Summary
फ्रूट फ्लाई (ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर) का व्यापक रूप से जैविक और विष विज्ञान अनुसंधान के लिए उपयोग किया जाता है। मक्खियों की उपयोगिता का विस्तार करने के लिए, हमने एक उपकरण, सीरियल एनेस्थीसिया सरणी विकसित की, जो एक साथ कई फ्लाई नमूनों को वाष्पशील सामान्य एनेस्थेटिक्स (वीजीए) में उजागर करता है, जिससे वीजीए के संपार्श्विक प्रभावों (विषाक्त और सुरक्षात्मक) की जांच करना संभव हो जाता है।
Abstract
वाष्पशील सामान्य एनेस्थेटिक्स (वीजीए) का उपयोग दुनिया भर में सभी उम्र और चिकित्सा स्थितियों के लाखों लोगों पर किया जाता है। पर्यवेक्षक को "संज्ञाहरण" के रूप में प्रस्तुत मस्तिष्क समारोह के गहन और अभौतिक दमन को प्राप्त करने के लिए वीजीए (सैकड़ों माइक्रोमोलर से कम मिलीमोलर) की उच्च सांद्रता आवश्यक है। लिपोफिलिक एजेंटों की ऐसी उच्च सांद्रता से उत्पन्न संपार्श्विक प्रभावों का पूरा स्पेक्ट्रम ज्ञात नहीं है, लेकिन प्रतिरक्षा-भड़काऊ प्रणाली के साथ बातचीत का उल्लेख किया गया है, हालांकि उनके जैविक महत्व को समझा नहीं गया है।
जानवरों में वीजीए के जैविक प्रभावों की जांच करने के लिए, हमने फल मक्खी (ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर) द्वारा पेश किए गए प्रयोगात्मक लाभों का फायदा उठाने के लिए सीरियल एनेस्थीसिया सरणी (एसएए) नामक एक प्रणाली विकसित की। एसएए में श्रृंखला में व्यवस्थित आठ कक्ष होते हैं और एक सामान्य प्रवाह से जुड़े होते हैं। कुछ भाग प्रयोगशाला में उपलब्ध हैं, और अन्य आसानी से गढ़े या खरीदे जा सकते हैं। एक वेपोराइज़र, जो वीजीए के कैलिब्रेटेड प्रशासन के लिए आवश्यक है, एकमात्र व्यावसायिक रूप से निर्मित घटक है। वीजीए ऑपरेशन के दौरान एसएए के माध्यम से बहने वाले वायुमंडल का केवल एक छोटा प्रतिशत है, क्योंकि थोक (आमतौर पर 95% से अधिक) वाहक गैस है; डिफ़ॉल्ट वाहक हवा है। हालांकि, ऑक्सीजन और किसी भी अन्य गैसों की जांच की जा सकती है।
पूर्व प्रणालियों पर एसएए का प्रमुख लाभ यह है कि यह वीजीए की बिल्कुल टिटरेबल खुराक के लिए मक्खियों के कई समूहों के एक साथ संपर्क की अनुमति देता है। वीजीए की समान सांद्रता सभी कक्षों में मिनटों के भीतर प्राप्त की जाती है, इस प्रकार अप्रभेद्य प्रयोगात्मक स्थितियां प्रदान करती हैं। प्रत्येक कक्ष में एक ही मक्खी से लेकर सैकड़ों मक्खियां हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, एसएए एक साथ आठ अलग-अलग जीनोटाइप या विभिन्न जैविक चर (जैसे, पुरुष बनाम महिला, पुराने बनाम युवा) के साथ चार जीनोटाइप की जांच कर सकता है। हमने न्यूरोइन्फ्लेमेशन-माइटोकॉन्ड्रियल म्यूटेंट और दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (टीबीआई) से जुड़े दो प्रयोगात्मक फ्लाई मॉडल में वीजीए के फार्माकोडायनामिक्स और उनके फार्माकोजेनेटिक इंटरैक्शन की जांच करने के लिए एसएए का उपयोग किया है।
Introduction
संपार्श्विक एनेस्थेटिक प्रभावों का अस्तित्व (यानी, ऐसे प्रभाव जो तुरंत देखने योग्य नहीं हैं लेकिन व्यवहार संबंधी परिणामों में देरी हो सकती है) को आम तौर पर स्वीकार किया जाता है, लेकिन उनके तंत्र और जोखिम कारकों की समझ अल्पविकसित बनी हुई है। उनकी विलंबित अभिव्यक्ति और सूक्ष्मता संभावित महत्वपूर्ण चर की संख्या को सीमित करती है जिन्हें स्तनधारी मॉडल में उचित समय सीमा के भीतर और स्वीकार्य लागत पर जांच की जा सकती है। फ्रूट फ्लाई (ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर) न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग3 के संदर्भ में और टॉक्सिकोलॉजिकल स्क्रीनिंग4 के लिए अद्वितीय लाभ प्रदान करता है, जो आज तक एनेस्थेटिक संपार्श्विक प्रभावों के अध्ययन के लिए लागू नहीं किया गया है।
हमने एनेस्थेटिक फार्माकोडायनामिक्स और फार्माकोजेनेटिक्स के अध्ययन में फल मक्खियों के उपयोग की सुविधा के लिए सीरियल एनेस्थीसिया सरणी (एसएए) विकसित किया। एसएए का एक महत्वपूर्ण लाभ कई समूहों की समान प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए एक साथ जोखिम है। जब फल मक्खियों के प्रयोगात्मक लचीलेपन के साथ जोड़ा जाता है, तो एसएए का उच्च थ्रूपुट स्तनधारी मॉडल में असंभव पैमाने पर जैविक और पर्यावरणीय चर की खोज की अनुमति देता है।
सिद्धांत रूप में, एसएए केवल जुड़े एनेस्थेटाइजिंग स्थानों (50 एमएल शीशियों से बने कक्ष) की एक श्रृंखला है जिसके माध्यम से एक वाहक गैस वाष्पशील एजेंटों को वितरित करती है। सिस्टम के पहले कक्ष में आसुत जल होता है जिसके माध्यम से वाहक गैस आर्द्र होती है (मक्खियां निर्जलीकरण के प्रति संवेदनशील होती हैं), और यह एक साधारण प्रवाह संकेतक के साथ समाप्त होती है जो सिस्टम के माध्यम से गैस प्रवाह को इंगित करती है। कनेक्टिंग ट्यूबिंग के उद्घाटन पर लगाए गए महीन जाल कक्षों के बीच मक्खियों के प्रवास को रोकने के लिए कक्षों को अलग करते हैं। "श्रृंखला में" स्थानों की संख्या दबाव रहित गैस प्रवाह (ट्यूबिंग, जाल) के प्रतिरोध से सीमित है।
हमने पिछले प्रकाशन 5 में इस एसएए प्रोटोटाइप के कैनेटीक्स की विशेषताबताई। यद्यपि सटीक फार्माकोकाइनेटिक गुण एसएए के बीच भिन्न होंगे, प्रयोगात्मक रूप से परीक्षण की गई प्रासंगिक मूल बातें इस प्रकार हैं: (i) 1.5-2 एल / मिनट का प्रारंभिक प्रवाह 2 मिनट के भीतर एनेस्थेटिक की वांछित एकाग्रता के साथ सभी कक्षों (±550 एमएल की कुल मात्रा) को बराबर करता है; (ii) कक्षों में वितरित एनेस्थेटिक वाष्प की सांद्रता पहले और अंतिम स्थान के बीच काफी हद तक नहीं बदलती है क्योंकि एक व्यक्तिगत कक्ष (50 एमएल) में गैस की मात्रा में निहित एनेस्थेटिक की मात्रा किसी भी संख्या में मक्खियों द्वारा ली गई मात्रा से कहीं अधिक है; और (iii) एक बार जब कक्ष ों का संतुलन हो जाता है, तो पर्यावरण के अपशिष्ट और संदूषण से बचने के लिए वाहक गैस प्रवाह को कम (50-100 एमएल / मिनट या उससे कम) किया जा सकता है (वाष्पशील एनेस्थेटिक्स में ग्रीनहाउस गैस गुण होते हैं)। वाष्प की स्थिर-अवस्था एकाग्रता को बनाए रखने के लिए आवश्यक न्यूनतम प्रवाह मुख्य रूप से एसएए की रिसाव पर निर्भर करता है, क्योंकि मक्खियों द्वारा वाष्प का उत्थान नगण्य है। इन मानक स्थितियों (2% आइसोफ्लुरेन और 1.5 एल / मिनट वाहक गैस प्रवाह) के तहत, मक्खियों को 3-4 मिनट के भीतर सरणी के सभी पदों में एनेस्थेटाइज्ड (यानी, स्थिर) किया जाता है, जिसमें पदों के बीच ध्यान देने योग्य अंतर होता है। वीजीए को मिनटों से घंटों तक प्रशासित किया जा सकता है, और हमारे विशिष्ट जोखिम प्रतिमान 15 मिनट से 2 घंटे की सीमा में हैं। सिस्टम को फ्लश करने के लिए, वेपोराइज़र को बंद कर दिया जाता है, और सरणी के लगभग 10x वॉल्यूम (5 मिनट के लिए 1.5 L / min) का आदान-प्रदान करने के लिए प्रवाह बनाए रखा जाता है। एनेस्थेटिक उन्मूलन की गति प्रवाह की निर्धारित दर के साथ भिन्न होगी।
वाष्पशील एनेस्थेटिक एजेंट कई अभी भी अज्ञात लक्ष्यों के साथ बातचीत करते हैं, जिसमें प्रतिरक्षा-भड़काऊ प्रणाली6 शामिल है। प्राथमिक बनाम संपार्श्विक परिणामों ("एनेस्थेटिक स्थिति" बनाम दीर्घकालिक और अल्पकालिक "साइड इफेक्ट्स") के लिए व्यक्तिगत आणविक लक्ष्यों का योगदान खराब समझा जाता है। इसलिए, मक्खियों और स्तनधारियों के बीच स्पष्ट अंतर के बावजूद, उच्च जानवरों में प्रयोगों को सूचित करने के लिए एक संवेदनशील, उच्च-थ्रूपुट फ्लाई सिस्टम मूल्यवानहै। कुछ अंतर, वास्तव में, फायदेमंद हो सकते हैं; उदाहरण के लिए, मक्खी की प्रतिरक्षा प्रणाली उच्च जानवरों से भिन्न होती है जिसमेंप्रतिक्रिया 8 के अनुकूली हाथ का अभाव होता है। हालांकि यह मनुष्यों में बीमारी को समझने के लिए एक सीमा की तरह लग सकता है, यह अनुकूली प्रतिक्रिया 9 से अलगाव में जन्मजात प्रतिरक्षा-भड़काऊ प्रतिक्रिया के साथ वीजीए की बातचीत का अध्ययन करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करताहै। यह एक आबादी में मौजूद विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि द्वारा सूजन और उनके मॉड्यूलेशन पर वीजीए के फार्माकोलॉजिकल प्रभावों के अध्ययन की अनुमति देता है।
Protocol
नोट: प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
1. एसएए का निर्माण
- चित्र 1 ए में आयामों का उपयोग करके लकड़ी काटकर और फ्रेम को इकट्ठा करके फ्रेम बनाएं।
- 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब कैप्स को संशोधित करें।
- ड्रिल बिट में 9/32 के साथ प्रत्येक टोपी में दो छेद ड्रिल करें। रैगिंग प्लास्टिक को साफ करने के लिए छेद को रेत दें। सतह को खुरदरा करने के लिए टोपी के शीर्ष को रेत दें (यह गोंद आसंजन के साथ मदद करता है)।
- प्लास्टिक को स्कोर करके आकार में 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट (प्रवाह के लिए 3 इंच और बहिर्वाह के लिए 1.5 इंच) काटें और फिर इसे स्कोर की गई लाइन पर साफ तोड़ दें। कटे हुए/टूटे हुए पिपेट के सिरों को रेत दें।
- ट्यूबों पर गोंद जाल (चिपकने वाले के लिए उचित सुखाने का समय दें)। चिपकने वाला सूखने के बाद जाल को ट्यूब के आकार में काट लें।
- शंक्वाकार टोपी के छेद में ट्यूबों को डालें, जिसमें दोनों ट्यूब कैप के ऊपर (3/4 इंच) फैली हुई हैं; सुनिश्चित करें कि प्रवाह ट्यूब बहिर्वाह की तुलना में ट्यूब में अधिक समय तक फैली हुई है (चित्रा 1 बी)।
- भागों को एक साथ सुरक्षित करने के लिए ट्यूबों के चारों ओर कैप्स के शीर्ष पर गोंद लागू करें (जारी रखने से पहले चिपकने वाले के लिए उचित सुखाने का समय दें)।
- फ्रेम से कैप्स संलग्न करें, और ट्यूबिंग को रूट करें (चित्रा 1 सी)।
- फ्रेम में चिपकने वाला केबल टाई-डाउन संलग्न करें (3.25 अलग, केंद्र से केंद्र)।
- ज़िप टाई का उपयोग करके फ्रेम पर कैप चिपकाएं; ज़िप टाई टैग को काटें और छोटा हो जाता है।
- प्रत्येक संशोधित कैप (चित्रा 1 डी) पर अंतर्वाह / बहिर्वाह ट्यूबों के लिए टायगन ट्यूबिंग की लंबाई (9 इंच) को काटें और कनेक्ट करें। अपस्ट्रीम छोर से शुरू करके, पहले प्रवाह से जुड़ें, और फिर बाद में आउटफ्लो से अगली स्थिति के प्रवाह के लिए टयूबिंग संलग्न करें।
- सबसे डाउनस्ट्रीम "इनफ्लो" (स्थिति 10, चित्रा 1 ई) में एक प्रवाह संकेतक जोड़ें।
- पहली स्थिति पर एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब डालें, और इसे इनफ्लो ट्यूब के ठीक नीचे पानी से भरें (चित्रा 1 एफ)।
- वेपोराइज़र के लिए इंटरफेसिंग तैयार करें। प्लंजर्स को हटा दें, दो 10 एमएल डिस्पेंसिंग सिरिंज (1/2 में गहरी x 1/4 चौड़ा, चित्रा 1 जी) में से डिग्री काट लें, और उन्हें छिद्रों के साथ संरेखित करने के लिए सीधे वेपोराइज़र के सामने की ओर इशारा करते हुए वेपोराइज़र प्रवाह और बहिर्वाह में डालें (चित्रा 1 एच)। वैकल्पिक: संशोधित सिरिंज को जगह में गोंद करें। यदि सस्ती है, तो एक वाणिज्यिक कई गुना उपयोग करें (एक विकल्प के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
- पूरी प्रणाली को बंद कर दें। निम्नलिखित क्रम में घटकों को एक साथ संलग्न करने के लिए टाइगॉन ट्यूबिंग का उपयोग करें: नियामक > गैस विशिष्ट फ्लोमीटर > वेपोराइज़र > एसएए (चित्रा 1 सी) के साथ वाहक गैस टैंक।
- खाली 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों के साथ सरणी पर खाली पदों को भरें। गैस टैंक चालू करें, फ्लोमीटर को ~ 2 एल / मिनट तक खोलें, और वेपोराइज़र को 0% तक चालू करें। वेपोराइज़र के ऊपर फ्लोमीटर और प्रवाह के लिए एसएए के अंतिम कक्ष के डाउनस्ट्रीम प्रवाह संकेतक की जांच करके सिस्टम के माध्यम से गैस प्रवाह की पुष्टि करें। वैकल्पिक रूप से, डाउनस्ट्रीम टयूबिंग अंत को पानी में डालें, और बुलबुले की तलाश करें।
नोट: चूंकि सिस्टम पर दबाव नहीं डाला जाता है, इसलिए कुछ सेंटीमीटर से अधिक पानी का स्तंभ प्रवाह को रोक देगा। यदि सरणी के डाउनस्ट्रीम छोर पर कोई प्रवाह नहीं है, तो निम्नलिखित की जांच करें: प्रवाह की अनुमति देने के लिए वेपोराइज़र को चालू करने की आवश्यकता है; जांचें कि टैंक नियामक और प्रवाह मीटर प्रवाह की अनुमति दे रहे हैं; यह सुनिश्चित करने के लिए सरणी स्थितियों की जांच करें कि ट्यूबों को कसकर फंसाया गया है; और संशोधित कैप्स पर चिपकने वाले के आसपास लीक की जांच करें।
चित्र 1: एसएए का निर्माण(ए) एसएए का समर्थन करने वाले लकड़ी के फ्रेम के माप के साथ योजनाबद्ध। (बी) 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट से बने प्रवाह और बहिर्वाह ट्यूबों के साथ एक संशोधित कैप के माप के साथ स्कीमाटाइज्ड क्रॉस-सेक्शन। (सी) इकट्ठे एसएए (ओलुफ्स एट अल.5 से पुन: प्रस्तुत) (डी) एक संशोधित 50 एमएल शंक्वाकार टोपी का विवरण जो प्रवाह और बहिर्वाह ट्यूबों को दर्शाता है। (ई) प्रवाह संकेतक के साथ डाउनस्ट्रीम (स्थिति 10) बहिर्वाह। (च) वाहक गैस को आर्द्र करने के लिए अपस्ट्रीम (स्थिति 1) पानी से भरी ट्यूब। लाल तीर पानी के स्तर को इंगित करता है। (छ) अस्थायी के लिए संशोधित 10 एमएल वितरण सिरिंज। लाल वृत्त 8 एमएल और 10 एमएल निशान (या एक्स 1/4 इंच में 1/2) के बीच स्थित कट-आउट नॉच पर प्रकाश डालता है। (ज) टीईसी7 वेपोराइज़र का रियर व्यू जो संशोधित सिरिंज के सम्मिलन और अभिविन्यास को दर्शाता है। बाईं ओर, छेद (लाल तीर) को दिखाने के लिए इस दृश्य में केवल एक सिरिंज है जिसे संशोधित सिरिंज के पायदान के साथ संरेखित करने की आवश्यकता है। नोट: इस कट-आउट नॉच का गलत संरेखण और बहिर्वाह उद्घाटन एनेस्थेटिक प्रशासन को बाधित करेगा। यह हिस्सा इस कस्टम-निर्मित प्रणाली में एक संभावित कमजोर स्थान है। यदि निधियां उपलब्ध हैं, तो एक वाणिज्यिक कई गुना उपयोग किया जाना चाहिए। संक्षिप्त नाम: एसएए = सीरियल संज्ञाहरण सरणी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
2. एनेस्थेटिक एक्सपोजर से पहले
- एनेस्थेटिक एक्सपोजर से चौबीस घंटे या उससे अधिक पहले, पसंदीदा विधि (जैसे, सीओ2 या ईथर) का उपयोग करके प्रयोग के लिए आवश्यक रूप से फ्लाई समूहों को क्रमबद्ध करें।
3. एसएए का संचालन
- खाद्य शीशियों से मक्खियों को खाली 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों (सीओ2 के बिना) में स्थानांतरित करें।
- एक्सपोजर से पहले किसी भी मृत मक्खियों की गणना और रिकॉर्ड करें।
- एसएए पर मक्खियों के साथ अनकैप और स्क्रू 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब।
- वाहक गैस चालू करें, और वांछित प्रवाह दर पर सेट करें।
नोट: हम आमतौर पर 1-2 एल / मिनट का उपयोग करते हैं। - एनेस्थेटिक वेपोराइज़र को वांछित एकाग्रता पर सेट करें।
नोट: हम आम तौर पर आइसोफ्लुरेन के लिए 2% और सेवोफ्लुरेन के लिए 3.5% का उपयोग करते हैं, जो स्तनधारियों10 में समान खुराक हैं। - वांछित अवधि (मिनट: 15 मिनट) के लिए मक्खियों को उजागर करें।
नोट: एसएए की स्थितियों में संतुलन में संभावित परिवर्तनशीलता से बचने के लिए 15 मिनट के न्यूनतम एक्सपोजर समय की सिफारिश की जाती है। इस प्रणाली में, एनेस्थेटिक्स को सभी पदों पर समान होने में 2-3 मिनट लगते हैं। - एक्सपोजर के अंत में, सिस्टम को ताजा गैस प्रवाह (वेपोराइज़र सेट 0%) के साथ 5 मिनट के लिए 1.5 एल / मिनट पर कुल एसएए मात्रा के लगभग 10 गुना वॉल्यूम के अनुरूप फ्लश करें।
4. प्रयोग शुरू करने से पहले चेकलिस्ट
- उच्च दबाव नियामक (एयर टैंक के शीर्ष पर) को पूरी तरह से खोलें, और फिर वाहक गैस प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए इसे आधा मोड़ बंद करें।
- प्रत्येक पंक्ति के लिए टयूबिंग का पालन करें i) फ्लोमीटर और ii) वेपोराइज़र (सुनिश्चित करें कि प्रवाह / बहिर्वाह सही ढंग से जुड़ा हुआ है), और iii) वेपोराइज़र में एनेस्थेटिक स्तर की जांच करें।
- विषयों के साथ कक्षों को लोड करने के बाद, जांचें कि हवा / गैस बुलबुला परीक्षण या प्रवाह संकेतक के साथ बह रही है।
नोट: डायल बंद स्थिति में होने पर कुछ वेपोराइज़र हवा के प्रवाह की अनुमति नहीं देते हैं। - जब गैस बह रही है, तो पुष्टि करें कि फ्लोमीटर और डाउनस्ट्रीम प्रवाह संकेतक दोनों प्रवाह का संकेत देते हैं।
- प्रयोग के अंत में, एनेस्थेटिक को धोने के लिए 4-5 मिनट के एयरफ्लो की अनुमति दें।
Representative Results
एक एसएए वीडियो लिंक यहां प्रदान किया गया है: पेरोन्स्की रिसर्च मेथड्स - एनेस्थिसियोलॉजी विभाग - यूडब्ल्यू-मैडिसन (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) हमारी प्रयोगशाला ने एसएए का उपयोग (i) एनेस्थेटिक्स के लिए व्यवहार संवेदनशीलता पर जीनोटाइप के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए कियाहै। (ii) एनेस्थेटिक्स11 के संपार्श्विक प्रभावों के लिए माइटोकॉन्ड्रियल उत्परिवर्ती की जांच करना; और (iii) दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (टीबीआई) 12,13,14,15,16,17 में परिणामों पर आइसोफ्लुरेन और सेवोफ्लुरेन के फार्माकोडायनामिक्स की जांच करें। प्रकाशित परिणाम स्पष्ट रूप से प्रदर्शित करते हैं कि आनुवंशिक पृष्ठभूमि एनेस्थीसिया के पारंपरिक फेनोटाइप और एनेस्थेटिक विषाक्तता के संपार्श्विक प्रभावों के साथ-साथ ऊतक संरक्षण 5,11,13,14,15 के संबंध में नैदानिक रूप से उपयोग किए जाने वाले वीजीए के फार्माकोडायनामिक्स को प्रभावित करती है।
प्रतिनिधि उदाहरण 1 (चित्रा 2): विश्वसनीय रूप से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगात्मक स्थितियों द्वारा पता लगाए गए आइसोफ्लुरेन विषाक्तता के लिए लचीलापन में आनुवंशिक बहाव
अलग-अलग सुसंस्कृत एनडी 2360114 मक्खियों के बीच वीजीए-प्रेरित मृत्यु दर में क्रमिक मात्रात्मक परिवर्तन की खोज एसएए का उपयोग करके प्रयोगात्मक समूहों में एनेस्थेटिक फार्माकोडायनामिक्स की विश्वसनीय तुलना की उपयोगिता का एक उदाहरण है। एनडी 23 एक जीन एन्कोडिंग है जो एमईटीसी के कॉम्प्लेक्स I के कोर में एक सबयूनिट को एन्कोडिंग करता है (स्तनधारियों में एनडुफ्स 8 के अनुरूप)18। इस सबयूनिट में उत्परिवर्तन लेह सिंड्रोम का एक कारण है, जो एक घातक माइटोकॉन्ड्रियल बीमारी है। हमने मानक प्रयोगशाला स्थितियों (यानी, वीजीए के संपर्क के बिना) के तहत एक साथ संवर्धित विभिन्न होमोजीगोस एनडी 2360114 स्टॉक में समय के साथ आइसोफ्लुरेन-प्रेरित मृत्यु दर फेनोटाइप का क्रमिक कमजोर होना देखा। आइसोफ्लुरेन विषाक्तता के लिए यह विकासवादी अनुकूलन वीजीए के किसी भी जोखिम की अनुपस्थिति में हुआ और संभवतः उत्परिवर्ती स्टॉक के भीतर "सबसे फिट के अस्तित्व" का एक संपार्श्विक प्रभाव है। आइसोफ्लुरेन संवेदनशीलता में यह क्रमिक परिवर्तन हमारे विश्वास के बिना अज्ञात रहा होगा कि प्रयोगात्मक स्थितियां परख में और समय के साथ समान थीं। हम निष्कर्ष निकालते हैं कि चयन एनडी 2360114 के प्रभावों के संशोधक का पक्ष लेता है, जिसमें आइसोफ्लुरेन विषाक्तता के लिए संयोग से लचीलापन बढ़ जाता है। चूंकि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में सूजन लेह सिंड्रोम के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, प्रतिरोध का देखा गया विकास जन्मजात प्रतिरक्षा-भड़काऊ प्रतिक्रिया में अनुकूली परिवर्तनों के कारण हो सकता है, जिसमें आइसोफ्लुरेन विषाक्तता का प्रतिरोध एक आकस्मिक उपोत्पाद है।
चित्रा 2: एनडी 2360114 मक्खियों में विकासवादी दबाव के परिणामस्वरूप आइसोफ्लुरेन विषाक्तता-प्रेरित मृत्यु दर में भिन्नता। एकल-जोड़ी संभोग के माध्यम से एकल आबादी से अलग की गई सात लाइनें (ए-जी), विस्तारित और 24 घंटे की मृत्यु दर (पीएम 24) के लिए परीक्षण 2% आइसोफ्लुरेन (10-13 दिन की उम्र में) के 2 घंटे के संपर्क में आने के बाद एकल आबादी से उत्पन्न फेनोटाइप में परिवर्तनशीलता दिखाती हैं। डेटा बॉक्स और मूंछ भूखंडों के रूप में दिखाया गया है। बक्से डेटा के दूसरे और तीसरे चतुर्थक का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें मूंछें न्यूनतम और अधिकतम डेटा बिंदुओं तक फैली होती हैं। माध्य और माध्य क्रमशः "+" और क्षैतिज रेखाओं द्वारा इंगित किए जाते हैं। व्यक्ति प्रतिकृति (एन) की प्रतिशत मृत्यु दर को वृत्त के रूप में दिखाया गया है। N = 20-50 मक्खियों/शीशियों की 3-4 शीशियां। एक साधारण एक-तरफ़ा एनोवा के लिए पी-वैल्यू; p = 0.012 साधनों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
प्रतिनिधि उदाहरण 2 (चित्रा 3): आइसोफ्लुरेन फार्माकोडायनामिक्स पर आनुवंशिक पृष्ठभूमि प्रभाव ों को प्रकट करने के लिए एसएए के उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोग का चित्रण
सिस्टम के उच्च थ्रूपुट के एक उदाहरण के रूप में, चित्रा 3 दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (टीबीआई) 16 से पहले आइसोफ्लुरेन (2% आइसोफ्लुरेन के 15 मिनट) के समान एक्सपोजर के प्रभावों को दर्शाता है, इस फ्लाई मॉडल13,15,19 में एनेस्थेटिक पूर्वशर्त (एपी) का परीक्षण करने वाला एक प्रोटोकॉल। टीबीआई के प्राकृतिक एट्रिशन (एमआई 24) के लिए ठीक होने के24 घंटे बाद मृत्यु दर का रीडआउट है। इस मॉडल में, सभी मक्खियों ने टीबीआई के बाद 30 मिनट के भीतर गतिशीलता (यानी, जीवित थी) हासिल की, और एमआई24 में दर्ज मृत्यु दर द्वितीयक मस्तिष्क की चोट (एसबीआई) का परिणाम थी। चार फ्लाई लाइनों में, आइसोफ्लुरेन के साथ एपी ने एमआई24 को विभिन्न डिग्री तक कम कर दिया, यह दर्शाता है कि एपी के प्रति जवाबदेही एक मात्रात्मक विशेषता है। चूंकि भड़काऊ प्रतिक्रिया एसबीआई से रुग्णता में एक महत्वपूर्ण कारक है, इसलिए एपी में प्रतिरक्षा प्रणाली20 का मॉड्यूलेशन शामिल हो सकता है।
चित्रा 3: आइसोफ्लुरेन के साथ पूर्व शर्त द्वारा मृत्यु दर (एमआई24) के दमन पर आनुवंशिक पृष्ठभूमि का प्रभाव। 2% आइसोफ्लुरेन (बैंगनी) के 15 मिनट के साथ मक्खियों की पूर्व शर्त ने डब्ल्यू1118 और वाई 1 डब्ल्यू 1118 उपभेदों (पी < 0.0001 और पी = 0.036, क्रमशः) में मृत्यु दर सूचकांक को 24 घंटे (एमआई24) पर कम कर दिया। पूर्व शर्त ओरेगन आर (ओआर) और कैंटन एस (सीएस) लाइनों (पी = 0.16 और पी = 0.27, क्रमशः) में एमआई24 काफी कम नहीं था। डेटा बॉक्स और मूंछ भूखंडों के रूप में दिखाया गया है। बक्से डेटा के दूसरे और तीसरे चतुर्थक का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें मूंछें न्यूनतम और अधिकतम डेटा बिंदुओं तक फैली होती हैं। माध्य और माध्य क्रमशः "+" और क्षैतिज रेखाओं द्वारा इंगित किए जाते हैं। व्यक्तिगत प्रतिकृति (एन) के एमआई24 मानों को वृत्त के रूप में दिखाया गया है। टीबीआई-उपचारित मक्खियों के लिए एन = 30-40 मक्खियों/शीशी की 15-33 शीशियां। अनुपचारित नियंत्रण के लिए एन = 30-40 मक्खियों / शीशी की 2-15 शीशियां। एक अप्रकाशित, दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट से पी-मान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
एसएए के निर्माण में महत्वपूर्ण कदमों में गैसों के एनेस्थेटिक मिश्रण के रिसाव से बचने के लिए तंग फिटिंग सुनिश्चित करना शामिल है। प्रयोगशाला स्थान के संदूषण से बचने के लिए एसएए को एक फ्यूम हुड में रखा जाना चाहिए। वाहक गैस सिलेंडर से एसएए के डाउनस्ट्रीम प्रवाह संकेतक तक सभी तत्वों को चेकलिस्ट में उल्लिखित के रूप में जांचा जाना चाहिए।
मक्खियों को वीजीए देने के अन्य तरीके (इनब्रियोमीटर) 21 को संचालित करने के लिए जटिल हैं, कम थ्रूपुट22 हैं, कई आबादी23 के एक साथ जोखिम की अनुमति नहीं देते हैं, एनेस्थेटिक एकाग्रता21 के सटीक नियंत्रण की अनुमति नहीं देते हैं, या एक रीडआउट है जिसे चिकित्सकीय रूप से स्वीकृतशब्दों 24 में अनुवाद करना मुश्किल है।
एसएए का वर्तमान संस्करण एक वाणिज्यिक वेपोराइज़र पर निर्भर करता है, और इसलिए, विष विज्ञान संबंधी अध्ययन वाष्पशील एनेस्थेटिक्स तक सीमित हैं। यदि अन्य वाष्पशील पदार्थों के साथ उपयोग किया जाता है, तो आउटपुट को कैलिब्रेट करने के बाद एक वेपोराइज़र का उपयोग "ऑफ लेबल" किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, वाष्पशील पदार्थों को वाष्पीकृत करने की एक अलग विधि लागू की जा सकती है, जिसके लिए दवा सांद्रता को टाइट करने के लिए समर्पित माप की आवश्यकता होगी, जैसा कि पहलेवर्णित है।
प्रवाह संकेतकों के अलावा, कोई अलार्म नहीं हैं (यानी, यदि टैंक खाली हैं, तो एसएए के माध्यम से प्रवाह बाधित होगा)। उपयोग की तीव्रता के आधार पर, एसएए को टाइगन ट्यूबिंग की सफाई, कसाव और संभवतः प्रतिस्थापन की आवश्यकता हो सकती है। हमने 7 साल के उपयोग में दो बार अपने मूल एसएए पर "रखरखाव" किया है।
फल मक्खियों को एनेस्थेटाइज करने की यह विधि एक उच्च-थ्रूपुट प्रणाली में ड्रोसोफिला शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध आनुवंशिक टूलबॉक्स के उपयोग की अनुमति देती है। विभिन्न आबादी (जैसे, जीनोटाइप, आयु, लिंग) की मक्खियों के कई समूहों को एक साथ समान एनेस्थेटिक सांद्रता और वाहक गैस (वायु, ओ2, एन2ओ, महान गैसों) के वांछित संयोजन के संपर्क में लाया जा सकता है जो अनुसंधान प्रश्न के लिए उपयुक्त है।
हम यहां दिखाते हैं कि एसएए एनडी 2360114 फ्लाई लाइन में आइसोफ्लुरेन विषाक्तता के लिए लचीलापन में अप्रत्याशित परिवर्तनों का खुलासा करने के लिए उपयोगी रहा है और मानक प्रयोगशाला फ्लाई लाइनें एपी के प्रति उनकी प्रतिक्रिया में भिन्न होती हैं।
एसएए को कीड़ों (जैसे, मधुमक्खियों) पर अन्य वाष्पशील कार्बनिक यौगिकों (वीओसी) के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। वाष्पशील एनेस्थेटिक्स (आइसोफ्लुरेन: 20 डिग्री सेल्सियस पर 240 मिमीएचजी) के करीब वाष्प दबाव वाले वीओसी के लिए, पारंपरिक वेपोराइज़र का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन आउटपुट को कैलिब्रेट करना होगा। डेफ्लुरेन के लिए वाणिज्यिक वेपोराइज़र गर्म होता है, संभावित रूप से अतिरिक्त लचीलापन प्रदान करता है।
Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम एसएए प्रोटोटाइप के निर्माण के लिए मार्क जी पर्किन्स, पियर्स प्रयोगशाला, एनेस्थिसियोलॉजी विभाग, विस्कॉन्सिन-मैडिसन विश्वविद्यालय को धन्यवाद देते हैं। यह काम आर01जीएम 134107 के साथ नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज (एनआईजीएमएस) और विस्कॉन्सिन-मैडिसन विश्वविद्यालय के एनेस्थिसियोलॉजी विभाग के आर एंड डी फंड द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serial Anesthesia Array: | |||
| 5 mL Serological Pipettes | Fisher Scientific | 13-676-10C | Polystyrene, 5mL serological pipette |
| 50 mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 1495949A | Polypropylene, 50 mL |
| Cable Tie Mounting Pad | Grainger | 6EEE6 | 1.25 inch L x 1 inch W x 0.28 inch H |
| Dispensing Syringe | Grainger | 5FVE0 | 10 mL with Luer-Lock Connection |
| Fabric Mesh Netting | 1 mm mesh | ||
| Flow Indicator | Grainger | 8RH52 | 5/16 to 1/2 inch connection size, paddle wheel style |
| Tygon Tubing | Tygon | E-3603 | ID: 5/16, OD: 7/16, wall: 1/16 |
| Wood Frame | 10 feet of 2 inch x 3/4 inch | ||
| Zip Tie | >5inch | ||
| Vaporizer Interface (Budget Alternative to Manifold): | |||
| Dispensing Syringe | Grainger | 5FVE0 | 10 mL with Luer-Lock Connection |
| Commercial Manifold and Vaporizers: | |||
| 1/4 inch Equal Barbed Y Connector | Somni Scientific | BF-9000 | |
| 1/8 inch NPT to 1/4 inch Barbed Elbow (Plastic) | Somni Scientific | BF-9004 | |
| AIR 0-4 LPM Flowmeter w/ black knob | Somni Scientific | FP-4002 | |
| Flowmeter auxiliary mounting bracket | Somni Scientific | NonInvPart | |
| Medical Air, 1/8 inch NPT Male x DISS Male | Somni Scientific | GF-11012 | |
| TT-2 Table Top Anesthesia System, built in dual diverter valve system. Includes 6' color coded tubing X2. (Vaporizer not Included) | Somni Scientific | TT-17000 | |
| Tec 7 Isoflurane Vaporizer | GE Datex-Ohmeda | 1175-9101-000 | Agent-specific vaporizer (Isoflurane) |
| Tec 7 Sevoflurane Vaporizer | GE Datex-Ohmeda | 1175-9301-000 | Agent-specific vaporizer (Sevoflurane) |
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