Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Оптимизация технологии обработки Tiebangchui с Zanba на основе CRITIC в сочетании с методом поверхности отклика Бокса-Бенкена

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65139
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 2, 2
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

В настоящем протоколе описан эффективный и стандартный метод дезинтоксикационной обработки обжаренного в Занбе Tiebangchui с использованием CRITIC в сочетании с методом поверхности отклика Бокса-Бенкена.

Abstract

Высушенный корень Aconitum pendulum Busch., называемый Tiebangchui (TBC) на китайском языке, является одним из самых известных тибетских лекарств. Это широко используемая трава на северо-западе Китая. Тем не менее, многие случаи отравления произошли из-за интенсивной токсичности TBC и из-за того, что его терапевтические и токсические дозы аналогичны. Поэтому поиск безопасного и эффективного метода снижения его токсичности является актуальной задачей. Поиск по классике тибетской медицины показывает, что метод обработки TBC, обжаренного с Занбой, был записан в «Спецификации обработки тибетской медицины провинции Цинхай (2010)». Однако конкретные параметры обработки пока не ясны. Таким образом, это исследование направлено на оптимизацию и стандартизацию технологии обработки жареного TBC Zanba.

Во-первых, был проведен однофакторный эксперимент по четырем факторам: толщина среза TBC, количество Zanba, температура обработки и время. С содержанием моноэфирных и диэфирных алкалоидов в TBC, обжаренном в Занбе, в качестве индексов, CRITIC в сочетании с методом поверхности отклика Бокса-Бенкена был использован для оптимизации технологии обработки ТБК, обжаренного в Занбе. Оптимизированные условия обработки TBC, обжаренного в Zanba, представляли собой толщину ломтика TBC 2 см, что в три раза больше Zanba, чем TBC, температуру обработки 125 °C и 60 минут жарки. Это исследование определило оптимизированные и стандартные условия обработки для использования Zanba-stir-fried-TBC, тем самым обеспечив экспериментальную основу для безопасного клинического использования и промышленного производства Zanba-stir-stir-fried TBC.

Introduction

Высушенный корень Aconitum pendulum Busch и A. flavum Hand.-Mazz., одного из самых известных тибетских лекарств, по-китайски называется Tiebangchui (TBC) 1,2. Высушенные корни TBC помогают рассеять холод и ветер, уменьшить боль и успокоить шок. Это было записано в первом томе «Стандартов на лекарства (тибетская медицина) Министерства здравоохранения Китайской Народной Республики», в котором говорится, что высушенные корни TBC обычно используются для лечения ревматоидного артрита, синяков и других простудных заболеваний3. Тем не менее, клиническая терапевтическая доза TBC аналогична его токсической дозе, и часто сообщалось о случаях отравления или смерти из-за неправильного использования4. Таким образом, снижение токсичности и сохранение эффективности TBC с годами стало горячей точкой исследований.

В тибетской медицине обработка является одним из наиболее эффективных методов ослабления токсичности туберкулеза. Согласно «Спецификации обработки тибетской медицины провинции Цинхай (2010 г.)», оригинальные травы (TBC) следует поместить в железный горшок и обжарить с занбой до тех пор, пока занба не пожелтеет, после чего занба удаляется, а травы сушат на воздухе 5,6. Однако никаких конкретных параметров процесса не было задокументировано, что затрудняет контроль технологии обработки и качества жареного в Занбе TBC. Метод CRITIC - это метод объективного взвешивания, который позволяет избежать фаззификации и субъективности, а также повысить объективность взвешивания7. Метод поверхности отклика Бокса-Бенкена может непосредственно отражать взаимодействие между каждым фактором посредством полиномиальной подгонки8. Комбинация поверхности отклика Бокса-Бенкена и метода CRITIC обычно используется для оптимизации технологии обработки для получения оптимизированного протоколаобработки 9,10. В данной работе в качестве оценочных показателей использовали моноэфир-дитерпеноидный алкалоид (MDA) (бензойлаконитин) и два диэфир-дитерпеноидных алкалоида (DDA) (аконитин, 3-дезоксиаконитин). CRITIC в сочетании с методом поверхности отклика Бокса-Бенкена был применен для оптимизации технологии обработки обжаренного TBC Zanba и создания стандартного метода обработки для клинически безопасного использования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Метод обработки TBC с перемешиванием Zanba был оптимизирован и стандартизирован CRITIC в сочетании с методом поверхности отклика Бокса-Бенкена. Бензойлаконитин, аконитин и 3-дезоксиаконитин использовались в качестве оценочных показателей во время этой процедуры.

1. Приготовление раствора образца

  1. Приготовьте исходный раствор эталонного вещества. Точно взвесьте 9,94 мг бензоилаконитина, 8,49 мг аконитина и 6,25 мг 3-дезоксиаконитина (таблица материалов) на электронных аналитических весах и поместите их в мерную колбу объемом 10 мл. Затем добавляют 0,05% раствор метанола соляной кислоты, чтобы растворить твердые вещества и увеличить объем до 10 мл. Наконец, хорошо встряхните смесь, чтобы получить исходный раствор эталонного вещества с массовой концентрацией 0,9940 мг/мл бензоилаконитина, 0,8490 мг/мл аконитина и 0,6250 мг/мл 3-дезоксиаконитина.
    ВНИМАНИЕ: Соляная кислота является высококоррозионным материалом11. Используйте надлежащую защиту, такую как перчатки, лабораторный халат, защитные очки и вытяжной шкаф.
  2. Приготовьте раствор испытуемого образца.
    1. Взвесьте 2 г обжаренного порошка TBC Zanba в конической колбе.
      1. Приготовьте обжаренный TBC Zanba, взвесив 30 г TBC (2 см) и 90 г Zanba и добавив их в предварительно разогретую машину для жарки. Установите время и температуру жарки на 40 мин и 140 °C соответственно. Настройте машину на полную обработку.
      2. Используйте высокоскоростную дробильную машину, чтобы измельчить обжаренный TBC Zanba отдельно в образцы порошка, которые могут проходить через сито размером 50 меш (0,355 мм).
    2. Добавьте 3 мл раствора аммиака и 50 мл смешанного раствора изопропилового спирта и этилацетата (соотношение 1:1 об./об.) в вышеуказанную коническую колбу, основываясь на предыдущих исследованиях12,13.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления раствора аммиака добавьте 40 мл концентрированного раствора аммиака в мерную колбу объемом 100 мл и залейте очищенной водой измерительную линию. Примите соответствующие защитные меры при использовании концентрированного раствора аммиака, так как он имеет сильный запах.
    3. Взвесьте вышеуказанный образец и коническую колбу и запишите вес. Ультразвук в течение 30 мин (напряжение: 220 В, частота: 40 кГц).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Алкалоиды аконитина легко разлагаются при нагревании. Таким образом, температура ультразвуковой экстракции должна быть ниже 25 °C.
    4. Взвесьте образец и коническую колбу после ультразвуковой экстракции.
    5. Восполнить потерянный вес можно добавлением смеси изопропилового спирта и этилацетата (соотношение 1:1 об./об.).
    6. Отфильтруйте раствор образца. Выпарить 25 мл фильтрата досуха с помощью роторного испарителя при 40 °C.
    7. Растворите остаток, добавив 5 мл 0,05% раствора метанола соляной кислоты, отфильтруйте раствор через шприцевой фильтр 0,2 мкм и проанализируйте его, выполнив высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).
  3. Приготовьте смешанный эталонный раствор, содержащий 0,1988 мг/мл бензоилаконитина, 0,0509 мг/мл аконитина и 0,0938 мг/мл 3-дезоксиаконитина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый стандарт (0,9940 мг бензоилаконитина, 0,2545 мг аконитина и 0,4690 мг 3-дезоксиаконитина) растворяют в мерной колбе объемом 5 мл в 0,05% метаноле соляной кислоты в качестве среды для растворения.
  4. Приготовьте буфер из 0,04 М ацетата аммония, растворив 6,16 г ацетата аммония (таблица материалов) в 2 л сверхчистой воды (подвижная фаза А). Отрегулируйте рН до 8,50 с помощью нашатырного спирта.
    ВНИМАНИЕ: Аммиак является опасным материалом. Используйте надлежащую защиту, такую как перчатки, лабораторный халат, защитные очки и вытяжной шкаф.
  5. Отфильтруйте 2 л сверхчистого 100% ацетонитрила (подвижная фаза B) и дегазируйте его.
    ВНИМАНИЕ: Ацетонитрил является опасным материалом13. Используйте надлежащую защиту, такую как перчатки, лабораторный халат, защитные очки и вытяжной шкаф.

2. Хроматографическое состояние

  1. Введите 10 мкл предварительно обработанных растворов образцов в систему ВЭЖХ с бинарными насосами. Используйте систему ВЭЖХ с колонкой ODS-3 (5 мкм x 4,6 мм x 250 мм; работает при 30 °C) с подвижными фазами A и B для разделения MDA и DDA. Введите каждый образец три раза для технической репликации.
  2. Запрограммируйте метод, как показано в таблице 1 для столбца ODS-3. Установите скорость потока 1,0 мл/мин и длину волны детектирования 235 нм.
  3. Запишите пиковые площади каждого целевого соединения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию об инструментах можно найти в таблице материалов.

3. Тест на адаптивность системы

ПРИМЕЧАНИЕ: См. раздел 2 для хроматографических условий для выполнения шагов 3.1-3.5.

  1. Исследуйте линейную зависимость между концентрацией и площадью пика.
    1. Приготовьте раствор бензоилаконитина различной концентрации - 19,88, 39,76, 59,64, 159,04, 198,80 и 497,00 мкг/мл.
    2. Приготовьте раствор аконитина различной концентрации - 8,49, 16,98, 25,47, 33,96, 50,94 и 169,80 мкг/мл.
    3. Приготовьте раствор 3-дезоксиаконитина различной концентрации - 1,875, 12,50, 37,50, 62,50, 93,75 и 125,00 мкг/мл.
    4. Введите вышеуказанные эталонные растворы от низкой массовой концентрации до высокой массовой концентрации и запишите пиковые площади.
    5. Получите три уравнения линейной регрессии из графика концентрации эталонного раствора (мкг/л) в зависимости от площади пика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что концентрации бензойлаконитина, аконитина и 3-дезоксиаконитина находятся в линейном диапазоне этой стандартной кривой.
  2. Проведите прецизионное испытание путем непрерывного введения шести повторов по 10 мкл раствора образца в систему ВЭЖХ и запустите образцы в тех же условиях ВЭЖХ, описанных в разделе 2. Запишите пиковые области бензоилаконитина, аконитина и 3-дезоксиаконитина.
  3. Проведите эксперименты по испытанию стабильности путем введения 10 мкл приготовленного раствора образца и определите пиковые площади через 0 ч, 2 ч, 4 ч, 8 ч, 12 ч и 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пиковые области автоматически регистрируются эталонной системой ВЭЖХ. Эти временные точки были основаны на соответствующей литературе15,16,17.
  4. Проведите испытание на воспроизводимость, взяв одну и ту же партию обжаренного в Занбе TBC для параллельного приготовления шести растворов тестовых образцов в соответствии с методом, описанным на шаге 1.2. Введите 10 мкл каждого образца в систему ВЭЖХ и запустите образцы, как описано в разделе 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Воспроизводимость оценивали путем сравнения различий в концентрациях между шестью образцами.
  5. Проведите эксперимент по восстановлению, приготовив шесть порций одной и той же партии обжаренного в Занбе TBC для тестового раствора. Затем добавьте ~ 100% эталонного вещества каждого индексного компонента в шесть порций испытуемого раствора, чтобы рассчитать скорость извлечения. Введите эти образцы (10 мкл) в систему ВЭЖХ в тех же условиях, которые описаны в разделе 2, и рассчитайте скорость восстановления, используя уравнение (1):
    Equation 1(1)
    ПРИМЕЧАНИЕ: В уравнении (1) А - количество компонента, подлежащего измерению в испытуемом растворе, В - количество добавленного эталонного вещества, а С - измеренное значение раствора, содержащего эталонное вещество и обжаренный в Занбе образец ТБК.

4. Однофакторные эксперименты

  1. Сравнение толщины среза
    1. Подготовьте пять групп для тестов, каждая с 30 г TBC, где толщина TBC составляет 0,5, 1, 2, 3 и 4 см соответственно. Взвесьте количество занбы, которое в три раза больше, чем у TBC (90 г).
      ПРИМЕЧАНИЕ: TBC токсичен. Используйте надлежащую защиту, такую как перчатки, лабораторный халат, защитные очки и вытяжной шкаф, и будьте осторожны в процессе резки. В ходе предварительного эксперимента было обнаружено, что для полного контакта между TBC и Zanba требуется в три раза больше Zanba. Таким образом, в формальном экспериментальном дизайне исследование выбрало в три раза больше занбы при изучении толщины среза.
    2. Установите температуру и время автоматической машины для жарки на 140 ° C и 40 минут соответственно.
    3. Добавьте ~ 30 г TBC и 90 г Zanba в машину после того, как автоматическая машина для жарки нагреется до заданной температуры.
    4. Подготовьте образцы растворов, выполнив шаг 1.2. Рассчитайте содержание MDA и DDA в различных продуктах переработки в соответствии со стандартной кривой (таблица 2). Рассчитайте общий балл на основе результатов с помощью метода CRITIC в разделе 6.
    5. Таким образом, сравните количество Zanba, а также температуру и время обработки для оптимизации условий.
  2. Сравнение количества занбы
    1. Выполните пять групп тестов, каждая из которых содержит 30 г TBC (2 см), где количество Zanba в один, два, три, четыре и пять раз больше, чем TBC соответственно.
    2. Включите жаркое для обработки. Установите время и температуру жарки на 40 минут и 140 °C.
    3. Подготовьте образцы растворов, выполнив шаг 1.2. Рассчитайте содержание MDA и DDA в различных продуктах переработки в соответствии со стандартной кривой (таблица 2). Рассчитайте общий балл на основе результатов с помощью метода CRITIC в разделе 6.
  3. Сравнение температуры обработки
    1. Проведите пять групп тестов, каждая из которых содержит 30 г TBC (2 см) и 90 г Zanba.
    2. Включите жаркое для обработки. Установите температуру обработки 100 °C, 120 °C, 140 °C, 160 °C и 180 °C. Установите время обработки равным 40 минутам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В ходе предварительных экспериментов было обнаружено, что скорость пожелтения Занбы очень низкая, когда температура обработки ниже 100 ° C, и Занба легко горит и чернеет, если температура слишком высока (выше 180 ° C). Поэтому 100 °C и 180 °C были установлены в качестве минимального и максимального значений температуры во время обработки соответственно.
    3. Подготовьте образцы растворов, выполнив шаг 1.2. Запишите пиковые области MDA и DDA. Рассчитайте содержание MDA и DDA в различных продуктах переработки в соответствии со стандартной кривой (таблица 2). Рассчитайте общий балл на основе результатов с помощью метода CRITIC в разделе 6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент включает в себя высокие температуры 160 ° C и 180 ° C. Обратите внимание на безопасность во время эксперимента, согласно правилам безопасности лаборатории.
  4. Сравнение времени обработки
    1. Проведите пять групп тестов, каждая из которых содержит 30 г TBC (2 см) и 90 г Zanba.
    2. Включите жаркое для обработки. Установите время обработки на 20, 40, 60, 80 и 100 минут. Установите температуру 140 °C.
    3. Подготовьте образцы растворов, следуя описанию в шаге 1.2. Запишите пиковые области MDA и DDA. Рассчитайте качество MDA и DDA в различных продуктах переработки в соответствии со стандартной кривой (таблица 2). Рассчитайте общий балл на основе результатов с помощью метода CRITIC в разделе 6.

5. Оптимизация технологии обработки обжаренного TBC Zanba с использованием методологии поверхности отклика (RSM)

  1. Конструкция поверхности отклика Box-Behnken
    1. Определите диапазон толщины среза (A, 1-3 см), количества занбы (B, 2-4x), температуры обработки (C, 100-140 °C) и времени обработки (D, 40-80 мин) путем предварительных экспериментов с использованием однофакторных тестов (этап 4.1-4.4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Закодированные значения четырех переменных и их уровни приведены в таблице 3. Три уровня каждой переменной были закодированы как -1, 0 и 1.
  2. Используйте программное обеспечение для создания матрицы и анализа моделей поверхностей отклика.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скриншоты использования программного обеспечения показаны в дополнительном файле 1.
    1. Используйте трехуровневый четырехфакторный дизайн Бокса-Бенкена, состоящий из 24 экспериментов (как сделано в этом исследовании), и измерьте пять повторений (порядок выполнения 1, 9, 14, 16 и 25), чтобы вычислить чистую сумму ошибок квадратов (таблица 4). Установите полную оценку (Y) в качестве ответа (шаги 1-4, дополнительный файл 1).
      1. На главной странице нажмите «Новый дизайн» (шаг 1, дополнительный файл 1), а на левой панели страницы «Дизайн» нажмите «Поверхность ответа» | Box-Behnken и задайте параметры четырех множителей в таблице (шаг 2, дополнительный файл 1).
      2. Нажмите «Далее» (шаг 2, дополнительный файл 1), задайте имена ответов и нажмите «Готово» (шаг 3, дополнительный файл 1).
      3. Сгенерируйте дизайн поверхности отклика с помощью описанной выше операции (шаг 4, дополнительный файл 1).
  3. Завершите эксперимент на основе 29 сценариев, разработанных для поверхности ответа.
  4. Подготовьте образцы растворов, выполнив шаг 1.2.
  5. Запишите пиковые области MDA и DDA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пиковые области автоматически регистрируются эталонной системой ВЭЖХ.
  6. Рассчитайте качество MDA и DDA в различных продуктах переработки.
  7. Рассчитайте полный балл на основе результатов с помощью метода CRITIC на шаге 6.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретный метод проиллюстрирован на шаге 6.
  8. Введите полученную полную оценку 29 испытаний в компьютер и проанализируйте ее с помощью указанного программного обеспечения (шаг 5, дополнительный файл 1).
  9. Выполните статистическую проверку полиномиальных уравнений и анализ поверхности отклика, нанесенных на графики 3D-моделей, с помощью программного обеспечения (шаги 6-8, дополнительный файл 1).
    1. На левой панели навигации в разделе « Анализ» (+) щелкните Y, а затем нажмите « Начать анализ » в окне «Настройка» (шаг 6, дополнительный файл 1).
    2. Нажмите на ANOVA в верхнем меню и посмотрите на таблицу результатов, отображающую дисперсионный анализ (шаг 7, дополнительный файл 1).
    3. В верхнем меню нажмите « Графики моделей », а затем «3D-поверхность », чтобы получить графики поверхности отклика, отражающие влияние параметров обработки на синтетические оценки (шаг 8, дополнительный файл 1).
  10. Выполните валидацию модели поверхности отклика в трех экземплярах при прогнозируемых оптимальных условиях (этап 9, дополнительный файл 1) для проверки стабильности технологии обработки. На левой панели навигации в разделе « Оптимизация» нажмите « Числовой » Затем в верхнем меню нажмите « Решения». Соблюдайте прогнозируемые оптимальные условия.

6. Оценка модели

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен после завершения каждого однофакторного эксперимента или эксперимента с поверхностью отклика. После завершения каждого эксперимента (например, сравнения толщины среза) содержание MDA и DDA в различных образцах измеряют для получения пяти наборов данных в соответствии с этапом 1.2 и разделом 2. Данные приведены в дополнительной таблице S1.

  1. Безразмерная обработка индекса
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг преобразует измеренное значение (Xij) в безразмерное относительное значение, так что значение каждого индекса находится на одном и том же уровне количества. Эта операция может облегчить всесторонний анализ и сравнение показателей в разных единицах или порядкахвеличины 18. Для иллюстрации значения толщины среза использовались для расчетов, показанных ниже (дополнительная таблица S1).
    1. Стандартизировать содержание MDA (получить yMDA; MDA относится к бензоилаконитину) с использованием формулы в уравнении (2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Индекс «i» обозначает один из четырех факторов, а толщина среза является первым исследованным фактором. Следовательно, значение i равно 1. Индекс «j» обозначает каждый уровень факторов; Таким образом, когда толщина среза равна первому уровню (0,5 см), j равен 1; Когда толщина среза равна пятому уровню (4 см), j равно 5. Содержание MDA (Xij) в обработанных TBC толщиной 0,5, 1, 2, 3 и 4 см составляло 0,9693, 1,0876, 1,3940, 1,4185 и 1,3614 мг/г соответственно. Таким образом, x j, max равен 1,4185, а xj, min равен 0,9693.
      Equation 2(2)
      Таким образом Equation 3
      Здесь Xij — измеренное содержание MDA эксперимента в i-м множителе и на j-м уровне; xj, min – минимальное содержание МДА в данной группе экспериментов; и xj, max — максимальное содержание MDA в этой группе экспериментов. Таким образом, i = 1, 2, ..., m и j = 1, 2, ..., n.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, стандартизированные значения MDA составляют 0,0000, 0,2634, 0,9455, 1,0000 и 0,8729 с использованием уравнения (2).
    2. Стандартизировать общее содержание DDA (получить yDDA; DDA относится к аконитину и 3-дезоксиаконитину) с использованием формулы в уравнении (3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: i - один из четырех факторов, а j - каждый уровень факторов; Xij – измеряемое содержание DDA эксперимента в i-м множителе и на j-м уровне; xj, min - минимальное содержание DDA в этом групповом эксперименте данных; и xj, max — максимальное содержание DDA в этом групповом эксперименте данных. Таким образом, i = 1, 2, ..., m и j = 1, 2, ..., n. Содержание DDA (Xij) в обработанных TBC толщиной 0,5, 1, 2, 3 и 4 см составляло 0,3492, 0,2692, 0,2962, 0,5354, 0,5124 мг/г соответственно. Таким образом, x j, max равен 0,5354, а xj, min равен 0,2692.
      Equation 4(3)
      Equation 5
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартизированные значения: 0,6995, 1,0000, 0,8986, 0,0000 и 0,0864 с использованием уравнения (3).
  2. Рассчитайте соответствующую интенсивность контраста (S i), конфликт (δ i), информацию (C i) и вес индекса (W i) в соответствии с уравнением. (4) - (7), соответственно19,20.
    ПРИМЕЧАНИЕ: i = 1, 2, ..., m. yij - стандартизированные данные содержания MDA или DDA эксперимента в i-м факторе и на j-м уровне.
    1. Чтобы оценить интенсивность контраста, сначала рассчитайте среднее значение MDA.
      Equation 6
      Где Equation 7 — среднее значение MDA.
      Equation 8(4)
      Equation 21
    2. Чтобы вычислить значение конфликта, сначала оцените коэффициент корреляции γij с помощью функции КОРРЕЛ в Excel21.
      Equation 9(5)
      Equation 10
    3. Рассчитайте значения информации следующим образом.
      Equation 11(6)
      Equation 12
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогично, C1, DDAS = 0,7210
    4. Рассчитайте вес индекса следующим образом.
      Equation 13(7)
      Equation 14
      ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, весовые коэффициенты MDA и DDA в сравнении толщины среза были установлены равными 0,4945 и 0,5055 соответственно.
  3. Рассчитайте комплексные оценки толщины срезов.
    Equation 15
    Equation 16
    Equation 17
    Equation 18
    Equation 19
    ПРИМЕЧАНИЕ: Y13 является максимальным значением. Поэтому оптимальным параметром толщины нарезки является третий уровень – 2 см.

   

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом исследовании использованный градиент элюирования имел хорошее разрешение (рис. 1) для трех компонентов индекса в TBC, обжаренном в Zanba, что было определено после повторной отладки. Три компонента индекса в TBC, обжаренном в Занбе, имели хорошую линейную зависимость в определенном диапазоне концентраций (таблица 2). Точность (Таблица 5), стабильность (Таблица 6), повторяемость (Таблица 7) и извлечение образцов (Таблица 8) ТБК, обжаренного в Занбе, находились в пределах методологического диапазона, указанного в Китайской фармакопее (том 4, 2020)22, что указывает на то, что метод осуществим. Таким образом, метод ВЭЖХ был надежным для проведения анализа ТБК, обжаренного в Занбе.

Влияние каждого фактора на технологию обработки было выяснено с помощью однофакторных тестов, результаты которых представлены на рисунке 2. Была визуализирована тенденция всесторонней оценки TBC Zanba-stir-stir в различных условиях. С помощью однофакторных тестов определяли диапазон толщины среза (A, 1-3 см), количества занбы (B, 2-4x), температуры обработки (C, 100-140 °C) и времени обработки (D, 40-80 мин).

Метод CRITIC - это метод объективной оценки, использующий преимущества измеренных данных19,20. Когда каждый индекс имеет очень разные уровни, использование исходного значения индекса непосредственно для анализа приводит к большей роли индекса с более высоким значением в комплексном анализе и меньшей роли индекса с меньшим значением. Поэтому исходные данные показателя должны быть стандартизированы для обеспечения достоверности результатов применительно к экспериментальным значениям в данном исследовании. По результатам теста поверхности отклика и метода CRITIC весовые коэффициенты MDA и DDA в эксперименте с поверхностью отклика были установлены равными 0,5295 и 0,4705 соответственно. Общий балл (Y) может быть рассчитан в соответствии с уравнением (8).

Equation 20(8)

Результаты экспериментального планирования Бокса-Бенкена приведены в таблице 4, а в таблице 9 представлены результаты коэффициентов ANOVA и регрессии. Полиномиальные уравнения комплексных оценок также были получены после анализа программного обеспечения. Значения вероятности менее 0,05 позволяют предположить, что модель значима (p < 0,0001)23; Уравнение в терминах фактических факторов было получено в уравнении (9) (Y: всеобъемлющий балл; A: толщина нарезки; B: количество занбы; C: температура обработки; и D: время обработки). Уравнение показало, что интенсивность влияния на комплексные оценки следует следующему порядку: время обработки > температура обработки > толщина среза > количество занбы для четырех различных факторов.

Y = 89,05 + 4,57A + 2,88 B + 4,63 C - 4,83 D + 5,19AB + 4,91AC + 6,97AD + 6,69BC - 7,05BD - 1,17CD - 22,80 A 2 - 21,93 B 2 - 19,58 C 2 - 27,19D 2 (9)

Поверхности отклика и контурные графики показаны на рисунке 3, демонстрируя изменения синтетических оценок в зависимости от четырех переменных. На основании экспериментальных результатов были определены оптимальные параметры обработки обжаренного в Занбе ТБК: толщина среза 2,117 см, что в 3,118 раза больше, чем у ТБК, температура обработки 123,106 °С и время обработки 58,156 мин. В зависимости от целесообразности операции была скорректирована оптимальная технология обработки Занбы - оптимальная толщина среза ТБК составляла 2 см, количество Занбы - в три раза, температура обработки - 125 °С, а время обработки - 60 мин. Надежность модели была доказана тремя испытаниями, которые проводились по полученным параметрам обработки (табл. 10).

Figure 1
Рисунок 1: Хроматограммы. Хроматограмма раствора образца (А) и смешанного стандартного раствора (В) (1: бензойлаконитин; 2: аконитин; 3: 3: 3-дезоксиаконитин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Синтетические оценки всех отдельных факторов. а) толщина среза; (B) сумма занбы; (C) температура обработки; и (D) время обработки. Результаты показали, что совокупные баллы ТБК, обжаренного в Занбе, являются самыми высокими, когда толщина ломтика составляет 2 см, количество Занбы - в три раза, температура обработки - 120 °C, а время обработки - 60 минут. Таким образом, результаты показали диапазон толщины нарезки (A, 1-3 см), количества занбы (B, 2-4x), температуры обработки (C, 100-140 °C) и времени обработки (D, 40-80 мин), которые будут использоваться для разработки следующего эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Графики поверхности отклика (3D), отражающие влияние параметров обработки на комплексные оценки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Градиент ВЭЖХ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Линейная зависимость компонентов индекса в TBC, обжаренном в Занбе. Результаты показали, что три компонента индекса в ТБК, обжаренном в Занбе, имели хорошую линейную зависимость в определенном диапазоне концентраций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 3: Уровни переменных для экспериментального дизайна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 4: Экспериментальный дизайн Бокса-Бенкена с ответами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 5: Результаты прецизионных измерений. Значения относительного стандартного отклонения (RSD) пиковых областей бензоилаконитина, аконитина и 3-дезоксиаконитина составили 0,42%, 0,71% и 2,95% соответственно (n = 6). Аббревиатура: RSD = относительное стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 6: Результаты испытания на стабильность. Значения RSD пиковых площадей бензойлаконитина, аконитина и 3-дезоксиаконитина составили 1,86%, 0,54% и 2,81% соответственно (n = 6). Аббревиатура: RSD = относительное стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 7: Результаты испытания на воспроизводимость. Значения RSD пиковых областей бензойлаконитина, аконитина и 3-дезоксиаконитина составили 1,99%, 1,84% и 2,41% соответственно (n = 6). Аббревиатура: RSD = относительное стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 8: Измерения скорости извлечения пробы. Значения RSD скорости извлечения бензойлаконитина, аконитина и 3-дезоксиаконитина составили 2,47%, 1,88% и 2,33% соответственно. Аббревиатура: RSD = относительное стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 9: Дисперсионный анализ (ANOVA) результатов экспериментальной модели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 10: Результаты проверочных испытаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Инструкции к программному обеспечению для проектирования Box-Behnken Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S1: Результат расчета толщины среза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TBC является важным тибетским лекарством, способствующим рассеиванию холода и облегчению боли. Он в основном использовался для лечения травматических повреждений и ревматической артралгии в Китае на протяжении тысячелетий24,25,26. Дитерпеноидные алкалоиды являются как активными, так и токсичными ингредиентами TBC27,28,29. Основными токсическими эффектами алкалоидов аконита TBC являются нейротоксичность, кардиотоксичность и желудочно-кишечная токсичность30,31. TBC обычно обрабатывается перед пероральным использованием, чтобы снизить риск токсичности. Различные методы обработки, такие как приготовление на пару, отваривание и жарка на песке, а также обработка отваром Хэцзы, вином Цинкэ и занбой, были полезны для снижения токсичности TBC при сохранении его эффективности1. Среди них важным методом обработки является жарка с перемешиванием занбы. Занба производится из высокогорного ячменя (Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f), который является важным зерном для людей, живущих на Цинхай-Тибетском нагорье32,33. Тем не менее, точные параметры приготовления жареного TBC Zanba до сих пор неясны, поэтому эту технологию обработки необходимо стандартизировать, чтобы обеспечить контроль качества и безопасное применение.

Наиболее важным аспектом метода является то, что индекс оценки был определен с помощью метода CRITIC. Согласно последним исследованиям, высокотоксичные DDA могут быть гидролизованы или пиролизованы в MDA с умеренной токсичностью в процессе нагрева34,35. Исследования показали, что гидролиз аконитина до бензоилаконина является типичным примером36. Поэтому в качестве оценочного показателя при оптимизации технологического процесса были взяты изменения состава в процессе переработки. Метод CRITIC является объективным весовым методом, который в основном учитывает вариацию показателей и конфликт между показателями, которые выражаются стандартным отклонением и коэффициентом корреляции соответственно. Он широко применяется в традиционной китайской медицине37,38. В этом протоколе вес основных компонентов ТБК, обжаренных в Занбе, включая бензойлаконитин, аконитин и 3-дезоксиаконитин, был рассчитан с использованием метода объективного назначения взвешивания CRITIC, который использовался в качестве стандарта оценки ТБК, обжаренного в Занбе.

Одной из ключевых экспериментальных процедур является обеспечение постоянной температуры обработки во время обработки, так как температура обработки сильно влияет на разложение DDA. Поэтому предварительный эксперимент включал использование многих видов нагревательных устройств, таких как индукционная плита, электрическая керамическая плита и многофункциональная машина для жарки. Многофункциональная машина для жарки может поддерживать постоянную температуру и стабилизировать качество обрабатываемого продукта.

Несмотря на то, что оптимизированная технология обработки может эффективно снизить токсичность TBC, ограничения все еще существуют. Во-первых, некоторые из активных ингредиентов в жареном TBC Zanba остаются неизвестными. Таким образом, качественный и количественный анализ не может быть проведен, поскольку соответствующий эталонный продукт недоступен. Больше внимания следует уделять фитохимическим исследованиям для получения целевых компонентов контроля качества. Кроме того, фармакологическое сравнение сырого и жареного ТБК Занба неясно. Следующими целями будут детоксикация и оценка эффектов резервирования эффективности на животных моделях.

Традиционная культура обработки китайской медицины в основном передается от мастера к ученику, и конечная точка обработки обычно оценивается субъективным сознанием людей, что не способствует установлению стандартизированного метода обработки. В данном исследовании параметры цифрового процесса были использованы для указания конечной точки обработки, которая может в определенной степени реализовать комбинацию современных технологий. Таким образом, это исследование стандартизировало технологию обработки жареного Занба для ослабления токсичности и сохранения эффективности TBC. Этот подход может дать полезную информацию и рекомендации по технологии обработки других ядовитых этнических лекарств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была выполнена при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (No 82130113), Китайского фонда постдокторантуры (No 2021MD703800), Научного фонда для молодежи Департамента науки и технологий провинции Сычуань (No 2022NSFSC1449) и Программы содействия исследованиям «Ученые Синлиня» Университета традиционной китайской медицины Чэнду (No 2021). BSH2021009).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Deoxyaconitine Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. DST221109-033
Aconitine Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. DSTDW000602
Ammonium acetate Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd Chromatographic grade
Benzoylaconitine Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. DSTDB005502
Design-Expert software Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, USA version 13.0
Electronic analytical balance Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd. FA1004
High performance liquid chromatography SHIMADZU Co., Ltd. LC-20A
High-speed smashing machine Beijing Zhongxing Weiye Instrument Co., Ltd. FW-100
Millipore filter Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd φ13 0.22 Nylon66
stir-Fry machine Changzhou Maisi Machinery Co., Ltd Type 5
Tiebangchui Gannan Baicao Biotechnology Development Co., Ltd 20211012
Ultra pure water systemic RephiLe Bioscience, Ltd. Genie G
Ultrasonic cleansing machine Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd SB2200
Zanba 27 Chuanzang Road, Ganzi County -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, C. Y., et al. Aconitum pendulum and Aconitum flavum: A narrative review on traditional uses, phytochemistry, bioactivities and processing methods. Journal of Ethnopharmacology. 292, 115216 (2022).
  2. Wang, J., Meng, X. H., Chai, T., Yang, J. L., Shi, Y. P. Diterpenoid alkaloids and one lignan from the roots of Aconitum pendulum Busch. Natural Products and Bioprospecting. 9 (6), 419-423 (2019).
  3. Yu, L., et al. Traditional Tibetan medicine: therapeutic potential in rheumatoid arthritis. Frontiers In Pharmacology. 13, 938915 (2022).
  4. Zhao, R., et al. One case of ventricular arrhythmia caused by poisoning of traditional Chinese medicine Aconitum pendulum Busch. Journal of People's Military Medical. 61 (4), 346-348 (2018).
  5. Qinghai Medical Products Administration. Processing specification of Tibetan medicine of Qinghai province. Qinghai Nationalities Publishing House. , 96-97 (2010).
  6. Li, J., et al. Comparison of three objective weighting methods to optimize the extraction process of Jianwei Chupi granules. Journal of Guangdong Pharmaceutical University. 38 (6), 91-97 (2022).
  7. Feng, Z. G., et al. Processing methods and the underlying detoxification mechanisms for toxic medicinal materials used by ethnic minorities in China: A review. Journal of Ethnopharmacology. 305, 116126 (2023).
  8. Hsu, Y. T., Su, C. S. Application of Box-Behnken design to investigate the effect of process parameters on the microparticle production of ethenzamide through the rapid expansion of the supercritical solutions process. Pharmaceutics. 12 (1), 42 (2020).
  9. Cheng, F., et al. Optimization of the baked drying technology of Cinnamomi Ramulus based on CRITIC combined with box-behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (8), 1838-1842 (2022).
  10. Huang, X., et al. Optimization of microwave processing technology for carbonized Gardenia jasminoides by Box-Behnken response surface methodology based on CRITIC weighted evaluation. Chinese Herbal Medicines. 48 (6), 1133-1138 (2017).
  11. Elling, U., et al. Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells. Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).
  12. Gu, J., Wang, Y. P., Ma, X. Simultaneous determinnation of three diester diterpenoid alkaloids in the toots of Aconiti flavi et penduli by HPLC method. Chinese Pharmaceutical Affairs. 28 (6), 618-621 (2014).
  13. Zhang, Y., Fu, X. UPLC simultaneous determination of six esteric alkaloids components in Aconitum Flaram Hand.Mazz. Asia-Pacific Traditional Medicine. 16 (5), 62-65 (2020).
  14. Rumachik, N. G., Malaker, S. A., Paulk, N. K. VectorMOD: Method for bottom-up proteomic characterization of rAAV capsid post-translational modifications and vector impurities. Frontiers In Immunology. 12, 657795 (2021).
  15. Wang, Y. J., Tao, P., Wang, Y. Attenuated structural transformation of aconitine during sand frying process and antiarrhythmic effect of its converted products. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 7243052 (2021).
  16. Wang, H. P., Zhang, Y. B., Yang, X. W., Zhao, D. Q., Wang, Y. P. Rapid characterization of ginsenosides in the roots and rhizomes of Panax ginseng by UPLC-DAD-QTOF-MS/MS and simultaneous determination of 19 ginsenosides by HPLC-ESI-MS. Journal of Ginseng Research. 40 (4), 382-394 (2016).
  17. vander Leeuw, G., et al. Pain and cognitive function among older adults living in the community. Journals of Gerontology Series A. Biological Sciences and Medical Sciences. 71 (3), 398-405 (2016).
  18. Lao, D., Liu, R., Liang, J. Study on plasma metabolomics for HIV/AIDS patients treated by HAART based on LC/MS-MS. Frontiers in Pharmacology. 13, 885386 (2022).
  19. Li, Y., et al. Evaluation of the effectiveness of VOC-contaminated soil preparation based on AHP-CRITIC-TOPSIS model. Chemosphere. 271, 129571 (2021).
  20. Zhong, S., Chen, Y., Miao, Y. Using improved CRITIC method to evaluate thermal coal suppliers. Scientific Reports. 13 (1), 195 (2023).
  21. Lewis, N. S., et al. Magnetically levitated mesenchymal stem cell spheroids cultured with a collagen gel maintain phenotype and quiescence. Journal of Tissue Engineering. 8, (2017).
  22. Chinese Pharmacopoeia Committee. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. 4, Chinese Medical Science and Technology Press. (2020).
  23. Li, G., et al. Effect of response surface methodology-optimized ultrasound-assisted pretreatment extraction on the composition of essential oil released from tribute citrus peels. Frontiers in Nutrition. 9, 840780 (2022).
  24. Liu, X. F., et al. Hezi inhibits Tiebangchui-induced cardiotoxicity and preserves its anti-rheumatoid arthritis effects by regulating the pharmacokinetics of aconitine and deoxyaconitine. Journal of Ethnopharmacology. 302, 115915 (2023).
  25. Smolen, J. S., et al. Rheumatoid arthritis. Nature Reviews.Disease Primers. 4, 18001 (2018).
  26. Wang, F., et al. C19-norditerpenoid alkaloids from Aconitum szechenyianum and their effects on LPS-activated NO production. Molecules. 21 (9), 1175 (2016).
  27. Wang, B., et al. Study on the alkaloids in Tibetan medicine Aconitum pendulum Busch by HPLC-MSn combined with column chromatography. Journal of Chromatographic Science. 54 (5), 752-758 (2016).
  28. Liu, S., et al. A review of traditional and current methods used to potentially reduce toxicity of Aconitum roots in Traditional Chinese Medicine. Journal of Ethnopharmacology. 207, 237-250 (2017).
  29. Qiu, Z. D., et al. Online discovery of the molecular mechanism for directionally detoxification of Fuzi using real-time extractive electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114216 (2021).
  30. El-Shazly, M., et al. Use, history, and liquid chromatography/mass spectrometry chemical analysis of Aconitum. Journal of Food and Drug Analysis. 24 (1), 29-45 (2016).
  31. Chan, T. Y. K. Aconitum alkaloid poisoning because of contamination of herbs by aconite roots. Phytotherapy Research. 30 (1), 3-8 (2016).
  32. Guo, L., et al. Exploring microbial dynamics associated with flavours production during highland barley wine fermentation. Food Research International. 130, 108971 (2020).
  33. Guo, T. L., Horvath, C., Chen, L., Chen, J., Zheng, B. Understanding the nutrient composition and nutritional functions of highland barley (Qingke): A review. Trends in Food Science & Technology. 103, 109-117 (2020).
  34. Wu, H., et al. Anti-myocardial infarction effects of Radix Aconiti Lateralis Preparata extracts and their influence on small molecules in the heart using matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry imaging. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), 4837 (2019).
  35. Huang, G., et al. Study on cardiotoxicity and mechanism of "Fuzi" extracts based on metabonomics. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3506 (2018).
  36. Li, S. L., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
  37. Xie, Y., et al. Optimization of processing technology of braised Rehmanniae Raidx based on multiple indexes and response surface technology and correlation between components and color. Journal of Chinese Traditional Medicine. 47 (18), 4927-4937 (2022).
  38. Yang, X. Q., Xu, W., Xiao, C. P., Sun, J., Feng, Y. Z. Study on processing technology of Atractylodes chinensis with rice water and its pharmacodynamics of anti-diarrhea. Chinese Herbal Medicines. 53 (1), 78-86 (2022).

Tags

Медицина выпуск 195 Aconitum pendulum Busch. технология обработки Zanba-stir-stir-fried Tiebangchui метод CRITIC метод поверхности реакции
Оптимизация технологии обработки Tiebangchui с Zanba на основе CRITIC в сочетании с методом поверхности отклика Бокса-Бенкена
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S., Yu, L., Li, C., Wang, N.,… More

Li, S., Yu, L., Li, C., Wang, N., Lai, X., Liu, Y., Zhang, Y. Optimization of Processing Technology for Tiebangchui with Zanba Based on CRITIC Combined with Box-Behnken Response Surface Method. J. Vis. Exp. (195), e65139, doi:10.3791/65139 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter