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Bioengineering

एरोमैटिक अमीनो एसिड द्वारा विनियमित सेल चयापचय की बायोऑर्थोगोनल रासायनिक इमेजिंग

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65121
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Shu Chien-Gene Lay Department of Bioengineering, University of California San Diego
* These authors contributed equally

Summary

हम ड्यूटेरियम-ऑक्साइड (भारी पानी डी2ओ) जांच किए गए उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (डीओ-एसआरएस) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके अमीनो एसिड द्वारा विनियमित कोशिकाओं में चयापचय गतिविधियों को सीधे कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो दो-फोटॉन उत्तेजना प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (2पीईएफ) के साथ एकीकृत है।

Abstract

आवश्यक सुगंधित अमीनो एसिड (एएए) कोशिकाओं में नए बायोमास को संश्लेषित करने और सामान्य जैविक कार्यों को बनाए रखने के लिए निर्माण खंड हैं। उदाहरण के लिए, कैंसर कोशिकाओं के लिए उनके तेजी से विकास और विभाजन को बनाए रखने के लिए एएए की प्रचुर मात्रा में आपूर्ति महत्वपूर्ण है। इसके साथ, न्यूनतम नमूना तैयारी के साथ एक अत्यधिक विशिष्ट, गैर-आक्रामक इमेजिंग दृष्टिकोण की बढ़ती मांग है ताकि सीधे कल्पना की जा सके कि कोशिकाएं अपने चयापचय के लिए एएए का उपयोग कैसे करती हैं। यहां, हम एक ऑप्टिकल इमेजिंग प्लेटफॉर्म विकसित करते हैं जो ड्यूटेरियम ऑक्साइड (डी2ओ) को उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (डीओ-एसआरएस) के साथ जोड़ता है और डीओ-एसआरएस को दो-फोटॉन उत्तेजना फ्लोरेसेंस (2पीईएफ) के साथ एकल माइक्रोस्कोप में एकीकृत करता है ताकि एएए विनियमन के तहत हेला कोशिकाओं की चयापचय गतिविधियों को सीधे देखा जा सके। सामूहिक रूप से, डीओ-एसआरएस प्लेटफॉर्म एकल हेला सेल इकाइयों में नए संश्लेषित प्रोटीन और लिपिड की उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन और विशिष्टता प्रदान करता है। इसके अलावा, 2पीईएफ साधन एक लेबल-मुक्त तरीके से निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (एनएडीएच) और फ्लेविन के ऑटोफ्लोरेसेंस संकेतों का पता लगा सकता है। यहां वर्णित इमेजिंग सिस्टम इन विट्रो और विवो मॉडल दोनों के साथ संगत है, जो विभिन्न प्रयोगों के लिए लचीला है। इस प्रोटोकॉल के सामान्य वर्कफ़्लो में सेल कल्चर, कल्चर मीडिया तैयारी, सेल सिंक्रनाइज़ेशन, सेल फिक्सेशन और डीओ-एसआरएस और 2पीईएफ तौर-तरीकों के साथ नमूना इमेजिंग शामिल है।

Introduction

आवश्यक सुगंधित अमीनो एसिड (एएए) होने के नाते, फेनिलएलनिन (पीएचई) और ट्रिप्टोफैन (ट्रिप) को मानव शरीर द्वारा सामान्यजैविक कार्यों को बनाए रखने के लिए नए अणुओं को संश्लेषित करने के लिए अवशोषित किया जा सकता है। प्रोटीन, मेलेनिन और टायरोसिन के संश्लेषण के लिए पीएचई की आवश्यकता होती है, जबकि मेलाटोनिन, सेरोटोनिन और नियासिन 2,3 के संश्लेषण के लिए ट्रिप की आवश्यकता होती है। हालांकि, इन एएए की अधिक खपत रेपामाइसिन (एमटीओआर) मार्ग के स्तनधारी लक्ष्य को बढ़ा सकती है, एएमपी-सक्रिय प्रोटीन काइनेज को रोक सकती है, और माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय में हस्तक्षेप कर सकती है, सामूहिक रूप से मैक्रोमोलेक्यूल जैवसंश्लेषण को बदल सकती है औरस्वस्थ कोशिकाओं में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) जैसे घातक अग्रदूतों के उत्पादन की ओर अग्रसर हो सकती है।. कैंसर के विकास औरस्वस्थ कोशिकाओं के विकास को बढ़ावा देने में एएए की भूमिकाओं को समझने के लिए अतिरिक्त एएए विनियमन के तहत परिवर्तित चयापचय गतिशीलता का प्रत्यक्ष दृश्य आवश्यक है।

पारंपरिक एएए अध्ययन गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) 10 पर भरोसा करते हैं। चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) जैसे अन्य तरीकों में सीमित स्थानिक संकल्प होते हैं, जिससेजैविक नमूनों के सेलुलर और उप-सेलुलर विश्लेषण करना मुश्किल हो जाता है। हाल ही में, मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर प्रदूषक/आयनीकरण (माल्डी) विकसित किया गया है ताकि कैंसर प्रसार में लिपिड और प्रोटीन सिंथेसिस में एएए की भूमिका को स्पष्ट किया जा सके। हालांकि, यह तकनीक अभी भी उथले इमेजिंग गहराई, खराब स्थानिक संकल्प और व्यापक नमूना तैयारी से ग्रस्त है। सेलुलर स्तर पर, नॉनटॉक्सिक स्थिर आइसोटोप, जैसे नाइट्रोजन -15 और कार्बन -13, को मैक्रोमोलेक्यूल्स में उनके समावेश को समझने के लिए मल्टी-आइसोटोप इमेजिंग और नैनोस्केल सेकेंडरी आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ पता लगाया जा सकता है। हालांकि, ये विधियां जीवित जैविक नमूने15,16 के लिए विनाशकारी हैं। परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) एक और शक्तिशाली तकनीक है जो चयापचय गतिशीलता17 की कल्पना कर सकती है। दूसरी ओर, एएफएम इमेजिंग के दौरान स्कैनिंग की धीमी दर, थर्मल बहाव से परिणाम की छवि विरूपण का कारण बन सकती है।

हमने ड्यूटेरियम-ऑक्साइड (डी2ओ) को युग्मित करके एक नॉनइनवेसिव बाइऑर्थोगोनल इमेजिंग मोडिटी विकसित की, जो उत्तेजित रमन स्कैटरिंग (डीओ-एसआरएस) माइक्रोस्कोपी और लेबल-फ्री टू-फोटॉन उत्तेजना फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (2पीईएफ) है। जैविक नमूने 18,19,20,21,22,23,24 इमेजिंग करते समय यह साधन एक उच्च स्थानिक संकल्प और रासायनिक विशिष्टता प्राप्त करता है। यह प्रोटोकॉल कैंसर की प्रगति के दौरान लिपिड, प्रोटीन और रेडॉक्स अनुपात परिवर्तनों की चयापचय गतिशीलता की जांच करने के लिए डीओ-एसआरएस और 2पीईएफ के अनुप्रयोगों का परिचय देता है। डी2ओ पानी का एक स्थिर आइसोटोप रूप होने के साथ, सेलुलर बायोमोलेक्यूल्स को कोशिकाओं में कुल शरीर के पानी के साथ त्वरित मुआवजे के कारण ड्यूटेरियम (डी) के साथ लेबल किया जा सकता है, जो एंजाइमेटिक एक्सचेंज21 के माध्यम से कार्बन-ड्यूटेरियम (सी-डी) बॉन्ड बनाता है। नए संश्लेषित मैक्रोमोलेक्यूल्स में सी-डी बॉन्ड, जिसमें लिपिड, प्रोटीन, डीएनए / आरएनए और कार्बोहाइड्रेट शामिल हैं, रमन स्पेक्ट्रम20,21,22,25,26,27 के सेल साइलेंट क्षेत्र में पाए जा सकते हैं। दो सिंक्रनाइज़ लेजर दालों के साथ, नए संश्लेषित लिपिड और प्रोटीन के सी-डी बॉन्ड को साइटोटोक्सिक एजेंटों के साथ निकालने या लेबल किए बिना हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग (एचएसआई) के माध्यम से एकल कोशिकाओं पर प्रदर्शित किया जा सकता है। इसके अलावा, एसआरएस माइक्रोस्कोपी में क्रॉस-सेक्शनल छवियों22,26 के एक सेट को कैप्चर और संयोजन करके जैविक नमूनों में रुचि के चयनित क्षेत्रों के त्रि-आयामी (3 डी) मॉडल बनाने की क्षमता है। हाइपरस्पेक्ट्रल और 3 डी वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग के साथ, डीओ-एसआरएस एकल कोशिकाओं में नए संश्लेषित मैक्रोमोलेक्यूल्स के स्थानिक वितरण को प्राप्त कर सकता है, साथ ही ऑर्गेनेल के प्रकार के साथ जो एएए विनियमन22 के तहत कैंसर के विकास को बढ़ावा देने की प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाता है। इसके अलावा, 2पीईएफ का उपयोग करके, हम जैविक नमूनों21,23,24 में उच्च रिज़ॉल्यूशन, गहरी प्रवेश गहराई और निम्न-स्तरीय क्षति के साथ फ्लेविन और निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (एनएडीएच) के ऑटोफ्लोरेसेंस सिग्नल प्राप्त कर सकते हैं। फ्लेविन और एनएडीएच ऑटोफ्लोरेसेंस संकेतों का उपयोग कैंसर कोशिकाओं22,26 में रेडॉक्स होमियोस्टैसिस और लिपिड पेरोक्सीडेशन को चिह्नित करने के लिए किया गया है। जैसे, न केवल डीओ-एसआरएस और 2पीईएफ का युग्मन उच्च स्थानिक वितरण, रासायनिक विशिष्टता जानकारी और न्यूनतम नमूना तैयारी के साथ कैंसर कोशिकाओं में एएए-विनियमित चयापचय गतिशीलता का उपकोशिकीय विश्लेषण प्रदान करता है, बल्कि विधि विषाक्त अभिकर्मकों के साथ अंतर्जात अणुओं को निकालने या लेबल करने की आवश्यकता को भी कम करती है। इस प्रोटोकॉल में, हम पहले डी2ओ और अमीनो एसिड तैयार करने की प्रक्रियाओं के साथ-साथ कैंसर सेल संस्कृति को प्रस्तुत करते हैं। फिर, हम डीओ-एसआरएस इमेजिंग और 2पीईएफ इमेजिंग के प्रोटोकॉल दिखाते हैं। अंत में, हम एसआरएस और 2पीईएफ इमेजिंग के प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत करते हैं, जो लिपिड और प्रोटीन के एएए-विनियमित चयापचय परिवर्तन, और कैंसर कोशिकाओं में रेडॉक्स अनुपात परिवर्तन प्रदर्शित करते हैं। प्रक्रिया का एक विस्तृत चित्रण चित्र 1 में हाइलाइट किया गया है।

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Protocol

1. मीडिया की तैयारी

  1. डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में 10 एमएल नियंत्रण और अतिरिक्त एएए तैयार करें जिसमें 50% डी2ओ हो।
    1. नियंत्रण मीडिया के लिए, 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 4.7 एमएल डबल डिस्टिल्ड वॉटर (डीडीएच2ओ) के साथ 10 मिलीग्राम डीएमईएम पाउडर को मापें और मिलाएं। डीएमईएम पाउडर में मानक सांद्रता में सभी अमीनो एसिड होते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब को अच्छी तरह से भंवर और इनवर्ट करें कि समाधान अच्छी तरह से मिश्रित है। डी2ओ के 4.7 एमएल, भ्रूण गोजातीय सीरम के 0.5 एमएल (5% एफबीएस), और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%) के 0.1 एमएल जोड़ें। यह सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब को अच्छी तरह से भंवर और इनवर्ट करें कि समाधान अच्छी तरह से मिश्रित है।
    2. 15x PHE उपचार माध्यम के लिए, 10 मिलीग्राम डीएमईएम पाउडर को 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 4.7 मिलीलीटर डीडीएच2ओ, 0.5 मिलीलीटर एफबीएस (5%), और 0.1 मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%) के साथ मिलाएं। यह सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब को अच्छी तरह से भंवर और इनवर्ट करें कि समाधान अच्छी तरह से मिश्रित है। माध्यम में 924 मिलीग्राम / लीटर की एकाग्रता पर अतिरिक्त पीएच पाउडर जोड़ें। यह सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब को अच्छी तरह से भंवर और इनवर्ट करें कि समाधान अच्छी तरह से मिश्रित है।
    3. 15x ट्रिप उपचार माध्यम के लिए, 10 मिलीग्राम डीएमईएम पाउडर को 4.7 मिलीलीटर डीडीएच2ओ, 0.5 एमएल एफबीएस (5%), और 0.1 मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%) के साथ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में मापें और मिलाएं। यह सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब को अच्छी तरह से भंवर और इनवर्ट करें कि समाधान अच्छी तरह से मिश्रित है। माध्यम में 224 मिलीग्राम / लीटर की एकाग्रता पर अतिरिक्त ट्रिप पाउडर जोड़ें। यह सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब को अच्छी तरह से भंवर और इनवर्ट करें कि समाधान अच्छी तरह से मिश्रित है।
    4. पिछले चरणों के सभी शंक्वाकार ट्यूबों में क्रमशः 30.0 मिलीग्राम / एमएल और 95.0 मिलीग्राम / एमएल पर मेथिओनिन और थ्रेओनिन जोड़ें। ट्यूब को अच्छी तरह से भंवर और उल्टा करें। सोडियम पाइरूवेट को संस्कृति मीडिया में जोड़ने की आवश्यकता नहीं है।
    5. 0.22 μm पॉलीथेरसल्फोन झिल्ली फिल्टर के साथ 25 मिमी सिरिंज फ़िल्टर के साथ नियंत्रण और उपचार मीडिया को फ़िल्टर करें।
    6. पैराफिल्म के साथ सभी मीडिया-निहित शंक्वाकार ट्यूबों को सील करें और 3 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। मीडिया के साथ कोशिकाओं का इलाज करने से पहले, सभी मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
      नोट: पाउडर और तरल अभिकर्मकों को उपचार और नियंत्रण मीडिया की कुल मात्रा के आधार पर मापा और संयुक्त किया जाना चाहिए।

2. सेल नमूना तैयारी

  1. मानक डीएमईएम का उपयोग करके एक कल्चर फ्लास्क (यानी, टी 10, टी 25, आदि) में गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर (एचईएलए) कोशिकाओं को बनाए रखें, जो 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) पर 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है।
  2. हेला कोशिकाओं को 1: 10 के विभाजित अनुपात में 80% या उच्च सेल व्यवहार्यता तक पहुंचने तक उप-संस्कृति करें।
  3. एक बार जब कोशिकाएं 80% या उससे अधिक कंफ्लुएंसी प्राप्त कर लेती हैं, तो डीएमईएम का उपयोग करके 24-वेल प्लेट पर 2 x 10 5 कोशिकाओं को बीज देने के लिए आगे बढ़ें, जो0.5 % एफबीएस और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है।
    1. सेल सीडिंग से पहले, निष्फल, पॉली-डी-लिसिन, लैमिनिन-लेपित, गोल कवरलिप्स, व्यास में 12 मिमी के साथ एक 24-वेल प्लेट तैयार करें। कवरलिप्स को 70% इथेनॉल में डुबोएं और लिंट-फ्री वाइप्स का उपयोग करके धीरे से सुखाएं। प्लेट के उपयुक्त कुओं में साफ कवरलिप्स रखें।
    2. एक बार जब कोशिकाएं चरण 2.2 में 80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं, तो मैग्नीशियम और कैल्शियम आयनों के बिना 1x फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को एक बार धो लें।
    3. फ्लास्क से अनुगामी कोशिकाओं को अलग करने के लिए 0.25% ट्रिप्सिन जोड़ें और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
    4. डीएमईएम को 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक जोड़ें, धीरे से ऊपर और नीचे पिपेट करें, और 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 300 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    5. डीएमईएम में कोशिकाओं को 0.5% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक करें।
    6. हेमोसाइटोमीटर, लाइट माइक्रोस्कोप और ट्राइपैन ब्लू का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें, और 24-वेल प्लेट के प्रति कुएं में 2 x 105 कोशिकाओं का घनत्व बीज दें। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं की गिनती के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग किया जा सकता है।
    7. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेटर में वापस करें, और कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए प्लेट को धीरे से हिलाएं।
  4. 8 घंटे के बाद, पुराने संस्कृति मीडिया को 50% डी 2 ओ/ अतिरिक्त पीएचई या 50% डी2ओ / अतिरिक्त ट्रिप मीडिया के साथ बदलें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में और 36 घंटे के लिए 5% सीओ2 पर वापस करें।
  5. 36 घंटे के बाद, माइक्रोस्कोप स्लाइड पर कोशिकाओं को ठीक करें।
    1. ठीक करने से पहले, 9 मिमी व्यास के इमेजिंग स्पेसर के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें और कैल्शियम और मैग्नीशियम आयनों के साथ पूरक 1x पीबीएस के 15 μL रखें।
    2. कैल्शियम और मैग्नीशियम आयनों के साथ पूरक 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें।
    3. 4% मेथनॉल-मुक्त पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान के 0.5 एमएल जोड़ें और प्लेट को लगभग 15 मिनट के लिए जैव सुरक्षा हुड के नीचे छोड़ दें।
    4. पीएफए घोल को एस्पिरेट करें और कैल्शियम और मैग्नीशियम आयनों के साथ दो बार पूरक 1x पीबीएस के साथ कुल्ला करें।
    5. प्रत्येक कुएं में कैल्शियम और मैग्नीशियम आयनों के साथ पूरक 1x PBS के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    6. प्रत्येक कुएं से धीरे-धीरे कवरलिप्स को पकड़ने के लिए बाँझ चिमटी का उपयोग करें। चरण 2.5.1 में तैयार पीबीएस से संपर्क करने के लिए इमेजिंग स्पेसर्स पर कवरलिप्स के सेल-युक्त पक्ष को इनवर्ट और रखें। सुनिश्चित करें कि गैर-सेल युक्त पक्ष हवा के संपर्क में है।
    7. पारदर्शी नेल पॉलिश का उपयोग करके, इमेजिंग स्पेसर के साथ कवरस्लिप की बाहरी परत को सील करें।
  6. इमेजिंग न होने पर माइक्रोस्कोप स्लाइड को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. सहज रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी माप (चित्रा 2)

  1. सहज रमन स्पेक्ट्रा (चित्रा 2 ए) प्राप्त करने के लिए एक कॉन्फोकल रमन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  2. कुंजी को ऑन स्थिति में घुमाकर लेजर चालू करें।
  3. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलने के लिए LabSpec6 सॉफ्टवेयर आइकन पर डबल-क्लिक करें।
  4. जैविक नमूने को सीधे उद्देश्य लेंस के नीचे नमूना धारक पर लोड करें।
  5. सॉफ़्टवेयर पर, वीडियो कैमरा चालू करने के लिए कैमरा आइकन पर क्लिक करें।
  6. 50x ऑब्जेक्टिव लेंस के साथ रुचि के क्षेत्र की पहचान करने के लिए फोकस प्लेन को समायोजित करें। एक्सवाई चरण के प्लेनर अनुवाद को नियंत्रित करने के लिए जॉयस्टिक को स्थानांतरित करें और फोकस की गहराई को बदलने के लिए जॉयस्टिक को घुमाएं।
  7. माप के लिए स्थिति चुनने के बाद, 40 mW उत्तेजना शक्ति के साथ 100x उद्देश्य लेंस पर स्विच करें। वीडियो कैमरा बंद करने के लिए लाल स्टॉप आइकन पर क्लिक करें।
  8. 1800 लाइनों / मिमी के झंझरी का चयन करें, और अधिग्रहण सीमा 400 सेमी -1 से 3,150 सेमी -1 तक सेट करें।
  9. कम से कम शोर और सबसे सटीक स्पेक्ट्रम के लिए अधिग्रहण समय 90 सेकंड, संचय 3 और बिनिंग 4 पर सेट करें।
    नोट: इन इमेजिंग मापदंडों को प्रयोग को फिट करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
  10. रीयल-टाइम प्रदर्शन चालू करने के लिए तीर चिह्न क्लिक करें.
  11. फोकस प्लेन को ठीक करने के लिए रमन शिफ्ट (सेमी -1) को पसंद के मूल्य पर ट्यून करें।
    नोट: इस प्रयोग में, रमन लेजर को लिपिड बूंदों पर केंद्रित किया गया था, जिसमें सीएच2 बॉन्ड की उच्च सांद्रता थी। इसलिए, 2,850 सेमी -1 की रमन शिफ्ट जो सीएच2 बॉन्ड के स्ट्रेचिंग मोड से मेल खाती थी, को इस उद्देश्य के लिए चुना गया था।
  12. सबसे अच्छा सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अनुकूलित करने के लिए जॉयस्टिक के साथ फोकस प्लेन को समायोजित करें।
  13. फोकस प्लेन चुनने के बाद, रियल-टाइम डिस्प्ले के लिए रेड स्टॉप आइकन पर क्लिक करें।
  14. स्पेक्ट्रम अधिग्रहण शुरू करने के लिए सर्कल आइकन का चयन करें।
  15. एक बार सेलुलर क्षेत्र लेने के बाद, पीबीएस के साथ पृष्ठभूमि को मापने के लिए एक ही फोकस प्लेन का उपयोग करें। एक अलग कंप्यूटर सॉफ़्टवेयर एप्लिकेशन का उपयोग करके प्रत्येक उपकोशिकीय लक्ष्य स्पेक्ट्रम से पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम घटाएं, जैसे कि उत्पत्ति (चित्रा 1 बी)।

4. 2पीईएफ और एसआरएस के साथ इमेजिंग प्रयोग।

नोट: एसआरएस लेजर संरेखण का विस्तृत विवरण एक पूर्व रिपोर्ट28 में पाया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल एक मल्टीमॉडल एसआरएस और 2पीईएफ इमेजिंग सिस्टम (चित्रा 2 सी, डी) के संचालन पर केंद्रित है।

  1. लेजर को गर्म करने के लिए स्टार्ट पर क्लिक करें।
  2. नियंत्रण इकाई और मॉनिटर के मुख्य स्विच सेट करने के आदेश का पालन करें: 1) नियंत्रण बॉक्स IX3-CBH के मुख्य स्विच को चालू पर दबाएं, 2) टच पैनल नियंत्रक के मुख्य स्विच को चालू पर दबाएं, 3) मुख्य लेजर कंबाइनर FV31-SCOMB से जुड़े LD OBIS 6 लेजर रिमोट के लिए बिजली की आपूर्ति के एसी एडाप्टर के मुख्य स्विच को दबाएं।, और 4) उप लेजर कंबाइनर FV31-SCOMB से जुड़े LD OBIS 6 लेजर रिमोट के लिए बिजली की आपूर्ति के एसी एडाप्टर के मुख्य स्विच को दबाएं।
  3. एसआई फोटोडायोड डिटेक्टर और लॉक-इन एम्पलीफायर ऑन के मुख्य स्विच दबाएं।
  4. स्टोक्स बीम को 1,031 एनएम, पल्स चौड़ाई 6 पीएस और पुनरावृत्ति दर को 80 मेगाहर्ट्ज पर सेट करें।
  5. माइक्रोस्कोप में युग्मित, सिंक्रनाइज़ पंप बीम के साथ आपूर्ति की गई पिकोएमराल्ड प्रणाली को 720-990 एनएम से एक टेनेबल तरंग दैर्ध्य , 5-6 पीएस की पल्स चौड़ाई और 80 मेगाहर्ट्ज की पुनरावृत्ति दर के साथ सेट करें। पंप और स्टोक्स दोनों की औसत उत्तेजना शक्ति 450 किलोवाट है। नमूने के लिए फोटोडैमेज को कम करने के लिए उत्तेजना शक्ति का अनुकूलन करें।
  6. स्टोक्स और पंप बीम को इकट्ठा करने के लिए एक उच्च-संख्यात्मक एपर्चर (एनए) तेल कंडेनसर (यानी, 1.4 एनए) का उपयोग करें जहां कंडेनसर पर कुछ बूंदों का उत्सर्जन करके नमूना लगाया जाता है।
  7. तेल पर नमूना माउंट करें और माइक्रोस्कोप स्लाइड के शीर्ष पर एक बड़ी पानी की बूंद रखें जहां नमूना तय किया गया है। यह जल-विसर्जन उद्देश्य लेंस के लिए है।
  8. लॉक-इन एम्पलीफायर को 20 मेगाहर्ट्ज पर सेट करें। सुपर-रिज़ॉल्यूशन सॉफ़्टवेयर मॉड्यूल का उपयोग करके छवि को अब संसाधित करें।
  9. रहने के समय के लिए 512 पिक्सेल x 512 पिक्सेल और 80 μs/pixel का चयन करें।
  10. एक बार वांछित सेलुलर क्षेत्र ठीक से केंद्रित हो जाने के बाद, छवि प्राप्त करें। माइक्रोस्कोप के अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, छवियों को Olympus .oir ग्राफिक फ़ाइल के रूप में सहेजें।
  11. 1,900 सेमी -1 पर एक पृष्ठभूमि छवि प्राप्त करें और इसे सभी सेलुलर छवियों से घटाएं।
  12. 2पीईएफ इमेजिंग करने के लिए, एक ही असमर्थ पिकोसेकंड लेजर का उपयोग करें, और फ्लेविन और एनएडीएच के लेबल-मुक्त ऑटोफ्लोरेसेंस को क्रमशः 800 एनएम और 780 एनएम पर सेट करें।
  13. फ्लेविन और एनएडीएच ऑटोफ्लोरेसेंस बैकस्प्रेटेड उत्सर्जन को इकट्ठा करने के लिए 460 एनएम / 515 एनएम फिल्टर क्यूब का उपयोग करें।
  14. रहने का समय 8 μs/pixel और पिक्सेल आकार 512 पिक्सेल x 512 पिक्सेल में समायोजित करें। लेजर शटर पावर पैरामीटर को 150 किलोवाट पर सेट करें।
  15. 3 डी छवि पुनर्निर्माण के लिए, उत्तेजित रमन हानि को 2,850 सेमी -1 (797 एनएम) तक ट्यून करें।
  16. एक बार वांछित एकल कोशिकाओं की पहचान हो जाने के बाद, उन कोशिकाओं की शीर्ष और निचली परतों का पता लगाने के लिए शीर्ष फोकस प्लेन से स्कैन करने के लिए लेजर पंजीकृत करें।
    नोट: 3 डी मॉडल उत्पन्न होते हैं और .oir फ़ाइलों के रूप में सहेजे जाते हैं।

5. स्पेक्ट्रा और छवि विश्लेषण

  1. स्पेक्ट्रा विश्लेषण
    1. सभी उपकोशिकीय लक्ष्य स्पेक्ट्रा से पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम को घटाने के लिए उत्पत्ति सॉफ़्टवेयर या अन्य प्रासंगिक अनुप्रयोगों का उपयोग करें।
    2. सॉफ्टवेयर के अंतर्निहित कार्यों के साथ रमन स्पेक्ट्रा को संसाधित करने के लिए MATLAB के गणितीय मॉडलिंग संचालन का उपयोग करें। पायथन का उपयोग स्पेक्ट्रा प्रोसेसिंग के लिए भी किया जा सकता है।
      1. स्पेक्ट्रल प्री-प्रोसेसिंग फ़ाइलों को एक सरणी में परिवर्तित करने के साथ शुरू होता है। स्पेक्ट्रा को हर पारस्परिक सेंटीमीटर पर इंटरपोलेट किया जाता है।
      2. सत्यापन के लिए, कच्चे डेटा को ग्राफ़ करें। MATLAB में अंतर्निहित फ़ंक्शन msbackadj का उपयोग करके कच्चे स्पेक्ट्रा पर आधारभूत सुधार करें। संक्षेप में, अंतर्निहित फ़ंक्शन उपयोगकर्ताओं द्वारा पहचाने गए पृथक्करण-इकाई मूल्यों पर बेसलाइन बिंदुओं का अनुमान लगाता है और आसन्न खिड़कियों के बीच की दूरी लौटाता है। बेसलाइन बिंदुओं से, अनुमान लगाएं और एक प्रतिगमन रेखा खींचें। प्रत्येक व्यक्तिगत कच्चे स्पेक्ट्रम से बेसलाइन को घटाने के लिए प्रतिगमन रेखा को चिकना करने के लिए स्मूथिंग लागू करें।
      3. प्रोटीन की रमन तीव्रता को 2,930 सेमी-1 पर प्रत्येक रमन शिफ्ट की तीव्रता से विभाजित करके न्यूनतम-अधिकतम सामान्यीकरण करें। रमन स्पेक्ट्रम पर 2,930 सेमी-1 सिग्नल आमतौर पर सबसे अधिक तीव्रता वाला होता है। इस सामान्यीकरण के साथ, अधिकतम मान 1 में बदल जाता है जबकि न्यूनतम मान 0 में बदल जाता है। हर दूसरा मान 0 और 1 के बीच दशमलव में बदल जाता है।
      4. शोर को कम करने के लिए एक ही स्थिति के व्यक्तिगत स्पेक्ट्रा को एक स्पेक्ट्रम में औसत करें।
    3. एक बार संसाधित होने के बाद, सभी स्पेक्ट्रा को एक साथ प्रदर्शित करने के लिए ओरिजिन जैसे अनुप्रयोगों का उपयोग करें। स्पेक्ट्रा में प्रदर्शित चोटियां एक विशिष्ट रासायनिक बंधन या कार्यात्मक समूह का प्रतिनिधित्व करती हैं।
  2. लिपिड बूंदों का 3 डी छवि विश्लेषण
    1. सभी 3 डी छवियों को संसाधित करने के लिए फिजी-इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करें
    2. 3 डी छवि स्टैक के लिए बैंडपास फिल्टर और स्मूथिंग फ़ंक्शन निष्पादित करें।
    3. 3 डी छवि विश्लेषण के लिए, प्रत्येक लिपिड बूंद को एक गोलाकार स्कोर में असाइन करें जो सतह पर द्रव्यमान के केंद्र के बीच की दूरी को मापकर गणना की जाती है। प्रत्येक गोलाकार स्कोर की तुलना एक ही यूक्लिडियन योजना पर एक पूर्ण गोले के गोलाकार स्कोर के साथ करें। कम गोलाकार स्कोर वाले लिपिड बूंदों को छोड़ दें और उनकी मात्रा और गणना के लिए शेष लिपिड बूंदों का मूल्यांकन करें।
    4. एक उपयुक्त सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर एप्लिकेशन पर सांख्यिकीय महत्व के लिए विभिन्न उपचारों के बीच लिपिड बूंदों की मात्रा और गणना का विश्लेषण करें। यहां, ग्राफपैड प्रिज्म का उपयोग किया गया था।
  3. 2 डी हाइपरस्पेक्ट्रल छवि विश्लेषण
    1. सभी 2 डी हाइपरस्पेक्ट्रल छवियों को संसाधित करने के लिए फिजी-इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    2. मास्क छवि बनाने के लिए 2,930 सेमी -1 चैनल का चयन करें जिसमें 0 और 1 मान हैं। पृष्ठभूमि को 0 और सेलुलर क्षेत्र को 1 को असाइन करें।
    3. फ्लोरोसेंट प्रभाव को हटाने के लिए ड्यूटेरियम-लेबल प्रोटीन चैनल (2,175 सेमी -1) को पृष्ठभूमि चैनल (1,900 सेमी -1) में घटाएं।
    4. प्रोटीन टर्नओवर दर अनुपातमीट्रिक छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रोटीन चैनल (2,930 सेमी -1) द्वारा परिणामी ड्यूटेरियम-लेबल प्रोटीन चैनल को विभाजित करें।
    5. फिर, किसी भी शेष पृष्ठभूमि शोर को हटाने के लिए अनुपातमीट्रिक छवियों द्वारा चरण 5.3.2 में बनाई गई मुखौटा छवि को गुणा करें। नतीजतन, प्रत्येक अनुपातमीट्रिक छवि में एक अंधेरा पृष्ठभूमि उत्पन्न होती है।
    6. एकल कक्षों पर प्रदर्शित पिक्सेल तीव्रता को मैन्युअल रूप से विभाजित करने और गणना करने के लिए FIJI-ImageJ में फ्रीहैंड चयन उपकरण का उपयोग करें। पिक्सेल तीव्रता रासायनिक बंधन की सांद्रता के अनुरूप है जिसे देखा जा रहा है।
    7. एक उपयुक्त सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग पर सांख्यिकीय महत्व के लिए पिक्सेल तीव्रता का विश्लेषण करें। यहां, ग्राफपैड प्रिज्म का उपयोग किया गया था। शेष अनुपातमीट्रिक विश्लेषण के साथ इस विश्लेषण को दोहराएं।

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Representative Results

50% डी 2 ओ युक्त सेल कल्चर मीडिया में 15 गुना सांद्रता पर अतिरिक्त एएए के अलावा हेला कोशिकाओं में नए संश्लेषित लिपिड और प्रोटीन के अलग-अलग सी-डी रमन बैंड का उत्पादन किया गया (चित्रा 2 बी)। पिछले प्रयोगों को विभिन्न एकाग्रता स्तरों के साथ किया गया था, जैसे कि 2x और 5x, और हालांकि डेटा प्रस्तुत नहीं किया गया है, 15x एकाग्रता ने नए संश्लेषित लिपिड और प्रोटीन के सबसे अलग C-D रमन बैंड का उत्पादन किया। विशेष रूप से, लिपिड बूंदों (एलडी) की जांच करके, हमने देखा कि 15x Phe और 15x Tryp दोनों ने क्रमशः 2,143 सेमी -1 और 2,172 सेमी -1 पर नए संश्लेषित लिपिड और प्रोटीन संकेतों को प्रेरित किया। डीओ-एसआरएस का उपयोग बाद में एकल कोशिकाओं पर सी-डी संकेतों के स्थानिक वितरण की कल्पना करने के लिए किया गया था (चित्रा 3)। इमेजजे का उपयोग करते हुए, अलग-अलग कोशिकाओं की पिक्सेल तीव्रता को मैन्युअल रूप से खंडित और गणना की गई थी, जैसा कि चित्रा 3 ए में डॉटेड-व्हाइट सीमाओं द्वारा इंगित किया गया है। नियंत्रण कोशिकाएं मध्यम सी-डी लिपिड और प्रोटीन बैंड प्रदर्शित करती हैं; हालांकि, 15x PHE और 15x Tryp मजबूत C-D लिपिड और प्रोटीन बैंड प्रदर्शित करते हैं। मात्रात्मक विश्लेषण इंगित करता है कि अतिरिक्त एएए लिपिड संश्लेषण को 10% -17% तक बढ़ा सकते हैं लेकिन प्रोटीन संश्लेषण को 10% तक कम कर सकते हैं (चित्रा 3 सी, डी)। परिणाम ऑटोफैगी की कमी की संभावना का अनुमान लगाते हैं जो नए संश्लेषित लिपिड जमा करता है, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन को बढ़ावा देता है, और अतिरिक्त एएए विनियमन7 के तहत ऑक्सीडेटिव असंतुलन को प्रेरित करता है।

कैंसर चयापचय पर एएए के प्रभावों को समझने के लिए असंतृप्त लिपिड (~ 3,011 सेमी -1), संतृप्त लिपिड (~ 2,880 सेमी -1), और एनएडीएच, फ्लेविन के लेबल-फ्री मल्टीमॉडल एसआरएस और 2पीईएफ इमेजिंग का अधिग्रहण किया गया था। इसी तरह, अलग-अलग कोशिकाओं की पिक्सेल तीव्रता को मैन्युअल रूप से विभाजित किया गया था और इमेजजे का उपयोग करके गणना की गई थी, जैसा कि चित्रा 3 बी में डॉटेड-व्हाइट सीमाओं द्वारा इंगित किया गया है। ए-उपचारित कोशिकाओं का अनुपातमेट्रिक विश्लेषण असंतृप्त लिपिड / संतृप्त लिपिड में 10% की वृद्धि और फ्लेविन / फ्लेविन + एनएडीएच में 50% की वृद्धि प्रदर्शित करता है (चित्रा 3 ई, एफ)। माइटोकॉन्ड्रिया की इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में, आरओएस को एनएडीएच और एफएडीएच2 से आणविक ऑक्सीजन प्रजातियों में इलेक्ट्रॉनों के हस्तांतरण से उत्पन्न किया जा सकता है। कई कैंसर कोशिकाओं में आरओएस के संचय के परिणामस्वरूप एक ऑक्सीडेटिव असंतुलन होता है जो असंतृप्त फैटी एसिड को ऑक्सीकरण करता है, संतृप्त फैटी एसिड संश्लेषण को बढ़ावा देता है, और एनएडीएच ऑटोफ्लोरेसेंस संकेतों को कम करता है। इसलिए, फ्लेविन / फ्लेविन + एनएडीएच में देखी गई वृद्धि संचित आरओएस का एक संकेतक है जो एनएडीएच ऑटोफ्लोरेसेंस संकेतों को कम करती है। ऑक्सीडेटिव असंतुलन के जवाब में, हेला कोशिकाएं ऑक्सीकृत लोगों को बदलने के लिए अपने असंतृप्त लिपिड संश्लेषण को बढ़ा सकती हैं। यह प्रतिक्रिया अन्य कैंसर सेल लाइनों29 में नहीं देखी जाती है, जो अतिरिक्त एएए आहार30 के तहत कैंसर कोशिकाओं की चयापचय विषमता को दर्शाती है।

मल्टीमॉडल इमेजिंग के अलावा, एसआरएस नियंत्रण में एलडी और एएए-उपचारित हेला कोशिकाओं की लेबल-मुक्त 3 डी छवियों का पुनर्निर्माण कर सकता है। संक्षेप में, माइक्रोस्कोपी रुचि के एक चयनित क्षेत्र में क्रॉस-अनुभागीय छवियों का एक सेट उत्पन्न करता है। इस अध्ययन में, उत्तेजित रमन हानि (एसआरएल) को 2,845 सेमी -1 तक ट्यून किया गया था और 1 μm (चित्रा 4 ए) के चरण आकार के साथ शीर्ष परत से नीचे की परत तक स्कैन किया गया था। 3 डी लिपिड बूंदों के मात्रात्मक विश्लेषण से पता चलता है कि एलडी आकार में कम हो गए लेकिन नियंत्रण की तुलना में एएए-उपचारित कोशिकाओं में गिनती में वृद्धि हुई (चित्रा 4 बी, सी)। भारी हाइड्रोफोबिक अमीनो एसिड की बढ़ती उपस्थिति, जैसे कि ट्राइप और पीएचई एलडी-कोटिंग प्रोटीन के कार्य को खराब कर सकती है। यह अंततः लिपोलिसिस को कम करता है, जो कई छोटे एलडी जमा करता है। इस अध्ययन के लेबल-मुक्त 3 डी एसआरएस वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग परिणाम पिछले अध्ययनों के साथ पुष्टि करते हैं कि अतिरिक्त एएए-उपचारित कोशिकाएं कई छोटे एलडी31,32 प्रदर्शित करती हैं।

Figure 1
चित्र 1: डीओ-एसआरएस और 2पीईएफ के साथ छवि अधिग्रहण और विश्लेषण का एक चित्रण। (ए) लिपिड बूंद संख्या, मात्रा और गोलाकार स्कोर प्राप्त करने के लिए एक 3 डी छवि पुनर्निर्माण और विश्लेषण। (बी) हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग और ड्यूटेरियम-लेबल लिपिड (सीडीएल; 2,145 सेमी -1), लिपिड (2,845 सेमी -1), ड्यूटेरियम-लेबल प्रोटीन (सीडीपी; 2,175 सेमी -1), प्रोटीन (2,940 सेमी -1), असंतृप्त लिपिड (3,011 सेमी -1), संतृप्त लिपिड (2,880 सेमी -1), एनएडीएच, और फ्लेविन का विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सहज रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का भौतिक सेटअप और उत्तेजित रमन प्रकीर्णन माइक्रोस्कोपी। (ए) इस अध्ययन के लिए उपयोग किया जाने वाला सहज रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी सेटअप। (बी) सीडी लेबल (लाल), सीडी लेबल (काला), नियंत्रण समूह (नीली, ठोस रेखा), 15 x पीएचई-उपचारित समूह (लाल, बिंदीदार रेखा), और 15 x ट्रिप-उपचारित समूह (गुलाबी, बिंदीदार रेखा) के लिए नमूना सहज रमन स्पेक्ट्रा। (सी) इस जांच के लिए उपयोग किए जाने वाले उत्तेजित रमन प्रकीर्णन माइक्रोस्कोपी सेटअप का योजनाबद्ध आरेख। (डी) प्रेरित रमन प्रकीर्णन माइक्रोस्कोपी सेटअप का उपयोग डीओ-एसआरएस और 2पीईएफ प्लेटफॉर्म के रूप में किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: डीओ-एसआरएस और 2पीईएफ माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके हेला कोशिकाओं में चयापचय गतिशीलता की कल्पना करना। (ए) ड्यूटेरियम-लेबल लिपिड (2,145 सेमी -1), लिपिड (2,845 सेमी -1), ड्यूटेरियम-लेबल प्रोटीन (2,175 सेमी -1), प्रोटीन (2,940 सेमी -1) नियंत्रण में हेला कोशिकाओं में देखा गया (सीटीआरएल), 15 एक्स फेनिलएलनिन (15 एक्स पीएचई), और 15 एक्स ट्रिप्टोफैन (15 एक्स ट्रिप) डीओ-एसआरएस प्लेटफॉर्म के साथ। लिपिड टर्नओवर दर और प्रोटीन टर्नओवर दर की गणना की Equation 1 गई थीEquation 2। कच्चे चित्रों को पहले पीबीएस सिग्नल द्वारा पृष्ठभूमि की तीव्रता को हटाने के लिए घटाया गया था और इमेजजे का उपयोग करके कोशिकाओं के बाहर तीव्रता को हटाने के लिए मुखौटा लगाया गया था। अनुपातमीट्रिक विश्लेषण के लिए पिक्सेल-वार विभाजन किया गया था। (बी) एनएडीएच और फ्लेविन चैनलों को 2पीईएफ माइक्रोस्कोपी के साथ देखा गया, और असंतृप्त लिपिड (3,011 सेमी -1) और संतृप्त लिपिड (2,880 सेमी -1) को लेबल-मुक्त एसआरएस माइक्रोस्कोपी के साथ देखा गया। ऑप्टिकल रेडॉक्स अनुपात और संतृप्ति अनुपात की गणना किसके साथ Equation 3 की गई थीEquation 4? (C-F) नियंत्रण में प्रत्येक हेला सेल के लिए अनुपातमीट्रिक तीव्रता का परिमाणीकरण, 15x Phe, और 15x Tryp स्थितियां। नियंत्रण स्थितियों के साथ अतिरिक्त एएए स्थितियों की तुलना करने के लिए सांख्यिकीय अंतर का उपयोग किया गया था। पी < 0.0001, ***पी < 0.001, **पी < 0.01, * पी < 0.05 की गणना दो-तरफा एनोवा परीक्षण से की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: लेबल-मुक्त एसआरएस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एकल हेला सेल के 3 डी लिपिड बूंद वितरण का विज़ुअलाइज़ेशन । (ए) नियंत्रण और अतिरिक्त एएए स्थितियों में हेला कोशिकाओं में एसआरएस 3 डी लिपिड ड्रॉपलेट वॉल्यूम प्रोजेक्शन। विश्लेषण से पहले दहलीज को परिभाषित किया गया था, जिससे लिपिड ड्रॉपलेट सिग्नल वितरण का पता चलता है। (बी, सी) दो-तरफा एनोवा परीक्षण का उपयोग करके नियंत्रण समूह और अतिरिक्त एएए स्थितियों के तहत व्यक्तिगत हेला कोशिकाओं के भीतर लिपिड बूंद की मात्रा और गणना का परिमाणीकरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

ड्रोसोफिला और मानव ऊतक 21,22,23,24,26,27,33 सहित विभिन्न पूर्व विवो मॉडल में चयापचय गतिशीलता की जांच करने के लिए डीओ-एसआरएस और 2पीईएफ इमेजिंग लागू की गई है। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली इमेजिंग पद्धति डीओ-एसआरएस और 2पीईएफ माइक्रोस्कोपी को एकीकृत करती है, जो साइटोटोक्सिक अभिकर्मकों के साथ अणु निष्कर्षण या लेबलिंग की आवश्यकता को समाप्त करके अन्य अणु-विशिष्ट इमेजिंग विधियों को पीछे छोड़ सकती है और न्यूनतम नमूना तैयारी की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, डीओ-एसआरएस माइक्रोस्कोपी हमें जानवरों और कोशिकाओं में डे नोवो लिपोजेनेसिस और प्रोटीन संश्लेषण की जांच करने और सीटू23,27,34 में उनकी चयापचय गतिशीलता की कल्पना करने में सक्षम बनाता है। 2पीईएफ जैविक नमूनों35,36 में फ्लेविन और एनएडीएच जैसे स्वाभाविक रूप से पाए जाने वाले बायोमोलेक्यूल्स के ऑटोफ्लोरेसेंस संकेतों को कैप्चर करता है। एसआरएस की इमेजिंग प्रवेश गहराई कम प्रकीर्णन नमूने37 में 200-500 μm तक प्राप्त कर सकती है। यूरिया जैसे ऊतक-समाशोधन विधियों के साथ, प्रवेश की गहराई दस गुनासे अधिक बढ़ सकती है। 2पीईएफ के साथ एसआरएस का युग्मन हमें जैविक नमूनों में फ्लेविन और एनएडीएच जैसे अंतर्जात फ्लोरोफोर की छवि बनाने में सक्षम बनाता है, जो पता लगाने के लिए बहिर्जात बायोमार्कर की आवश्यकता को समाप्त करता है। 2PEF 500 μm38 की प्रवेश गहराई प्राप्त कर सकता है। अन्य मल्टीप्लेक्स इमेजिंग तौर-तरीकों की तुलना में, जैसे कि बहु-रंग एकल-फोटॉन कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, डीओ-एसआरएस और 2पीईएफ दोनों साइटोटोक्सिक बहिर्जात बायोमार्कर के बिना काफी बड़ी प्रवेश गहराई प्राप्त कर सकते हैं।

डीओ-एसआरएस और 2पीईएफ के स्थानिक रिज़ॉल्यूशन को बढ़ाने के लिए, हमने एक अनुकूली क्षण अनुमान (एडम) -आधारित पॉइंटिलिज़्म डीकन्वोल्यूशन (ए-पीओडी) छवि पोस्ट-प्रोसेसिंग टूल34 विकसित किया है। ए-पीओडी किसी भी हार्डवेयर सुधार की आवश्यकता के बिना विवर्तन-सीमित डीओ-एसआरएस और 2पीईएफ छवियों को सुपर-रिज़ॉल्यूशन में परिवर्तित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, रमन स्पेक्ट्रम में कई विशिष्ट रासायनिक कंपन मोड होते हैं जिनका उपयोग पता लगाने योग्य अणुओं की संख्या बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। इस लाभ को लेते हुए, हमारी प्रयोगशाला ने सेल और ऊतक मॉडल36 में कई लिपिड प्रजातियों को अलग करने के लिए एक दंडित संदर्भ मिलान (पीआरएफ) विधि उत्पन्न की है। ये दो तकनीकी विकास सेलुलर और उप-सेलुलर स्तरों पर जैविक प्रक्रियाओं का अधिक विस्तार से अध्ययन करने के लिए नए रास्ते खोलते हैं, जिनका उपयोग मस्तिष्क, कैंसर और उम्र बढ़नेकी प्रक्रियाओं में चयापचय परिवर्तनों को चिह्नित करने के लिए किया गया है।

इस प्रोटोकॉल की एक मुख्य सीमा डी2ओ के साथ सेलुलर नमूनों की एकाग्रता और समय इनक्यूबेशन है ताकि अलग, मात्रात्मक सी-डी रमन बैंड का उत्पादन किया जा सके। अधिक मजबूत, चयापचय रूप से सक्रिय सेल लाइनें, जैसे कि हेला कोशिकाएं, गैर-रोगग्रस्त स्तनधारी सेल लाइनों की तुलना में तेजी से नए संश्लेषित मैक्रोमोलेक्यूल्स में ड्यूटेरियम परमाणुओं को शामिल कर सकती हैं, जैसे कि मानव भ्रूण किडनी (एचईके) कोशिकाएं, जिससे दो अलग-अलग सेल लाइनों21 में डी2ओ के साथ इनक्यूबेशन समान एकाग्रता और समय के लिए विभिन्न सी-डी तीव्रता देखी जाती हैं। इसके अलावा, 48 घंटे के लिए 80% या उससे अधिक की एकाग्रता पर डी2ओ का प्रशासन सेलुलर नमूनों में विषाक्तता का परिचय दे सकता है। वांछनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए इष्टतम डी2ओ एकाग्रता और समय इनक्यूबेशन की पहचान करने के लिए एक अनुकूलन प्रयोग आवश्यक है।

प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू डीओ-एसआरएस और 2पीईएफ इमेजिंग का एकीकरण है। आमतौर पर, डीओ-एसआरएस और 2पीईएफ तौर-तरीके एक ही पिकोसेकंड उत्तेजना लेजर साझा करते हैं, क्योंकि इसकी संकीर्ण बैंडविड्थ को एसआरएस और 2पीईएफ संकेतों के साथ अनुकूलित किया जा सकता है। यद्यपि हमारी प्रौद्योगिकी घर पर निर्मित है, यह मंच व्यावसायिक रूपसे उपलब्ध है। रमन सिग्नल का पता लगाने के लिए अतिरिक्त उपकरण, जैसे कि एक मॉड्यूलेटर के साथ दो सिंक्रनाइज़ लेजर दलहन, फोटोडायोड डिटेक्टर, एक लॉक-इन एम्पलीफायर और एक स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के संयुक्त प्रयासों की आवश्यकता होती है। डी2ओ जैव प्रौद्योगिकी विक्रेताओं से आसानी से खरीदा जा सकता है। इसलिए, शोधकर्ता इस तकनीक को बहुत आसानी से एक्सेस कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या हितों का अन्य टकराव नहीं है।

Acknowledgments

याजुआन ली और एंथनी फंग को उनके तकनीकी समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं, और सेल लाइन के लिए फ्रैली लैब। हम यूसीएसडी, एनआईएच U54CA132378, एनआईएच 5आर01एनएस111039, एनआईएच R21NS125395, NIHU54DK134301, एनआईएचयू 54 HL165443 और हेलमैन फेलो अवार्ड से स्टार्ट-अप फंड को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Serological Pipettes  Avantor (by VWR) 75816-100 https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100
15 mL Conical Centrifuge Tube VWR 89039-664 https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664
16% Formaldehyde, Methanol-free ThermoFisher Scientific 28906 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906
24-well plate Fisherbrand FB0112929 https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929
25 mm Syringe Filter, 2 μm PES Foxx Life Sciences 381-2216-OEM https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003
460 nm Filter Cube Olympus OCT-ET460/50M32
AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote Olympus Supply power to the laser
Band-pass Filter KR Electronics KR2724 8 MHz
BNC 50 Ohm Terminator  Mini Circuits STRM-50
BNC Cable Thorlabs 2249-C Coaxial Cable, BNC Male/Male
Broadband Dielectric Mirror Thorlabs BB1-E03 750 - 1100 nm
Centrifuge
Condenser Olympus
Cover Glass Corning 2850-25 https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25
DC power supply TopWard 6302D
Dichroic Mount Thorlabs KM100CL
Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent mpbio  196055 https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf
Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate MilliporeSigma 38210000 https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder
With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate 
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Corning MT10027CV https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20
FIJI ImageJ ImageJ Version 1.53t 24 August 2022 https://imagej.net/software/fiji/downloads
Heavy Water (Deuterium Oxide) Cambridge Isotope Laboratories, Inc. 7732-18-5 https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L
Hela Cells ATCC CCL-2 https://www.atcc.org/products/ccl-2
Hemocymeter MilliporeSigma Z359629-1EA https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI
zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk
QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr
SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL
w_wcB&gclsrc=aw.ds
High O.D. Bandpass Filter Chroma Technology ET890/220m Filter the Stokes beam and transmit the pump beam
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) Cytiva  SH300880340 https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340
HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution Cytiva SH30042.02 https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445
Integrated SRS Laser System Applied Physics & Electronics, Inc. picoEMERALD picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam.  The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope.
Inverted Laser-scanning Microscope Olympus FV1200MPE
IX3-CBH Control box Olympus Control the laser-scanning microscope
Kinematic Mirror Mount Thorlabs POLARIS-K1-2AH 2 Low-Profile Hex Adjusters
L-Phenalynine Sigma P5482-25G https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482
L-Tryptophan Sigma T8941-25G https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941
LabSpec 6 Horiba XploRA N/A https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/
Lock-In Amplifier Zurich Instruments N/A https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier
Long-pass Dichroic Beam Splitter Semrock Di02-R980-25x36 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter
MATLAB MathWorks Version: R2022b https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-003 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003
Microscopy Imaging Software Olympus FluoView
MPLN 100x, Olympus Olympus MPLAPON https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364
MPLN 50x, Olympus Olympus MPLAPON  https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363
NA Oil Condenser Olympus  6-U130 https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser
Nail Polish Wet n Wild B01EO2G5O4 https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW
HHQP38FXXDC_0
Origin OriginLab Origin 2022b (9.95) https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin
Parafilm Fisher Scientific S37440 https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782
PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) Thermofischer - Gibco 14040117 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117
Penicillin/Streptomycin Thermofischer - Gibco 15140122 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Periscope Assembly Thorlabs RS99 Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork.
picoEmerald System A.P.E N/A https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/
Shielded Box with BNC Connectors Pomona Electronics 2902 Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female
Si Photodiode Detector Home Built N/A DYI series
Silicon Wafer
Spacers Grace Bio-Labs 654008 https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/
Spontaneous Raman spectroscopy Horiba XploRA N/A https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/
Stimulated Raman Scattering Microscopy Home Built N/A
Touch  Panel Controller Olympus Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope
Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl)  Lonza 17-942E https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"
Tweezers Kaverme - Amazon B07RNVXXV1 https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1"
Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy Home Built N/A
Weighing Paper  VWR 12578-165 https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper
Zurich LabOneQ Software Zurich Instruments Control the Zurich lock-in amplifier

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बायोइंजीनियरिंग अंक 195
एरोमैटिक अमीनो एसिड द्वारा विनियमित सेल चयापचय की बायोऑर्थोगोनल रासायनिक इमेजिंग
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Bagheri, P., Hoang, K., Kuo, C. y., Trivedi, H., Jang, H., Shi, L. Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids. J. Vis. Exp. (195), e65121, doi:10.3791/65121 (2023).

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