Summary
Nous présentons un protocole pour visualiser directement les activités métaboliques dans les cellules régulées par les acides aminés à l’aide de la microscopie à diffusion Raman stimulée sondée (DO-SRS) à oxyde de deutérium (eau lourde D2O), intégrée à la microscopie à fluorescence d’excitation à deux photons (2PEF).
Abstract
Les acides aminés aromatiques essentiels (AAA) sont des éléments constitutifs pour synthétiser de nouvelles biomasses dans les cellules et maintenir des fonctions biologiques normales. Par exemple, un approvisionnement abondant en AAA est important pour que les cellules cancéreuses maintiennent leur croissance et leur division rapides. Avec cela, il y a une demande croissante pour une approche d’imagerie hautement spécifique et non invasive avec une préparation minimale des échantillons pour visualiser directement comment les cellules exploitent les AAA pour leur métabolisme in situ. Ici, nous développons une plate-forme d’imagerie optique qui combine le sondage d’oxyde de deutérium (D2O) avec la diffusion Raman stimulée (DO-SRS) et intègre DO-SRS avec fluorescence d’excitation à deux photons (2PEF) dans un seul microscope pour visualiser directement les activités métaboliques des cellules HeLa sous régulation AAA. Collectivement, la plateforme DO-SRS fournit une résolution spatiale et une spécificité élevées des protéines et des lipides nouvellement synthétisés dans des unités cellulaires HeLa uniques. En outre, la modalité 2PEF peut détecter les signaux d’autofluorescence du nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et de la flavine d’une manière sans marqueur. Le système d’imagerie décrit ici est compatible avec les modèles in vitro et in vivo , ce qui est flexible pour diverses expériences. Le flux de travail général de ce protocole comprend la culture cellulaire, la préparation des milieux de culture, la synchronisation cellulaire, la fixation cellulaire et l’imagerie d’échantillons avec les modalités DO-SRS et 2PEF.
Introduction
Étant des acides aminés aromatiques essentiels (AAA), la phénylalanine (Phe) et le tryptophane (Tryp) peuvent être absorbés par le corps humain pour synthétiser de nouvelles molécules pour maintenir des fonctions biologiques normales1. Phe est nécessaire pour la synthèse des protéines, de la mélanine et de la tyrosine, tandis que Tryp est nécessaire pour la synthèse de la mélatonine, de la sérotonine et de la niacine 2,3. Cependant, une consommation excessive de ces AAA peut réguler positivement la cible mammifère de la voie de la rapamycine (mTOR), inhiber la protéine kinase activée par l’AMP et interférer avec le métabolisme mitochondrial, modifiant collectivement la biosynthèse des macromolécules et conduisant à la production de précurseurs malins, tels que les espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules saines 4,5,6. La visualisation directe de la dynamique métabolique altérée sous une régulation excessive des AAA est essentielle pour comprendre les rôles des AAA dans la promotion du développement du cancer et la croissance des cellules saines 7,8,9.
Les études traditionnelles de l’AAA reposent sur la chromatographie en phase gazeuse (CG)10. D’autres méthodes, telles que l’imagerie par résonance magnétique (IRM), ont des résolutions spatiales limitées, ce qui rend difficile l’analyse cellulaire et sous-cellulaire d’échantillons biologiques11. Récemment, la désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) a été développée pour élucider le rôle des AAA dans les synthèses lipidiques et protéiques dans la prolifération du cancer avec des biomarqueurs non invasifs12,13,14. Cependant, cette technique souffre encore de faibles profondeurs d’imagerie, d’une faible résolution spatiale et d’une préparation extensive des échantillons. Au niveau cellulaire, les isotopes stables non toxiques, tels que l’azote 15 et le carbone 13, peuvent être tracés avec l’imagerie multi-isotopique et la spectrométrie de masse d’ions secondaires à l’échelle nanométrique pour comprendre leur incorporation dans les macromolécules. Cependant, ces méthodes sont destructrices pour les échantillons biologiques vivants15,16. La microscopie à force atomique (AFM) est une autre technique puissante qui permet de visualiser la dynamique métabolique17. La vitesse lente de balayage pendant l’imagerie AFM, en revanche, peut provoquer une distorsion de l’image du résultat de la dérive thermique.
Nous avons développé une modalité d’imagerie biorthogonale non invasive en couplant la microscopie à diffusion Raman stimulée (DO-SRS) à l’oxyde de deutérium (D2O) et la microscopie à fluorescence à excitation à deux photons sans marquage (2PEF). Cette modalité permet d’obtenir une résolution spatiale et une spécificité chimique élevées lors de l’imagerie d’échantillons biologiques 18,19,20,21,22,23,24. Ce protocole introduit les applications de DO-SRS et 2PEF pour examiner la dynamique métabolique des changements de lipides, de protéines et de ratios redox au cours de la progression du cancer. D2Oétant une forme isotopique stable de l’eau, les biomolécules cellulaires peuvent être marquées avec du deutérium (D) en raison de sa compensation rapide avec l’eau corporelle totale dans les cellules, formant des liaisons carbone-deutérium (C-D) par échange enzymatique21. Les liaisons C-D dans les macromolécules nouvellement synthétisées, y compris les lipides, les protéines, l’ADN / ARN et les glucides, peuvent être détectées dans la région silencieuse cellulaire du spectre Raman 20,21,22,25,26,27. Avec deux impulsions laser synchronisées, les liaisons C-D des lipides et des protéines nouvellement synthétisés peuvent être affichées sur des cellules individuelles via l’imagerie hyperspectrale (HSI) sans les extraire ou les marquer avec des agents cytotoxiques. En outre, la microscopie SRS a la capacité de construire des modèles tridimensionnels (3D) de régions d’intérêt sélectionnées dans des échantillons biologiques en capturant et en combinant un ensemble d’images en coupe transversale22,26. Grâce à l’imagerie volumétrique hyperspectrale et 3D, DO-SRS peut obtenir des distributions spatiales de macromolécules nouvellement synthétisées dans des cellules individuelles, ainsi que le type d’organites qui facilitent le processus de promotion de la croissance du cancer en vertu de la réglementation AAA22. De plus, en utilisant 2PEF, nous pouvons obtenir des signaux d’autofluorescence de flavine et de nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) avec une haute résolution, une profondeur de pénétration profonde et des dommages de faible niveau dans des échantillons biologiques21,23,24. Les signaux d’autofluorescence flavine et NADH ont été utilisés pour caractériser l’homéostasie redox et la peroxydation lipidique dans les cellules cancéreuses22,26. En tant que tel, non seulement le couplage de DO-SRS et 2PEF fournit une analyse subcellulaire de la dynamique métabolique régulée par l’AAA dans les cellules cancéreuses avec une distribution spatiale élevée, des informations de spécificité chimique et une préparation minimale des échantillons, mais la méthode réduit également le besoin d’extraire ou de marquer des molécules endogènes avec des réactifs toxiques. Dans ce protocole, nous présentons d’abord les procédures de préparation de D2O et d’acides aminés, ainsi que la culture de cellules cancéreuses. Ensuite, nous montrons les protocoles d’imagerie DO-SRS et d’imagerie 2PEF. Enfin, nous présentons les résultats représentatifs de l’imagerie SRS et 2PEF, qui démontrent des changements métaboliques régulés par l’AAA des lipides et des protéines, et des changements de ratio redox dans les cellules cancéreuses. Une illustration détaillée du processus est mise en évidence à la figure 1.
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Protocol
1. Préparation des médias
- Préparer 10 mL de contrôle et d’AAA en excès dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 50 % deD2O.
- Pour le milieu témoin, mesurer et mélanger 10 mg de poudre de DMEM avec 4,7 mL d’eau bidistillée (ddH2O) dans un tube conique de 15 mL. La poudre DMEM contient tous les acides aminés à des concentrations standard. Bien vorter et inverser le tube pour s’assurer que la solution est bien mélangée. Ajouter 4,7 mL deD2O, 0,5 mL de sérum bovin fœtal (FBS à 5 %) et 0,1 mL de pénicilline/streptomycine (1 %). Bien vorter et inverser le tube pour s’assurer que la solution est bien mélangée.
- Pour le milieu de traitement 15x PHE, mesurer et mélanger 10 mg de poudre de DMEM avec 4,7 mL de ddH2O, 0,5 mL de FBS (5%) et 0,1 mL de pénicilline/streptomycine (1%) dans un tube conique de 15 mL. Bien vorter et inverser le tube pour s’assurer que la solution est bien mélangée. Ajouter l’excès de poudre de Phe à une concentration de 924 mg/L dans le milieu. Bien vorter et inverser le tube pour s’assurer que la solution est bien mélangée.
- Pour le milieu de traitement Tryp 15x, mesurer et mélanger 10 mg de poudre DMEM avec 4,7 mL deddH2O, 0,5 mL de FBS (5%) et 0,1 mL de pénicilline/streptomycine (1%) dans un tube conique de 15 mL. Bien vorter et inverser le tube pour s’assurer que la solution est bien mélangée. Ajouter l’excès de poudre de tryp à une concentration de 224 mg/L dans le milieu. Bien vorter et inverser le tube pour s’assurer que la solution est bien mélangée.
- Ajouter de la méthionine et de la thréonine à 30,0 mg/mL et 95,0 mg/mL, respectivement, à tous les tubes coniques des étapes précédentes. Vortex complet et inverser le tube. Il n’est pas nécessaire d’ajouter du pyruvate de sodium au milieu de culture.
- Filtrer le milieu de contrôle et de traitement avec un filtre à seringue de 25 mm avec des filtres à membrane en polyéthersulfone de 0,22 μm.
- Sceller tous les tubes coniques contenus dans le média avec un parafilm et conserver à 4 °C jusqu’à 3 semaines. Avant de traiter les cellules avec des milieux, réchauffer tout le média à 37°C.
NOTA : Les réactifs en poudre et liquides doivent être mesurés et combinés en fonction du volume total du milieu de traitement et de contrôle.
2. Préparation de l’échantillon de cellules
- Maintenir les cellules cancéreuses du col de l’utérus (HeLa) dans un flacon de culture (c.-à-d. T10, T25, etc.) en utilisant du DMEM standard complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone (CO2).
- Sous-culture des cellules HeLa à un rapport fractionné de 1:10 jusqu’à ce qu’elle atteigne 80% ou plus de viabilité cellulaire.
- Une fois que les cellules atteignent une confluence de 80% ou plus, procéder à l’ensemencement de 2 x 10 5 cellules par puits sur une plaque de 24 puits en utilisant du DMEM complété par0,5 % FBS et 1% de pénicilline / streptomycine.
- Avant l’ensemencement cellulaire, préparez une plaque de 24 puits avec des lamelles rondes stérilisées, recouvertes de poly-d-lysine, enrobées de laminine, de 12 mm de diamètre. Plongez les lamelles de couverture dans de l’éthanol à 70 % et séchez-les doucement à l’aide de lingettes non pelucheuses. Placez les lamelles de couverture propres dans les puits appropriés de la plaque.
- Une fois que les cellules atteignent 80% de confluence à l’étape 2.2, lavez les cellules une fois avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans ions magnésium et calcium.
- Ajouter 0,25% de trypsine pour dissocier les cellules adhérentes du ballon et incuber à 37 °C et 5% deCO2 pendant 3 min.
- Ajouter le DMEM complété par 10% FBS et 1% de pénicilline/streptomycine, pipeter doucement de haut en bas et recueillir les cellules par centrifugation à 300 x g à température ambiante (TR) pendant 3 min.
- Resuspendre les cellules dans le DMEM supplémenté avec 0,5% FBS et 1% de pénicilline / streptomycine.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, d’un microscope optique et d’un bleu de trypan, et ensemencer une densité de 2 x 105 cellules par puits d’une plaque de 24 puits. Alternativement, un compteur de cellules automatisé peut être utilisé pour compter les cellules.
- Remettez les cellules dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO2, et agitez doucement la plaque pour répartir les cellules uniformément.
- Après 8 h, remplacer les anciens milieux de culture par 50% D 2 O/milieu Phe en excès ou 50%D2O/milieu tryp en excès. Remettre les cellules dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO2 pendant 36 h.
- Après 36 h, fixez les cellules sur des lames de microscope.
- Avant la fixation, préparez les lames de microscope avec des espaceurs d’imagerie de 9 mm de diamètre et placez 15 μL de 1x PBS complété par des ions calcium et magnésium.
- Rincer les cellules avec 1x PBS complété par des ions calcium et magnésium.
- Ajouter 0,5 mL de solution de paraformaldéhyde (PFA) sans méthanol à 4 % et laisser la plaque sous la hotte de biosécurité pendant environ 15 minutes.
- Aspirer la solution de PFA et rincer deux fois avec 1x PBS supplémenté en ions calcium et magnésium.
- Ajouter 1,5 mL de 1x PBS complété par des ions calcium et magnésium dans chaque puits.
- Utilisez une pince à épiler stérile pour saisir délicatement les lamelles de couvercle de chaque puits. Inverser et placer le côté contenant la cellule des lames de couverture sur les entretoises d’imagerie pour entrer en contact avec le PBS préparé à l’étape 2.5.1. Assurez-vous que le côté non contenant des cellules est exposé à l’air.
- À l’aide de vernis à ongles transparent, scellez la couche externe de la lamelle de couverture avec l’entretoise d’imagerie.
- Conservez les lames de microscope à 4 °C lorsqu’elles ne sont pas en imagerie.
3. Mesure spontanée par spectroscopie Raman (Figure 2)
- Utiliser un microscope Raman confocal pour obtenir des spectres Raman spontanés (Figure 2A).
- Allumez le laser en tournant la clé sur la position ON .
- Double-cliquez sur l’icône du logiciel LabSpec6 pour ouvrir le logiciel d’acquisition.
- Chargez l’échantillon biologique sur le porte-échantillon directement sous la lentille de l’objectif.
- Sur le logiciel, cliquez sur l’icône Caméra pour allumer la caméra vidéo.
- Ajustez le plan de mise au point pour identifier une région d’intérêt avec l’objectif objectif 50x. Déplacez le joystick pour contrôler la translation de la raboteuse de l’étage XY et faites pivoter le joystick pour modifier la profondeur de champ.
- Après avoir choisi la position de mesure, passez à l’objectif 100x avec une puissance d’excitation de 40 mW. Cliquez sur l’icône rouge Arrêter pour éteindre la caméra vidéo.
- Sélectionnez un réseau de 1800 lignes/mm et définissez la plage d’acquisition de 400 cm-1 à 3 150 cm-1.
- Réglez le temps d’acquisition sur 90 s, l’accumulation sur 3 et le binning sur 4 pour le moins de bruit et le spectre le plus précis.
REMARQUE : Ces paramètres d’imagerie peuvent être optimisés pour s’adapter à l’expérience. - Cliquez sur l’icône Flèche pour activer l’affichage en temps réel.
- Réglez le décalage Raman (cm-1) sur une valeur de choix pour affiner le plan de mise au point.
REMARQUE: Dans cette expérience, le laser Raman a été concentré sur les gouttelettes lipidiques, qui contenaient une forte concentration de liaisonsCH2 . Par conséquent, un décalage Raman de 2 850 cm-1 correspondant aux modes d’étirement de la liaison CH2 a été sélectionné à cet effet. - Ajustez le plan de mise au point avec le joystick pour optimiser le meilleur rapport signal/bruit.
- Après avoir choisi le plan de mise au point, cliquez sur l’icône rouge Arrêter pour un affichage en temps réel.
- Sélectionnez l’icône Cercle pour démarrer l’acquisition du spectre.
- Une fois la région cellulaire prise, utilisez le même plan de mise au point pour mesurer l’arrière-plan avec PBS. Soustrayez le spectre de fond de chaque spectre cible subcellulaire à l’aide d’une application logicielle distincte, telle qu’Origin (Figure 1B).
4. Expériences d’imagerie avec 2PEF et SRS
NOTE: Des descriptions détaillées de l’alignement laser SRS peuvent être trouvées dans un rapport antérieur28. Ce protocole se concentre sur le fonctionnement d’un système d’imagerie multimodal SRS et 2PEF (Figure 2C, D).
- Cliquez sur Démarrer pour réchauffer le laser.
- Suivez l’ordre pour régler les interrupteurs principaux de l’unité de commande et du moniteur sur: 1) appuyez sur l’interrupteur principal du boîtier de commande IX3-CBH sur On, 2) appuyez sur l’interrupteur principal du contrôleur de l’écran tactile sur On, 3) appuyez sur l’interrupteur principal de l’adaptateur secteur de l’alimentation pour LD OBIS 6 Laser Remote connecté au combinateur laser principal FV31-SCOMB sur On, et 4) appuyez sur l’interrupteur principal de l’adaptateur secteur de l’alimentation pour LD OBIS 6 Laser Remote connecté au combinateur laser FV31-SCOMB sur On.
- Appuyez sur les interrupteurs principaux du détecteur de photodiodes Si et de l’amplificateur de verrouillage On.
- Réglez le faisceau Stokes à 1 031 nm, la largeur d’impulsion à 6 ps et le taux de répétition à 80 MHz.
- Couplé au microscope, réglez le système picoEmerald fourni avec le faisceau de pompe synchronisé avec une longueur d’onde accordable de 720 à 990 nm, une largeur d’impulsion de 5 à 6 ps et un taux de répétition de 80 MHz. La puissance d’excitation moyenne de la pompe et de Stokes est de 450 mW. Optimisez la puissance d’excitation pour minimiser les photodommages pour l’échantillon.
- Utilisez un condenseur d’huile à grande ouverture numérique (NA) (c.-à-d. 1,4 NA) pour recueillir les faisceaux de Stokes et de pompe où l’échantillon est monté en émettant quelques gouttes sur le condenseur.
- Montez l’échantillon sur l’huile et placez une grosse gouttelette d’eau sur la lame du microscope où l’échantillon est fixé. Ceci est pour la lentille objectif d’immersion dans l’eau.
- Réglez l’amplificateur de verrouillage sur 20 MHz. Traitez l’image maintenant à l’aide du module logiciel super-résolution.
- Sélectionnez 512 pixels x 512 pixels et 80 μs/pixel pour le temps d’arrêt.
- Une fois que la région cellulaire souhaitée est correctement focalisée, acquérir l’image. À l’aide du logiciel d’acquisition du microscope, enregistrez les images en tant que fichier graphique .oir Olympus.
- Acquérir une image d’arrière-plan à 1 900 cm-1 et la soustraire de toutes les images cellulaires.
- Pour effectuer une imagerie 2PEF, utilisez le même laser picoseconde accordable et réglez l’autofluorescence sans marquage de Flavin et de NADH sur 800 nm et 780 nm, respectivement.
- Utilisez un cube filtrant de 460 nm/515 nm pour recueillir l’émission rétrodiffusée par autofluorescence de Flavine et de NADH.
- Ajustez le temps de séjour à 8 μs/pixel et la taille des pixels à 512 pixels x 512 pixels. Réglez le paramètre de puissance de l’obturateur laser sur 150 mW.
- Pour la reconstruction d’images 3D, réglez la perte Raman stimulée à 2 850 cm-1 (797 nm).
- Une fois que les cellules individuelles souhaitées ont été identifiées, enregistrez le laser pour balayer à partir du plan de mise au point supérieur afin de détecter les couches supérieure et inférieure de ces cellules.
Remarque : Les modèles 3D sont générés et enregistrés en tant que fichiers .oir.
5. Analyse des spectres et des images
- Analyse spectrale
- Utilisez le logiciel Origin ou d’autres applications pertinentes pour soustraire le spectre de fond de tous les spectres cibles subcellulaires.
- Utilisez les opérations de modélisation mathématique de MATLAB pour traiter les spectres Raman avec les fonctions intégrées du logiciel. Python peut également être utilisé pour le traitement des spectres.
- Le prétraitement spectral commence par la conversion des fichiers en tableau. Les spectres sont interpolés à chaque centimètre réciproque.
- Pour la validation, représentez graphiquement les données brutes. Effectuez la correction de ligne de base sur les spectres bruts à l’aide de la fonction intégrée msbackadj dans MATLAB. En bref, la fonction intégrée estime les points de référence aux valeurs d’unité de séparation identifiées par les utilisateurs et renvoie la distance entre les fenêtres adjacentes. À partir des points de référence, estimez et tracez une droite de régression. Appliquez le lissage pour lisser la droite de régression afin de soustraire la ligne de base de chaque spectre brut individuel.
- Effectuer une normalisation min-max en divisant l’intensité Raman de la protéine à 2 930 cm-1 par l’intensité de chaque décalage Raman. Le signal de 2 930 cm-1 est généralement l’intensité la plus élevée du spectre Raman. Avec cette normalisation, la valeur maximale est transformée en 1 tandis que la valeur minimale est transformée en 0. Toutes les autres valeurs sont transformées en une décimale entre 0 et 1.
- Faire la moyenne des spectres individuels de la même condition en un seul spectre pour réduire le bruit.
- Une fois traité, utilisez des applications, telles que Origin, pour afficher tous les spectres simultanément. Les pics affichés dans les spectres représentent une liaison chimique ou un groupe fonctionnel spécifique.
- Analyse d’images 3D de gouttelettes lipidiques
- Utilisez le logiciel FIJI-ImageJ pour traiter toutes les images 3D
- Exécutez les fonctions Bandpass Filters et Smoothing pour les piles d’images 3D.
- Pour l’analyse d’images 3D, attribuez chaque gouttelette lipidique à un score sphérique calculé en mesurant la distance entre son centre de masse et la surface. Comparez chaque score sphérique avec un score sphérique d’une sphère parfaite sur le même plan euclidien. Jetez les gouttelettes lipidiques avec de faibles scores sphériques et évaluez les gouttelettes lipidiques restantes pour leur volume et leur nombre.
- Analyser le volume et le nombre de gouttelettes lipidiques entre différents traitements pour la signification statistique sur une application logicielle statistique appropriée. Ici, GraphPad Prism a été utilisé.
- Analyse d’images hyperspectrales 2D
- Utilisez le logiciel FIJI-ImageJ pour traiter toutes les images hyperspectrales 2D.
- Sélectionnez la couche 2 930 cm-1 pour créer une image de masque contenant les valeurs 0 et 1. Affectez l’arrière-plan à 0 et la région cellulaire à 1.
- Soustrayez le canal protéique marqué au deutérium (2 175 cm-1) au canal de fond (1 900 cm-1) pour éliminer les effets fluorescents.
- Divisez le canal protéique marqué au deutérium résultant par le canal protéique (2 930 cm-1) pour obtenir des images ratiométriques du taux de renouvellement des protéines.
- Ensuite, multipliez l’image de masque réalisée à l’étape 5.3.2 par les images ratiométriques pour supprimer les bruits de fond restants. Par conséquent, un arrière-plan sombre est généré dans chaque image ratiométrique.
- Utilisez l’outil Sélection à main levée de FIJI-ImageJ pour segmenter et calculer manuellement l’intensité des pixels affichée sur des cellules individuelles. Les intensités de pixels correspondent aux concentrations de la liaison chimique visualisée.
- Analysez les intensités de pixels pour la signification statistique sur une application logicielle statistique appropriée. Ici, GraphPad Prism a été utilisé. Répétez cette analyse avec l’analyse ratiométrique restante.
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Representative Results
L’ajout d’un excès d’AAA à des concentrations de 15x dans les milieux de culture cellulaire contenant 50 % de D2O a produit des bandes Raman C-D distinctes de lipides et de protéines nouvellement synthétisés dans les cellules HeLa (Figure 2B). Des expériences antérieures ont été réalisées avec différents niveaux de concentration, tels que 2x et 5x, et bien que les données ne soient pas présentées, la concentration 15x a produit les bandes Raman C-D les plus distinctes de lipides et de protéines nouvellement synthétisés. Plus précisément, en étudiant les gouttelettes lipidiques (LD), nous avons remarqué que 15x Phe et 15x Tryp induisaient des signaux lipidiques et protéiques nouvellement synthétisés à 2 143 cm-1 et 2 172 cm-1, respectivement. DO-SRS a ensuite été utilisé pour visualiser la distribution spatiale des signaux C-D sur des cellules individuelles (Figure 3). À l’aide d’ImageJ, les intensités en pixels des cellules individuelles ont été segmentées et calculées manuellement, comme l’indiquent les bordures blanches en pointillés de la figure 3A. Les cellules témoins présentent des bandes lipidiques et protéiques C-D modérées; cependant, les bandes lipidiques et protéiques 15x Phe et 15x Tryp présentent des bandes lipidiques et protéiques C-D plus fortes. L’analyse quantitative indique que l’excès d’AAA peut réguler à la hausse la synthèse des lipides de 10% à 17%, mais réguler à la baisse la synthèse des protéines de 10% (Figure 3C, D). Les résultats en déduisent la possibilité d’un manque d’autophagie qui accumule les lipides nouvellement synthétisés, favorise le dysfonctionnement mitochondrial et induit un déséquilibre oxydatif sous l’excès de régulation AAA7.
L’imagerie multimodale sans marquage SRS et 2PEF de lipides insaturés (~ 3 011 cm-1), de lipides saturés (~ 2 880 cm-1) et de NADH, Flavine ont été acquises pour comprendre les effets des AAA sur le métabolisme du cancer. De même, les intensités en pixels des cellules individuelles ont été segmentées manuellement et calculées à l’aide d’ImageJ, comme l’indiquent les bordures blanches en pointillés de la figure 3B. L’analyse ratiométrique des cellules traitées AAA montre une augmentation de 10% des lipides insaturés / lipides saturés et une augmentation de 50% des flavines / flavine + NADH (Figure 3E, F). Dans la chaîne de transport d’électrons des mitochondries, les ROS peuvent être générés à partir du transfert d’électrons du NADH et du FADH2 aux espèces moléculaires de l’oxygène. L’accumulation de ROS dans de nombreuses cellules cancéreuses entraîne un déséquilibre oxydatif qui oxyde les acides gras insaturés, favorise la synthèse des acides gras saturés et épuise les signaux d’autofluorescence du NADH. Par conséquent, l’augmentation observée de Flavine/Flavine + NADH est un indicateur de ROS accumulé qui réduit les signaux d’autofluorescence du NADH. En réponse à un déséquilibre oxydatif, les cellules HeLa peuvent réguler à la hausse leur synthèse lipidique insaturée pour remplacer les cellules oxydées. Cette réponse n’est pas observée dans d’autres lignées cellulaires cancéreuses29, ce qui signifie l’hétérogénéité métabolique des cellules cancéreuses sous un régime AAA en excès30.
En plus de l’imagerie multimodale, SRS peut reconstruire des images 3D sans marquage de LD dans des cellules HeLa contrôlées et traitées par AAA. En bref, la microscopie génère un ensemble d’images en coupe transversale dans une région d’intérêt sélectionnée. Dans cette étude, la perte Raman stimulée (SRL) a été réglée à 2 845 cm-1 et balayée de la couche supérieure à la couche inférieure avec une taille de pas de 1 μm (Figure 4A). Les analyses quantitatives des gouttelettes lipidiques 3D révèlent que les LD ont diminué en taille mais ont augmenté dans le nombre de cellules traitées AAA par rapport au témoin (Figure 4B,C). La présence accrue d’acides aminés hydrophobes volumineux, tels que le tryp et le phe, peut altérer la fonction des protéines d’enrobage LD. Cela réduit finalement la lipolyse, qui accumule de nombreuses petites LD. Les résultats d’imagerie volumétrique 3D SRS sans marquage de cette étude corroborent les études précédentes en visualisant que les cellules traitées par AAA en excès présentent de nombreuses LD plus petites31,32.
Figure 1 : Illustration de l’acquisition et de l’analyse d’images avec DO-SRS et 2PEF. (A) Une reconstruction et une analyse d’images 3D pour acquérir le nombre de gouttelettes lipidiques, le volume et le score sphérique. (B) Imagerie hyperspectrale et analyse des lipides marqués au deutérium (CDL; 2 145 cm-1), lipidiques (2 845 cm-1), protéines marquées au deutérium (CDP; 2 175 cm-1), protéines (2 940 cm-1), lipides insaturés (3 011 cm-1), lipides saturés (2 880 cm-1), NADH et flavine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Configuration physique de la spectroscopie Raman spontanée et de la microscopie à diffusion Raman stimulée. (A) Configuration de spectroscopie Raman spontanée utilisée pour cette étude. (B) Exemple de spectres Raman spontanés pour l’étiquette CD (rouge), sans étiquette CD (noir), le groupe témoin (bleu, ligne continue), 15x le groupe traité au phe (rouge, ligne pointillée) et le groupe 15x traité au tryp (rose, ligne pointillée). (C) Schéma de principe de la microscopie à diffusion Raman stimulée utilisée pour cette étude. (D) Configuration de microscopie à diffusion Raman stimulée utilisée comme plate-forme DO-SRS et 2PEF. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Visualisation de la dynamique métabolique dans les cellules HeLa à l’aide de la microscopie DO-SRS et 2PEF. (A) Lipide marqué au deutérium (2 145 cm-1), lipide (2 845 cm-1), protéine marquée au deutérium (2 175 cm-1), protéine (2 940 cm-1) visualisée dans les cellules HeLa sous contrôle (Ctrl), 15x phénylalanine (15x Phe) et 15x tryptophane (15x Tryp) avec la plateforme DO-SRS. Le taux de renouvellement des lipides et le taux de renouvellement des protéines ont été calculés comme 
et 
. Les images brutes ont d’abord été soustraites par le signal PBS pour supprimer l’intensité de l’arrière-plan et masquées pour supprimer l’intensité à l’extérieur des cellules à l’aide d’ImageJ. La division au pixel près a été effectuée pour l’analyse ratiométrique. (B) Les canaux NADH et Flavine visualisés par microscopie 2PEF, et lipides insaturés (3 011 cm-1) et lipides saturés (2 880 cm-1) visualisés par microscopie SRS sans marque. Le rapport redox optique et le rapport de saturation ont été calculés avec 
et 
. (C-F) Quantification des intensités ratiométriques pour chaque cellule HeLa sous contrôle, conditions 15x Phe et 15x Tryp. La différence statistique a été utilisée pour comparer les conditions d’excès d’AAA avec les conditions de contrôle. p < 0,0001, ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05 ont été calculés à partir d’un test ANOVA bidirectionnel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Visualisation de la distribution 3D des gouttelettes lipidiques d’une seule cellule HeLa à l’aide d’un microscope SRS sans marque. (A) Projection 3D du volume de gouttelettes lipidiques SRS dans les cellules HeLa dans des conditions contrôlées et en excès AAA. Le seuil a été défini avant l’analyse, révélant la distribution du signal des gouttelettes lipidiques. (B,C) Quantification du volume et du nombre de gouttelettes lipidiques dans les cellules HeLa individuelles sous le groupe témoin et les conditions d’excès AAA à l’aide du test ANOVA bidirectionnel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’imagerie DO-SRS et 2PEF a été appliquée pour étudier la dynamique métabolique dans divers modèles ex vivo, y compris la drosophile et les tissus humains 21,22,23,24,26,27,33. La modalité d’imagerie utilisée dans cette étude intègre la microscopie DO-SRS et 2PEF, qui peut devancer d’autres méthodes d’imagerie spécifiques à la molécule en éliminant le besoin d’extraction ou de marquage des molécules avec des réactifs cytotoxiques et en nécessitant une préparation minimale des échantillons. Plus précisément, la microscopie DO-SRS nous permet de sonder la lipogenèse de novo et la synthèse des protéines chez les animaux et les cellules et de visualiser leur dynamique métabolique in situ23,27,34. 2PEF capture les signaux d’autofluorescence de biomolécules naturelles, telles que la flavine et le NADH, dans des échantillons biologiques35,36. La profondeur de pénétration d’imagerie du SRS peut atteindre jusqu’à 200-500 μm dans des échantillons moins diffusants37. Avec des méthodes de nettoyage des tissus telles que l’urée, la profondeur de pénétration peut être multipliée par plus dedix 37. Le couplage du SRS avec le 2PEF nous permet d’imager des fluorophores endogènes tels que la flavine et le NADH dans des échantillons biologiques, ce qui élimine davantage le besoin de biomarqueurs exogènes pour la détection. 2PEF peut atteindre une profondeur de pénétration de 500 μm38. Par rapport à d’autres modalités d’imagerie multiplexe, telles que la microscopie confocale à fluorescence multicolore monophotonique, DO-SRS et 2PEF peuvent atteindre une profondeur de pénétration significativement plus grande sans biomarqueurs exogènes cytotoxiques.
Pour augmenter la résolution spatiale de DO-SRS et 2PEF, nous avons développé un outil de post-traitement d’image basé sur l’estimation de moment adaptatif (Adam) basé sur la déconvolution du pointillisme (A-PoD)34. A-PoD peut convertir des images DO-SRS et 2PEF limitées en images super-résolues sans nécessiter d’améliorations matérielles. De plus, le spectre Raman contient de nombreux modes de vibration chimique spécifiques qui peuvent être exploités pour augmenter le nombre de molécules détectables. Profitant de cet avantage, notre laboratoire a en outre généré une méthode d’appariement de référence pénalisé (PRF) pour distinguer plusieurs espèces lipidiques dans des modèles cellulaires et tissulaires36. Ces deux développements techniques ouvrent de nouvelles voies pour étudier plus en détail les processus biologiques aux niveaux cellulaire et subcellulaire, qui ont été utilisés pour caractériser les changements métaboliques dans le cerveau, le cancer et les processus de vieillissement26,27,35.
L’une des principales limites de ce protocole est la concentration et le temps d’incubation des échantillons cellulaires avec D2O pour produire des bandes Raman C-D distinctes et quantifiables. Des lignées cellulaires métaboliquement actives plus robustes, telles que les cellules HeLa, peuvent incorporer des atomes de deutérium dans des macromolécules nouvellement synthétisées à un rythme plus rapide que les lignées cellulaires de mammifères non malades, telles que les cellules rénales embryonnaires humaines (HEK), conduisant à diverses intensités C-D observées pour la même concentration et la même période d’incubation avec D2O dans deux lignées cellulaires différentes21. De plus, l’administration deD2Oà une concentration égale ou supérieure à 80 % pendant 48 h peut introduire une toxicité pour les échantillons cellulaires. Une expérience d’optimisation pour identifier la concentration optimale de D2O et le temps d’incubation est nécessaire pour obtenir les résultats souhaités.
Un aspect essentiel du protocole est l’intégration de l’imagerie DO-SRS et 2PEF. En règle générale, les modalités DO-SRS et 2PEF partagent le même laser d’excitation picoseconde, car sa bande passante étroite peut être optimisée avec des signaux SRS et 2PEF. Bien que notre technologie soit construite à la maison, cette plate-forme est disponible dans le commerce39. Des équipements supplémentaires, tels que deux impulsions laser synchronisées avec un modulateur, un détecteur de photodiodes, un amplificateur verrouillé et les efforts conjoints d’un microscope à balayage sont nécessaires pour détecter le signal Raman. D2O peut être facilement acheté auprès de fournisseurs de biotechnologie. Par conséquent, les chercheurs peuvent accéder à cette technologie très facilement.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents ou d’autres conflits d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Yajuan Li et Anthony Fung pour leur soutien technique, et le laboratoire Fraley pour la lignée cellulaire. Nous reconnaissons les fonds de démarrage de UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 et Hellman Fellow Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
| 15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
| 16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
| 24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
| 25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
| 460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
| AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
| Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
| Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | ||
| Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
| DC power supply | TopWard | 6302D | |
| Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
| FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
| Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
| Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
| Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
| High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
| HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
| Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
| L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
| LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
| Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
| Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
| Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
| MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
| MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
| NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
| Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
| Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
| PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
| Penicillin/Streptomycin | Thermofischer - Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
| Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
| Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
| Silicon Wafer | |||
| Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
| Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
| Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
| Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
| Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
| Tweezers | Kaverme - Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
| Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
| Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
| Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
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