Summary
Apresentamos um protocolo para visualizar diretamente as atividades metabólicas em células reguladas por aminoácidos usando microscopia Raman estimulada de espalhamento Raman estimulado com óxido de deutério (água pesada D2O) (DO-SRS), que é integrada à microscopia de fluorescência por excitação de dois fótons (2PEF).
Abstract
Aminoácidos aromáticos essenciais (AAAs) são blocos de construção para sintetizar novas biomassas em células e sustentar funções biológicas normais. Por exemplo, um suprimento abundante de AAAs é importante para que as células cancerosas mantenham seu rápido crescimento e divisão. Com isso, há uma demanda crescente por uma abordagem de imagem altamente específica, não invasiva, com preparação mínima da amostra para visualizar diretamente como as células aproveitam os AAAs para seu metabolismo in situ. Aqui, desenvolvemos uma plataforma de imagem óptica que combina sondagem de óxido de deutério (D2O) com espalhamento Raman estimulado (DO-SRS) e integra DO-SRS com fluorescência de excitação de dois fótons (2PEF) em um único microscópio para visualizar diretamente as atividades metabólicas das células HeLa sob regulação AAA. Coletivamente, a plataforma DO-SRS fornece alta resolução espacial e especificidade de proteínas e lipídios recém-sintetizados em unidades únicas de células HeLa. Além disso, a modalidade 2PEF pode detectar sinais de autofluorescência de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) e Flavina de forma livre de marcação. O sistema de imagem aqui descrito é compatível com modelos in vitro e in vivo , o que é flexível para vários experimentos. O fluxo de trabalho geral deste protocolo inclui cultura celular, preparação de meios de cultura, sincronização celular, fixação celular e imagem de amostra com as modalidades DO-SRS e 2PEF.
Introduction
Sendo aminoácidos aromáticos essenciais (AAAs), fenilalanina (Phe) e triptofano (Tryp) podem ser absorvidos pelo organismo humano para sintetizar novas moléculas para sustentar funções biológicas normais1. Phe é necessário para a síntese de proteínas, melanina e tirosina, enquanto Tryp é necessário para a síntese de melatonina, serotonina, e niacina 2,3. No entanto, o consumo excessivo desses AAAs pode regular o alvo mamífero da via da rapamicina (mTOR), inibir a proteína quinase ativada por AMP e interferir no metabolismo mitocondrial, alterando coletivamente a biossíntese de macromoléculas e levando à produção de precursores malignos, como espécies reativas de oxigênio (EROs) em células saudáveis 4,5,6. A visualização direta da dinâmica metabólica alterada sob regulação excessiva do AAA é essencial para entender o papel dos AAA na promoção do desenvolvimento do câncer e do crescimento de células saudáveis 7,8,9.
Os estudos tradicionais de AAA baseiam-se na cromatografia gasosa (GC)10. Outros métodos, como a ressonância magnética (RM), têm resoluções espaciais limitadas, dificultando a análise celular e subcelular de amostrasbiológicas11. Recentemente, a dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI) foi desenvolvida para elucidar o papel dos AAAs na síntese lipídica e proteica na proliferação do câncer com biomarcadores não invasivos12,13,14. No entanto, essa técnica ainda sofre com profundidades de imagem rasas, baixa resolução espacial e preparação extensa da amostra. Em nível celular, isótopos estáveis não tóxicos, como nitrogênio-15 e carbono-13, podem ser rastreados com imagens multiisótopos e espectrometria de massa de íons secundários em nanoescala para entender sua incorporação em macromoléculas. No entanto, esses métodos são destrutivos para amostras biológicas vivas15,16. A microscopia de força atômica (MFA) é outra técnica poderosa que pode visualizar a dinâmicametabólica17. A lentidão da varredura durante a aquisição de AFM, por outro lado, pode causar distorção da imagem do resultado da deriva térmica.
Desenvolvemos uma modalidade de imagem biortogonal não invasiva acoplando microscopia de espalhamento Raman estimulado sondado com óxido de deutério (D2O) e microscopia de fluorescência de excitação de dois fótons label-free (2PEF). Esta modalidade alcança alta resolução espacial e especificidade química na obtenção de imagens de amostras biológicas 18,19,20,21,22,23,24. Este protocolo introduz as aplicações de DO-SRS e 2PEF para examinar a dinâmica metabólica de lipídios, proteínas e alterações da razão redox durante a progressão do câncer. Sendo a D2O uma forma isotópica estável da água, as biomoléculas celulares podem ser marcadas com deutério (D) devido à sua rápida compensação com a água corporal total nas células, formando ligações carbono-deutério (C-D) através da troca enzimática21. As ligações C-D em macromoléculas recém-sintetizadas, incluindo lipídios, proteínas, DNA/RNA e carboidratos, podem ser detectadas na região silenciosa celular do espectro Raman 20,21,22,25,26,27. Com dois pulsos de laser sincronizados, ligações C-D de lipídios e proteínas recém-sintetizados podem ser exibidas em células individuais via imagem hiperespectral (HSI) sem extraí-las ou marcá-las com agentes citotóxicos. Além disso, a microscopia SRS tem a capacidade de construir modelos tridimensionais (3D) de regiões selecionadas de interesse em amostras biológicas, capturando e combinando um conjunto de imagens transversais22,26. Com imagens volumétricas hiperespectrais e 3D, DO-SRS pode obter distribuições espaciais de macromoléculas recém-sintetizadas em células únicas, juntamente com o tipo de organelas que facilitam o processo de promoção do crescimento do câncer sob regulação doAAA22. Além disso, usando 2PEF, podemos obter sinais de autofluorescência de Flavina e nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) com alta resolução, profundidade de penetração profunda e danos de baixo nível em amostras biológicas21,23,24. Sinais de autofluorescência de flavina e NADH têm sido utilizados para caracterizar a homeostase redox e a peroxidação lipídica em célulascancerosas22,26. Como tal, não só o acoplamento de DO-SRS e 2PEF fornece análise subcelular da dinâmica metabólica regulada por AAA em células cancerosas com alta distribuição espacial, informações de especificidade química e preparação mínima de amostras, mas o método também reduz a necessidade de extrair ou rotular moléculas endógenas com reagentes tóxicos. Neste protocolo, apresentamos primeiramente os procedimentos de preparação de D2O e aminoácidos, bem como cultura de células cancerígenas. Em seguida, mostramos os protocolos de imagem DO-SRS e imagem por 2PEF. Finalmente, apresentamos os resultados representativos da imagem SRS e 2PEF, que demonstram alterações metabólicas de lipídios e proteínas reguladas por AAA e alterações na razão redox em células cancerosas. Uma ilustração detalhada do processo é destacada na Figura 1.
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Protocol
1. Preparação da mídia
- Preparar 10 mL de AAAs controle e excesso em meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco contendo 50% D2O.
- Para o meio controle, medir e misturar 10 mg de pó de DMEM com 4,7 mL de água bidestilada (ddH2O) em um tubo cônico de 15 mL. O pó de DMEM contém todos os aminoácidos em concentrações padrão. Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada. Adicionar 4,7 mL de D2O, 0,5 mL de soro fetal bovino (SFB a 5%) e 0,1 mL de penicilina/estreptomicina (1%). Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada.
- Para o meio de tratamento 15x Phe, medir e misturar 10 mg de DMEM em pó com 4,7 mL de ddH2O, 0,5 mL de FBS (5%) e 0,1 mL de penicilina/estreptomicina (1%) em um tubo cônico de 15 mL. Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada. Adicionar o excesso de pó de Phe na concentração de 924 mg/L ao meio. Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada.
- Para o meio de tratamento Tryp 15x, medir e misturar 10 mg de pó de DMEM com 4,7 mL de ddH2O, 0,5 mL de FBS (5%) e 0,1 mL de penicilina/estreptomicina (1%) em um tubo cônico de 15 mL. Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada. Adicione o excesso de Tryp pó a uma concentração de 224 mg/L ao meio. Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada.
- Adicionar metionina e treonina a 30,0 mg/mL e 95,0 mg/mL, respectivamente, a todos os tubos cônicos das etapas anteriores. Vórtice completamente e inverta o tubo. Não é necessário adicionar piruvato de sódio aos meios de cultura.
- Filtrar o meio de controle e tratamento com um filtro de seringa de 25 mm com filtros de membrana de polietersulfona de 0,22 μm.
- Selar todos os tubos cônicos contendo mídia com parafilme e armazenar a 4 °C por até 3 semanas. Antes de tratar as células com meio, aqueça todos os meios a 37°C.
NOTA: Os reagentes em pó e líquidos devem ser medidos e combinados com base no volume total dos meios de tratamento e controle.
2. Preparação da amostra celular
- Manter células de câncer cervical (HeLa) em um frasco de cultura (ou seja, T10, T25, etc.) usando DMEM padrão suplementado com FBS a 10% e penicilina/estreptomicina a 1% a 37 °C e dióxido de carbono (CO2) a 5%.
- Sub-cultivar as células HeLa na proporção de 1:10 até atingir 80% ou mais de viabilidade celular.
- Uma vez que as células atinjam 80% ou mais de confluência, proceda à semeadura de 2 x 105 células por poço em uma placa de 24 poços usando DMEM suplementado com SFB a 0,5% e penicilina/estreptomicina a 1%.
- Antes da semeadura celular, prepare uma placa de 24 poços com laminina, esterilizada, poli-d-lisina, laminina, laminina, lamínica, com 12 mm de diâmetro. Submergir as lamínulas em etanol 70% e secar suavemente usando lenços sem fiapos. Coloque as tampas limpas nos poços apropriados da placa.
- Quando as células atingirem 80% de confluência na etapa 2.2, lavá-las uma vez com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem íons magnésio e cálcio.
- Adicionar tripsina a 0,25% para dissociar as células aderentes do frasco e incubar a 37 °C e 5% CO2 por 3 min.
- Adicionar DMEM suplementado com FBS a 10% e penicilina/estreptomicina a 1%, pipetar suavemente para cima e para baixo e coletar as células por centrifugação a 300 x g à temperatura ambiente (TR) por 3 min.
- Ressuspender as células em DMEM suplementado com SFB a 0,5% e penicilina/estreptomicina a 1%.
- Conte as células usando um hemocitômetro, microscópio de luz e azul de tripano e semeie uma densidade de 2 x 105 células por poço de uma placa de 24 poços. Como alternativa, um contador de células automatizado pode ser usado para contar as células.
- Devolver as células à incubadora a 37 °C e 5% de CO2 e agitar suavemente a placa para distribuir as células uniformemente.
- Após 8 h, substituir o meio de cultura antigo por meios de Tryp 50% D 2 O/excesso de Phe ou50% D2O/excesso de Tryp. Retornar as células à incubadora a 37 °C e 5% CO2 por 36 h.
- Após 36 h, fixar as células em lâminas de microscópio.
- Antes da fixação, prepare as lâminas do microscópio com espaçadores de imagem de 9 mm de diâmetro e coloque 15 μL de PBS 1x suplementado com íons cálcio e magnésio.
- Enxaguar as células com 1x PBS suplementado com íons cálcio e magnésio.
- Adicionar 0,5 mL de solução de paraformaldeído (PFA) sem metanol a 4% e deixar a placa sob a capa de biossegurança por aproximadamente 15 min.
- Aspirar a solução de PFA e enxaguar com 1x PBS suplementado com íons cálcio e magnésio duas vezes.
- Adicionar 1,5 mL de 1x PBS suplementado com íons cálcio e magnésio em cada poço.
- Use pinças estéreis para agarrar suavemente as tampas de cada poço. Inverter e colocar o lado que contém células das tampas nos espaçadores de imagem para entrar em contato com o PBS preparado na etapa 2.5.1. Certifique-se de que o lado que não contém células está exposto ao ar.
- Usando esmalte transparente, sele a camada externa da lamínula com o espaçador de imagem.
- Conservar as lâminas do microscópio a 4 °C quando não estiver a efectuar imagens por imagem.
3. Medida por espectroscopia Raman espontânea (Figura 2)
- Utilizar microscópio Raman confocal para obtenção de espectros Raman espontâneos (Figura 2A).
- Ligue o laser girando a chave para a posição ON .
- Clique duas vezes no ícone do software LabSpec6 para abrir o software de aquisição.
- Coloque a amostra biológica no porta-amostras diretamente abaixo da lente objetiva.
- No software, clique no ícone Câmera para ligar a câmera de vídeo.
- Ajuste o plano de foco para identificar uma região de interesse com a lente objetiva de 50x. Mova o joystick para controlar a conversão da plaina do estágio XY e gire o joystick para alterar a profundidade de foco.
- Depois de escolher a posição para medição, mude para a lente objetiva de 100x com 40 mW de potência de excitação. Clique no ícone vermelho Parar para desligar a câmera de vídeo.
- Selecione uma grade de 1800 linhas/mm e defina a faixa de aquisição de 400 cm-1 a 3.150 cm-1.
- Defina o Tempo de Aquisição para 90 s, o Acúmulo para 3 e o Binning para 4 para o menor ruído e espectro mais preciso.
NOTA: Esses parâmetros de imagem podem ser otimizados para se ajustar ao experimento. - Clique no ícone de seta para ativar a exibição em tempo real.
- Ajuste o deslocamento Raman (cm-1) para um valor de escolha para ajustar o plano de foco.
OBS: Neste experimento, o laser Raman foi focalizado nas gotículas lipídicas, que continham uma alta concentração de ligações CH2 . Portanto, um desvio Raman de 2.850 cm-1 que correspondesse aos modos de alongamento da ligação CH2 foi selecionado para o propósito. - Ajuste o plano de foco com o joystick para otimizar a melhor relação sinal-ruído.
- Depois de escolher o plano de foco, clique no ícone vermelho Parar para uma exibição em tempo real.
- Selecione o ícone Círculo para iniciar a aquisição de espectro.
- Uma vez que a região celular é tomada, use o mesmo plano de foco para medir o fundo com PBS. Subtraia o espectro de fundo de cada espectro alvo subcelular usando um aplicativo de software de computador separado, como o Origin (Figura 1B).
4. Experimentos de imagem com 2PEF e SRS
NOTA: Descrições detalhadas do alinhamento do laser SRS podem ser encontradas em um relatório anterior28. Este protocolo concentra-se na operação de um sistema multimodal de imagens SRS e 2PEF (Figura 2C, D).
- Clique em Iniciar para aquecer o laser.
- Siga a ordem para definir os interruptores principais da unidade de controle e o monitor ligado: 1) pressione o interruptor principal da caixa de controle IX3-CBH para On, 2) pressione o interruptor principal do controlador do painel de toque para On, 3) pressione o interruptor principal do adaptador AC da fonte de alimentação para LD OBIS 6 Laser Remote conectado ao combinador laser principal FV31-SCOMB para One 4) pressione o interruptor principal do adaptador AC da fonte de alimentação para LD OBIS 6 Laser Remote conectado ao combinador sublaser FV31-SCOMB para On.
- Pressione os interruptores principais do detector de fotodiodo Si e do amplificador de bloqueio On.
- Defina o feixe de Stokes em 1.031 nm, a largura de pulso em 6 ps e a taxa de repetição em 80 MHz.
- Acoplado ao microscópio, ajuste o sistema picoEmerald fornecido com o feixe de bomba sincronizado com um comprimento de onda ajustável de 720-990 nm, uma largura de pulso de 5-6 ps, e uma taxa de repetição de 80 MHz. O poder de excitação médio da bomba e do Stokes é de 450 mW. Otimize o poder de excitação para minimizar os fotodanos para a amostra.
- Use um condensador de óleo de alta abertura numérica (NA) (ou seja, 1,4 NA) para coletar os Stokes e feixes de bomba onde a amostra é montada emitindo algumas gotas no condensador.
- Monte a amostra sobre o óleo e coloque uma gota de água grande em cima da lâmina do microscópio onde a amostra é fixada. Isso é para a lente objetiva de imersão em água.
- Ajuste o amplificador de bloqueio para 20 MHz. Processe a imagem agora usando o módulo de software de super-resolução.
- Selecione 512 pixels x 512 pixels e 80 μs/pixel para o tempo de permanência.
- Uma vez que a região celular desejada esteja focada corretamente, adquira a imagem. Usando o software de aquisição do microscópio, salve as imagens como um arquivo gráfico .oir da Olympus.
- Adquira uma imagem de fundo a 1.900 cm-1 e subtraia-a de todas as imagens celulares.
- Para realizar imagens com PFE2, use o mesmo laser de picossegundo ajustável e ajuste a autofluorescência livre de Flavina e NADH para 800 nm e 780 nm, respectivamente.
- Use um cubo de filtro de 460 nm/515 nm para coletar a emissão retroespalhada de autofluorescência de Flavin e NADH.
- Ajuste o tempo de permanência para 8 μs/pixel e o tamanho do pixel para 512 pixels x 512 pixels. Defina o parâmetro de potência do obturador a laser para 150 mW.
- Para reconstrução de imagens 3D, ajuste a perda Raman estimulada para 2.850 cm-1 (797 nm).
- Uma vez que as células individuais desejadas tenham sido identificadas, registre o laser para escanear a partir do plano de foco superior para detectar as camadas superior e inferior dessas células.
Observação : modelos 3D são gerados e salvos como arquivos .oir.
5. Análise de espectros e imagens
- Análise de espectros
- Use o software Origin ou outros aplicativos relevantes para subtrair o espectro de fundo de todos os espectros de destino subcelulares.
- Use as operações de modelagem matemática do MATLAB para processar os espectros Raman com as funções integradas do software. Python também pode ser usado para processamento de espectros.
- O pré-processamento espectral começa com a conversão dos arquivos em uma matriz. Os espectros são interpolados a cada centímetro recíproco.
- Para validação, represente graficamente os dados brutos. Execute a correção de linha de base nos espectros brutos usando a função interna msbackadj no MATLAB. Em resumo, a função interna estima os pontos da linha de base em valores de unidade de separação identificados pelos usuários e retorna a distância entre as janelas adjacentes. A partir dos pontos basais, estime e desenhe uma linha de regressão. Aplique Suavização para suavizar a linha de regressão para subtrair a linha de base de cada espectro bruto individual.
- Realizar a normalização min-max dividindo a intensidade Raman da proteína a 2.930 cm-1 pela intensidade de cada deslocamento Raman. O sinal de 2.930 cm-1 é tipicamente a maior intensidade no espectro Raman. Com essa normalização, o valor máximo é transformado em 1, enquanto o valor mínimo é transformado em 0. Todos os outros valores são transformados em um decimal entre 0 e 1.
- Faça a média dos espectros individuais da mesma condição em um único espectro para reduzir o ruído.
- Uma vez processado, use aplicativos, como o Origin, para exibir todos os espectros simultaneamente. Os picos exibidos nos espectros representam uma ligação química específica ou grupo funcional.
- Análise de imagens 3D de gotículas lipídicas
- Use o software FIJI-ImageJ para processar todas as imagens 3D
- Execute as funções Filtros de passagem de banda e Suavização para as pilhas de imagens 3D.
- Para análise de imagens 3D, atribua cada gota lipídica a um escore esférico calculado medindo-se a distância entre seu centro de massa e a superfície. Compare cada escore esférico com um escore esférico de uma esfera perfeita no mesmo plano euclidiano. Descarte gotículas lipídicas com baixos escores esféricos e avalie as gotículas lipídicas remanescentes quanto ao seu volume e contagens.
- Analisar o volume e a contagem de gotículas lipídicas entre diferentes tratamentos para obter significância estatística em um software estatístico apropriado. Aqui, o GraphPad Prism foi usado.
- Análise de imagens hiperespectrais 2D
- Use o software FIJI-ImageJ para processar todas as imagens hiperespectrais 2D.
- Selecione o canal de 2.930 cm-1 para criar uma imagem de máscara que contenha valores 0 e 1. Atribua o plano de fundo a 0 e a região celular a 1.
- Subtrair o canal de proteína marcada com deutério (2.175 cm-1) para o canal de fundo (1.900 cm-1) para remover os efeitos fluorescentes.
- Divida o canal de proteína marcada com deutério resultante pelo canal de proteína (2.930 cm-1) para obter imagens ratiométricas da taxa de turnover proteico.
- Em seguida, multiplique a imagem da máscara feita na etapa 5.3.2 pelas imagens ratiometric para remover quaisquer ruídos de fundo restantes. Como resultado, um fundo escuro é gerado em cada imagem ratiométrica.
- Use a ferramenta Freehand Selection no FIJI-ImageJ para segmentar e calcular manualmente as intensidades de pixel exibidas em células individuais. As intensidades de pixel correspondem às concentrações da ligação química que está sendo visualizada.
- Analise as intensidades de pixel para obter significância estatística em um aplicativo de software estatístico apropriado. Aqui, o GraphPad Prism foi usado. Repita essa análise com o restante da análise ratiométrica.
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Representative Results
A adição do excesso de AAAs em concentrações de 15x aos meios de cultura celular contendo 50% D2O produziu bandas Raman C-D distintas de lipídios e proteínas recém-sintetizados em células HeLa (Figura 2B). Experimentos anteriores foram realizados com diferentes níveis de concentração, como 2x e 5x, e embora os dados não sejam apresentados, a concentração de 15x produziu as mais distintas bandas Raman C-D de lipídios e proteínas recém-sintetizados. Especificamente, investigando gotículas lipídicas (DLs), observamos que tanto 15x Phe quanto 15x Tryp induziram sinais lipídicos e proteicos recém-sintetizados a 2.143 cm-1 e 2.172 cm-1, respectivamente. Posteriormente, DO-SRS foi utilizado para visualizar a distribuição espacial dos sinais C-D em células isoladas (Figura 3). Usando o ImageJ, as intensidades de pixel das células individuais foram segmentadas e calculadas manualmente, como indicado pelas bordas brancas pontilhadas na Figura 3A. As células controle exibem bandas lipídicas e proteicas C-D moderadas; no entanto, o 15x Phe e o 15x Tryp apresentam bandas lipídicas e proteicas C-D mais fortes. A análise quantitativa indica que o excesso de AAAs pode aumentar a síntese lipídica em 10%-17%, mas diminuir a síntese proteica em 10% (Figura 3C,D). Os resultados inferem a possibilidade de ausência de autofagia que acumule lipídios recém-sintetizados, promova disfunção mitocondrial e induza desequilíbrio oxidativo sob regulação excessiva do AAA7.
SRS multimodal livre de marcação e imagens de 2PEF de lipídios insaturados (~3.011 cm-1), lipídios saturados (~2.880 cm-1) e NADH, Flavina foram adquiridos para entender os efeitos dos AAAs no metabolismo do câncer. Da mesma forma, as intensidades de pixel das células individuais foram segmentadas manualmente e calculadas usando o ImageJ, como indicado pelas bordas pontilhadas brancas na Figura 3B. A análise ratiométrica das células tratadas com AAA mostra um aumento de 10% em lipídios insaturados/saturados e um aumento de 50% em Flavin/Flavina + NADH (Figura 3E,F). Na cadeia de transporte de elétrons das mitocôndrias, as ROS podem ser geradas a partir da transferência de elétrons de NADH e FADH2 para espécies moleculares de oxigênio. O acúmulo de ROS em muitas células cancerosas resulta em um desequilíbrio oxidativo que oxida ácidos graxos insaturados, promove a síntese de ácidos graxos saturados e esgota os sinais de autofluorescência NADH. Portanto, o aumento observado em Flavin/Flavin + NADH é um indicador de ROS acumulado que reduz os sinais de autofluorescência de NADH. Em resposta ao desequilíbrio oxidativo, as células HeLa podem upregulation sua síntese lipídica insaturada para substituir as oxidadas. Essa resposta não é observada em outras linhagens de células cancerígenas29, o que significa a heterogeneidade metabólica das células cancerosas sob dieta AAAem excesso 30.
Além da imagem multimodal, o SRS pode reconstruir imagens 3D sem marcação de LDs em células HeLa tratadas com AAA e controle e AAA. Em resumo, a microscopia gera um conjunto de imagens transversais ao longo de uma região de interesse selecionada. Neste estudo, a perda Raman estimulada (SRL) foi sintonizada em 2.845 cm-1 e escaneada da camada superior para a camada inferior com um tamanho de passo de 1 μm (Figura 4A). Análises quantitativas de gotículas lipídicas 3D revelam que os LDs reduziram de tamanho, mas aumentaram na contagem em células tratadas com AAA em comparação com o controle (Figura 4B,C). A presença aumentada de aminoácidos hidrofóbicos volumosos, como Tryp e Phe, pode prejudicar a função das proteínas de revestimento LD. Isso acaba reduzindo a lipólise, que acumula inúmeros pequenos LDs. Os resultados de imagem volumétrica 3D SRS sem marcação deste estudo corroboram com estudos anteriores ao visualizar que o excesso de células tratadas com AAA exibe numerosos DLs menores31,32.
Figura 1: Ilustração da aquisição e análise das imagens com DO-SRS e 2PEF. (A) Reconstrução e análise de imagens 3D para aquisição do número de gotículas lipídicas, volume e escore esférico. (B) Imagem hiperespectral e análise de lipídios marcados com deutério (CDL; 2.145 cm-1), lipídios (2.845 cm-1), proteína marcada com deutério (CDP; 2.175 cm-1), proteína (2.940 cm-1), lipídios insaturados (3.011cm-1), lipídios saturados (2.880 cm-1), NADH e Flavin. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Configuração física da espectroscopia Raman espontânea e microscopia de espalhamento Raman estimulada. (A) Configuração da espectroscopia Raman espontânea utilizada para este estudo. (B) Espectros Raman espontâneos da amostra para rótulo de CD (vermelho), sem rótulo de CD (preto), grupo controle (azul, linha sólida), grupo tratado com 15x Phe (vermelho, linha pontilhada) e grupo tratado com 15x Tryp (rosa, linha pontilhada). (C) Diagrama esquemático do dispositivo de microscopia de espalhamento Raman estimulado utilizado para esta investigação. (D) Configuração de microscopia de espalhamento Raman estimulada usada como plataforma DO-SRS e 2PEF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Visualizando a dinâmica metabólica em células HeLa usando DO-SRS e microscopia 2PEF. (A) Lipídios marcados com deutério (2.145 cm-1), lipídios (2.845 cm-1), proteína marcada com deutério (2.175 cm-1), proteínas (2.940 cm-1) visualizados em células HeLa sob controle (Ctrl), 15x fenilalanina (15x Phe) e 15x triptofano (15x Tryp) com a plataforma DO-SRS. A taxa de turnover lipídico e a taxa de turnover proteico foram calculadas como 
e 
. As imagens brutas foram primeiro subtraídas pelo sinal PBS para remover a intensidade de fundo e mascaradas para remover a intensidade fora das células usando o ImageJ. Para a análise ratiométrica foi realizada a divisão pixel-wise. (B) canais de NADH e Flavina visualizados com microscopia de 2PFE, e lipídios insaturados (3.011 cm-1) e saturados (2.880 cm-1) visualizados com microscopia SRS label-free. A razão redox óptica e a razão de saturação foram calculadas com 
e 
. (C-F) Quantificação das intensidades ratiométricas para cada célula HeLa sob controle, condições de 15x Phe e 15x Trip. A diferença estatística foi utilizada para comparar as condições de excesso de AAA com as condições de controle. p < 0,0001, ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05 foram calculados a partir de um teste ANOVA two-way. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Visualização da distribuição de gotículas lipídicas 3D de uma única célula HeLa usando um microscópio SRS livre de marcação. (A) Projeção do volume de gotículas lipídicas SRS 3D em células HeLa sob controle e condições de excesso de AAA. O limiar foi definido previamente à análise, revelando a distribuição do sinal das gotículas lipídicas. (B,C) Quantificação do volume e contagem de gotículas lipídicas dentro de células HeLa individuais sob grupo controle e condições de excesso de AAA usando o teste ANOVA two-way. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
DO-SRS e 2PEF têm sido aplicados para investigar a dinâmica metabólica em vários modelos ex vivo, incluindo Drosophila e tecidos humanos 21,22,23,24,26,27,33. A modalidade de imagem usada neste estudo integra a microscopia DO-SRS e 2PEF, que pode superar outros métodos de imagem específicos de moléculas, eliminando a necessidade de extração de moléculas ou marcação com reagentes citotóxicos e exigindo preparação mínima da amostra. Especificamente, a microscopia DO-SRS permite sondar a lipogênese de novo e a síntese proteica em animais e células e visualizar sua dinâmica metabólica in situ23,27,34. O 2PEF capta os sinais de autofluorescência de biomoléculas de ocorrência natural, como Flavina e NADH, em amostras biológicas35,36. A profundidade de penetração da imagem do SRS pode atingir até 200-500 μm em amostras de menor espalhamento37. Com métodos de limpeza de tecidos, como a ureia, a profundidade de penetração pode aumentar mais de dez vezes37. O acoplamento do SRS com o 2PEF permite obter imagens de fluoróforos endógenos como Flavina e NADH em amostras biológicas, o que elimina ainda mais a necessidade de biomarcadores exógenos para detecção. O 2PFE pode atingir uma profundidade de penetração de 500 μm38. Em comparação com outras modalidades de imagem multiplex, como microscopia confocal de fluorescência multicolorida de fóton único, tanto o DO-SRS quanto o 2PEF podem alcançar uma profundidade de penetração significativamente maior sem biomarcadores exógenos citotóxicos.
Para aumentar a resolução espacial do DO-SRS e do 2PEF, desenvolvemos uma ferramenta de pós-processamento de imagens de deconvolução de pontilhismo (A-PoD) baseada em estimativa de momento adaptativa (Adam)34. O A-PoD pode converter imagens DO-SRS e 2PEF limitadas por difração em imagens super-resolvidas sem a necessidade de melhorias de hardware. Além disso, o espectro Raman contém muitos modos de vibração química específicos que podem ser aproveitados para aumentar o número de moléculas detectáveis. Aproveitando essa vantagem, nosso laboratório gerou ainda um método de correspondência de referência penalizada (PRF) para distinguir múltiplas espécies lipídicas em modelos celulares e teciduais36. Esses dois desenvolvimentos técnicos abrem novos caminhos para o estudo mais detalhado de processos biológicos em nível celular e subcelular, que têm sido utilizados para caracterizar alterações metabólicas no cérebro, câncer e processos de envelhecimento26,27,35.
Uma das principais limitações deste protocolo é a concentração e o tempo de incubação de amostras celulares com D2O para produzir bandas Raman C-D distintas e quantificáveis. Linhagens celulares mais robustas e metabolicamente ativas, como as células HeLa, podem incorporar átomos de deutério em macromoléculas recém-sintetizadas em um ritmo mais rápido do que linhagens celulares de mamíferos não doentes, como células de rim embrionário humano (HEK), levando a várias intensidades de C-D observadas para a mesma concentração e tempo de incubação com D2O em duas linhagens celulares diferentes21. Além disso, a administração de D2O numa concentração igual ou superior a 80% durante 48 h pode introduzir toxicidade nas amostras celulares. Um experimento de otimização para identificar a concentração ótima de D2O e o tempo de incubação é necessário para alcançar os resultados desejáveis.
Um aspecto crítico do protocolo é a integração das imagens DO-SRS e 2PEF. Normalmente, as modalidades DO-SRS e 2PEF compartilham o mesmo laser de excitação de picossegundos, pois sua largura de banda estreita pode ser otimizada com sinais SRS e 2PEF. Embora nossa tecnologia seja caseira, esta plataforma está disponível comercialmente39. Equipamentos adicionais, como dois pulsos de laser sincronizados com um modulador, detector de fotodiodos, um amplificador lock-in e esforços conjuntos de um microscópio de varredura são necessários para detectar o sinal Raman. D2O pode ser facilmente adquirido a fornecedores de biotecnologia. Portanto, os pesquisadores podem acessar essa tecnologia com muita facilidade.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Yajuan Li e Anthony Fung por seu suporte técnico e ao laboratório Fraley pela linha celular. Agradecemos os fundos iniciais da UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 e Hellman Fellow Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer - Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
| Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
| Silicon Wafer | |||
| Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
| Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
| Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Tweezers | Kaverme - Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
| Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
References
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