Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Optimering av processteknik för Tiebangchui med Zanba baserat på CRITIC kombinerat med Box-Behnken Response Surface Method

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65139
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 2, 2
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Detta protokoll beskriver en effektiv och standardiserad avgiftningsmetod för Zanba-wokad Tiebangchui med CRITIC i kombination med Box-Behnken-responsytemetoden.

Abstract

Den torkade roten av Aconitum pendel Busch., kallad Tiebangchui (TBC) på kinesiska, är en av de mest kända tibetanska läkemedlen. Det är en allmänt använd ört i nordvästra Kina. Emellertid, många fall av förgiftning har inträffat på grund av TBC: s intensiva toxicitet och eftersom dess terapeutiska och toxiska doser är likartade. Därför är det en brådskande uppgift att hitta en säker och effektiv metod för att minska dess toxicitet. En sökning genom de tibetanska medicinklassikerna visar att bearbetningsmetoden för TBC stekt med Zanba registrerades i "Processing specification of Tibetan medicine of Qinghai Province (2010)". De specifika bearbetningsparametrarna är dock ännu inte klara. Således syftar denna studie till att optimera och standardisera bearbetningstekniken för Zanba-stekt TBC.

Först genomfördes ett enfaktorexperiment på fyra faktorer: skivtjockleken på TBC, mängden Zanba, bearbetningstemperatur och tid. Med monoester- och diesteralkaloidinnehåll i Zanba-wokad TBC som index användes CRITIC i kombination med Box-Behnken-responsytemetoden för att optimera bearbetningstekniken för Zanba-wokad TBC. De optimerade bearbetningsförhållandena för Zanba-wokad TBC var en TBC-skivtjocklek på 2 cm, tre gånger mer Zanba än TBC, en bearbetningstemperatur på 125 ° C och 60 min omrörning. Denna studie bestämde de optimerade och standardiserade bearbetningsförhållandena för användning av Zanba-stekt TBC, vilket ger en experimentell grund för säker klinisk användning och industriell produktion av Zanba-stekt TBC.

Introduction

Den torkade roten av Aconitum pendel Busch och A. flavum Hand.-Mazz., ett av de mest kända tibetanska läkemedlen, kallas Tiebangchui (TBC) på kinesiska 1,2. De torkade rötterna av TBC är till hjälp för att skingra kyla och vind, minska smärta och lugnande chock. Det registrerades i den första volymen av "Drug Standards (Tibetan Medicine) of the Ministry of Health of the People's Republic of China", som säger att de torkade rötterna av TBC vanligtvis används för att behandla reumatoid artrit, blåmärken och andra kalla sjukdomar3. Den kliniska terapeutiska dosen av TBC liknar dock dess toxiska dos, och incidenter av förgiftning eller död har ofta rapporterats på grund av felaktig användning4. Därför har minskning av toxiciteten och bevarandet av effekten av TBC blivit en forskningsplats genom åren.

I tibetansk medicin är bearbetning en av de mest effektiva metoderna för att dämpa TBC: s toxicitet. Enligt "Processing specification of Tibetan medicine of Qinghai Province (2010)" ska de ursprungliga örterna (TBC) placeras i en järngryta och stekas med Zanba tills Zanba blir gul, varefter Zanba avlägsnas och örterna torkas i luft 5,6. Inga specifika processparametrar har dock dokumenterats, vilket gör det svårt att kontrollera bearbetningstekniken och kvaliteten på Zanba-wokad TBC. CRITIC-metoden är en objektiv viktmetod som kan undvika fuzzifiering och subjektivitet och förbättra objektiviteten vid vägning7. Box-Behnken-responsytemetoden kan direkt återspegla interaktionen mellan varje faktor genom polynompassning8. Kombinationen av Box-Behnkens svarsyta och CRITIC-metoden används ofta för att optimera bearbetningstekniken för att förvärva det optimerade bearbetningsprotokollet 9,10. I detta dokument användes en monoester-diterpenoid alkaloid (MDA) (bensoylakonitin) och två diester-diterpenoidalkaloider (DDA) (akonitin, 3-deoxiakonitin) som utvärderingsindex. CRITIC i kombination med Box-Behnken-responsytemetoden tillämpades för att optimera bearbetningstekniken för Zanba-wokad TBC och etablera en standardbearbetningsmetod för klinisk säker användning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Zanba-wokad TBC-bearbetningsmetoden optimerades och standardiserades av CRITIC i kombination med Box-Behnken-responsytmetoden. Bensoylakonitin, akonitin och 3-deoxiakonitin användes som utvärderingsindex under denna procedur.

1. Beredning av provlösning

  1. Bered stamlösningen av referensämnet. Väg exakt 9,94 mg bensoylakonitin, 8,49 mg akonitin och 6,25 mg 3-deoxiakonitin (materialtabell) på en elektronisk analysvåg och placera dem i en 10 ml mätkolv. Tillsätt sedan 0,05% saltsyrametanollösning för att lösa upp de fasta ämnena och späd volymen till 10 ml. Skaka slutligen blandningen väl så att stamlösningen av referensämnet erhålls med masskoncentrationer på 0,9940 mg/ml bensoylakonitin, 0,8490 mg/ml akonitin och 0,6250 mg/ml 3-deoxiakonitin.
    VARNING: Saltsyra är ett mycket frätande material11. Använd rätt skydd, till exempel handskar, en labbrock, skyddsglasögon och en dragskåp.
  2. Bered provlösningen.
    1. Väg upp 2 g Zanba-wokad TBC-pulver i en konisk kolv.
      1. Förbered Zanba-wokad TBC genom att väga 30 g TBC (2 cm) och 90 g Zanba och tillsätt dem i den förvärmda stekmaskinen. Ställ in tid och temperatur på omrörningsmaskinen på 40 min respektive 140 °C. Ställ in maskinen på att slutföra bearbetningen.
      2. Använd en höghastighetskrossmaskin för att mala Zanba-wokad TBC separat i pulverprover som kan passera genom en sikt med 50 nät (0,355 mm).
    2. Tillsätt 3 ml ammoniaklösning och 50 ml blandad lösning av isopropylalkohol och etylacetat (förhållandet 1:1 v/v) i ovanstående E-kolv, baserat på tidigare studier12,13.
      Anmärkning: För att bereda ammoniaklösningen, tillsätt 40 ml koncentrerad ammoniaklösning i en 100 ml mätkolv och fyll med renat vatten till mätledningen. Vidta lämpliga skyddsåtgärder vid användning av koncentrerad ammoniaklösning eftersom den har en stark lukt.
    3. Väg ovanstående prov och E-kolv och notera vikten. Ultraljud i 30 min (spänning: 220 V, frekvens: 40 kHz).
      OBS: Akonitinalkaloider sönderdelas lätt av värme. Således måste temperaturen på ultraljud utvinning vara under 25 °C.
    4. Väg provet och den koniska kolven efter ultraljudsextraktion.
    5. Kompensera för den förlorade vikten genom att tillsätta en blandning av isopropylalkohol och etylacetat (förhållandet 1: 1 v / v).
    6. Filtrera provlösningen. Indunsta 25 ml av filtratet till torrhet med en rotationsindunstare vid 40 °C.
    7. Lös upp återstoden genom att tillsätta 5 ml 0,05% saltsyrametanollösning, filtrera lösningen genom ett 0,2 μm sprutfilter och analysera det genom att utföra högpresterande vätskekromatografi (HPLC).
  3. Bered en blandad referenslösning som innehåller 0,1988 mg/ml bensoylakonitin, 0,0509 mg/ml akonitin och 0,0938 mg/ml 3-deoxiakonitin.
    OBS: Varje standard (0,9940 mg bensoylakonitin, 0,2545 mg akonitin och 0,4690 mg 3-deoxiakonitin) löses i en 5 ml mätkolv i 0,05% saltsyrametanol som upplösningsmedium.
  4. Bered 0,04 M ammoniumacetatbuffert genom att lösa 6,16 g ammoniumacetat (materialtabell) i 2 liter ultrarent vatten (mobil fas A). Justera pH till 8,50 med ammoniak.
    VARNING: Ammoniak är ett farligt material. Använd rätt skydd, till exempel handskar, en labbrock, skyddsglasögon och en dragskåp.
  5. Filtrera 2 L ultraren 100% acetonitril (mobil fas B) och avgasa den.
    VARNING: Acetonitril är ett farligt material13. Använd rätt skydd, till exempel handskar, en labbrock, skyddsglasögon och en dragskåp.

2. Kromatografiska tillstånd

  1. Injicera 10 μl av de förbehandlade provlösningarna i ett HPLC-system med binära pumpar. Använd ett HPLC-system som använder en ODS-3-kolonn (5 μm x 4,6 mm x 250 mm; arbetar vid 30 °C) med mobila faser A och B för separation av MDA och DDA. Injicera varje prov tre gånger för teknisk replikering.
  2. Programmera metoden enligt tabell 1 för ODS-3-kolumnen. Ställ in en flödeshastighet på 1,0 ml / min och detekteringsvåglängden som 235 nm.
  3. Registrera toppområdena för varje målförening.
    OBS: Detaljer om instrumenten finns i materialtabellen.

3. Provning av systemets anpassningsförmåga

Anmärkning: Se avsnitt 2 för kromatografiska förhållanden för att utföra steg 3.1-3.5.

  1. Undersök det linjära förhållandet mellan koncentrationen och toppområdet.
    1. Förbered olika koncentrationer - 19,88, 39,76, 59,64, 159,04, 198,80 och 497,00 μg / ml - av bensoylaconitinlösning.
    2. Förbered olika koncentrationer - 8,49, 16,98, 25,47, 33,96, 50,94 och 169,80 μg / ml - av akonitinlösning.
    3. Förbered olika koncentrationer - 1,875, 12,50, 37,50, 62,50, 93,75 och 125,00 μg / ml - av 3-deoxiakonitinlösning.
    4. Injicera ovanstående referenslösningar från låg masskoncentration till hög masskoncentration och registrera toppområdena.
    5. Hämta tre linjära regressionsekvationer från diagrammet över referenslösningskoncentrationen (μg/L) mot topparean.
      OBS: Se till att koncentrationerna av bensoylakonitin, akonitin och 3-deoxiakonitin faller inom det linjära området för denna standardkurva.
  2. Utför precisionsprovning genom att kontinuerligt injicera sex upprepningar av 10 μl av provlösningen i HPLC-systemet och kör proverna under samma HPLC-betingelser som beskrivs i avsnitt 2. Registrera toppområdena för bensoylakonitin, akonitin och 3-deoxiakonitin.
  3. Utför stabilitetstester genom att injicera 10 μl av den beredda provlösningen och bestäm toppytorna efter 0 timmar, 2 timmar, 4 timmar, 8 timmar, 12 timmar och 24 timmar.
    OBS: Toppområdena registreras automatiskt av det refererade HPLC-systemet. Dessa tidpunkter baserades på relevant litteratur15,16,17.
  4. Utför reproducerbarhetstestet genom att ta samma sats Zanba-wokad TBC för att bereda sex provlösningar parallellt enligt metoden i steg 1.2. Injicera 10 μl av varje prov i HPLC-systemet och kör proverna enligt beskrivningen i avsnitt 2.
    OBS: Reproducerbarheten bedömdes genom jämförelse av koncentrationsskillnaderna mellan de sex proverna.
  5. Utför återhämtningsexperimentet genom att förbereda sex portioner av samma sats Zanba-wokad TBC för testlösningen. Tillsätt sedan ~100 % av referensämnet för varje indexkomponent i sex delar av testlösningen för att beräkna återvinningsgraden. Injicera dessa prover (10 μl) i HPLC-systemet under samma betingelser som beskrivs i avsnitt 2 och beräkna återvinningshastigheten med hjälp av ekvation 1:
    Equation 1(1)
    Anmärkning: I Eq. (1) är A den mängd av komponenten som ska mätas i testlösningen, B är mängden tillsatt referensämne och C är det uppmätta värdet för den lösning som innehåller referensämnet och TBC-provet från Zanba.

4. Enfaktorexperiment

  1. Jämförelse av skivtjocklek
    1. Förbered fem grupper för tester, var och en med 30 g TBC, där tjockleken på TBC är 0,5, 1, 2, 3 respektive 4 cm. Väg en mängd Zanba som är tre gånger så mycket som TBC (90 g).
      OBS: TBC är giftigt. Använd lämpligt skydd, till exempel handskar, en labbrock, skyddsglasögon och dragskåp, och var försiktig under skärprocessen. Genom förexperimentet fann man att tre gånger mängden Zanba krävdes för fullständig kontakt mellan TBC och Zanba. Därför valde studien i den formella experimentella designen tre gånger mängden Zanba när man undersökte skivans tjocklek.
    2. Ställ in temperaturen och tiden för den automatiska omrörningsmaskinen på 140 °C respektive 40 minuter.
    3. Tillsätt ~ 30 g TBC och 90 g Zanba i maskinen efter att den automatiska stekmaskinen har värmts upp till den inställda temperaturen.
    4. Förbered provlösningarna genom att följa steg 1.2. Beräkna innehållet i MDA och DDA i olika bearbetningsprodukter enligt standardkurvan (tabell 2). Beräkna totalpoängen baserat på resultaten via CRITIC-metoden i avsnitt 6.
    5. På detta sätt jämföra mängderna Zanba, samt bearbetningstemperaturer och tider för optimering av förhållandena.
  2. Jämförelse av mängden Zanba
    1. Utför fem grupper av tester, var och en med 30 g TBC (2 cm), där mängden Zanba är en, två, tre, fyra respektive fem gånger så mycket som TBC.
    2. Slå på stekmaskinen för bearbetning. Ställ in tid och temperatur på omrörningsmaskinen på 40 min och 140 °C.
    3. Förbered provlösningarna genom att följa steg 1.2. Beräkna innehållet i MDA och DDA i olika bearbetningsprodukter enligt standardkurvan (tabell 2). Beräkna totalpoängen baserat på resultaten via CRITIC-metoden i avsnitt 6.
  3. Jämförelse av bearbetningstemperatur
    1. Utför fem grupper av tester, vardera med 30 g TBC (2 cm) och 90 g Zanba.
    2. Slå på stekmaskinen för bearbetning. Ställ in bearbetningstemperaturen på 100 °C, 120 °C, 140 °C, 160 °C och 180 °C. Ställ in behandlingstiden som 40 min.
      OBS: Genom förexperiment fann man att hastigheten för Zanba-gulning är mycket låg när bearbetningstemperaturen är under 100 ° C, och Zanba är lätt att bränna och blir svart om temperaturen är för hög (över 180 ° C). Därför sattes 100 °C och 180 °C till minimi- respektive maximivärden för temperatur under bearbetningen.
    3. Förbered provlösningarna genom att följa steg 1.2. Registrera toppområdena för MDA och DDA. Beräkna innehållet i MDA och DDA i olika bearbetningsprodukter enligt standardkurvan (tabell 2). Beräkna totalpoängen baserat på resultaten via CRITIC-metoden i avsnitt 6.
      OBS: Experimentet involverar höga temperaturer på 160 ° C och 180 ° C. Var uppmärksam på säkerheten under experimentet, enligt laboratoriets säkerhetskod.
  4. Jämförelse av behandlingstid
    1. Utför fem grupper av tester, vardera med 30 g TBC (2 cm) och 90 g Zanba.
    2. Slå på stekmaskinen för bearbetning. Ställ in bearbetningstiden på 20, 40, 60, 80 och 100 min. Ställ in temperaturen på 140 °C.
    3. Bered provlösningarna genom att följa beskrivningen i steg 1.2. Registrera toppområdena för MDA och DDA. Beräkna kvaliteten på MDA och DDA i olika bearbetningsprodukter enligt standardkurvan (tabell 2). Beräkna totalpoängen baserat på resultaten via CRITIC-metoden i avsnitt 6.

5. Optimering av bearbetningsteknik av Zanba-wokad TBC med hjälp av responsytemetodik (RSM)

  1. Box-Behnkens design av svarsytan
    1. Bestäm intervallet för skivtjocklek (A, 1-3 cm), mängden Zanba (B, 2-4x), bearbetningstemperaturen (C, 100-140 °C) och bearbetningstiden (D, 40-80 min) genom preliminära experiment med enfaktorstester (steg 4.1-4.4).
      Anm.: De kodade värdena för fyra variabler och deras nivåer visas i tabell 3. Tre nivåer av varje variabel kodades som -1, 0 och 1.
  2. Använd programvara för att generera matrisen och analysera svarsytemodellerna.
    OBS: Skärmbilderna för programvaruanvändningen visas i kompletterande fil 1.
    1. Använd en Box-Behnken-design med tre nivåer och fyra faktorer bestående av 24 experiment (som gjordes i denna studie) och mät fem replikat (körordning 1, 9, 14, 16 och 25) för att beräkna den rena felsumman av kvadrater (tabell 4). Ange den omfattande poängen (Y) som svar (steg 1–4, kompletterande fil 1).
      1. På hemsidan klickar du på Ny design (steg 1, Kompletterande fil 1) och i den vänstra panelen på sidan Design klickar du på Svarsyta | Box-Behnken och ställ in parametrarna för de fyra faktorerna i tabellen (steg 2, Kompletterande fil 1).
      2. Klicka på Nästa (steg 2, Kompletterande fil 1), ange svarsnamnen och klicka på Slutför (steg 3, Kompletterande fil 1).
      3. Generera responsytans design genom ovanstående operation (steg 4, kompletterande fil 1).
  3. Slutför experimentet baserat på de 29 scenarier som utformats för svarsytan.
  4. Förbered provlösningarna genom att följa steg 1.2.
  5. Registrera toppområdena för MDA och DDA.
    OBS: Toppområdena registreras automatiskt av det refererade HPLC-systemet.
  6. Beräkna kvaliteten på MDA och DDA i de olika bearbetningsprodukterna.
  7. Beräkna totalpoängen utifrån resultaten via CRITIC-metoden i steg 6.
    Den specifika metoden illustreras i steg 6.
  8. Ange den erhållna omfattande poängen för 29 försök i datorn och analysera den med hjälp av den refererade programvaran (steg 5, kompletterande fil 1).
  9. Utföra statistisk validering av polynomekvationer och responsyteanalyser plottade i 3D-modellgrafer genom programvaran (steg 6-8, kompletterande fil 1).
    1. I det vänstra navigeringsfönstret , under Analys (+), klickar du på Y och sedan på Starta analys i fönstret Konfigurera (steg 6, Kompletterande fil 1).
    2. Klicka på ANOVA i toppmenyn och observera resultattabellen som visar variansanalys (steg 7, Kompletterande fil 1).
    3. I toppmenyn klickar du på Modelldiagram och sedan 3D-yta för att få fram svarsytediagrammen som återspeglar effekterna av bearbetningsparametrar på de syntetiska poängen (steg 8, Kompletterande fil 1).
  10. Utföra valideringen av responsytemodellen i tre exemplar under de förutsagda optimala förhållandena (steg 9, kompletterande fil 1) för att verifiera bearbetningsteknikens stabilitet. I det vänstra navigeringsfönstret , under Optimering, klicka på Numerisk Klicka sedan på Lösningar i toppmenyn. Observera de förutsagda optimala förhållandena.

6. Utvärdering av modell

OBS: Detta steg ska utföras efter att varje enfaktorexperiment eller responsyteexperiment har slutförts. Efter att varje experiment (t.ex. jämförelse av skivtjocklek) har slutförts mäts innehållet i MDA och DDA i de olika proverna för att erhålla fem dataset, enligt steg 1.2 och avsnitt 2. Uppgifterna visas i tilläggstabell S1.

  1. Dimensionslös bearbetning av indexet
    OBS: Detta steg omvandlar det uppmätta värdet (Xij) till ett dimensionslöst relativt värde, så att värdet för varje index är på samma kvantitetsnivå. Denna operation kan underlätta omfattande analys och jämförelse av indikatorer i olika enheter eller storleksordningar18. I illustrationssyfte har värden för segmenttjocklek använts för beräkningarna nedan (kompletterande tabell S1).
    1. Standardisera innehållet i MDA (erhålla yMDA; MDA avser bensoylakonitin) genom att använda formeln i Eq. (2).
      OBS: Indexet "i" står för en av fyra faktorer, och skivtjocklek är den första faktorn som undersöks. Därför är värdet på i lika med 1. Indexet "j" står för varje nivå av faktorer; Således, när skivtjockleken är den första nivån (0,5 cm), är J lika med 1; När skivtjockleken är den femte nivån (4 cm) är j lika med 5. Innehållet av MDA (Xij) i den bearbetade TBC med tjocklekar på 0,5, 1, 2, 3 och 4 cm var 0,9693, 1,0876, 1,3940, 1,4185 respektive 1,3614 mg / g. Således är x j, max 1,4185 och x j,min är 0,9693.
      Equation 2(2)
      Sålunda Equation 3
      Här är Xij det uppmätta innehållet i experimentets MDA i den i:te faktorn och på j:te nivån; xj, min är minimihalten av MDA i denna grupp av experiment; och xj, max är det maximala innehållet i MDA i denna grupp av experiment. Således är i = 1, 2, ..., m och j = 1, 2, ..., n.
      OBS: Således är de standardiserade värdena för MDA 0,0000, 0,2634, 0,9455, 1,0000 och 0,8729 med Eq. (2).
    2. Standardisera det totala innehållet i utvecklingsagendan från Doha (erhållay DDA; DDA avser akonitin och 3-deoxiakonitin) genom att använda formeln i Eq. (3).
      OBS: i är en av fyra faktorer, och j är varje nivå av faktorerna; Xij är det uppmätta innehållet i DDA i experimentet på i:te faktorn och på j:te nivån, xj, min är minimiinnehållet i utvecklingsagendan från Doha i detta gruppexperiment med data, och xj, max är det maximala innehållet i DDA i detta gruppexperiment av data. På detta sätt är i = 1, 2, ..., m och j = 1, 2, ..., n. Innehållet i DDA (Xij) i den bearbetade TBC med tjocklekar på 0,5, 1, 2, 3 och 4 cm var 0,3492, 0,2692, 0,2962, 0,5354 respektive 0,5124 mg / g. Således är x j, max 0,5354 och x j,min är 0,2692.
      Equation 4(3)
      Equation 5
      De standardiserade värdena är 0,6995, 1,0000, 0,8986, 0,0000 och 0,0864 med Eq. (3).
  2. Beräkna motsvarande kontrastintensitet (S i), konflikt (δ i), information (C i) och indexvikt (W i) enligt Eqs. (4) till (7), respektive19,20.
    OBS: i = 1, 2, ..., m. yij är de standardiserade uppgifterna för MDA- eller DDA-innehållet i experimentet i den i: e faktorn och på j-th nivå.
    1. Om du vill uppskatta kontrastintensiteten beräknar du först det genomsnittliga MDA-värdet.
      Equation 6
      Var Equation 7 är medelvärdet för MDA.
      Equation 8(4)
      Equation 21
    2. För att beräkna konfliktvärdet, uppskatta först korrelationskoefficienten γij med hjälp av KORREL-funktionen i Excel21.
      Equation 9(5)
      Equation 10
    3. Beräkna informationsvärden enligt följande.
      Equation 11(6)
      Equation 12
      På samma sätt, C1, DDAS = 0,7210
    4. Beräkna indexvikten enligt följande.
      Equation 13(7)
      Equation 14
      OBS: Därför fastställdes viktkoefficienterna för MDA och DDA i jämförelse av skivtjocklek till 0,4945 respektive 0,5055.
  3. Beräkna de omfattande poängen för skivtjocklekar.
    Equation 15
    Equation 16
    Equation 17
    Equation 18
    Equation 19
    OBS: Y13 är det maximala värdet. Därför är den bästa parametern för skivtjocklekar den tredje nivån - 2 cm.

   

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denna studie hade den använda elueringsgradienten en bra upplösning (figur 1) för de tre indexkomponenterna i Zanba-wokad TBC, som bestämdes efter upprepad felsökning. De tre indexkomponenterna i Zanba-wokad TBC hade ett bra linjärt förhållande inom ett specifikt koncentrationsintervall (tabell 2). Precisionen (tabell 5), stabiliteten (tabell 6), repeterbarheten (tabell 7) och provåtervinningen (tabell 8) av Zanba-wokad TBC låg alla inom det metodologiska intervall som anges i den kinesiska farmakopén (volym 4, 2020)22, vilket indikerar att metoden var genomförbar. Därför var HPLC-metoden tillförlitlig för att genomföra analysen av Zanba-wokad TBC.

Effekten av varje faktor på bearbetningstekniken belystes med hjälp av enfaktortester, vars resultat visas i figur 2. Trenden med den omfattande poängen för Zanba-stekt TBC under olika förhållanden visualiserades. Intervallet för skivtjocklek (A, 1-3 cm), mängd Zanba (B, 2-4x), bearbetningstemperatur (C, 100-140 °C) och bearbetningstid (D, 40-80 min) bestämdes med hjälp av enfaktortester (figur 2).

CRITIC-metoden är en objektiv utvärderingsmetod som utnyttjar mätdata19,20. När varje index har mycket olika nivåer, resulterar användning av det ursprungliga indexvärdet direkt för analys i en större roll för indexet med ett högre värde i den omfattande analysen och en mindre roll för indexet med ett lägre värde. Därför måste de ursprungliga indikatordata standardiseras för att säkerställa resultatens tillförlitlighet, som tillämpas på experimentvärdena i denna studie. Enligt testresultaten för responsytan och CRITIC-metoden fastställdes viktkoefficienterna för MDA och DDA i responsyteexperimentet till 0,5295 respektive 0,4705. Den samlade poängen (Y) kan beräknas enligt Eq. (8).

Equation 20(8)

Resultaten av Box-Behnkens experimentella design visas i tabell 4, medan tabell 9 visar resultaten av ANOVA- och regressionskoefficienterna. Polynomekvationerna för omfattande poäng erhölls också efter mjukvaruanalysen. Sannolikhetsvärden mindre än 0,05 tydde på att modellen var signifikant (p < 0,0001)23; Ekvationen i termer av faktiska faktorer erhölls i Eq. (9) (Y: omfattande poäng; A: skivtjocklek; B: mängd Zanba; C: bearbetningstemperatur; och D: behandlingstid). Ekvationen indikerade att intensiteten av påverkan på omfattande poäng följer denna ordning: bearbetningstid > bearbetningstemperatur > skivtjocklek > mängd Zanba för fyra olika faktorer.

Y = 89,05 + 4,57 A + 2,88 B + 4,63 C - 4,83 D + 5,19AB + 4,91AC + 6,97AD + 6,69BC - 7,05BD - 1,17CD - 22,80A 2 - 21,93 B 2 - 19,58 C 2 - 27,19D 2 (9)

Svarsytorna och konturdiagrammen visas i figur 3, som visar förändringarna i syntetiska poäng som en funktion av fyra variabler. På grundval av de experimentella resultaten bestämdes de optimala bearbetningsparametrarna för Zanba-stekt TBC till följande: skivtjocklek på 2.117 cm, 3.118 gånger mer Zanba än TBC, bearbetningstemperatur på 123.106 ° C och bearbetningstid på 58.156 min. Beroende på operationens genomförbarhet justerades den optimala bearbetningstekniken för Zanba - den optimala skivtjockleken på TBC var 2 cm, mängden Zanba var tre gånger, bearbetningstemperaturen var 125 °C och bearbetningstiden var 60 min. Modellens tillförlitlighet bevisades genom tre tester som utfördes enligt de erhållna bearbetningsparametrarna (tabell 10).

Figure 1
Figur 1: Kromatogram. Kromatogrammet av provlösningen (A) och den blandade standardlösningen (B) (1: bensoylakonitin; 2: akonitin; 3: 3-deoxiakonitin). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: De syntetiska poängen för alla enskilda faktorer . a) Skivans tjocklek. b) Zanbas belopp. c) Bearbetningstemperatur. och (D) behandlingstid. Resultaten visade att de omfattande poängen av Zanba-wokad TBC är högst när skivans tjocklek är 2 cm, mängden Zanba är tre gånger, bearbetningstemperaturen är 120 ° C och bearbetningstiden är 60 min. Så resultaten visade intervallet för skivtjocklek (A, 1-3 cm), mängd Zanba (B, 2-4x), bearbetningstemperatur (C, 100-140 ° C) och bearbetningstid (D, 40-80 min) som skulle användas för att utforma nästa experiment. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Svarsytediagram (3D) som återspeglar effekterna av bearbetningsparametrar på omfattande poäng. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: HPLC-gradienten. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Det linjära förhållandet mellan indexkomponenterna i Zanba-wokad TBC. Resultaten tyder på att de tre indexkomponenterna i Zanba-wokad TBC hade ett bra linjärt förhållande inom ett visst koncentrationsintervall. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Nivåer av variabler för försöksplaneringen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 4: Box-Behnkens experimentella design med svar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 5: Resultaten av precisionsmätningen. De relativa standardavvikelsevärdena (RSD) för toppområdena bensoylakonitin, akonitin och 3-deoxiakonitin var 0,42%, 0,71% respektive 2,95% (n = 6). Förkortning: RSD = relativ standardavvikelse. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 6: Resultaten av stabilitetstestet. RSD-värdena för toppområdena bensoylakonitin, akonitin och 3-deoxiaconitin var 1,86%, 0,54% respektive 2,81% (n = 6). Förkortning: RSD = relativ standardavvikelse. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 7: Resultaten av reproducerbarhetstestet. RSD-värdena för toppområdena bensoylakonitin, akonitin och 3-deoxiakonitin var 1,99%, 1,84% respektive 2,41% (n = 6). Förkortning: RSD = relativ standardavvikelse. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 8: Mätningar av återvinningsgraden. RSD-värdena för återvinningsgraden för bensoylakonitin, akonitin och 3-deoxiakonitin var 2,47%, 1,88% respektive 2,33%. Förkortning: RSD = relativ standardavvikelse. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 9: Variansanalys (ANOVA) resultat av experimentmodellen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 10: Resultaten av verifiering av tester. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande fil 1: Instruktionerna för designprogrammet Box-Behnken Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell S1: Beräkningsresultatet av skivans tjocklek. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TBC är ett viktigt tibetanskt läkemedel med effekterna av att skingra kyla och lindra smärta. Det har mest använts för att behandla traumatisk skada och reumatisk artralgi i Kina i tusentals år24,25,26. Diterpenoidalkaloider är både aktiva och giftiga ingredienser i TBC27,28,29. De viktigaste toxiska effekterna av aconitumalkaloiderna av TBC är neurotoxicitet, kardiotoxicitet och gastrointestinal toxicitet30,31. TBC behandlas vanligtvis före oral användning för att minska risken för toxicitet. Olika bearbetningsmetoder, såsom ångning, avkokning och sandstekning, samt bearbetning med Hezi-avkok, Qingke-vin och Zanba, har varit användbara för att minska toxiciteten hos TBC samtidigt som dess effektivitet bevaras1. Bland dem är Zanba-stekning en viktig bearbetningsmetod. Zanba produceras av höglandskorn (Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f), som är ett viktigt spannmål för människor som bor på Qinghai-Tibet-platån32,33. De exakta parametrarna för att formulera Zanba-wokad TBC är dock fortfarande oklara, varför denna bearbetningsteknik måste standardiseras för att säkerställa kvalitetskontroll och säker tillämpning.

Den mest avgörande aspekten av metoden är att utvärderingsindexet bestämdes med CRITIC-metoden. Enligt nyligen genomförda studier kan mycket giftiga DDA hydrolyseras eller pyrolyseras till en MDA med måttlig toxicitet under uppvärmningsprocessen34,35. Studier har visat att akonitinhydrolys till bensoylakonin är det typiska exemplet36. Därför togs sammansättningsförändringarna i bearbetningsprocessen som utvärderingsindex i processteknikoptimeringen. CRITIC-metoden är en objektivviktmetod som huvudsakligen beaktar variationen av indikatorer och konflikten mellan indikatorer, som uttrycks av standardavvikelsen respektive korrelationskoefficienten. Det har använts i stor utsträckning vid bearbetning av traditionell kinesisk medicin37,38. I detta protokoll beräknades vikten av huvudkomponenterna i Zanba-wokad TBC, inklusive bensoylakonitin, akonitin och 3-deoxiakonitin, med hjälp av CRITIC-vägningsmetoden för objektiv tilldelning, som användes som utvärderingsstandard för Zanba-wokad TBC.

Ett av de viktigaste experimentella förfarandena är att säkerställa en konstant bearbetningstemperatur under bearbetningen, eftersom bearbetningstemperaturen i hög grad påverkar sönderdelningen av DDA. Därför involverade förexperimentet användningen av många typer av värmeanordningar, såsom en induktionskokare, elektrisk keramisk spis och multifunktionell stekmaskin. Den multifunktionella stekmaskinen kan hålla en konstant temperatur och stabilisera kvaliteten på den bearbetade produkten.

Även om den optimerade bearbetningstekniken kan minska TBC: s toxicitet effektivt, finns det fortfarande begränsningar. För det första är några av de aktiva ingredienserna i Zanba-wokad TBC fortfarande okända. Därför kan kvalitativ och kvantitativ analys inte utföras eftersom den relevanta referensprodukten inte finns tillgänglig. Mer uppmärksamhet bör ägnas åt fytokemiska undersökningar för att uppnå målkomponenterna för kvalitetskontroll. Dessutom är den farmakologiska jämförelsen av rå och Zanba-wokad TBC oklar. Avgiftning och utvärdering av effektreservationseffekter i djurmodeller kommer att vara nästa mål.

Traditionell kinesisk medicinbearbetningskultur överförs huvudsakligen från mästare till lärling, och slutpunkten för bearbetning bedöms i allmänhet av människors subjektiva medvetande, vilket inte bidrar till upprättandet av en standardiserad bearbetningsmetod. I denna studie användes digitala processparametrar för att specificera bearbetningsslutpunkten, vilket till viss del kan realisera kombinationen av modern teknik. Sammanfattningsvis standardiserade denna studie Zanba-wokad bearbetningsteknik för toxisk dämpning och effektreservation av TBC. Detta tillvägagångssätt kan ge användbar information och vägledning för bearbetning av teknik för andra giftiga etniska läkemedel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes ekonomiskt av National Natural Science Foundation of China (nr 82130113), China Postdoctoral Science Foundation (nr 2021MD703800), Science Foundation for Youths of Science & Technology Department of Sichuan-provinsen (nr 2022NSFSC1449) och "Xinglin Scholars" Research Promotion Program vid Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (nr. BSH2021009).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Deoxyaconitine Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. DST221109-033
Aconitine Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. DSTDW000602
Ammonium acetate Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd Chromatographic grade
Benzoylaconitine Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. DSTDB005502
Design-Expert software Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN, USA version 13.0
Electronic analytical balance Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd. FA1004
High performance liquid chromatography SHIMADZU Co., Ltd. LC-20A
High-speed smashing machine Beijing Zhongxing Weiye Instrument Co., Ltd. FW-100
Millipore filter Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd φ13 0.22 Nylon66
stir-Fry machine Changzhou Maisi Machinery Co., Ltd Type 5
Tiebangchui Gannan Baicao Biotechnology Development Co., Ltd 20211012
Ultra pure water systemic RephiLe Bioscience, Ltd. Genie G
Ultrasonic cleansing machine Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd SB2200
Zanba 27 Chuanzang Road, Ganzi County -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, C. Y., et al. Aconitum pendulum and Aconitum flavum: A narrative review on traditional uses, phytochemistry, bioactivities and processing methods. Journal of Ethnopharmacology. 292, 115216 (2022).
  2. Wang, J., Meng, X. H., Chai, T., Yang, J. L., Shi, Y. P. Diterpenoid alkaloids and one lignan from the roots of Aconitum pendulum Busch. Natural Products and Bioprospecting. 9 (6), 419-423 (2019).
  3. Yu, L., et al. Traditional Tibetan medicine: therapeutic potential in rheumatoid arthritis. Frontiers In Pharmacology. 13, 938915 (2022).
  4. Zhao, R., et al. One case of ventricular arrhythmia caused by poisoning of traditional Chinese medicine Aconitum pendulum Busch. Journal of People's Military Medical. 61 (4), 346-348 (2018).
  5. Qinghai Medical Products Administration. Processing specification of Tibetan medicine of Qinghai province. Qinghai Nationalities Publishing House. , 96-97 (2010).
  6. Li, J., et al. Comparison of three objective weighting methods to optimize the extraction process of Jianwei Chupi granules. Journal of Guangdong Pharmaceutical University. 38 (6), 91-97 (2022).
  7. Feng, Z. G., et al. Processing methods and the underlying detoxification mechanisms for toxic medicinal materials used by ethnic minorities in China: A review. Journal of Ethnopharmacology. 305, 116126 (2023).
  8. Hsu, Y. T., Su, C. S. Application of Box-Behnken design to investigate the effect of process parameters on the microparticle production of ethenzamide through the rapid expansion of the supercritical solutions process. Pharmaceutics. 12 (1), 42 (2020).
  9. Cheng, F., et al. Optimization of the baked drying technology of Cinnamomi Ramulus based on CRITIC combined with box-behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (8), 1838-1842 (2022).
  10. Huang, X., et al. Optimization of microwave processing technology for carbonized Gardenia jasminoides by Box-Behnken response surface methodology based on CRITIC weighted evaluation. Chinese Herbal Medicines. 48 (6), 1133-1138 (2017).
  11. Elling, U., et al. Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells. Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).
  12. Gu, J., Wang, Y. P., Ma, X. Simultaneous determinnation of three diester diterpenoid alkaloids in the toots of Aconiti flavi et penduli by HPLC method. Chinese Pharmaceutical Affairs. 28 (6), 618-621 (2014).
  13. Zhang, Y., Fu, X. UPLC simultaneous determination of six esteric alkaloids components in Aconitum Flaram Hand.Mazz. Asia-Pacific Traditional Medicine. 16 (5), 62-65 (2020).
  14. Rumachik, N. G., Malaker, S. A., Paulk, N. K. VectorMOD: Method for bottom-up proteomic characterization of rAAV capsid post-translational modifications and vector impurities. Frontiers In Immunology. 12, 657795 (2021).
  15. Wang, Y. J., Tao, P., Wang, Y. Attenuated structural transformation of aconitine during sand frying process and antiarrhythmic effect of its converted products. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 7243052 (2021).
  16. Wang, H. P., Zhang, Y. B., Yang, X. W., Zhao, D. Q., Wang, Y. P. Rapid characterization of ginsenosides in the roots and rhizomes of Panax ginseng by UPLC-DAD-QTOF-MS/MS and simultaneous determination of 19 ginsenosides by HPLC-ESI-MS. Journal of Ginseng Research. 40 (4), 382-394 (2016).
  17. vander Leeuw, G., et al. Pain and cognitive function among older adults living in the community. Journals of Gerontology Series A. Biological Sciences and Medical Sciences. 71 (3), 398-405 (2016).
  18. Lao, D., Liu, R., Liang, J. Study on plasma metabolomics for HIV/AIDS patients treated by HAART based on LC/MS-MS. Frontiers in Pharmacology. 13, 885386 (2022).
  19. Li, Y., et al. Evaluation of the effectiveness of VOC-contaminated soil preparation based on AHP-CRITIC-TOPSIS model. Chemosphere. 271, 129571 (2021).
  20. Zhong, S., Chen, Y., Miao, Y. Using improved CRITIC method to evaluate thermal coal suppliers. Scientific Reports. 13 (1), 195 (2023).
  21. Lewis, N. S., et al. Magnetically levitated mesenchymal stem cell spheroids cultured with a collagen gel maintain phenotype and quiescence. Journal of Tissue Engineering. 8, (2017).
  22. Chinese Pharmacopoeia Committee. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. 4, Chinese Medical Science and Technology Press. (2020).
  23. Li, G., et al. Effect of response surface methodology-optimized ultrasound-assisted pretreatment extraction on the composition of essential oil released from tribute citrus peels. Frontiers in Nutrition. 9, 840780 (2022).
  24. Liu, X. F., et al. Hezi inhibits Tiebangchui-induced cardiotoxicity and preserves its anti-rheumatoid arthritis effects by regulating the pharmacokinetics of aconitine and deoxyaconitine. Journal of Ethnopharmacology. 302, 115915 (2023).
  25. Smolen, J. S., et al. Rheumatoid arthritis. Nature Reviews.Disease Primers. 4, 18001 (2018).
  26. Wang, F., et al. C19-norditerpenoid alkaloids from Aconitum szechenyianum and their effects on LPS-activated NO production. Molecules. 21 (9), 1175 (2016).
  27. Wang, B., et al. Study on the alkaloids in Tibetan medicine Aconitum pendulum Busch by HPLC-MSn combined with column chromatography. Journal of Chromatographic Science. 54 (5), 752-758 (2016).
  28. Liu, S., et al. A review of traditional and current methods used to potentially reduce toxicity of Aconitum roots in Traditional Chinese Medicine. Journal of Ethnopharmacology. 207, 237-250 (2017).
  29. Qiu, Z. D., et al. Online discovery of the molecular mechanism for directionally detoxification of Fuzi using real-time extractive electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114216 (2021).
  30. El-Shazly, M., et al. Use, history, and liquid chromatography/mass spectrometry chemical analysis of Aconitum. Journal of Food and Drug Analysis. 24 (1), 29-45 (2016).
  31. Chan, T. Y. K. Aconitum alkaloid poisoning because of contamination of herbs by aconite roots. Phytotherapy Research. 30 (1), 3-8 (2016).
  32. Guo, L., et al. Exploring microbial dynamics associated with flavours production during highland barley wine fermentation. Food Research International. 130, 108971 (2020).
  33. Guo, T. L., Horvath, C., Chen, L., Chen, J., Zheng, B. Understanding the nutrient composition and nutritional functions of highland barley (Qingke): A review. Trends in Food Science & Technology. 103, 109-117 (2020).
  34. Wu, H., et al. Anti-myocardial infarction effects of Radix Aconiti Lateralis Preparata extracts and their influence on small molecules in the heart using matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry imaging. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), 4837 (2019).
  35. Huang, G., et al. Study on cardiotoxicity and mechanism of "Fuzi" extracts based on metabonomics. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3506 (2018).
  36. Li, S. L., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
  37. Xie, Y., et al. Optimization of processing technology of braised Rehmanniae Raidx based on multiple indexes and response surface technology and correlation between components and color. Journal of Chinese Traditional Medicine. 47 (18), 4927-4937 (2022).
  38. Yang, X. Q., Xu, W., Xiao, C. P., Sun, J., Feng, Y. Z. Study on processing technology of Atractylodes chinensis with rice water and its pharmacodynamics of anti-diarrhea. Chinese Herbal Medicines. 53 (1), 78-86 (2022).

Tags

Medicin utgåva 195 Aconitum pendel Busch. bearbetningsteknik Zanba-wokad Tiebangchui CRITIC-metod responsytemetod
Optimering av processteknik för Tiebangchui med Zanba baserat på CRITIC kombinerat med Box-Behnken Response Surface Method
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S., Yu, L., Li, C., Wang, N.,… More

Li, S., Yu, L., Li, C., Wang, N., Lai, X., Liu, Y., Zhang, Y. Optimization of Processing Technology for Tiebangchui with Zanba Based on CRITIC Combined with Box-Behnken Response Surface Method. J. Vis. Exp. (195), e65139, doi:10.3791/65139 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter