Summary
我们提出了一种协议，使用氧化氘（重水D2O）探测的受激拉曼散射（DO-SRS）显微镜直接可视化由氨基酸调节的细胞中的代谢活动，该显微镜与双光子激发荧光显微镜（2PEF）集成。
Abstract
必需芳香族氨基酸（AAA）是在细胞中合成新生物质和维持正常生物功能的基石。例如，充足的AAAs供应对于癌细胞维持其快速生长和分裂很重要。因此，对高度特异性、无创成像方法的需求不断增长，该方法具有最少的样品制备，以直接可视化细胞如何利用 AAA 进行 原位代谢。在这里，我们开发了一种光学成像平台，该平台将氧化氘（D2O）探测与受激拉曼散射（DO-SRS）相结合，并将DO-SRS与双光子激发荧光（2PEF）集成到单个显微镜中，以直接可视化AAA调节下HeLa细胞的代谢活动。总的来说，DO-SRS平台为单个HeLa细胞单元中新合成的蛋白质和脂质提供了高空间分辨率和特异性。此外，2PEF模式可以无标记方式检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素的自发荧光信号。这里描述的成像系统与 体外 和 体内 模型兼容，对于各种实验都是灵活的。该协议的一般工作流程包括细胞培养、培养基制备、细胞同步、细胞固定以及使用 DO-SRS 和 2PEF 模式进行样品成像。
Introduction
苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Tryp）是必需的芳香族氨基酸（AAA），可以被人体吸收，合成维持正常生物学功能的新分子1。Phe是合成蛋白质，黑色素和酪氨酸所必需的，而Tryp是合成褪黑激素，血清素和烟酸2,3所必需的。然而，过量食用这些AAA可以上调雷帕霉素（mTOR）途径的哺乳动物靶标，抑制AMP活化的蛋白激酶，并干扰线粒体代谢，共同改变大分子生物合成并导致恶性前体的产生，例如健康细胞中的活性氧（ROS）4,5,6.在过量的AAA调节下直接可视化改变的代谢动力学对于了解AAA在促进癌症发展和健康细胞生长中的作用至关重要7,8,9。
传统的AAA研究依赖于气相色谱（GC）10。其他方法，如磁共振成像（MRI），空间分辨率有限，因此难以对生物样品进行细胞和亚细胞分析11。最近，基质辅助激光解吸/电离（MALDI）已被开发出来，以阐明AAA在脂质和蛋白质合成中的作用，使用非侵入性生物标志物12,13,14在癌症增殖中的作用。然而，这种技术仍然存在成像深度浅、空间分辨率差和样品制备量大等问题。在细胞水平上，无毒稳定同位素，如氮-15和碳-13，可以通过多同位素成像和纳米级二次离子质谱法进行追踪，以了解它们掺入大分子中。然而，这些方法对活的生物样品15,16具有破坏性。原子力显微镜（AFM）是另一种强大的技术，可以可视化代谢动力学17。另一方面，AFM成像期间的缓慢扫描速率可能会导致热漂移导致结果的图像失真。
我们通过耦合氧化氘（D2O）探测的受激拉曼散射（DO-SRS）显微镜和无标记双光子激发荧光显微镜（2PEF）来开发一种无创双正交成像模式。这种模式在对生物样品18,19,20,21,22,23,24进行成像时实现了高空间分辨率和化学特异性。该协议介绍了DO-SRS和2PEF的应用，以检查癌症进展过程中脂质，蛋白质和氧化还原比率变化的代谢动力学。由于D2O是水的稳定同位素形式，细胞生物分子可以用氘（D）标记，因为它可以快速补偿细胞中的全身水分，通过酶交换形成碳 - 氘（C-D）键21。新合成的大分子（包括脂质、蛋白质、DNA/RNA 和碳水化合物）中的 C-D 键可以在拉曼光谱20、21、22、25、26、27 的细胞静默区域中检测到。通过两个同步激光脉冲，新合成的脂质和蛋白质的C-D键可以通过高光谱成像（HSI）显示在单个细胞上，而无需用细胞毒性剂提取或标记它们。此外，SRS显微镜能够通过捕获和组合一组横截面图像来构建生物样品中选定感兴趣区域的三维（3D）模型22,26。通过高光谱和3D体积成像，DO-SRS可以获得单细胞中新合成的大分子的空间分布，以及根据AAA法规22促进癌症生长过程的细胞器类型。此外，使用2PEF，我们可以获得黄素和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的自发荧光信号，具有高分辨率，深度穿透深度和生物样品中的低水平损伤21,23,24。黄素和NADH自发荧光信号已被用于表征癌细胞中的氧化还原稳态和脂质过氧化22,26。因此，DO-SRS和2PEF的偶联不仅提供了癌细胞中AAA调节代谢动力学的亚细胞分析，具有高空间分布，化学特异性信息和最少的样品制备，而且该方法还减少了用有毒试剂提取或标记内源性分子的需要。在该协议中，我们首先介绍了D2O和氨基酸制备以及癌细胞培养的程序。然后，我们展示了DO-SRS成像和2PEF成像的协议。最后，我们介绍了SRS和2PEF成像的代表性结果，证明了AAA调节的脂质和蛋白质代谢变化以及癌细胞中的氧化还原比例变化。图 1 突出显示了该过程的详细图示。
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Protocol
1. 培养基制备
- 在含有 50% D2O 的 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 中制备 10 mL 对照和过量 AAA。
- 对于对照介质，在 15 mL 锥形管中测量 10 mg DMEM 粉末与 4.7 mL 双蒸水 （ddH2O） 并混合。DMEM粉末含有标准浓度的所有氨基酸。彻底涡旋并倒置管，以确保溶液充分混合。加入 4.7 mL D2O、0.5 mL 胎牛血清 （5% FBS） 和 0.1 mL 青霉素/链霉素 （1%）。彻底涡旋并倒置管，以确保溶液充分混合。
- 对于 15x Phe 处理培养基，在 15 mL 锥形管中测量 10 mg DMEM 粉末与 4.7 mL ddH2O、0.5 mL FBS （5%） 和 0.1 mL 青霉素/链霉素 （1%） 混合。彻底涡旋并倒置管，以确保溶液充分混合。向培养基中加入浓度为924mg / L的过量Phe粉末。彻底涡旋并倒置管，以确保溶液充分混合。
- 对于 15x Tryp 处理培养基，在 15 mL 锥形管中测量 10 mg DMEM 粉末与 4.7 mL ddH2O、0.5 mL FBS （5%） 和 0.1 mL 青霉素/链霉素 （1%） 混合。彻底涡旋并倒置管，以确保溶液充分混合。向培养基中加入浓度为 224 mg/L 的过量 Tryp 粉末。彻底涡旋并倒置管，以确保溶液充分混合。
- 将蛋氨酸和苏氨酸分别以30.0mg / mL和95.0mg / mL添加到前面步骤的所有锥形管中。彻底涡旋并倒置管子。不需要将丙酮酸钠添加到培养基中。
- 用25 mm注射器过滤器和0.22μm聚醚砜膜过滤器过滤控制和处理介质。
- 用封口膜密封所有含有介质的锥形管，并在4°C下储存长达3周。在用培养基处理细胞之前，将所有培养基加热至37°C。
注意：粉末和液体试剂应根据处理和控制介质的总体积进行测量和组合。
2. 细胞样品制备
- 使用补充有10%FBS和1%青霉素/链霉素的标准DMEM在37°C和5%二氧化碳（CO2）下将宫颈癌（HeLa）细胞维持在培养瓶（即T10，T25等）中。
- 以1：10的分裂比例传代培养HeLa细胞，直到达到80%或更高的细胞活力。
- 一旦细胞达到80%或更高的汇合度，使用补充有0.5%FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM将每孔2 x 105 个细胞接种到24孔板上。
- 在细胞接种之前，用灭菌的聚-d-溶酶，层粘连蛋白包被的圆形盖玻片制备24孔板，直径为12 mm。将盖玻片浸入 70% 乙醇中，然后使用不起毛的湿巾轻轻干燥。将干净的盖玻片放入板的适当孔中。
- 一旦细胞在步骤2.2中达到80%汇合度，用不含镁和钙离子的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞一次。
- 加入0.25%胰蛋白酶以将贴壁细胞从烧瓶中解离，并在37°C和5%CO2 下孵育3分钟。
- 加入补充有10%FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM，轻轻上下移液，并在室温（RT）下以300× g 离心3分钟收集细胞。
- 将细胞重悬于补充有0.5%FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM中。
- 使用血细胞计数器、光学显微镜和台盼蓝计数细胞，并在 24 孔板中接种密度为 2 x 105 个细胞。或者，可以使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。
- 将细胞在37°C和5%CO2下返回培养箱中，轻轻摇动板以使细胞均匀分布。
- 8小时后，用50%D 2 O /过量Phe或50%D2O /过量Tryp培养基替换旧培养基。将细胞在37°C和5%CO2下返回培养箱36小时。
- 36小时后，将细胞固定在显微镜载玻片上。
- 在固定之前，准备带有直径为9 mm的成像垫片的显微镜载玻片，并放置15μL补充有钙和镁离子的1x PBS。
- 用补充有钙和镁离子的1x PBS冲洗细胞。
- 加入 0.5 mL 的 4% 无甲醇多聚甲醛 （PFA） 溶液，将板放在生物安全罩下约 15 分钟。
- 吸出PFA溶液，并用补充有钙和镁离子的1x PBS冲洗两次。
- 在每个孔中加入 1.5 mL 补充有钙和镁离子的 1x PBS。
- 使用无菌镊子轻轻地从每个孔中取出盖玻片。倒置并将盖玻片的包含细胞的一面放在成像垫片上，以接触步骤2.5.1中制备的PBS。确保不含电池的一面暴露在空气中。
- 使用透明指甲油，用成像垫片密封盖玻片的外层。
- 不成像时将显微镜载玻片储存在4°C。
3. 自发拉曼光谱测量（图2）
- 使用共聚焦拉曼显微镜获得自发拉曼光谱（图2A）。
- 通过将钥匙转到 ON 位置来打开激光器。
- 双击 LabSpec6 软件图标以打开采集软件。
- 将生物样品装载到物镜正下方的样品架上。
- 在软件上，单击 相机 图标 打开摄像机。
- 调整焦平面以使用50倍物镜识别感兴趣区域。移动操纵杆以控制XY载物台的刨床平移，并旋转操纵杆以改变焦深。
- 选择测量位置后，切换到激发功率为40 mW的100倍物镜。单击红色的 停止 图标以关闭摄像机。
- 选择1800线/mm的光栅，并将采集范围设置为400 cm-1至3,150 cm-1。
- 将采集时间设置为 90 s，将累积时间设置为 3，将合并设置为 4，以获得最小的噪声和最准确的频谱。
注意：这些成像参数可以优化以适应实验。 - 单击 箭头 图标以打开实时显示。
- 将拉曼频移 （cm-1） 调整到所选值以微调焦点平面。
注意：在该实验中，拉曼激光聚焦到含有高浓度CH2键的脂滴上。因此，为此选择了与CH 2键的拉伸模式相匹配的2,850 cm-1拉曼位移。 - 使用操纵杆调整对焦平面以优化最佳信噪比。
- 选择对焦平面后，单击红色的 停止 图标进行实时显示。
- 选择 圆圈 图标以开始频谱采集。
- 拍摄细胞区域后，使用相同的焦点平面用PBS测量背景。使用单独的计算机软件应用程序（例如Origin）从每个亚细胞目标光谱中减去背景光谱（图1B）。
4. 2PEF和SRS成像实验
注意：SRS激光对准的详细说明可以在以前的报告28中找到。该协议侧重于多模态SRS和2PEF成像系统的操作（图2C，D）。
- 单击 “开始” 以预热激光器。
- 按照顺序将控制单元和显示器的主开关设置为打开：1） 将控制盒 IX3-CBH 的主开关按开，2） 将触摸面板控制器的主开关按开，3） 按下连接到主激光组合器 FV31-SCOMB 的 LD OBIS 6 激光遥控器电源交流适配器的主开关开，以及 4） 将连接到子激光组合器 FV31-SCOMB 的 LD OBIS 6 激光遥控器电源的交流适配器的主开关按开。
- 按下 Si 光电二极管检测器和锁相放大器的主开关 On。
- 将 斯托克斯光束 设置为 1,031 nm， 脉冲宽度 设置为 6 ps， 重复频率 设置为 80 MHz。
- 耦合到显微镜中，设置与同步泵浦光束一起提供的picoEmerald系统，可调 波长 为720-990 nm， 脉冲宽度 为5-6 ps， 重复率为 80 MHz。泵和斯托克斯的平均激励功率均为450 mW。优化激发功率，以最大程度地减少样品的光损伤。
- 使用高数值孔径 （NA） 油冷凝器（即 1.4 NA）通过在冷凝器上发射几滴来收集安装样品的斯托克斯和泵浦光束。
- 将样品安装在油上，并在固定样品的显微镜载玻片顶部放置一个大水滴。这是用于水浸物镜的。
- 将锁相放大器设置为 20 MHz。 现在使用超分辨率软件模块处理图像。
- 选择 512 像素 x 512 像素和 80 μs/像素作为停留时间。
- 一旦所需的细胞区域正确聚焦，获取图像。使用显微镜的采集软件，将图像保存为奥林巴斯.oir图形文件。
- 获取1,900 cm-1 的背景图像，并从所有细胞图像中减去它。
- 要进行2PEF成像，请使用相同的可调谐皮秒激光器，并将黄素和NADH的无标记自发荧光分别设置为800 nm和780 nm。
- 使用 460 nm/515 nm 滤光片立方体收集黄素和 NADH 自发荧光背散射发射。
- 将停留时间调整为 8 μs/像素，将像素大小调整为 512 像素 x 512 像素。将激光快门功率参数设置为 150 mW。
- 对于 3D 图像重建，将受激拉曼损失调整为 2,850 cm-1 （797 nm）。
- 一旦确定了所需的单个细胞，就将激光注册为从顶部焦点平面扫描，以检测这些细胞的顶层和底层。
注意：3D 模型生成并保存为 .oir 文件。
5. 光谱和图像分析
- 光谱分析
- 使用Origin软件或其他相关应用程序从所有亚细胞靶光谱中减去背景光谱。
- 使用 MATLAB 的数学建模操作，通过软件的内置函数处理拉曼光谱。Python也可用于光谱处理。
- 光谱预处理从将文件转换为数组开始。光谱以每倒数厘米插值。
- 为了进行验证，请绘制原始数据。使用 MATLAB 中的内置函数 msbackadj 对原始光谱执行基线校正。简而言之，内置函数估计用户标识的分离单元值的基线点，并返回相邻窗口之间的距离。从基线点开始，估计并绘制一条回归线。应用平滑以 平滑 回归线，以从每个单独的原始光谱中减去基线。
- 通过将蛋白质在 2,930 cm-1 处的拉曼强度除以每个拉曼位移的强度来执行最小-最大归一化。2,930 cm-1 信号通常是拉曼光谱中强度最高的信号。通过此规范化，最大值将转换为 1，而最小值将转换为 0。每隔一个值都会转换为介于 0 和 1 之间的小数。
- 将相同条件的单个光谱平均为单个光谱以降低噪声。
- 处理后，使用应用程序（如 Origin）同时显示所有光谱。光谱中显示的峰代表特定的化学键或官能团。
- 脂滴的 3D 图像分析
- 使用FIJI-ImageJ软件处理所有3D图像
- 执行3D图像堆栈的 带通滤镜 和 平滑 功能。
- 对于 3D 图像分析，将每个脂滴分配给通过测量其质心到表面之间的距离计算的球形评分。将每个球面分数与同一欧几里得平面上完美球体的球面分数进行比较。丢弃球形评分低的脂滴，并评估剩余的脂滴的体积和计数。
- 在适当的统计软件应用程序上分析不同处理之间脂滴的体积和计数，以确定统计显着性。在这里，使用了GraphPad Prism。
- 二维高光谱图像分析
- 使用FIJI-ImageJ软件处理所有2D高光谱图像。
- 选择 2,930 cm-1 通道以创建包含 0 和 1 值的蒙版图像。将背景分配给 0，将蜂窝区域分配给 1。
- 将氘标记的蛋白质通道（2,175 cm-1）减去到背景通道（1,900 cm-1）以消除荧光效应。
- 将所得的氘标记蛋白质通道除以蛋白质通道（2,930 cm-1）以获得蛋白质周转率比率图像。
- 然后，将步骤5.3.2中制作的掩模图像乘以比例图像以去除任何剩余的背景噪声。结果，在每个比率图像中都会生成深色背景。
- 使用FIJI-ImageJ中的 手绘选择 工具手动分割和计算单个单元格上显示的像素强度。像素强度对应于正在可视化的化学键的浓度。
- 在适当的统计软件应用程序上分析像素强度的统计显著性。在这里，使用了GraphPad Prism。对剩余的比率分析重复此分析。
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Representative Results
将浓度为 15x 的过量 AAA 添加到含 50% D2O 的细胞培养基中，在 HeLa 细胞中产生了新合成的脂质和蛋白质的不同 C-D 拉曼带（图 2B）。以前的实验是用不同的浓度水平进行的，例如2x和5x，虽然没有提供数据，但15x浓度产生了新合成的脂质和蛋白质的最明显的C-D拉曼带。具体来说，通过研究脂滴（LDs），我们注意到15x Phe和15x Tryp分别在2,143 cm-1和2,172 cm-1处诱导新合成的脂质和蛋白质信号。随后使用DO-SRS可视化单细胞上C-D信号的空间分布（图3）。使用ImageJ，手动分割和计算单个细胞的像素强度，如图3A中的白色虚线边框所示。对照细胞显示中等的C-D脂质和蛋白质条带;然而，15x Phe和15x Tryp显示出更强的C-D脂质和蛋白质条带。定量分析表明，过量的AAA可能会将脂质合成上调10%-17%，但将蛋白质合成下调10%（图3C，D）。结果推断缺乏自噬的可能性，自噬积累新合成的脂质，促进线粒体功能障碍，并在过量的AAA调节下诱导氧化失衡7。
获得不饱和脂质（~3,011 cm-1）、饱和脂质（~2,880 cm-1）和NADH、黄素的无标记多模态SRS和2PEF成像，以了解AAA对癌症代谢的影响。同样，使用ImageJ手动分割和计算单个单元格的像素强度，如图3B中的白色虚线边框所示。AAA处理细胞的比例分析显示不饱和脂质/饱和脂质增加10%，黄素/黄素+ NADH增加50%（图3E，F）。在线粒体的电子传递链中，ROS可以通过将电子从NADH和FADH2转移到分子氧物种中产生。ROS在许多癌细胞中的积累导致氧化失衡，氧化不饱和脂肪酸，促进饱和脂肪酸合成，并耗尽NADH自发荧光信号。因此，观察到的黄素/黄素+ NADH的增加是减少NADH自发荧光信号的累积ROS的指标。为了响应氧化失衡，HeLa细胞可能会上调其不饱和脂质合成以取代氧化的脂质合成。在其他癌细胞系29中未观察到这种反应，这表明在过量的AAA饮食30下癌细胞的代谢异质性。
除了多模态成像外，SRS还可以重建对照和AAA处理的HeLa细胞中LD的无标记3D图像。简而言之，显微镜在选定的感兴趣区域中生成一组横截面图像。在这项研究中，将受激拉曼损失（SRL）调谐为2,845 cm-1，并以1μm的步长从顶层扫描到底层（图4A）。3D脂滴的定量分析显示，与对照相比，AAA处理的细胞中的LD尺寸减小但计数增加（图4B，C）。大量疏水氨基酸（如Tryp和Phe）的存在增加可能会损害LD包被蛋白的功能。这最终减少了脂解，脂肪分解积累了许多小LD。这项研究的无标记3D SRS体积成像结果与以前的研究相吻合，通过可视化过量的AAA处理的细胞表现出许多较小的LDs31,32。
图 1：使用 DO-SRS 和 2PEF 进行图像采集和分析的示意图。 （A） 用于获取脂滴数、体积和球形评分的 3D 图像重建和分析。（B） 氘标记脂质（CDL;2,145 cm-1）、脂质（2,845 cm-1）、氘标记蛋白（CDP; 2,175 cm-1）、蛋白质（2,940 cm-1）、不饱和脂质（3,011cm-1）、饱和脂质（2,880 cm-1）、NADH 和黄素的高光谱成像和分析。请点击此处查看此图的大图。
图2：自发拉曼光谱和受激拉曼散射显微镜的物理设置 。 （A）用于本研究的自发拉曼光谱设置。（B）CD标签（红色），无CD标签（黑色），对照组（蓝色，实线），15x Phe处理组（红色，虚线）和15x Tryp处理组（粉红色，虚线）的自发拉曼光谱。（C）用于本研究的受激拉曼散射显微镜装置示意图。（D）用作DO-SRS和2PEF平台的受激拉曼散射显微镜装置。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：使用 DO-SRS 和 2PEF 显微镜可视化 HeLa 细胞中的代谢动力学。 （A） 在受控 （Ctrl） 在 HeLa 细胞中可视化的氘标记脂质 （2,145 cm-1）、脂质 （2,845 cm-1）、氘标记蛋白 （2,175 cm-1）、蛋白质 （2,940 cm-1） 在受控 （Ctrl）、15x 苯丙氨酸 （15x Phe） 和 15x 色氨酸 （15x Tryp） 中使用 DO-SRS 平台。脂质周转率和蛋白质周转率计算如下
和
。首先用PBS信号减去原始图像以去除背景强度，并使用ImageJ掩盖以去除细胞外的强度。对比率分析进行逐像素除法。（B）用2PEF显微镜观察NADH和黄素通道，用无标记SRS显微镜观察不饱和脂质（3,011cm-1）和饱和脂质（2,880cm-1）。用
和计算光学氧化还原比和饱和
比。（C-F）定量每个受控的HeLa细胞的比例强度，15x Phe和15x Tryp条件。统计差异用于比较过量AAA条件与对照条件。p < 0.0001， ***p < 0.001， **p < 0.01， *p < 0.05 根据双向方差分析检验计算得出。请点击此处查看此图的大图。
图 4：使用无标记 SRS 显微镜可视化单个 HeLa 细胞的 3D 脂滴分布。 （A） 在控制和过量 AAA 条件下 HeLa 细胞中的 SRS 3D 脂滴体积投影。在分析之前定义阈值，揭示脂滴信号分布。（乙，丙）使用双向方差分析检验在对照组和过量AAA条件下定量单个HeLa细胞内的脂滴体积和计数。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
DO-SRS和2PEF成像已被应用于研究各种离体模型中的代谢动力学，包括果蝇和人体组织21,22,23,24,26,27,33。本研究中使用的成像方式集成了DO-SRS和2PEF显微镜，无需使用细胞毒性试剂进行分子提取或标记，并且需要最少的样品制备，因此可以超越其他分子特异性成像方法。具体来说，DO-SRS显微镜使我们能够探测动物和细胞中的从头脂肪生成和蛋白质合成，并在原位可视化它们的代谢动力学23,27,34。 2PEF捕获生物样品中天然存在的生物分子（如黄素和NADH）的自发荧光信号35,36。SRS的成像穿透深度可以在较少的散射样品中达到200-500μm37。使用尿素等组织清除方法，穿透深度可增加十倍以上37。SRS与2PEF的偶联使我们能够对生物样品中的内源性荧光团（如黄素和NADH）进行成像，这进一步消除了检测外源性生物标志物的需要。2PEF可以达到500μm38的穿透深度。与其他多重成像方式（例如多色单光子共聚焦荧光显微镜）相比，DO-SRS和2PEF都可以在没有细胞毒性外源性生物标志物的情况下实现显着更大的穿透深度。
为了提高DO-SRS和2PEF的空间分辨率，我们开发了一种基于自适应矩估计（Adam）的点点反卷积（A-PoD）图像后处理工具34。A-PoD可以将衍射极限DO-SRS和2PEF图像转换为超分辨率图像，而无需任何硬件改进。此外，拉曼光谱包含许多特定的化学振动模式，可以利用这些模式来增加可检测分子的数量。利用这一优势，我们的实验室进一步生成了一种惩罚参考匹配（PRF）方法来区分细胞和组织模型中的多种脂质物种36。这两项技术发展为在细胞和亚细胞水平上更详细地研究生物过程开辟了新的途径，这些过程已被用于表征大脑，癌症和衰老过程中的代谢变化26,27,35。
该方案的一个主要限制是细胞样品与D2O的浓度和时间孵育，以产生不同的，可量化的C-D拉曼条带。更健壮、代谢活跃的细胞系，如HeLa细胞，可以比非患病哺乳动物细胞系（如人胚胎肾（HEK）细胞）更快的速度将氘原子掺入新合成的大分子中，导致在两个不同的细胞系中观察到相同浓度和与D2O孵育时间下观察到不同的C-D强度21。此外，以80%或以上的浓度施用D2O48小时可能会对细胞样品产生毒性。为了获得理想的结果，需要进行优化实验以确定最佳的D2O浓度和时间孵育。
该协议的一个关键方面是DO-SRS和2PEF成像的集成。通常，DO-SRS和2PEF模式共享相同的皮秒激发激光器，因为其窄带宽可以通过SRS和2PEF信号进行优化。虽然我们的技术是自制的，但这个平台是商用的39.检测拉曼信号需要额外的设备，例如两个同步激光脉冲和一个调制器、光电二极管检测器、锁相放大器和扫描显微镜的共同努力。D2O可以很容易地从生物技术供应商处购买。因此，研究人员可以很容易地获得这项技术。
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Disclosures
作者没有相互竞争的经济利益或其他利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢李亚娟博士和冯安东尼博士的技术支持，以及Fraley实验室的细胞系。我们感谢UCSD，NIH U54CA132378，NIH 5R01NS111039，NIH R21NS125395，NIHU54DK134301，NIHU54 HL165443和Hellman Fellow奖的启动资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer - Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
| Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
| Silicon Wafer | |||
| Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
| Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
| Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Tweezers | Kaverme - Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
| Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
References
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