Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Optimering af behandlingsteknologi til Tiebangchui med Zanba baseret på CRITIC kombineret med Box-Behnken responsoverflademetode

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65139
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 2, 2
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Denne protokol beskriver en effektiv og standard afgiftningsbehandlingsmetode for Zanba-stir-fried Tiebangchui ved hjælp af CRITIC kombineret med Box-Behnken-responsoverflademetoden.

Abstract

Den tørrede rod af Aconitum pendul Busch., kaldet Tiebangchui (TBC) på kinesisk, er en af de mest berømte tibetanske lægemidler. Det er en meget udbredt urt i det nordvestlige Kina. Imidlertid er der opstået mange tilfælde af forgiftning på grund af TBC's intense toksicitet, og fordi dets terapeutiske og toksiske doser er ens. Derfor er det en presserende opgave at finde en sikker og effektiv metode til at reducere dens toksicitet. En søgning gennem de tibetanske medicinklassikere viser, at behandlingsmetoden for TBC omrørt med Zanba blev registreret i "Behandlingsspecifikation for tibetansk medicin i Qinghai-provinsen (2010)". De specifikke behandlingsparametre er dog endnu ikke klare. Denne undersøgelse sigter således mod at optimere og standardisere behandlingsteknologien for Zanba-omrørt stegt TBC.

For det første blev der udført et enkeltfaktoreksperiment på fire faktorer: skivetykkelsen af TBC, mængden af Zanba, behandlingstemperatur og tid. Med monoester og diester alkaloid indhold i Zanba-stir-fried TBC som indeks, blev CRITIC kombineret med Box-Behnken responsoverflademetoden brugt til at optimere behandlingsteknologien af Zanba-stir-fried TBC. De optimerede forarbejdningsbetingelser for Zanba-omrørt TBC var en TBC-skivetykkelse på 2 cm, tre gange mere Zanba end TBC, en behandlingstemperatur på 125 °C og 60 minutters omrøring. Denne undersøgelse fastslog de optimerede og standardbehandlingsbetingelser for brugen af Zanba-stir-fried TBC, hvilket gav et eksperimentelt grundlag for sikker klinisk brug og industriel produktion af Zanba-stir-fried TBC.

Introduction

Den tørrede rod af Aconitum pendul Busch og A. flavum Hand.-Mazz., en af de mest berømte tibetanske lægemidler, kaldes Tiebangchui (TBC) på kinesisk 1,2. De tørrede rødder af TBC er nyttige til at fjerne kulde og vind, reducere smerte og beroligende chok. Det blev optaget i det første bind af "Drug Standards (Tibetan Medicine) fra Sundhedsministeriet i Folkerepublikken Kina", hvori det hedder, at de tørrede rødder af TBC almindeligvis anvendes til behandling af reumatoid arthritis, blå mærker og andre kolde sygdomme3. Den kliniske terapeutiske dosis af TBC svarer imidlertid til dens toksiske dosis, og tilfælde af forgiftning eller død er ofte blevet rapporteret på grund af forkert brug4. Derfor er reduktion af toksiciteten og bevarelse af effektiviteten af TBC blevet et forskningsmæssigt hotspot gennem årene.

I tibetansk medicin er forarbejdning en af de mest effektive metoder til at dæmpe toksiciteten af TBC. Ifølge "Processing specification of Tibetan medicine of Qinghai Province (2010)" skal de originale urter (TBC) placeres i en jerngryde og omrøres med Zanba, indtil Zanba bliver gul, hvorefter Zanba fjernes, og urterne tørres i luft 5,6. Der er dog ikke dokumenteret specifikke procesparametre, hvilket gør det vanskeligt at kontrollere forarbejdningsteknologien og kvaliteten af Zanba-stir-fried TBC. CRITIC-metoden er en objektiv vægtmetode, der kan undgå fuzzificering og subjektivitet og forbedre objektiviteten ved at veje7. Box-Behnken-responsoverflademetoden kan direkte afspejle samspillet mellem hver faktor gennem polynomisk tilpasning8. Kombinationen af Box-Behnken-responsfladen og CRITIC-metoden bruges almindeligvis til at optimere behandlingsteknologien for at erhverve den optimerede behandlingsprotokol 9,10. I dette papir blev en monoester-diterpenoid alkaloid (MDA) (benzoylaconitin) og to diester-diterpenoid alkaloider (DDA'er) (aconitin, 3-deoxyaconitin) anvendt som evalueringsindekser. CRITIC kombineret med Box-Behnken-responsoverflademetoden blev anvendt til at optimere behandlingsteknologien for Zanba-stir-fried TBC og etablere en standardbehandlingsmetode til klinisk sikker brug.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Zanba-stir-fried TBC-behandlingsmetoden blev optimeret og standardiseret af CRITIC kombineret med Box-Behnken-responsoverflademetoden. Benzoylaconitin, aconitin og 3-deoxyaconitin blev anvendt som evalueringsindekser under denne procedure.

1. Forberedelse af prøveopløsning

  1. Stamopløsningen af referencestoffet fremstilles. 9,94 mg benzoylconitin, 8,49 mg aconitin og 6,25 mg 3-deoxyaconitin (materialetabel) afvejes nøjagtigt på en elektronisk analysevægt og anbringes i en 10 ml målekolbe. Derefter tilsættes 0,05% saltsyremethanolopløsning for at opløse de faste stoffer og fylde op til 10 ml. Til sidst rystes blandingen godt for at opnå stamopløsningen af referencestoffet med massekoncentrationer på 0,9940 mg/ml benzoylaconitin, 0,8490 mg/ml aconitin og 0,6250 mg/ml 3-deoxyaconitin.
    FORSIGTIG: Saltsyre er et stærkt ætsende materiale11. Brug korrekt beskyttelse, såsom handsker, en laboratoriefrakke, beskyttelsesbriller og en røghætte.
  2. Forbered analyseprøveopløsningen.
    1. 2 g Zanba-omrørt TBC-pulver afvejes i en konisk kolbe.
      1. Tilbered Zanba-omrørt TBC ved at veje 30 g TBC (2 cm) og 90 g Zanba og tilsæt dem i den forvarmede stegemaskine. Indstil tid og temperatur på stegemaskinen til henholdsvis 40 min og 140 °C. Indstil maskinen til at fuldføre behandlingen.
      2. Brug en højhastigheds smadremaskine til at male Zanba-stir-fried TBC separat i pulverprøver, der kan passere gennem en 50 mesh (0,355 mm) sigte.
    2. I ovennævnte koniske kolbe tilsættes 3 ml ammoniakopløsning og 50 ml af en blandet opløsning af isopropylalkohol og ethylacetat (forholdet 1:1 v/v), baseret på tidligere undersøgelser12,13.
      BEMÆRK: For at klargøre ammoniakopløsningen tilsættes 40 ml koncentreret ammoniakopløsning i en 100 ml målekolbe og fyldes med renset vand til måleledningen. Tag passende beskyttelsesforanstaltninger, når du bruger koncentreret ammoniakopløsning, da den har en stærk lugt.
    3. Ovennævnte prøve og koniske kolbe vejes, og vægten registreres. Ultralyd i 30 min (spænding: 220 V, frekvens: 40 kHz).
      BEMÆRK: Aconitinalkaloider nedbrydes let ved varme. Således skal temperaturen af ultralydsekstraktion være under 25 ° C.
    4. Prøven og den koniske kolbe vejes efter ultralydsekstraktion.
    5. Der kompenseres for vægttabet ved tilsætning af en blanding af isopropylalkohol og ethylacetat (forholdet 1:1 v/v).
    6. Filtrer prøveopløsningen. 25 ml af filtratet inddampes til tørhed ved hjælp af en rotationsfordamper ved 40 °C.
    7. Remanensen opløses ved tilsætning af 5 ml 0,05% saltsyremethanolopløsning, filtreres opløsningen gennem et 0,2 μm sprøjtefilter, og den analyseres ved at udføre højtydende væskekromatografi (HPLC).
  3. Der fremstilles en blandet referenceopløsning, der indeholder 0,1988 mg/ml benzoylaconitin, 0,0509 mg/ml aconitin og 0,0938 mg/ml 3-deoxyaconitin.
    BEMÆRK: Hver standard (0,9940 mg benzoylconitin, 0,2545 mg aconitin og 0,4690 mg 3-deoxyaconicin) opløses i en 5 ml målekolbe i 0,05% saltsyremethanol som opløsningsmedium.
  4. Der fremstilles 0,04 M ammoniumacetatbuffer ved opløsning af 6,16 g ammoniumacetat (materialetabel) i 2 liter ultrarent vand (mobil fase A). Juster pH til 8,50 ved hjælp af ammoniak.
    FORSIGTIG: Ammoniak er et farligt materiale. Brug korrekt beskyttelse, såsom handsker, en laboratoriefrakke, beskyttelsesbriller og en røghætte.
  5. Filtrer 2 L ultraren 100% acetonitril (mobil fase B) og afgas den.
    FORSIGTIG: Acetonitril er et farligt materiale13. Brug korrekt beskyttelse, såsom handsker, en laboratoriefrakke, beskyttelsesbriller og en røghætte.

2. Kromatografisk tilstand

  1. 10 μL af de forbehandlede prøveopløsninger injiceres i et HPLC-system med binære pumper. Brug et HPLC-system, der anvender en ODS-3-søjle (5 μm x 4,6 mm x 250 mm; arbejder ved 30 °C) med mobile faser A og B til MDA- og DDA-adskillelse. Hver prøve injiceres tre gange med henblik på teknisk replikation.
  2. Programmér metoden som vist i tabel 1 for ODS-3-kolonnen. Indstil en strømningshastighed på 1,0 ml/min og detektionsbølgelængden til 235 nm.
  3. Registrer toparealerne for hver målforbindelse.
    BEMÆRK: Nærmere oplysninger om instrumenterne findes i materialefortegnelsen.

3. Test af systemets tilpasningsevne

BEMÆRK: Se afsnit 2 for de kromatografiske betingelser for at udføre trin 3.1-3.5.

  1. Undersøg det lineære forhold mellem koncentration og topareal.
    1. Forbered forskellige koncentrationer - 19,88, 39,76, 59,64, 159,04, 198,80 og 497,00 μg / ml - benzoylaconitinopløsning.
    2. Forbered forskellige koncentrationer - 8,49, 16,98, 25,47, 33,96, 50,94 og 169,80 μg / ml - af aconitinopløsning.
    3. Forbered forskellige koncentrationer - 1,875, 12,50, 37,50, 62,50, 93,75 og 125,00 μg / ml - af 3-deoxyaconitinopløsning.
    4. Ovennævnte referenceopløsninger indsprøjtes fra lav massekoncentration til høj massekoncentration, og topområderne registreres.
    5. Der opnås tre lineære regressionsligninger fra afbildningen af referenceopløsningskoncentrationen (μg/L) mod toparealet.
      BEMÆRK: Sørg for, at koncentrationerne af benzoylaconitin, aconitin og 3-deoxyaconitin falder inden for det lineære område for denne standardkurve.
  2. Der udføres præcisionsprøvning ved kontinuerligt at injicere seks gentagelser af 10 μL af prøveopløsningen i HPLC-systemet, og prøverne køres under de samme HPLC-betingelser, der er beskrevet i punkt 2. Optag topområderne benzoylaconitin, aconitin og 3-deoxyaconitin.
  3. Der udføres stabilitetsprøvningsforsøg ved indsprøjtning af 10 μL af den fremstillede prøveopløsning, og toparealerne bestemmes efter 0 timer, 2 timer, 4 timer, 8 timer, 12 timer og 24 timer.
    BEMÆRK: Toparealerne registreres automatisk af det refererede HPLC-system. Disse tidspunkter var baseret på relevant litteratur15,16,17.
  4. Reproducerbarhedstesten udføres ved at tage den samme batch Zanba-omrørt TBC til fremstilling af seks prøveopløsninger parallelt efter metoden i trin 1.2. Der injiceres 10 μL af hver prøve i HPLC-systemet, og prøverne køres som beskrevet i punkt 2.
    BEMÆRK: Reproducerbarheden blev vurderet ved at sammenligne koncentrationsforskellene mellem de seks prøver.
  5. Udfør genvindingseksperimentet ved at forberede seks portioner af det samme parti Zanba-omrørt stegt TBC til testopløsningen. Derefter tilsættes ~100 % af referencestoffet i hver indekskomponent i seks portioner af testopløsningen for at beregne genfindingsprocenten. Disse prøver (10 μL) indsprøjtes i HPLC-systemet under de samme betingelser, som er beskrevet i punkt 2, og genfindingshastigheden beregnes ved hjælp af ligning (1):
    Equation 1(1)
    BEMÆRK: I ækv. (1) er A mængden af den komponent, der skal måles i analyseopløsningen, B er mængden af tilsat referencestof, og C er den målte værdi af den opløsning, der indeholder referencestoffet og Zanba-omrørt TBC-prøven.

4. Enkeltfaktorforsøg

  1. Sammenligning af skivetykkelse
    1. Forbered fem grupper til test, hver med 30 g TBC, hvor tykkelsen af TBC er henholdsvis 0,5, 1, 2, 3 og 4 cm. Væg en mængde Zanba, der er tre gange så meget som TBC (90 g).
      BEMÆRK: TBC er giftigt. Brug korrekt beskyttelse, såsom handsker, en laboratoriefrakke, beskyttelsesbriller og en stinkhætte, og vær forsigtig under skæreprocessen. Gennem præeksperimentet blev det konstateret, at tre gange mængden af Zanba var nødvendig for fuldstændig kontakt mellem TBC og Zanba. Derfor valgte undersøgelsen i det formelle eksperimentelle design tre gange mængden af Zanba, når man undersøgte skivetykkelsen.
    2. Indstil temperaturen og tiden for den automatiske stegemaskine til henholdsvis 140 °C og 40 min.
    3. Tilsæt ~ 30 g TBC og 90 g Zanba i maskinen, efter at den automatiske stegemaskine er opvarmet til den indstillede temperatur.
    4. Prøveopløsningerne fremstilles ved at følge trin 1.2. Indholdet af MDA og DDA'erne i forskellige forarbejdningsprodukter beregnes i henhold til standardkurven (tabel 2). Beregn den omfattende score baseret på resultaterne via CRITIC-metoden i afsnit 6.
    5. På denne måde skal du sammenligne mængderne af Zanba samt behandlingstemperaturer og tider for optimering af forholdene.
  2. Sammenligning af mængden af Zanba
    1. Udfør fem grupper af tests, hver med 30 g TBC (2 cm), hvor mængden af Zanba er henholdsvis en, to, tre, fire og fem gange så meget som TBC.
    2. Tænd stegemaskinen til forarbejdning. Indstil tiden og temperaturen på stegemaskinen til 40 min og 140 °C.
    3. Prøveopløsningerne fremstilles ved at følge trin 1.2. Indholdet af MDA og DDA'er i forskellige forarbejdningsprodukter beregnes i henhold til standardkurven (tabel 2). Beregn den omfattende score baseret på resultaterne via CRITIC-metoden i afsnit 6.
  3. Sammenligning af behandlingstemperatur
    1. Udfør fem grupper af tests, hver med 30 g TBC (2 cm) og 90 g Zanba.
    2. Tænd stegemaskinen til forarbejdning. Indstil behandlingstemperaturen til 100 °C, 120 °C, 140 °C, 160 °C og 180 °C. Indstil behandlingstiden til 40 min.
      BEMÆRK: Gennem præeksperimenter blev det konstateret, at hastigheden af Zanba gulfarvning er meget lav, når forarbejdningstemperaturen er under 100 ° C, og Zanba er let at brænde og blive sort, hvis temperaturen er for høj (over 180 ° C). Derfor blev 100 °C og 180 °C fastsat til at være henholdsvis minimums- og maksimumsværdier for temperatur under forarbejdning.
    3. Prøveopløsningerne fremstilles ved at følge trin 1.2. Registrer topområderne for MDA og DDA'erne. Indholdet af MDA og DDA'er i forskellige forarbejdningsprodukter beregnes i henhold til standardkurven (tabel 2). Beregn den omfattende score baseret på resultaterne via CRITIC-metoden i afsnit 6.
      BEMÆRK: Forsøget indebærer høje temperaturer på 160 °C og 180 °C. Vær opmærksom på sikkerheden under eksperimentet i henhold til laboratoriets sikkerhedskode.
  4. Sammenligning af sagsbehandlingstid
    1. Udfør fem grupper af tests, hver med 30 g TBC (2 cm) og 90 g Zanba.
    2. Tænd stegemaskinen til forarbejdning. Indstil behandlingstiden til 20, 40, 60, 80 og 100 min. Indstil temperaturen til 140 °C.
    3. Prøveopløsningerne fremstilles ved at følge beskrivelsen i trin 1.2. Registrer topområderne for MDA og DDA'erne. Beregn kvaliteten af MDA og DDA'er i forskellige forarbejdningsprodukter i henhold til standardkurven (tabel 2). Beregn den omfattende score baseret på resultaterne via CRITIC-metoden i afsnit 6.

5. Optimering af behandlingsteknologi af Zanba-stir-fried TBC ved hjælp af responsoverflademetode (RSM)

  1. Box-Behnken respons overflade design
    1. Bestem området for skivetykkelse (A, 1-3 cm), mængden af Zanba (B, 2-4x), behandlingstemperaturen (C, 100-140 ° C) og behandlingstiden (D, 40-80 min) ved indledende eksperimenter ved hjælp af enkeltfaktortest (trin 4.1-4.4).
      BEMÆRK: De kodede værdier for fire variabler og deres niveauer er vist i tabel 3. Tre niveauer af hver variabel blev kodet som -1, 0 og 1.
  2. Brug software til at generere matrixen og analysere responsoverflademodellerne.
    BEMÆRK: Skærmbillederne for softwarebrug vises i supplerende fil 1.
    1. Brug et Box-Behnken-design med tre niveauer med fire faktorer bestående af 24 eksperimenter (som udført i denne undersøgelse), og mål fem replikater (kørselsrækkefølge 1, 9, 14, 16 og 25) til at beregne den rene fejlsum af kvadrater (tabel 4). Angiv den omfattende score (Y) som svar (trin 1-4, Supplerende fil 1).
      1. På startsiden skal du klikke på Nyt design (trin 1, Supplerende fil 1), og i venstre panel på designsiden skal du klikke på Svaroverflade | Box-Behnken og indstil parametrene for de fire faktorer i tabellen (trin 2, Supplerende fil 1).
      2. Klik på Næste (trin 2, Supplerende fil 1), indstil svarnavnene, og klik på Udfør (trin 3, Supplerende fil 1).
      3. Generer responsoverfladedesignet gennem ovenstående handling (trin 4, supplerende fil 1).
  3. Fuldfør eksperimentet baseret på de 29 scenarier, der er designet til svarfladen.
  4. Prøveopløsningerne fremstilles ved at følge trin 1.2.
  5. Registrer topområderne for MDA og DDA'erne.
    BEMÆRK: Toparealerne registreres automatisk af det refererede HPLC-system.
  6. Beregn kvaliteten af MDA og DDA'er i de forskellige forarbejdningsprodukter.
  7. Beregn den omfattende score baseret på resultaterne via CRITIC-metoden i trin 6.
    BEMÆRK: Den specifikke metode er illustreret i trin 6.
  8. Indtast den opnåede omfattende score på 29 forsøg i computeren og analyser den ved hjælp af den refererede software (trin 5, supplerende fil 1).
  9. Udfør den statistiske validering af polynomiets ligninger og responsoverfladeanalyser, der er plottet i 3D-modelgrafer gennem softwaren (trin 6-8, supplerende fil 1).
    1. Klik på Y i venstre navigationsrude under Analyse (+), og klik derefter på Start analyse i vinduet Konfigurer (trin 6, Supplerende fil 1).
    2. Klik på ANOVA i topmenuen og observer resultattabellen, der viser variansanalyse (trin 7, supplerende fil 1).
    3. I topmenuen skal du klikke på Modelgrafer og derefter 3D-overflade for at få responsoverfladeplottene, der afspejler virkningerne af behandlingsparametre på de syntetiske scorer (trin 8, Supplerende fil 1).
  10. Udfør valideringen af responsoverflademodellen i tre eksemplarer under de forventede optimale betingelser (trin 9, supplerende fil 1) for at verificere behandlingsteknologiens stabilitet. I venstre navigationsrude under Optimering skal du klikke på Numerisk Klik derefter på Løsninger i topmenuen. Overhold de forudsagte optimale forhold.

6. Evaluering af modeller

BEMÆRK: Dette trin skal udføres, når hvert enkeltfaktoreksperiment eller responsoverfladeforsøg er afsluttet. Efter hvert eksperiment (f.eks. sammenligning af skivetykkelse) er afsluttet, måles indholdet af MDA og DDA'erne i de forskellige prøver for at opnå fem datasæt i henhold til trin 1.2 og afsnit 2. Dataene er vist i supplerende tabel S1.

  1. Dimensionsløs behandling af indekset
    BEMÆRK: Dette trin omdanner den målte værdi (Xij) til en dimensionsløs relativ værdi, så værdien af hvert indeks er på samme mængdeniveau. Denne operation kan lette omfattende analyse og sammenligning af indikatorer i forskellige enheder eller størrelsesordener18. Til illustration er der anvendt snittykkelsesværdier til beregningerne nedenfor (supplerende tabel S1).
    1. Standardisere indholdet af MDA (opnå yMDA; MDA refererer til benzoylaconitin) ved hjælp af formlen i Eq. (2).
      BEMÆRK: Indekset "i" står for en af fire faktorer, og skivetykkelse er den første faktor, der undersøges. Derfor er værdien af i lig med 1. Indekset "j" står for hvert niveau af faktorer; Når skivetykkelsen således er det første niveau (0,5 cm), er J lig med 1; Når skivetykkelsen er det femte niveau (4 cm), er j lig med 5. Indholdet af MDA (Xij) i den forarbejdede TBC med tykkelser på 0,5, 1, 2, 3 og 4 cm var henholdsvis 0,9693, 1,0876, 1,3940, 1,4185 og 1,3614 mg/g. Således er x j, max 1,4185 og x j,min er 0,9693.
      Equation 2(2)
      Således Equation 3
      Her er Xij det målte indhold af eksperimentets MDA i i-th faktor og på j-th niveau; xj, min er minimumsindholdet af MDA i denne gruppe af eksperimenter og xj, max er det maksimale indhold af MDA i denne gruppe af eksperimenter. Således er i = 1, 2, ..., m og j = 1, 2, ..., n.
      BEMÆRK: De standardiserede værdier for MDA er således 0,0000, 0,2634, 0,9455, 1,0000 og 0,8729 ved anvendelse af Eq. (2).
    2. Standardisere det samlede indhold af DDA'erne (opnå yDDA'er; DDA'er refererer til aconitin og 3-deoxyaconicin) ved hjælp af formlen i eq. (3).
      BEMÆRK: i er en af fire faktorer, og j er hvert niveau af faktorerne; Xij er det målte indhold af eksperimentets DDA'er i i'te faktor og på j'te niveau xj, min er minimumsindholdet af DDA'erne i dette gruppeeksperiment af data; og xj, max er det maksimale indhold af DDA'erne i dette gruppeeksperiment af data. På denne måde er i = 1, 2, ..., m og j = 1, 2, ..., n. Indholdet af DDA'erne (Xij) i den forarbejdede TBC med tykkelser på 0,5, 1, 2, 3 og 4 cm var henholdsvis 0,3492, 0,2692, 0,2962, 0,5354, 0,5124 mg/g. Således er x j, max 0,5354 og x j,min er 0,2692.
      Equation 4(3)
      Equation 5
      BEMÆRK: De standardiserede værdier er 0,6995, 1,0000, 0,8986, 0,0000 og 0,0864 ved hjælp af Eq. (3).
  2. Beregn den tilsvarende kontrastintensitet (S i), konflikt (δ i), information (C i) og indeksvægt (W i) i henhold til Eqs. (4) til (7), henholdsvis19,20.
    BEMÆRK: i = 1, 2, ..., m. yij er de standardiserede data for eksperimentets MDA- eller DDA-indhold i i-th faktor og på j-th niveau.
    1. For at estimere kontrastintensiteten skal du først beregne den gennemsnitlige MDA-værdi.
      Equation 6
      Hvor Equation 7 er gennemsnitsværdien af MUB.
      Equation 8(4)
      Equation 21
    2. For at beregne konfliktværdien skal du først estimere korrelationskoefficienten γij ved hjælp af funktionen KORRELATION i Excel21.
      Equation 9(5)
      Equation 10
    3. Beregn informationsværdier som følger.
      Equation 11(6)
      Equation 12
      BEMÆRK: Tilsvarende C1, DDAS = 0,7210
    4. Beregn indeksvægten som følger.
      Equation 13(7)
      Equation 14
      BEMÆRK: Derfor blev vægtkoefficienterne for MDA og DDA'erne i sammenligning med skivetykkelse fastsat til henholdsvis 0,4945 og 0,5055.
  3. Beregn de omfattende scorer for skivetykkelser.
    Equation 15
    Equation 16
    Equation 17
    Equation 18
    Equation 19
    BEMÆRK: Y13 er den maksimale værdi. Derfor er den bedste parameter for udskæringstykkelser det tredje niveau - 2 cm.

   

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne undersøgelse havde den anvendte elueringsgradient en god opløsning (figur 1) for de tre indekskomponenter i Zanba-stir-fried TBC, som bestemt efter gentagen fejlfinding. De tre indekskomponenter i Zanba-stir-fried TBC havde et godt lineært forhold inden for et specifikt koncentrationsområde (tabel 2). Præcisionen (tabel 5), stabiliteten (tabel 6), repeterbarheden (tabel 7) og prøvegenvinding (tabel 8) af Zanba-omrørt TBC lå alle inden for det metodologiske interval, der er specificeret i den kinesiske farmakopé (bind 4, 2020)22, hvilket indikerer, at metoden var mulig. Derfor var HPLC-metoden pålidelig til at udføre analysen af Zanba-stir-fried TBC.

Virkningen af hver faktor på forarbejdningsteknologien blev belyst ved hjælp af enkeltfaktortest, hvis resultater er vist i figur 2. Tendensen med den omfattende score af Zanba-stir-fried TBC under forskellige forhold blev visualiseret. Området for skivetykkelse (A, 1-3 cm), mængde Zanba (B, 2-4x), behandlingstemperatur (C, 100-140 °C) og behandlingstid (D, 40-80 min) blev bestemt ved hjælp af enkeltfaktortest (figur 2).

CRITIC-metoden er en objektiv evalueringsmetode, der udnytter målte data19,20. Når hvert indeks har meget forskellige niveauer, resulterer brug af den oprindelige indeksværdi direkte til analyse i en større rolle for indekset med en højere værdi i den omfattende analyse og en mindre rolle for indekset med en lavere værdi. Derfor skal de oprindelige indikatordata standardiseres for at sikre pålideligheden af resultaterne, som anvendt på de eksperimentelle værdier i denne undersøgelse. Ifølge responsoverfladetestresultaterne og CRITIC-metoden blev vægtkoefficienterne for MDA og DDA'erne i responsoverfladeeksperimentet fastsat til henholdsvis 0,5295 og 0,4705. Den samlede score (Y) kunne beregnes i henhold til Eq. (8).

Equation 20(8)

Resultaterne af Box-Behnken-eksperimentelt design er vist i tabel 4, mens tabel 9 viser resultaterne af ANOVA og regressionskoefficienterne. Polynomiets ligninger af omfattende score blev også opnået efter softwareanalysen. Sandsynlighedsværdier mindre end 0,05 antydede, at modellen var signifikant (p < 0,0001)23; Ligningen i form af faktiske faktorer blev opnået i eq. (9) (Y: omfattende score; A: udskæring tykkelse; B: mængde Zanba; C: forarbejdningstemperatur og D: behandlingstid). Ligningen viste, at intensiteten af indflydelsen på omfattende score følger denne rækkefølge: behandlingstid > behandlingstemperatur > skivetykkelse > mængde Zanba for fire forskellige faktorer.

Y = 89,05 + 4,57 A + 2,88 B + 4,63 C - 4,83 D + 5,19AB + 4,91AC + 6,97 e.Kr. + 6,69f.Kr. - 7,05BD - 1,17CD - 22,80A 2 - 21,93B 2 - 19,58C 2 - 27,19 D 2 (9)

Responsfladerne og konturplottene er vist i figur 3, hvilket viser ændringerne i syntetiske scorer som funktion af fire variabler. På baggrund af de eksperimentelle resultater blev de optimale forarbejdningsparametre for Zanba-omrørt TBC bestemt til at være som følger: skivetykkelse på 2.117 cm, 3.118 gange mere Zanba end TBC, behandlingstemperatur på 123.106 °C og behandlingstid på 58.156 min. Afhængigt af operationens gennemførlighed blev Zamba's optimale behandlingsteknologi justeret - den optimale skivetykkelse af TBC var 2 cm, mængden af Zanba var tre gange, behandlingstemperaturen var 125 ° C, og behandlingstiden var 60 minutter. Pålideligheden af modellen blev bevist gennem tre tests, der blev udført i henhold til de opnåede behandlingsparametre (tabel 10).

Figure 1
Figur 1: Kromatogrammer. Kromatogrammet for prøveopløsningen (A) og den blandede standardopløsning (B) (1: benzoylaconitin; 2: aconitin; 3: 3-deoxyaconicin). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Den syntetiske score for alle enkeltfaktorer. (A) Skivetykkelse; B) mængden af Zanba C) forarbejdningstemperatur og (D) behandlingstid. Resultaterne viste, at den omfattende score af Zanba-lynstegt TBC er højest, når skivetykkelsen er 2 cm, mængden af Zanba er tre gange, forarbejdningstemperaturen er 120 ° C, og behandlingstiden er 60 min. Så resultaterne viste rækkevidden af skæretykkelse (A, 1-3 cm), mængde Zanba (B, 2-4x), behandlingstemperatur (C, 100-140 ° C) og behandlingstid (D, 40-80 min), der skulle bruges til at designe det næste eksperiment. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Responsfladediagrammer (3D), der afspejler behandlingsparametrenes indvirkning på omfattende scorer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: HPLC-gradienten. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Det lineære forhold mellem indekskomponenterne i Zanba-stir-fried TBC. Resultaterne antydede, at de tre indekskomponenter i Zanba-stir-fried TBC havde et godt lineært forhold inden for et bestemt koncentrationsområde. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Niveauer af variabler til det eksperimentelle design. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Box-Behnkens eksperimentelle design med svar. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 5: Resultaterne af præcisionsmålingen. De relative standardafvigelsesværdier (RSD) for toparealerne af benzoylaconitin, aconitin og 3-deoxyaconitin var henholdsvis 0,42%, 0,71% og 2,95% (n = 6). Forkortelse: RSD = relativ standardafvigelse. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 6: Resultaterne af stabilitetstesten. RSD-værdierne for topområderne benzoylaconitin, aconitin og 3-deoxyaconitin var henholdsvis 1,86%, 0,54% og 2,81% (n = 6). Forkortelse: RSD = relativ standardafvigelse. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 7: Resultaterne af reproducerbarhedstesten. RSD-værdierne for topområderne benzoylaconitin, aconitin og 3-deoxyaconitin var henholdsvis 1,99%, 1,84% og 2,41% (n = 6). Forkortelse: RSD = relativ standardafvigelse. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 8: Stikprøvemålinger af genfindingsprocent. RSD-værdierne for genvindingshastigheden af benzoylaconitin, aconitin og 3-deoxyaconitin var henholdsvis 2,47%, 1,88% og 2,33%. Forkortelse: RSD = relativ standardafvigelse. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 9: Variansanalyse (ANOVA) resultater af eksperimentmodellen. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 10: Resultaterne af verifikation af test. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende fil 1: Instruktionerne i Box-Behnken-designsoftwaren Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S1: Beregningsresultatet af skivetykkelsen. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TBC er en vigtig tibetansk medicin med virkningerne af at fjerne kulde og lindre smerter. Det har været mest brugt til behandling af traumatisk skade og reumatisk artralgi i Kina i tusinder af år24,25,26. Diterpenoid alkaloider er både aktive og giftige ingredienser i TBC27,28,29. De vigtigste toksiske virkninger af aconitumalkaloiderne i TBC er neurotoksicitet, kardiotoksicitet og gastrointestinal toksicitet30,31. TBC behandles generelt før oral brug for at mindske risikoen for toksicitet. Forskellige behandlingsmetoder, såsom dampning, decocting og sandstegning samt forarbejdning med Hezi-afkogning, Qingke-vin og Zanba, har været nyttige til at reducere toksiciteten af TBC, samtidig med at dens effektivitetbevares 1. Blandt dem er Zanba-omrøring en vigtig behandlingsmetode. Zanba fremstilles af højlandsbyg (Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f), som er et vigtigt korn for mennesker, der bor på Qinghai-Tibet-plateauet32,33. Imidlertid er de nøjagtige parametre for formulering af Zanba-stir-fried TBC stadig uklare, hvorfor denne behandlingsteknologi skal standardiseres for at sikre dens kvalitetskontrol og sikre anvendelse.

Det mest afgørende aspekt ved metoden er, at evalueringsindekset blev bestemt med CRITIC-metoden. Ifølge nylige undersøgelser kan meget giftige DDA'er hydrolyseres eller pyrolyseres til en MDA med moderat toksicitet under opvarmningsprocessen34,35. Undersøgelser har vist, at aconitinhydrolyse til benzoylaconin er det typiske eksempel36. Derfor blev sammensætningsændringerne i behandlingsprocessen taget som evalueringsindekset i procesteknologioptimeringen. CRITIC-metoden er en objektiv vægtmetode, der hovedsageligt tager højde for variationen af indikatorer og konflikten mellem indikatorer, som udtrykkes af henholdsvis standardafvigelsen og korrelationskoefficienten. Det har været meget anvendt i behandlingen af traditionel kinesisk medicin37,38. I denne protokol blev vægten af hovedkomponenterne i Zanba-omrørt stegt TBC, herunder benzoylaconitin, aconitin og 3-deoxyaconitin, beregnet ved hjælp af CRITIC-vejemetoden for objektiv tildeling, som blev anvendt som evalueringsstandard for Zanba-omrørt stegt TBC.

En af de vigtigste eksperimentelle procedurer er at sikre en konstant behandlingstemperatur under forarbejdning, da behandlingstemperaturen i høj grad påvirker nedbrydningen af DDA'er. Derfor involverede foreksperimentet brugen af mange slags varmeenheder, såsom en induktionskomfur, elektrisk keramisk komfur og multifunktionel stegemaskine. Den multifunktionelle stegemaskine kunne opretholde en konstant temperatur og stabilisere kvaliteten af det forarbejdede produkt.

Selvom den optimerede behandlingsteknologi effektivt kunne reducere TBC's toksicitet, eksisterer der stadig begrænsninger. For det første forbliver nogle af de aktive ingredienser i Zanba-omrørt TBC ukendte. Der kan derfor ikke foretages kvalitative og kvantitative analyser, da det relevante referenceprodukt ikke foreligger. Der bør lægges større vægt på fytokemiske undersøgelser for at opnå målkvalitetskontrolkomponenterne. Derudover er den farmakologiske sammenligning af rå og Zanba-omrørt stegt TBC uklar. Afgiftning og evaluering af effektforbeholdseffekterne i dyremodeller vil være de næste mål.

Traditionel kinesisk medicinbehandlingskultur overføres hovedsageligt fra mester til lærling, og slutpunktet for behandlingen bedømmes generelt af folks subjektive bevidsthed, hvilket ikke er befordrende for etableringen af en standardiseret behandlingsmetode. I denne undersøgelse blev digitale procesparametre brugt til at specificere behandlingsslutpunktet, som til en vis grad kan realisere kombinationen af moderne teknologi. Sammenfattende standardiserede denne undersøgelse Zanba-stir-fried behandlingsteknologi til toksisk dæmpning og effektivitetsreservation af TBC. Denne tilgang kan give nyttige oplysninger og vejledning til behandling af teknologi af andre giftige etniske lægemidler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev økonomisk støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 82130113), China Postdoctoral Science Foundation (nr. 2021MD703800), Science Foundation for Youths of Science & Technology Department of Sichuan-provinsen (nr. 2022NSFSC1449) og "Xinglin Scholars" Research Promotion Program fra Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (nr. BSH2021009).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Deoxyaconitine Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. DST221109-033
Aconitine Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. DSTDW000602
Ammonium acetate Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd Chromatographic grade
Benzoylaconitine Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. DSTDB005502
Design-Expert software Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, USA version 13.0
Electronic analytical balance Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd. FA1004
High performance liquid chromatography SHIMADZU Co., Ltd. LC-20A
High-speed smashing machine Beijing Zhongxing Weiye Instrument Co., Ltd. FW-100
Millipore filter Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd φ13 0.22 Nylon66
stir-Fry machine Changzhou Maisi Machinery Co., Ltd Type 5
Tiebangchui Gannan Baicao Biotechnology Development Co., Ltd 20211012
Ultra pure water systemic RephiLe Bioscience, Ltd. Genie G
Ultrasonic cleansing machine Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd SB2200
Zanba 27 Chuanzang Road, Ganzi County -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, C. Y., et al. Aconitum pendulum and Aconitum flavum: A narrative review on traditional uses, phytochemistry, bioactivities and processing methods. Journal of Ethnopharmacology. 292, 115216 (2022).
  2. Wang, J., Meng, X. H., Chai, T., Yang, J. L., Shi, Y. P. Diterpenoid alkaloids and one lignan from the roots of Aconitum pendulum Busch. Natural Products and Bioprospecting. 9 (6), 419-423 (2019).
  3. Yu, L., et al. Traditional Tibetan medicine: therapeutic potential in rheumatoid arthritis. Frontiers In Pharmacology. 13, 938915 (2022).
  4. Zhao, R., et al. One case of ventricular arrhythmia caused by poisoning of traditional Chinese medicine Aconitum pendulum Busch. Journal of People's Military Medical. 61 (4), 346-348 (2018).
  5. Qinghai Medical Products Administration. Processing specification of Tibetan medicine of Qinghai province. Qinghai Nationalities Publishing House. , 96-97 (2010).
  6. Li, J., et al. Comparison of three objective weighting methods to optimize the extraction process of Jianwei Chupi granules. Journal of Guangdong Pharmaceutical University. 38 (6), 91-97 (2022).
  7. Feng, Z. G., et al. Processing methods and the underlying detoxification mechanisms for toxic medicinal materials used by ethnic minorities in China: A review. Journal of Ethnopharmacology. 305, 116126 (2023).
  8. Hsu, Y. T., Su, C. S. Application of Box-Behnken design to investigate the effect of process parameters on the microparticle production of ethenzamide through the rapid expansion of the supercritical solutions process. Pharmaceutics. 12 (1), 42 (2020).
  9. Cheng, F., et al. Optimization of the baked drying technology of Cinnamomi Ramulus based on CRITIC combined with box-behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (8), 1838-1842 (2022).
  10. Huang, X., et al. Optimization of microwave processing technology for carbonized Gardenia jasminoides by Box-Behnken response surface methodology based on CRITIC weighted evaluation. Chinese Herbal Medicines. 48 (6), 1133-1138 (2017).
  11. Elling, U., et al. Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells. Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).
  12. Gu, J., Wang, Y. P., Ma, X. Simultaneous determinnation of three diester diterpenoid alkaloids in the toots of Aconiti flavi et penduli by HPLC method. Chinese Pharmaceutical Affairs. 28 (6), 618-621 (2014).
  13. Zhang, Y., Fu, X. UPLC simultaneous determination of six esteric alkaloids components in Aconitum Flaram Hand.Mazz. Asia-Pacific Traditional Medicine. 16 (5), 62-65 (2020).
  14. Rumachik, N. G., Malaker, S. A., Paulk, N. K. VectorMOD: Method for bottom-up proteomic characterization of rAAV capsid post-translational modifications and vector impurities. Frontiers In Immunology. 12, 657795 (2021).
  15. Wang, Y. J., Tao, P., Wang, Y. Attenuated structural transformation of aconitine during sand frying process and antiarrhythmic effect of its converted products. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 7243052 (2021).
  16. Wang, H. P., Zhang, Y. B., Yang, X. W., Zhao, D. Q., Wang, Y. P. Rapid characterization of ginsenosides in the roots and rhizomes of Panax ginseng by UPLC-DAD-QTOF-MS/MS and simultaneous determination of 19 ginsenosides by HPLC-ESI-MS. Journal of Ginseng Research. 40 (4), 382-394 (2016).
  17. vander Leeuw, G., et al. Pain and cognitive function among older adults living in the community. Journals of Gerontology Series A. Biological Sciences and Medical Sciences. 71 (3), 398-405 (2016).
  18. Lao, D., Liu, R., Liang, J. Study on plasma metabolomics for HIV/AIDS patients treated by HAART based on LC/MS-MS. Frontiers in Pharmacology. 13, 885386 (2022).
  19. Li, Y., et al. Evaluation of the effectiveness of VOC-contaminated soil preparation based on AHP-CRITIC-TOPSIS model. Chemosphere. 271, 129571 (2021).
  20. Zhong, S., Chen, Y., Miao, Y. Using improved CRITIC method to evaluate thermal coal suppliers. Scientific Reports. 13 (1), 195 (2023).
  21. Lewis, N. S., et al. Magnetically levitated mesenchymal stem cell spheroids cultured with a collagen gel maintain phenotype and quiescence. Journal of Tissue Engineering. 8, (2017).
  22. Chinese Pharmacopoeia Committee. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. 4, Chinese Medical Science and Technology Press. (2020).
  23. Li, G., et al. Effect of response surface methodology-optimized ultrasound-assisted pretreatment extraction on the composition of essential oil released from tribute citrus peels. Frontiers in Nutrition. 9, 840780 (2022).
  24. Liu, X. F., et al. Hezi inhibits Tiebangchui-induced cardiotoxicity and preserves its anti-rheumatoid arthritis effects by regulating the pharmacokinetics of aconitine and deoxyaconitine. Journal of Ethnopharmacology. 302, 115915 (2023).
  25. Smolen, J. S., et al. Rheumatoid arthritis. Nature Reviews.Disease Primers. 4, 18001 (2018).
  26. Wang, F., et al. C19-norditerpenoid alkaloids from Aconitum szechenyianum and their effects on LPS-activated NO production. Molecules. 21 (9), 1175 (2016).
  27. Wang, B., et al. Study on the alkaloids in Tibetan medicine Aconitum pendulum Busch by HPLC-MSn combined with column chromatography. Journal of Chromatographic Science. 54 (5), 752-758 (2016).
  28. Liu, S., et al. A review of traditional and current methods used to potentially reduce toxicity of Aconitum roots in Traditional Chinese Medicine. Journal of Ethnopharmacology. 207, 237-250 (2017).
  29. Qiu, Z. D., et al. Online discovery of the molecular mechanism for directionally detoxification of Fuzi using real-time extractive electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114216 (2021).
  30. El-Shazly, M., et al. Use, history, and liquid chromatography/mass spectrometry chemical analysis of Aconitum. Journal of Food and Drug Analysis. 24 (1), 29-45 (2016).
  31. Chan, T. Y. K. Aconitum alkaloid poisoning because of contamination of herbs by aconite roots. Phytotherapy Research. 30 (1), 3-8 (2016).
  32. Guo, L., et al. Exploring microbial dynamics associated with flavours production during highland barley wine fermentation. Food Research International. 130, 108971 (2020).
  33. Guo, T. L., Horvath, C., Chen, L., Chen, J., Zheng, B. Understanding the nutrient composition and nutritional functions of highland barley (Qingke): A review. Trends in Food Science & Technology. 103, 109-117 (2020).
  34. Wu, H., et al. Anti-myocardial infarction effects of Radix Aconiti Lateralis Preparata extracts and their influence on small molecules in the heart using matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry imaging. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), 4837 (2019).
  35. Huang, G., et al. Study on cardiotoxicity and mechanism of "Fuzi" extracts based on metabonomics. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3506 (2018).
  36. Li, S. L., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
  37. Xie, Y., et al. Optimization of processing technology of braised Rehmanniae Raidx based on multiple indexes and response surface technology and correlation between components and color. Journal of Chinese Traditional Medicine. 47 (18), 4927-4937 (2022).
  38. Yang, X. Q., Xu, W., Xiao, C. P., Sun, J., Feng, Y. Z. Study on processing technology of Atractylodes chinensis with rice water and its pharmacodynamics of anti-diarrhea. Chinese Herbal Medicines. 53 (1), 78-86 (2022).

Tags

Medicin udgave 195 Aconitum pendul Busch. forarbejdningsteknologi Zanba-lynstegt Tiebangchui CRITIC metode responsoverflademetode
Optimering af behandlingsteknologi til Tiebangchui med Zanba baseret på CRITIC kombineret med Box-Behnken responsoverflademetode
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S., Yu, L., Li, C., Wang, N.,… More

Li, S., Yu, L., Li, C., Wang, N., Lai, X., Liu, Y., Zhang, Y. Optimization of Processing Technology for Tiebangchui with Zanba Based on CRITIC Combined with Box-Behnken Response Surface Method. J. Vis. Exp. (195), e65139, doi:10.3791/65139 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter