAA på kreftmetabolisme. På samme måte ble bildepunktintensitetene til individuelle celler manuelt segmentert og beregnet ved hjelp av ImageJ, som indikert av stiplede hvite kantlinjer i figur 3B. Ratiometrisk analyse av AAA-behandlede celler viser en 10% økning i umettet lipid / mettet lipid og en 50% økning i Flavin / Flavin + NADH (figur 3E, F). I elektrontransportkjeden til mitokondrier kan ROS genereres fra overføring av elektroner fra NADH og FADH2 til molekylære oksygenarter. Akkumuleringen av ROS i mange kreftceller resulterer i en oksidativ ubalanse som oksiderer umettede fettsyrer, fremmer mettet fettsyresyntese og tømmer NADH-autofluorescenssignaler. Derfor er den observerte økningen i Flavin / Flavin + NADH en indikator på akkumulert ROS som reduserer NADH autofluorescenssignaler. Som svar på oksidativ ubalanse kan HeLa-celler oppregulere deres umettede lipidsyntese for å erstatte de oksiderte. Denne responsen er ikke observert i andre kreftcellelinjer29, noe som betyr metabolsk heterogenitet av kreftceller under en overflødig AAA-diett30.
I tillegg til multimodal avbildning kan SRS rekonstruere etikettfrie 3D-bilder av LD-er i kontroll og AAA-behandlede HeLa-celler. Kort fortalt genererer mikroskopi et sett med tverrsnittsbilder gjennom et valgt område av interesse. I denne studien ble det stimulerte Raman-tapet (SRL) innstilt til 2,845 cm-1 og skannet fra topplaget til bunnlaget med en trinnstørrelse på 1 μm (figur 4A). Kvantitative analyser av 3D-lipiddråper viser at LDs reduserte i størrelse, men økte i antall i AAA-behandlede celler sammenlignet med kontrollen (figur 4B, C). Den økte tilstedeværelsen av voluminøse hydrofobe aminosyrer, som Tryp og Phe, kan svekke funksjonen til LD-beleggproteiner. Dette reduserer til slutt lipolyse, som akkumulerer mange små LDs. De etikettfrie 3D SRS volumetriske bilderesultatene av denne studien bekrefter tidligere studier ved å visualisere at overskytende AAA-behandlede celler viser mange mindre LDs31,32.
Figur 1: Illustrasjon av bildeopptak og analyse med DO-SRS og 2PEF. (A) En 3D-bilderekonstruksjon og analyse for å oppnå lipiddråpenummer, volum og sfærisk score. (B) Hyperspektral avbildning og analyse av deuteriummerket lipid (CDL; 2,145 cm-1), lipid (2,845 cm-1), deuteriummerket protein (CDP; 2,175 cm-1), protein (2,940 cm-1), umettet lipid (3,011cm-1), mettet lipid (2,880 cm-1), NADH og Flavin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Fysisk oppsett av spontan Raman-spektroskopi og stimulert Raman-spredningsmikroskopi. (A) Spontant Raman-spektroskopioppsett brukt i denne studien. (B) Eksempel på spontane Raman-spektra for CD-etikett (rød), uten CD-etikett (svart), kontrollgruppe (blå, heltrukket linje), 15x phe-behandlet gruppe (rød, stiplet linje) og 15x prøvebehandlet gruppe (rosa, stiplet linje). (C) Skjematisk diagram over det stimulerte Raman-spredningsmikroskopioppsettet som ble brukt til denne undersøkelsen. (D) Stimulert Raman-spredningsmikroskopioppsett brukt som DO-SRS- og 2PEF-plattform. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Visualisering av metabolsk dynamikk i HeLa-celler ved bruk av DO-SRS og 2PEF-mikroskopi. (A) Deuterium-merket lipid (2,145 cm-1), lipid (2,845 cm-1), deuterium-merket protein (2,175 cm-1), protein (2,940 cm-1) visualisert i HeLa-celler under kontroll (Ctrl), 15x fenylalanin (15x Phe) og 15x tryptofan (15x Tryp) med DO-SRS-plattformen. Lipidomsetningshastighet og proteinomsetningshastighet ble beregnet som 
og 
. Raw-bilder ble først trukket fra PBS-signalet for å fjerne bakgrunnsintensitet og maskert for å fjerne intensitet utenfor cellene ved hjelp av ImageJ. Pikselvis inndeling ble utført for den ratiometriske analysen. (B) NADH- og Flavin-kanaler visualisert med 2PEF-mikroskopi, og umettet lipid (3,011 cm-1) og mettet lipid (2,880 cm-1) visualisert med etikettfri SRS-mikroskopi. Optisk redoksratio og metningsratio ble beregnet med 
og 
. (VG Nett) Kvantifisering av ratiometriske intensiteter for hver HeLa-celle under kontroll, 15x Phe, og 15x Tryp betingelser. Den statistiske forskjellen ble brukt til å sammenligne overskytende AAA-forhold med kontrollbetingelsene. p < 0,0001, ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05 ble beregnet ut fra en toveis ANOVA-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Visualisering av 3D-lipiddråpefordeling av en enkelt HeLa-celle ved bruk av et etikettfritt SRS-mikroskop . (A) SRS 3D lipiddråpevolumprojeksjon i HeLa-celler under kontroll og overskytende AAA-forhold. Terskelen ble definert før analysen, og avslørte lipiddråpesignalfordeling. (B,C) Kvantifisering av lipiddråpevolum og tellinger i individuelle HeLa-celler under kontrollgruppe og overskytende AAA-forhold ved bruk av toveis ANOVA-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DO-SRS og 2PEF-avbildning har blitt brukt til å undersøke metabolsk dynamikk i ulike ex vivo-modeller, inkludert Drosophila og humant vev 21,22,23,24,26,27,33. Avbildningsmodaliteten som brukes i denne studien integrerer DO-SRS og 2PEF-mikroskopi, som kan overgå andre molekylspesifikke bildebehandlingsmetoder ved å eliminere behovet for molekylekstraksjon eller merking med cytotoksiske reagenser og krever minimal prøvepreparering. Spesielt gjør DO-SRS-mikroskopi oss i stand til å undersøke de novo lipogenese og proteinsyntese i dyr og celler og visualisere deres metabolske dynamikk in situ23,27,34. 2PEF fanger autofluorescenssignalene til naturlig forekommende biomolekyler, som Flavin og NADH, i biologiske prøver35,36. Avbildningspenetrasjonsdybden til SRS kan oppnå opptil 200-500 μm i mindre spredningsprøver37. Med vevsryddingsmetoder som urea kan penetrasjonsdybden øke mer enn ti ganger37. Koblingen av SRS med 2PEF gjør det mulig å avbilde endogene fluoroforer som Flavin og NADH i biologiske prøver, noe som ytterligere eliminerer behovet for eksogene biomarkører for deteksjon. 2PEF kan oppnå en inntrengningsdybde på 500 μm38. Sammenlignet med andre multiplekse avbildningsmodaliteter, som flerfarget enkeltfoton konfokalfluorescensmikroskopi, kan både DO-SRS og 2PEF oppnå en betydelig større penetrasjonsdybde uten cytotoksiske eksogene biomarkører.
For å øke den romlige oppløsningen til DO-SRS og 2PEF, utviklet vi et adaptivt momentestimering (Adam)-basert pointillisme dekonvolusjon (A-PoD) bildepostbehandlingsverktøy34. A-PoD kan konvertere diffraksjonsbegrensede DO-SRS- og 2PEF-bilder til superoppløste bilder uten behov for maskinvareforbedringer. I tillegg inneholder Raman-spekteret mange spesifikke kjemiske vibrasjonsmoduser som kan utnyttes for å øke antall detekterbare molekyler. Ved å ta denne fordelen har laboratoriet vårt videre generert en straffet referansematchingsmetode (PRF) for å skille flere lipidarter i celle- og vevsmodeller36. Disse to tekniske utviklingene åpner nye veier for å studere biologiske prosesser mer detaljert på cellulære og subcellulære nivåer, som har blitt brukt til å karakterisere metabolske endringer i hjerne-, kreft- og aldringsprosesser26,27,35.
En hovedbegrensning i denne protokollen er konsentrasjonen og tidsinkubasjonen av cellulære prøver med D2O for å produsere distinkte, kvantifiserbare C-D Raman-bånd. Mer robuste, metabolsk aktive cellelinjer, som HeLa-celler, kan inkorporere deuteriumatomer i nylig syntetiserte makromolekyler raskere enn ikke-syke pattedyrcellelinjer, slik som humane embryonale nyreceller (HEK), noe som fører til forskjellige C-D-intensiteter observert for samme konsentrasjon og tidsinkubasjon med D2O i to forskjellige cellelinjer21. Videre kan administrering av D2O i en konsentrasjon på 80% eller høyere i 48 timer introdusere toksisitet for cellulære prøver. Et optimaliseringseksperiment for å identifisere den optimale D2O-konsentrasjonen og tidsinkubasjonen er nødvendig for å oppnå ønskelige resultater.
Et kritisk aspekt ved protokollen er integrasjonen av DO-SRS og 2PEF bildebehandling. Vanligvis deler DO-SRS- og 2PEF-modaliteter den samme picosekund-eksitasjonslaseren, da den smale båndbredden kan optimaliseres med SRS- og 2PEF-signaler. Selv om teknologien vår er hjemmelaget, er denne plattformen kommersielt tilgjengelig39. Tilleggsutstyr, for eksempel to synkroniserte laserpulser med en modulator, fotodiodedetektor, en innlåsingsforsterker og et skanningsmikroskops felles innsats er nødvendig for å oppdage Raman-signalet. D2O kan lett kjøpes fra bioteknologileverandører. Derfor kan forskere få tilgang til denne teknologien veldig enkelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Yajuan Li og Anthony Fung for deres tekniske støtte, og Fraley-laboratoriet for cellelinjen. Vi anerkjenner oppstartsmidlene fra UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 og Hellman Fellow Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer - Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
| Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
| Silicon Wafer | |||
| Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
| Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
| Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Tweezers | Kaverme - Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
| Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
References
- Wu, G. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 45 (3), 407-411 (2013).
- Wei, Z., Liu, X., Cheng, C., Yu, W., Yi, P.
- Parthasarathy, A., et al. A three-ring circus: Metabolism of the three proteogenic aromatic amino acids and their role in the health of plants and animals. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 29 (2018).
- Wang, H., et al. l-tryptophan activates mammalian target of rapamycin and enhances expression of tight junction proteins in intestinal porcine epithelial cells. The Journal of Nutrition. 145 (6), 1156-1162 (2015).
- Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
- Mossmann, D., Park, S., Hall, M. N. mTOR signalling and cellular metabolism are mutual determinants in cancer. Nature Reviews. Cancer. 18 (12), 744-757 (2018).
- Kimura, T., Watanabe, Y. Tryptophan protects hepatocytes against reactive oxygen species-dependent cell death via multiple pathways including Nrf2-dependent gene induction. Amino Acids. 48 (5), 1263-1274 (2016).
- Ma, Q., et al. Dietary supplementation with aromatic amino acids decreased triglycerides and alleviated hepatic steatosis by stimulating bile acid synthesis in mice. Food and Function. 12 (1), 267-277 (2021).
- Cheng, C., et al. Treatment implications of natural compounds targeting lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease, obesity and cancer. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1654-1663 (2019).
- Lubes, G., Goodarzi, M. GC-MS based metabolomics used for the identification of cancer volatile organic compounds as biomarkers. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 313-322 (2018).
- Di Gialleonardo, V., Wilson, D. M., Keshari, K. R.
- Bowman, A. P., et al. Evaluation of lipid coverage and high spatial resolution MALDI-imaging capabilities of oversampling combined with laser post-ionisation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2277-2289 (2020).
- Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M. Imaging of lipid species by MALDI mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 50, 317-322 (2009).
- Pirman, D. A., et al. Changes in cancer cell metabolism revealed by direct sample analysis with MALDI mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), e61379 (2013).
- Li, Z., et al. Single-cell lipidomics with high structural specificity by mass spectrometry. Nature Communications. 12 (1), 2869 (2021).
- Miyagi, M., Kasumov, T. Monitoring the synthesis of biomolecules using mass spectrometry. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 374 (2079), 20150378 (2016).
- Wang, T., Shogomori, H., Hara, M., Yamada, T., Kobayashi, T. Nanomechanical recognition of sphingomyelin-rich membrane domains by atomic force microscopy. Biochemistry. 51 (1), 74-82 (2012).
- Fung, A. A., Shi, L. Mammalian cell and tissue imaging using Raman and coherent Raman microscopy. Wiley Interdisciplinary Reviews. Systems Biology and Medicine. 12 (6), e1501 (2020).
- Shi, L., Fung, A. A., Zhou, A. Advances in stimulated Raman scattering imaging for tissues and animals. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 11 (3), 1078-1101 (2021).
- Yamakoshi, H., et al. Imaging of EdU, an alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman microscopy. Journal of the American Chemical Society. 133 (16), 6102-6105 (2011).
- Shi, L., et al. Optical imaging of metabolic dynamics in animals. Nature Communications. 9 (1), 2995 (2018).
- Bagheri, P., Hoang, K., Fung, A. A., Hussain, S., Shi, L. Visualizing cancer cell metabolic dynamics regulated with aromatic amino acids using DO-SRS and 2PEF microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 779702 (2021).
- Li, Y., et al. Direct imaging of lipid metabolic changes in drosophila ovary during aging using DO-SRS microscopy. Frontiers in Aging. 2, 819903 (2022).
- Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of metabolic dynamics in aging Drosophila. Analyst. 146 (24), 7510-7519 (2021).
- Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
- Fung, A. A., et al. Imaging sub-cellular methionine and insulin interplay in triple negative breast cancer lipid droplet metabolism. Frontiers in Oncology. 12, 858017 (2022).
- Li, Y., Zhang, W., Fung, A. A., Shi, L. DO-SRS imaging of diet regulated metabolic activities in Drosophila during aging processes. Aging Cell. 21 (4), e13586 (2022).
- Shi, L., Wei, M., Min, W. Highly-multiplexed tissue imaging with raman dyes. Journal of Visualized Experiments. (182), e63547 (2022).
- Rysman, E., et al. De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation. Cancer Research. 70 (20), 8117-8126 (2010).
- Lisec, J., Jaeger, C., Rashid, R., Munir, R., Zaidi, N. Cancer cell lipid class homeostasis is altered under nutrient-deprivation but stable under hypoxia. BMC Cancer. 19 (1), 501 (2019).
- Thiam, A. R., Dugail, I. Lipid droplet-membrane contact sites - from protein binding to function. Journal of Cell Science. 132 (12), (2019).
- Schott, M. B., et al. Lipid droplet size directs lipolysis and lipophagy catabolism in hepatocytes. The Journal of Cell Biology. 218 (10), 3320-3335 (2019).
- Hoang, K., et al. Subcellular resolution DO-SRS and 2PEF imaging of metabolic dynamics regulated by L-methionine in amyotrophic lateral sclerosis. Optical Biopsy XXI: Toward Real-Time Spectroscopic Imaging and Diagnosis. SPIE. 1237303, 6-13 (2023).
- Jang, H., et al. Super-resolution stimulated Raman scattering microscopy with A-PoD. bioRxiv. , (2022).
- Li, Y., et al. Optical metabolic imaging uncovers sex- and diet-dependent lipid changes in aging drosophila brain. bioRxiv. , (2022).
- Zhang, W., et al.
- Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).
- Chang, T., et al. Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy. Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).
- Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope - Label Free Imaging. Leica Microsystems. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/ (2023).
