Summary
이 방법은 광견병 항원을 미리 결정된 지연 후에 박동성 방출을 가능하게 하는 구조적 및 물질적 특성을 가진 생분해성 고분자 미세입자로 캡슐화하는 것을 설명합니다. 입자 코어에서 회수된 항원의 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 평가는 입자 제조를 통해 손상되지 않은 삼량체 광견병 바이러스 당단백질의 존재를 확인합니다.
Abstract
광견병 노출 후 예방에 대한 현재 지침은 몇 주에 걸쳐 여러 번 주사해야 합니다. 이것은 광견병에 대한 치명적인 노출의 대부분이 발생하는 저소득 및 중간 소득 국가(LMIC)에 거주하는 사람들에게 불균형적으로 부담이 될 수 있습니다. 항원을 고분자 입자로 캡슐화하여 백신 요법을 단일 주사로 압축하기 위해 다양한 약물 전달 전략이 탐구되었습니다. 그러나, 캡슐화 과정 동안 가혹한 스트레스 요인은 캡슐화된 항원의 변성을 유발할 수 있다. 이 기사에서는 광견병 바이러스(RABV) 항원을 조정 가능한 박동 방출을 나타내는 고분자 미세 입자로 캡슐화하는 방법을 설명합니다. PULSED(Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs)라고 하는 이 방법은 소프트 리소그래피를 사용하여 미세 입자를 생성하여 다광자 3D 프린팅 마스터 몰드에서 역 폴리디메틸실록산(PDMS) 몰드를 만듭니다. 그런 다음 폴리락틱-코-글리콜산(PLGA) 필름을 PDMS 몰드로 압축 성형하여 압전 디스펜싱 로봇을 사용하여 농축된 RABV로 채워진 개방형 실린더를 생성합니다. 그런 다음 이러한 미세 구조는 입자의 상단을 가열하여 밀봉되어 재료가 흐르고 연속적인 비다공성 고분자 장벽을 형성할 수 있도록 합니다. 제조 후, 온전한 삼량체 광견병 바이러스 당단백질의 검출에 특이적인 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 미세입자에서 면역원성 항원의 높은 회수율을 확인합니다.
Introduction
백신 접종은 2000년에서 2019년 사이에 3,700만 명 이상의 사망을 예방한 매우 효과적인 의료 도구입니다1. 이러한 효과에도 불구하고, 백신으로 예방할 수 있는 질병은 전 세계 보건에 계속해서 심각한 위험을 초래하고 있으며, 특히 높은 백신 미접종률 및 미흡률로 인해 연간 150만 명의 백신 예방 가능 사망자가 발생하는 저소득 및 중간 소득 국가(LMIC)에서더욱 그렇습니다 2. 광견병도 이러한 불균형에서 예외는 아닙니다. 광견병은 인류에게 알려진 가장 치명적인 질병임에도 불구하고 거의 보편적으로 치명적이기 때문에 완전히 치료할 수 있으며 많은 고소득 국가에서 근절된 것으로 분류됩니다. 대신, 광견병의 부담은 아시아와 아프리카의 일부 지역에 사는 사람들에 의해 불균형적으로 부담되며, 이 질병은 인간과 가축에게 치명적인 결과를 초래합니다 3,4.
백신 접종은 광견병이 전 세계에 미치는 영향을 관리하는 데 매우 중요하다5. 예방 접종 비용은 질병의 전반적인 발병률이 낮다는 점을 고려하여 노출 전 예방(PrEP)의 광범위한 시행을 금지합니다. 또한 LMIC에서 노출 후 예방(PEP)의 유용성은 의료 서비스를 원하는 환자에 대한 사회경제적 압력에 의해 제한됩니다. 의료 액세스 포인트까지의 이동 거리, 치료를 받는 동안 임금 손실, 치료 비용, 일상 활동을 방해하는 약속 및 건망증과 같은 물류 요인으로 인해 PEP 준수율이 60%로 낮아집니다6,7. 이 높은 환자 감소율은 질병을 퇴치하기 위해 광견병 예방 접종의 격차를 해소하기 위한 접근 방식을 개선할 수 있는 기회를 제공합니다.
항원 방출을 조절하는 단일 주사(SI) 백신 접종 시스템은 한 번의 주사로 완전한 면역을 얻는 방법으로 연구되었습니다. 의료 서비스 제공자를 여러 번 방문할 필요가 없어지면 개인이 적절한 치료를 받지 못하게 하는 부담이 완화됩니다. SI 백신접종을 달성하기 위해, 항원은 전형적으로 종종 주사 가능한 미립자의 형태를 취하는 생분해성 중합체 매트릭스 내에 캡슐화된다. 일단 주입되면, 중합체는 분해되고 격리 된 항원을 방출한다. 현재까지 SI 백신 접종을 달성하기 위해 두 가지 기본 릴리스 전략이 추구되었습니다. 한 접근법에서, 항원은 장기간에 걸쳐 연속적으로 방출된다. 단일 주사의 면역원성을 향상시키기 위한 것이지만, 이 접근법이 인간의 광견병 바이러스(RABV)에 대한 보호 면역 반응을 이끌어내기에 충분한지는 불분명하다8. 다른 예에서, 항원은 종래의 입증된 프라임-부스트 백신 요법을 모방하기 위해 미리 결정된 지연 후에 방출된다. 분무 건조 및 에멀젼/용매 증발 기반 미세입자 제조 방법은 전자의 전략을 나타내며, 모델 백신9과 파상풍 톡소이드10와 같은 매우 안정적인 항원을 성공적으로 캡슐화하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 캡슐화 방법은 항원을 변성시킬 수 있는 열, 용매 상호작용 및 물리적 힘을 포함하는 스트레스 요인을 포함한다11.
PULSED(Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs)는 생분해성 미세 입자에 생물학적 제제를 캡슐화하는 데 사용할 수 있는 최근에 개발된 제조 방법입니다. 마이크로 몰딩은 액체 페이로드로 채워지고 가열되어 폴리머가 리플로우되고 생분해성 폴리머의 인접한 층 내에서 화물의 중앙 저장소를 완전히 캡슐화할 수 있도록 하는 입자를 생성하는 데 사용됩니다. 이러한 미세구조는 중합체성 쉘(12)의 분해 속도에 의존하는 지속기간 후에 페이로드의 박동성 방출을 초래한다. 이 원고는 많은 FDA 승인 제형13에 사용되는 생분해성 폴리머인 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA)로 구성된 미세 입자 내에서 비활성화된 RABV를 캡슐화하여 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 평가된 바와 같이 안정적인 RABV 항원을 캡슐화하기 위해 PULSED 제조 방법을 사용하는 것을 보여줍니다. PLGA 입자를 상이한 분자량 및/또는 말단기와 결합함으로써, 이 접근법은 단일 주사 후 현재의 광견병 백신 접종 시간 경과를 모방할 수 있는 잠재력을 갖는다.
Protocol
1. 입자 마스터 금형 생성
참고: 3D 프린팅 프로세스는 충분한 공간 해상도를 가진 모든 3D 프린터로 수행할 수 있습니다. 그러나 현재 프로토콜은 다광자 3D 프린터의 프로세스를 설명합니다.
- CAD(Computer-Aided Design) 프로그램을 사용하여 미세 입자 구조를 설계합니다.
참고: 설계 사양은 다음과 같습니다: 308개의 입자(직경 = 400μm, 높이 = 500μm, 벽 두께 = 100μm)가 22 x 14 배열로 배열되고 그 사이의 간격은 600μm입니다. 이 설계에는 배열 바로 바깥쪽에 기준점으로 4 개의 뾰족한 별과 5 개의 뾰족한 별이 포함되어 있습니다 (보충 그림 1). - 최종 디자인을 STL 파일(Supplementary Coding File 1)로 내보내고 아래와 같이 인쇄 매개변수를 정의할 수 있는 소프트웨어에 파일을 업로드합니다. 그런 다음 3D 프린터와 호환되는 파일로 저장합니다( 재료 표 참조).
참고: 슬라이싱 거리 = 5μm, 해칭 거리 = 1μm, 쉘 윤곽 = 50μm, 베이스 슬라이스 수 = 5μm, 비계 = 중공, 스캔 모드 = 갈보, z축 = 현미경 z-드라이브, 스캔 속도 = 100,000, 전력 = 100. - 플라즈마 세척 공정(가스:O2, 전력: 200와트, 온도: 25°C, 흐름: 20, 시간: 5분)을 사용하여 실리콘 인쇄 기판(재료 표 참조)을 전처리한 다음, 즉시 기판을 유리 페트리 접시에 에탄올 30mL와 3-(트리메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트 60μl의 용액에 담근다. 알루미늄 호일로 덮고 밤새 배양하십시오.
참고: 이 단계는 기판에 대한 인쇄 접착력을 증가시키며, 이는 PDMS 분리 중에 중요합니다(2.6단계). - 인쇄 파일을 다광자 3D 프린터에 업로드하고, 처리된 기판에 인쇄 레진을 적용하고, 10x 렌즈( 재료 표 참조)를 로드하고, 미세 구조를 인쇄합니다.
- 완료되면 인쇄물을 프로필렌 글리콜 메틸 에테르 아세테이트( 재료 표 참조)에 45분 동안 담가 노출되지 않은 포토레지스트를 제거한 다음 인쇄물을 이소프로필 알코올에 5분 동안 담그십시오. 마스터 몰드를 254nm의 자외선에 120분 동안 노출시켜 후경화합니다.
참고 : 가능한 경우 405-365 nm 범위의 UV 광선을 ~ 20 분 동안 사용하여 인쇄 된 구조물을 후 경화시킬 수 있습니다.
2. 폴리디메틸실록산(PDMS) 금형 생성
- 3D 프린팅된 마스터 몰드의 표면을 유리 슬라이드가 들어 있는 진공 챔버에 넣고 표면에 40μL의 Trichloro(1H,1H,2H,-perfluorooctyl)( 재료 표 참조) 실란을 첨가하여 처리합니다. 진공을 당깁니다(상대 압력: -20인치. Hg) 1 시간 동안.
알림: 이 단계는 탈형 시 쉽게 분리되도록 합니다(2.6단계). - 마스터 몰드 표면이 처리되는 동안 폴리디메틸실록산(PDMS) 프리폴리머 베이스와 PDMS 프리폴리머 경화제를 9:1 질량비로 완전히 혼합합니다(각 마스터 몰드에 최소 10g의 재료가 필요함). 완전히 혼합되면 경화되지 않은 PDMS를 50mL 원심분리기 튜브로 옮기고 실온에서 3분 동안 300 x g 로 원심분리합니다.
- 표면 처리가 완료되면 마스터 몰드를 알루미늄 호일 접시에 놓고 경화되지 않은 PDMS를 몰드 위에 부어 피처가 완전히 잠기도록 합니다. 알루미늄 호일 접시를 진공 챔버에 넣고 진공을 당깁니다(상대 압력: -20인치. Hg)를 1시간 동안 사용하여 기포를 제거합니다.
- 진공 챔버에서 알루미늄 호일 접시를 제거합니다. 마스터 몰드의 끝에 800μm 스페이서를 놓고 기포가 유입되지 않도록 주의하면서 깨끗한 유리 슬라이드를 마스터 몰드에 오버레이합니다. 바인더 클립을 사용하여 금형과 슬라이드를 함께 고정하고 스페이서에 대한 클램핑력을 국한시킵니다(보충 그림 2).
- 구조물을 120°C로 설정된 오븐에 최소 4시간 동안 두어 예비중합체를 PDMS 몰드로 경화시킨다.
- 오븐에서 구조물을 제거하고 바인더 클립을 조심스럽게 분리한 다음 면도날을 사용하여 경화된 PDMS 몰드에서 마스터 몰드를 조심스럽게 분리합니다.
참고: 3D 프린팅된 마스터 몰드를 재사용하여 추가 PDMS 몰드를 생성할 수 있습니다.
3. PLGA 필름 제작
- 450mg의 PLGA( 재료 표 참조)의 무게를 측정하고 내경이 50.8mm인 250μm 두께의 링 심 내에서 76mm x 76mm 논스틱 폴리머 시트에 놓습니다. PLGA 위에 두 번째 붙지 않는 폴리머 시트를 놓고 손가락으로 조일 때까지 101.6mm c-클램프를 사용하여 두 개의 알루미늄 블록 사이의 스택을 압축합니다.
참고: 502H PLGA는 이 연구에서 독점적으로 사용되었습니다. 그러나 다른 유형의 PLGA는 이 프로세스와 호환됩니다. - c-cl을 배치amped 어셈블리를 -30inHg의 상대 압력으로 진공 상태에서 120°C로 30분 동안 설정된 진공 오븐에 넣습니다. 그런 다음 어셈블리를 제거하고 cl을 단단히 조입니다.amp 진공 오븐에 30분 더 넣기 전에.
알림: 진공 사용의 주요 목적은 고온에서 가속화되는 PLGA 분해를 방지하는 것입니다. - 오븐에서 어셈블리를 꺼내 데시케이터에서 4시간 동안 식힙니다.
- 식으면 클램프를 풀고 붙지 않는 폴리머 시트에서 PLGA 필름을 제거한 다음 라벨이 붙은 페트리 접시에 필름을 놓습니다. 나중에 사용할 수 있도록 페트리 접시를 데시케이터 안에 보관하십시오.
4. PLGA 입자 생성
- 앞서 2.1단계에서 설명한 대로 PDMS 몰드의 표면을 처리합니다.
- 핀셋 및/또는 메스를 사용하여 처리된 PDMS 몰드에 대략 어레이 크기의 250μm PLGA 필름의 일부를 잘라내어 놓습니다.
- PLGA 필름과 PDMS 몰드 위에 깨끗한 유리 현미경 슬라이드를 오버레이하고 어레이와 PLGA 필름 바로 위에 스프링 클램프를 배치하여 구성 요소를 함께 고정합니다.
- 클램핑된 금형 어셈블리를 120°C로 설정된 진공 오븐에 넣고 -30인치의 상대 압력으로 진공을 당깁니다. 1 시간 동안 Hg.
알림: 입자를 형성하는 데 필요한 시간은 PLGA에 따라 다르며 1-12시간까지 다양할 수 있습니다. - 클을 제거amped 금형 어셈블리를 오븐에서 꺼내 실온에서 약 15분 동안 또는 만졌을 때 식을 때까지 수동적으로 식힙니다.
- 면도날을 사용하여 PDMS 몰드와 PLGA 입자 어레이 사이에 부드럽게 압력을 가하여 둘을 분리합니다. 나중에 사용할 수 있도록 PLGA 입자를 데시케이터에 보관하십시오.
5. 항원 농도 및 정제
- 시판되는 RABV 항원의 분취량 1개( 재료 표 참조)를 실온에서 해동합니다.
- 분자량 컷오프(MWCO, 재료 표 참조)가 100kDa인 두 개의 원심 스핀 필터를 두 개의 수집 튜브에 배치하여 여과 설정을 조립합니다.
- 500 μL의 UltraPure water를 추가하여 두 개의 원심 스핀 필터를 미리 적십니다.
- 실온의 벤치탑 원심분리기에서 2,400 x g 에서 1분 동안 필터를 돌립니다.
- 200μL 파이펫을 사용하여 여과 설정의 상단 및 하단 구획 모두에서 물을 제거합니다.
알림: 사전 습식 탈수 필터가 마르지 않도록 하십시오. - 각 스핀 필터의 상단 구획에 증류수 400μL를 추가한 다음 해동된 RABV 항원 100μL를 추가하고 피펫과 혼합합니다.
참고: 이 연구는 항원을 약 5배 농축하고 부형제 농도를 ~100kDa<50배 감소시켰습니다. - 두 개의 원심 스핀 필터를 탁상형 원심분리기에 로드하여 필터가 원심분리기의 중앙을 향하도록 합니다. 필터의 어느 쪽이 원심분리기의 중앙을 향하는지 표시하십시오.
알림: 방향이 잘못되면 용액이 제대로 여과/농축되지 않습니다. - 필터를 실온에서 14,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
- 원심분리기에서 필터를 회수합니다. 수집 튜브에는 여과액이 포함되고 필터에는 농축된 샘플이 포함됩니다(보충 그림 3A).
- 피펫을 사용하여 수집 튜브의 여과액을 제거하고 폐기합니다.
- 여과된 증류수 450μL를 각 필터에 넣고 농축된 샘플과 물을 위아래로 6회 피펫팅하여 혼합합니다.
- 두 개의 스핀 필터를 실온에서 10분 동안 14,000 x g 에서 두 번째로 원심분리합니다. 필터가 5.7단계와 동일한 방향으로 원심분리기 중앙을 향하도록 합니다.
- 원심분리기에서 필터 장치를 회수하고 이전과 마찬가지로 피펫을 사용하여 각 튜브에서 여과액을 제거하고 폐기합니다.
- 수집 튜브에서 스핀 필터를 제거하고 수집 튜브의 상단을 사용하여 필터 케이싱을 덮습니다(보충 그림 3B).
- 스핀 필터 케이싱의 바닥을 3,000초 동안 30rpm으로 와류 및 소용돌이에 직접 놓고 필터 케이싱을 똑바로 세우고 45° 각도로 유지합니다(보충 그림 3C).
참고: 이 단계는 원심분리 과정에서 펠릿을 형성한 RABV 항원을 재현탁하기 위한 것입니다. - 스핀 필터 케이싱에서 수집 튜브의 캡을 조심스럽게 제거합니다. 필터 케이싱을 제공된 수집 튜브에 다시 넣고 빠르게 회전(2-3초)하여 캡에 갇혔을 수 있는 부피를 수집합니다.
알림: 이 빠른 회전은 탁상용 미세 원심분리기에서 수행해야 합니다. 필터는 필터를 통해 용액이 손실되지 않도록 이전 구성과 반대로 원심분리기에 접해야 합니다. - 각 스핀 필터 장치를 스핀 필터 키트와 함께 제공된 새 수집 튜브로 뒤집고( 재료 표 참조) 실온에서 1,000 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 농축된 샘플을 수집합니다.
- 두 개의 수집 튜브에서 농축된 샘플을 하나의 수집 튜브로 통합합니다. 결과 볼륨을 측정하고 기록합니다.
참고: 결과 샘플은 스톡으로 초기 항원 농도의 5배를 가지며 스톡보다 약 50배 낮은 작은 부형제(<100kDa) 농도를 가지며 약간 유백색으로 보입니다. 총 부피는 약 44-48 μL이어야합니다. - 5x 농축, 2회 세척된 항원을 분배 시점까지 4°C에서 16시간 이상 보관하지 마십시오. 이 용액으로 입자를 채우기 전에 튜브를 1,000 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 기포를 제거합니다. 용액은 분배를 위한 공칭 목표 농도를 달성하기 위해 증류수를 사용하여 희석될 수 있습니다.
6. 입자 충전
- 탈이온수 500 mL를 0.22 μm 진공필터를 통해 진공 필터한 다음, 진공을 가하여 용액을 탈기한다(상대 압력: -20 in. Hg) 20 분 동안 초음파 처리하에.
- 이 시간 동안 압전 디스펜서 모세관(PDC, 재료 표 참조)을 압전 디스펜서에 부착합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 기계를 프라이밍하고( 재료 표 참조) PLGA 입자가 있는 슬라이드를 분배 영역에 놓습니다.
- "Find Target Reference Points"를 설정하고 Run을 실행한 다음 보충 그림 4에 따라 "Target Substrate"를 설정합니다.
- 농축된 항원 25μL를 소스 플레이트에 로드하고 기계에 로드합니다. PDC를 사용하여 농축된 항원 10μL을 분주 팁으로 흡인하고 팁 외부를 세척한 다음 분주 정렬을 보정합니다(보충 그림 5).
- "Target Setup parameters(대상 설정 매개변수)"를 입력하고 Run(실행)을 클릭합니다(보충 그림 6).
- 완료되면 채워진 파티클을 제거하고 스테레오스코프 아래에 채워져 있는지 확인합니다.
- 프로토콜의 다음 단계로 바로 이동합니다.
7. 입자 밀봉 및 수확
- 스테인리스 스틸 블록( 재료 표 참조)을 핫플레이트에 놓습니다. 두 개의 현미경 슬라이드를 스테인리스 스틸 블록에 놓아 평행이 되도록 합니다. 스테인리스 스틸 블록이 수평인지 확인한 다음 핫플레이트를 켜고 스테인리스 스틸의 표면 온도가 200°C가 되도록 온도를 설정합니다. 밀봉하기 전에 열판의 온도를 확인하십시오.
- 채워진 PLGA 입자를 두 개의 유리 슬라이드에 올려 핫플레이트 위에 매달고 즉시 18초 동안 타이머를 시작합니다.
알림: 입자를 밀봉하는 데 필요한 시간과 열의 양은 입자를 만드는 데 사용되는 PLGA의 화학적 특성에 따라 달라집니다. 맞춤형 3D 프린팅 슬라이드 홀더를 사용하여 핫플레이트에서 안전한 거리에서 슬라이드를 처리할 수 있습니다. STL 파일은 보충 코딩 파일 2로 제공됩니다. - 밀봉되면 핫플레이트에서 입자 어레이를 제거하고 입자 어레이를 두 개의 개별 유리 슬라이드에 배치하여 실험실 벤치 위에 매달아 놓습니다. 입자를 1분 동안 식히십시오.
- 일단 냉각되면 입체경을 통해 보면서 메스를 사용하여 입자를 수확할 수 있습니다. 블레이드로 메스를 슬라이드에 대해 45° 각도로 잡고 입자 바닥에 압력을 가하여 유리 슬라이드에서 분리합니다.
- 수확이 끝나면 메스를 사용하여 입자를 0.5mL의 저단백질 결합 튜브로 옮깁니다( 재료 표 참조). 그런 다음 30mg/mL 소혈청알부민(BSA)과 1mg/mL 포도당을 포함하는 1x 인산염 완충액(PBS) 250μL로 튜브를 채웁니다.
참고: PBS에서 제조된 30mg/mL BSA 및 1mg/mL 포도당 용액은 RABV 항원의 안정성을 유지합니다. - 한 쌍의 미세한 핀셋을 사용하여 입체경 아래에서 입자를 부수십시오. 입자의 코어에 있는 RABV 항원이 주변 용액에 용해될 수 있는지 확인하십시오. 항원 효능이 ELISA를 사용하여 평가될 수 있을 때까지 샘플을 4°C 냉장고에 보관합니다. 샘플은 준비 후 7일 이내에 ELSIA에서 실행해야 합니다.
8. ELISA에 의한 항원 평가
주의 : 마이크로플레이트가 마르지 않도록 하십시오. 항상 접시를 쌓고 건조를 방지하기 위해 항상 플라스틱 씰, 빈 접시 또는 뚜껑으로 상단 접시를 덮으십시오.
- 보충 파일 1의 지시에 따라 버퍼를 준비합니다.
- pH 9.4-9.6에서 코팅 완충액 4975μL에 코팅 항체 25μL를 첨가하여 2.5μg/mL 농도의 코팅 용액(탄산염-중탄산염 완충액, pH 9.6) 5mL를 준비합니다.
참고: 96개의 웰을 각각 50μL로 코팅하려면 5mL가 필요합니다(피펫팅 손실을 위한 추가 부피 포함). 필요한 각 추가 ELISA 플레이트에 대해 총 부피를 5mL씩 늘립니다. - 멀티채널 피펫을 사용하여 50μL의 코팅 용액을 마이크로플레이트의 각 웰에 분주합니다. 용액은 준비된 직후에 코팅에 사용해야합니다.
- 장갑을 낀 손바닥의 판 가장자리를 따라 부드럽게 두드려 각 우물의 바닥이 액체로 고르게 덮이도록 합니다.
- 플레이트를 접착 필름으로 밀봉하고 37°C에서 1시간 동안 두었다가 밤새 4°C로 옮깁니다.
- 냉장 보관에서 플레이트를 회수하고 각 웰에서 200μL의 세척 완충액으로 3회 세척합니다.
- 세척 완충액을 제거하고 300μL의 차단 완충액을 각 웰에 분배합니다.
주의 : 동일한 샘플로 여러 플레이트를 실행할 때amp다른 플레이트에서 반복되는 경우 플레이트별로 진행하는 것이 중요합니다(즉, 플레이트 1로 진행하기 전에 플레이트 2에 재료를 채운 다음 플레이트 3 등으로 진행하는 식). 재료 X를 모든 플레이트에 적용한 다음 재료 Y 등에 적용하면 우물이 건조될 위험이 증가하므로 적용하지 마십시오. 최종 세척 단계 후, 세척 완충액은 플레이트의 웰에 남아 있어야 하며, 플레이트에 샘플을 추가하기 직전에만 폐기되어야 한다. 플라스틱 96웰 플레이트 뚜껑을 사용하여 바로 분배되지 않는 ELISA 플레이트의 모든 웰을 덮어야 하며, 뚜껑을 순차적으로 움직여 재료로 채워질 추가 웰을 드러내야 합니다. - 플레이트를 접착 플라스틱 필름( 재료 표 참조)으로 밀봉하고 37 ± 2 °C에서 60 ± 5분 동안 인큐베이터에 넣습니다.
- 이 배양 동안 평가될 표준 곡선 및 테스트 샘플을 준비합니다.
참고: 평가 중인 항원은 피펫팅 손실을 설명하기 위해 최소 40μL의 초과 부피로 0.125IU/mL의 권장 희석액으로 희석액 완충액에 미리 희석해야 합니다. 모든 샘플은 각 ELISA 플레이트에서 이중(두 개의 기술 복제)으로 평가됩니다. 표준 곡선의 경우 총 8개 지점에 대한 2배 희석 시리즈가 각 ELISA 플레이트의 2열과 3열에 포함되어야 합니다. 희석 시리즈는 평가되는 항원의 예측된 양에 기초하여 적절한 수의 점으로 다른 모든 샘플에 대해 수행될 수 있다. 더 높은 처리량을 위해 덜 엄격하지만, 단일 샘플 희석은 위에서 설명한 도금의 대안으로 사용될 수 있습니다. 그러나 단일 희석의 예상 농도는 표준 곡선 범위 내에 있어야 합니다. - 저결합 단백질 96웰 플레이트 또는 저결합 단백질 튜브( 재료 표 참조)에서 플레이트의 컬럼을 따라 각 샘플의 2배 희석 시리즈를 수행합니다.
- 필요한 최종 부피의 두 배로 각 샘플에 대해 A 행에 희석 시리즈의 시작을 로드합니다(플레이트당 100μL의 샘플이 웰당 필요하므로 A2-A11의 모든 웰에는 최소 240μL의 샘플이 포함되어야 하며 피펫팅 손실을 고려하기 위해 40μL의 추가 부피가 있어야 함).
- 120μL의 희석제 버퍼를 컬럼 1과 12(즉, B2에서 H11까지)를 제외한 저결합 단백질 플레이트의 다른 모든 웰에 로드합니다.
- 10개의 팁이 장착된 멀티채널 피펫을 사용하여 120μL의 시료를 A2-A11에서 B2-B11로 옮기고 피펫팅을 여러 번 위아래로 반복하여 튀거나 기포가 생기지 않도록 혼합하여 연속 희석을 수행합니다. 이 과정을 반복하여 웰 H2-H11까지 컬럼을 따라 플레이트를 아래로 이동합니다. 웰의 마지막 줄에서 흡입된 나머지 120μL 부피를 폐기합니다.
참고: 이제 샘플을 분석할 준비가 되었습니다. 이 시간까지 차단 단계가 완료되지 않으면 샘플을 얼음 위에 보관해야 합니다. - 인큐베이션 단계가 끝나면 플레이트를 200 μL의 세척 완충액으로 3회 세척합니다.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 100μL의 희석제 버퍼를 컬럼 1과 12에 "블랭크"로 옮깁니다.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 샘플 희석액이 들어 있는 저결합 단백질 96웰 플레이트의 각 웰에서 세척된 ELISA 플레이트로 100μL를 옮깁니다. 실행 중인 모든 ELISA 플레이트에 대해 반복합니다.
- 플레이트를 접착 플라스틱 필름으로 밀봉하고 37 ± 2 °C에서 60 ± 5 분 동안 인큐베이터에 넣습니다.
- 희석제 완충액 10,995.6μL에 항체 용액 4.4μL를 첨가하여 0.2μg/mL 농도의 검출 항체 용액( 재료 표 참조)을 준비하고 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합합니다.
참고: 96웰에 각각 100μL씩 총 11mL가 필요합니다(피펫팅 손실을 위한 추가 부피 포함). 평가 중인 각 추가 ELISA 플레이트에 대해 총 부피를 11mL씩 늘립니다. 용액은 준비 직후에 사용해야합니다. - 인큐베이션 단계가 끝나면 플레이트를 200μL의 세척 완충액으로 5회 세척합니다.
- 남은 세척 완충액을 흡인하고 100μL의 검출 항체 용액을 멀티채널 피펫을 사용하여 마이크로플레이트의 각 웰에 분주합니다.
- 플레이트를 접착 플라스틱 필름으로 밀봉하고 37 ± 2 °C에서 60 ± 5 분 동안 인큐베이터에 넣습니다.
- 10,995.6 μL의 세척 완충액에 4.4 μL의 스트렙타비딘-퍼옥시다제 접합체 용액( 재료 표 참조)을 첨가하여 검출 항체 배양 단계가 끝날 무렵 접합체를 준비합니다.
참고: 각각 100μL씩 96웰에 총 11mL가 필요합니다(멀티채널 피펫팅을 위한 추가 부피 포함). 평가 중인 각 추가 ELISA 플레이트에 대해 총 부피를 11mL씩 늘립니다. - 플레이트를 200 μL의 세척 완충액으로 5회 세척한다.
- 남은 세척 완충액을 흡인하고 접합체 용액 100μL를 각 웰에 분주합니다.
- 플레이트를 접착 플라스틱 필름으로 밀봉하고 37°C ± 2°C에서 60± 5분 동안 37°C 인큐베이터에 넣습니다.
- 제조업체의 지침에 따라 최종 세척 단계에서 기판을 준비합니다( 재료 표 참조). 각 플레이트에 대해 o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드(OPD, 재료 표 참조) 1정을 암실에서 탈이온수 9mL에 녹인 다음 1mL의 10배 안정 과산화물 완충액을 채웁니다. 평가되는 플레이트의 수에 따라 정제 수와 용액의 총 부피(10mL)를 조정합니다.
- 플레이트를 200 μL의 세척 완충액으로 5회 세척한다.
- 100 μL의 기질을 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에 분주합니다.
- 플레이트를 접착 플라스틱 필름으로 밀봉하고 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하여 10-20분 동안 벤치에 둡니다.
알림: 채도를 피하기 위해 색상 현상을 시각적으로 모니터링합니다. - 50 μL의 정지 용액을 각 웰에 넣고 492 nm에서의 흡광도 및 620 nm의 기준 흡광도에 대해 즉시 플레이트를 판독합니다.
- 보정된 흡광도 판독값(492nm에서 판독값에서 620nm에서의 판독값을 뺀 값)을 사용하여 데이터를 분석하고 모든 샘플에서 블랭크의 평균을 뺍니다. S자 모양 4PL 보간법을 사용하여 흡광도 값을 IU/mL로 변환합니다. 마지막으로 250μL(총 샘플 부피)를 곱하여 IU로 변환합니다.
참고: 이 분석은 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다.
Representative Results
입자 밀봉 및 충전은 이 프로토콜에서 가장 중요한 두 단계입니다. 입자는 이상적인 충전과 몇 가지 일반적인 오류를 보여주기 위해 플루오레세인 나트륨 염으로 채워졌습니다. 시각화의 용이성을 위해 RABV 항원 대신에 플루오레세인 나트륨 염을 사용하였다. 충전하는 동안 입자 코어의 바닥에 용액을 분배한 다음 용매/물이 증발할 때까지 충분한 시간을 허용하는 것이 중요합니다. 완료되면 용질 저장소가 입자 코어의 바닥에 남아 있습니다(그림 1A). 일단 채워지면 입자를 올바르게 밀봉하는 것이 중요합니다. 그림 1B 는 밀봉 공정의 여러 결과(성공 및 실패)를 보여줍니다. 12초의 밀봉 시간이 지나면 입자 중심에서 입자 외부로 뚜렷한 경로가 남아 완전히 밀봉되지 않은 입자를 보여줍니다. 반대로, 36초 동안 밀봉하도록 방치하면 PLGA가 거의 완전히 녹아서 프로파일이 얕은 미세구조가 됩니다. 이상적인 형태는 입자가 18초 및 24초 동안 밀봉될 때 시각화할 수 있는데, 이는 입자 구조를 유지하면서 폴리머에 의해 완전히 캡슐화된 화물을 포함하기 때문입니다. 그림 1C 는 충진 및 밀봉 후 몇 가지 잠재적인 결과를 보여줍니다. 분배하는 동안 용매가 입자 바닥에 도달하지 않으면 입자 코어의 중간에 용질이 건조됩니다 (잘못 채워짐). 이러한 입자는 여전히 밀봉될 수 있지만 화물의 적재 불량은 적재 효율을 제한할 수 있습니다. 입자가 너무 많은 카고로 채워지면(overfilled), 카고가 PLGA가 개구부를 통해 유동하는 것을 방지하기 때문에 밀봉 공정이 금지됩니다. 올바르게 채워지고 밀봉되면 이 형상의 입자는 19G 바늘 안에 쉽게 들어갈 수 있을 만큼 작습니다. 또한, 2% 카르복시메틸셀룰로오스와 같은 점성 용액을 주입했을 때 10개의 입자가 19G 바늘(100% ± 0%)을 통해 일관되게 흘렀습니다(보충 그림 7).
그림 1: 충진 및 밀봉 공정의 일반적인 문제 . (A) 이미지는 한 번의 충전 사이클 후 용매의 증발을 보여주며, 여기서 입자에는 물에 용해된 100mg/mL 플루오레세인 나트륨 염 6nL이 로드됩니다. (B) 0, 12, 18, 24 및 36초에 밀봉 공정에서 제거된 502H PLGA 입자의 대표 이미지. (C) 입자가 올바르게, 부정확하게 채워지거나, 과충전되었을 때 밀봉 공정의 다른 결과. 이미지는 여러 이미지를 초점 스태킹하고 초점 스태킹 소프트웨어를 사용하여 병합하여 생성됩니다. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
항원을 입자에 로딩하기 전에 스핀 필터를 통해 처리하는 것은 두 가지 이유로 중요합니다. 첫째, 원심분리는 백신 용액 중의 스톡 부형제를 제거하는 역할을 하는데, 이는 RABV 항원을 보유하면서 입자 로딩 용량을 제한할 수 있다. 현재 프로토콜은 항원을 약 50배 정제합니다. 둘째, 이 과정에서 항원도 농축됩니다. 도 2A 는 농축된 항원 샘플 중의 무손상 RABV 비리온의 현미경 사진을 나타낸다. 이 항원은 출발 원액보다 약 4.4배 더 농축되어 있습니다(그림 2B). 원심 스핀 필터에 초기에 로딩된 항원의 양은 달성된 최종 폴드 농도를 조절하기 위해 변경될 수 있습니다. 예를 들어, 40μL의 스톡 항원을 로드하면 약 1.75배 농도가 됩니다. 보충 그림 8 은 농축 공정에서 와류(단계 5.15)의 중요성을 보여줍니다. 소용돌이를 게을리하거나 샘플을 부적절하게 소용돌이치면 농축 과정이 제한됩니다.
그림 2: 항원 농도. 원심 여과에 의한 항원의 농도를 투과전자현미경(A)으로 나타내고 ELISA(B)로 확인하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 통계 분석은 단방향 ANOVA를 사용한 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 수행됩니다. **p < 0.01, ****p < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3A는 밀봉되지 않은 밀봉된 입자로 채워진 농축된 항원을 나타낸다. 상당한 양의 항원이 입자에 로드되지만(0.0469 ± 0.0086 IU), 이 물질은 입자 용량의 <90%를 구성하여 추가 항원 로딩을 위한 충분한 공간을 남깁니다. 흥미롭게도 밀봉되지 않은 입자는 0.0396 ± 0.0077 IU만 함유하고 있으며, 이는 로드된 총량의 85% ± 16%만을 차지합니다. 비록 통계적으로 유의하지 않은 손실이었지만, RABV 항원의 일부는 충전 공정에서 반복적인 재수화 및 건조 동안 변성되었을 수 있다. 밀봉 후 항원의 69% ± 5%가 생리활성 형태로 캡슐화된 상태로 유지됩니다. 이는 열 응력으로 인해 밀봉 공정 중에 상당한 손실이 발생함을 시사하지만, 대부분의 비활성화된 바이러스 항원은 손상되지 않은 상태로 남아 있습니다(그림 3B). 항원과 함께 안정화 부형제의 공동-캡슐화는 제조 공정 전반에 걸쳐 항원 안정성을 더욱 증가시키기 위한 하나의 가능한 전략이며, 이전에 다른 불활성화된 바이러스 항원과 함께 성공적이었다14,15.
그림 3: 입자 제조 후 생체 활성 RABV 항원. (A) 이미지는 RABV 항원을 포함하는 밀봉되지 않은 입자와 밀봉된 입자를 보여줍니다. (B) 입자 제조 공정을 통한 항원 안정성(n=4). 로딩 제어는 항원을 용액에 직접 분배하여 생성됩니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 스케일 바 = 200 μm. 통계 분석은 단방향 ANOVA를 사용한 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 수행됩니다. *p < 0.05입니다. 이미지는 여러 이미지를 초점 스태킹하고 초점 스태킹 소프트웨어를 사용하여 병합하여 생성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 입자, 기준 및 배열 치수. 이 그림은 4각 별 기준점(A), 원통형 미세 입자(B), 5각 별 기준점(C) 및 CAD 소프트웨어에 표시된 기준점(D)이 있는 입자 배열의 기하학적 특성을 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 이 그림은 PDMS 금형을 경화시키기 위해 오븐에 배치된 구조물의 단면을 보여줍니다. 화살표는 바인더 클램프가 적용되는 위치를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 농축된 항원을 효율적으로 회수하기 위한 적절한 기술. 첫 번째 스핀이 끝나면 농축된 샘플이 빨간색(A)으로 원으로 표시되어 필터에 유지되고 여과액은 수집 튜브(더 큰 외부 튜브)의 바닥에 수집됩니다. 펠릿화된 항원을 재현탁하기 위해, 원심 필터 유닛은 와류를 준비하기 위해 수집 튜브(B)를 사용하여 캡핑된다. 와동할 때 튜브의 끝이 와류 패드와 접촉한 상태를 유지하고 캡 끝이 와류 패드(C)와 45° 각도를 유지하면서 회전합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 4: 사전 실행 프로그래밍 압전 디스펜서. (A) "메인 탭"에서 로봇 설정 > 기타 >Div. 기능 > 목표 기준점 찾기로 이동하여 "대상 기준점 찾기"를 설정합니다. 파란색으로 강조 표시된 버튼을 사용하여 신탁 표시를 설정합니다. 먼저 Learn Template(템플릿 학습)을 선택하고 관심 있는 신탁 마크 주위에 상자를 그리고 Search Template(템플릿 검색)을 클릭하여 템플릿 정확도를 확인한 다음 템플릿을 저장합니다. 4각 및 5각 별에 대해 이 작업을 수행하고 두 개의 다른 템플릿 이미지 사용의 지침에 따라 파일 이름을 저장합니다. 그런 다음 블랙 박스의 모든 매개 변수가 일치하는지 확인합니다. 템플릿 로드(Load Template)(녹색 상자)를 사용하여 4각형 별 기준점을 로드합니다. 작업 목록(주황색 상자)을 선택하여 "대상 참조점 찾기" 프로그램을 저장합니다. (B) 로봇 설정 > 작업 탭으로 이동하여 실행을 설정한 다음 실행 선택 항목(녹색 상자)의 작업을 사용하여 작업 목록(검은색 상자)에서 작업을 추가하여 파란색 상자에 표시된 작업 순서를 로드합니다 . 마지막으로 작업(주황색 상자)을 저장합니다. (C) 로봇 설정 > 대상 기판으로 이동하여 "대상 기판"을 설정한 다음 대상(파란색 상자)을 추가합니다. (D) 여기에 표시된 매개 변수를 입력하고 저장(파란색 상자)을 선택합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 5: 항원 로딩 및 분배 정렬 보정. (A) 노즐 설정 > 작업 수행 탭으로 이동하여 TakeProbe10 uL (블랙 박스)을 선택하고 DO (블랙 박스)를 클릭하여 항원 10μL을 디스펜싱 팁으로 흡인합니다. (B) 별도의 창이 열립니다. 농축된 항원이 로딩된 웰을 선택하고 OK (파란색 상자)를 선택합니다. (C) 항원을 흡인 한 후 파란색 상자를 선택하여 팁을 세척하고이 세척을 두 번 더 반복하십시오. 카메라(검은색 상자)를 선택하고 드롭 볼륨(녹색 상자)을 선택하여 드롭 볼륨을 결정합니다. 부피 표준 편차(%)<2(주황색 상자)로 안정적인 방울이 형성되고 있는지 확인합니다. (D) 이 단계를 따르면 Snap Drop Cam이 열립니다. 드롭다운 메뉴에서 이미지 (파란색 상자)를 선택하고 노즐 헤드 카메라 마법사를 선택합니다. 그러면 새 창이 열립니다. 다음 단계 시퀀스를 빠르게 수행합니다. (E) 보충 그림 4 에서 만든 타겟이 로드되었는지 확인한 다음 타겟으로 이동 (파란색 상자)을 선택합니다. 드롭을 15로 조정하고 스팟 (블랙박스)을 선택합니다. 발견되면 즉시 이동 (녹색 상자)을 선택합니다. 자동 찾기 가 선택되어 있는지 확인하고 입자 크기 = 12를 삭제한 다음 시작 (주황색 상자)을 클릭합니다. 자동 감지에 실패하면 슬라이드의 다른 영역(보라색 상자)으로 이동한 후 이 과정을 반복합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 6: 스포팅 어레이 프로그래밍 및 실행 시작. (A) 타겟 설정 > 타겟으로 이동한 다음 파란색 상자에 표시된 매개변수를 입력합니다. (B) 그런 다음 "필드 설정 탭"으로 이동하여 아니오에 20 을 입력합니다. 드롭 필드(파란색 상자)에서 웰(검은색 상자)을 선택한 다음 투약할 대상/입자(녹색 상자)를 선택합니다. 다른 웰을 선택하고 타겟/입자를 다시 선택하면 단일 실행 중에 추가 충전 주기가 수행됩니다. (C) 메인 화면에서 보충 그림 5 에서 생성된 실행 및 목표가 선택되어 있는지 확인합니다. (D) "실행 탭"으로 이동하여 실행 시작 (파란색 상자)을 선택합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 7: 미세입자 주입성. (ᄀ씨) 플루오레세인 나트륨 염으로 채워지고 19G 바늘에 밀봉된 미세 입자의 초점 적층 입체경 이미지. (D) 2% 카르복시메틸셀룰로오스 용액(n=8)을 사용하여 19G 바늘을 통해 총 10개의 입자를 주입하였다. 스케일 바 = 1mm. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 8: 항원 농도와 관련된 잠재적인 문제. 빨간색 선은 예상되는 농도 증가를 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 통계 분석은 단방향 ANOVA를 사용한 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 수행되었습니다. p < 0.001, ****p < 0.0001. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: RABV ELISA를 위한 완충액 및 용액 준비. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 1: 파티클 배열을 포함하는 STL 파일입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 2: 입자를 밀봉하는 데 사용되는 사용자 슬라이드 홀더의 형상이 포함된 STL 파일입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
특정 요구 사항에 맞게 입자 형상을 변경할 수 있습니다. 그러나 원통형 구조의 경우 저자는 프로토콜에 설명된 높이:직경:벽 두께의 5:4:1 비율을 유지할 것을 권장합니다. 이 종횡비는 입자를 밀봉하기에 충분한 PLGA 재료가 존재하고 취급하기에 충분히 기계적으로 견고함을 유지하도록 합니다. CAD 프로세스 중에 입자 치수와 모양을 쉽게 변경할 수 있으므로 수많은 형상을 생성할 수 있습니다. CAD의 유연성과 3D 프린팅을 결합하면 미세 입자 설계를 빠르게 반복할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다광자 3D 프린터를 사용하지만 적절한 재료로 미세 구조 치수를 인쇄할 수 있는 사양을 가진 모든 3D 프린터를 사용하여 초기 마스터 몰드를 생성할 수 있습니다. 또한, 포토리소그래피는 이전에 이 프로토콜에서 생성된 것보다 훨씬 더 큰 어레이에서 유사한 구조를 만드는 데 사용되었습니다. 그러나 노동력, 맞춤형 포토마스크 주문 지연, 장비 접근성으로 인해 반복적인 설계 프로세스가 느려질 수 있다(16). 마지막으로, 마스터 금형 생성은 사내 마스터 금형 제작이 불가능한 경우 유료 서비스 회사에 아웃소싱할 수 있습니다. 마스터 몰드를 생성하는 데 사용되는 3D 프린터 또는 방법에 관계없이 인쇄물을 기판에 접착하는 것은 다운스트림 단계에서 매우 중요합니다. 특히, PDMS 몰드 생성 중에 접착력이 불충분할 경우, 인쇄된 입자가 PDMS 몰드에 박힌 채로 남아 인쇄된 입자를 수동으로 제거하고 마스터 몰드를 파괴해야 합니다.
입자 충전은 고려해야 할 또 다른 중요한 측면입니다. 미립자는 충전 용량이 제한되어 있으므로 여과는 RABV 항원을 농축할 뿐만 아니라 미립자 코어 부피의 많은 부분을 차지하는 스톡 부형제를 제거하는 데에도 사용됩니다. 그러나 RABV 항원의 크기가 크면(약 60nm x 180nm) 17, 원심분리 단계에서 항원을 부분적으로 펠릿화할 수 있습니다. 이러한 이유로 RABV 항원의 높은 회수율을 달성하기 위해 원심분리 후 피펫팅 또는 볼텍싱에 의해 항원을 재현탁하는 것이 중요합니다. 고농축 용액은 분주 주기를 줄여 충진 중 항원 분해를 제한하기 때문에 분주에 이상적입니다. 그러나 점도는 안정적인 방울을 형성하는 압전 디스펜싱 로봇의 주요 한계이므로 매우 높은 농도의 용액을 디스펜싱하는 것이 불가능하거나 바람직하지 않을 수 있습니다. 충진 용액을 희석하는 것이 안정적인 입자 형성을 달성하는 가장 쉬운 방법이지만, 원하는 로딩을 달성하는 데 필요한 추가 충진 주기에 대한 항원 안정성과 입자를 채우는 데 필요한 더 긴 시간을 고려해야 합니다.
제한
이 방법은 초기 금형을 생산하기 위한 고도로 전문화된 장비와 미세 입자 생산을 위한 특수 충전 장비가 필요합니다. 초기 마스터 몰드를 생성할 수 있는 인쇄 해상도를 가진 3D 프린터의 필요성은 행위별 수가제 접근 방식으로 전복될 수 있지만 압전 디스펜싱 로봇에 대한 접근성은 제한적입니다. 압전 디스펜싱 로봇을 조달하려면 브랜드, 처리량 및 기능에 따라 종종 $80,000에서 $200,000 사이의 상당한 초기 초기 투자가 필요합니다. 몇 가지 다른 충전 방법이 잠재적인 대안이지만, 이러한 방법은 RABV 항원12를 사용하여 검증되지 않았습니다.
향후 적용 분야
캡슐화된 RABV 항원의 상당 부분은 밀봉 공정을 통해 안정적으로 유지되었습니다. 이론적으로, 이 항원을 노출후 예방 치료의 투여 타임라인을 모방하는 상이한 유형의 PLGA로 구성된 입자에 통합함으로써, 모든 용량을 단일 주사로 투여할 수 있었다. 추가 용량을 투여하기 위해 병원을 반복적으로 방문할 필요가 없어지면 환자 순응도가 향상되어 치료 결과가 향상됩니다. 또한, 고도로 복잡한 비활성화 된 광견병 바이러스의 ELISA 반응성을 유지하는 능력을 입증 한 후, 서브 유닛 백신을 포함한 다른 항원이이 캡슐화 방법과 호환 될 가능성이 있습니다. PULSED 미립자와 함께 다른 예방 항원을 사용하면 백신 접종이 부족한 인구의 예방 접종률을 높여 LMIC에서 수백만 명의 생명을 구할 수 있습니다. 그러나 이를 달성하기 위해서는 백신이 캡슐화뿐만 아니라 방출을 통해 안정적으로 유지되어야 하며, 이는 페이로드가 체온 및 PLGA 분해 생성물로 인해 고온과 잠재적으로 산성인 미세 환경에 노출되기 때문에 어려울 수 있습니다18. 향후 연구에서는 방출을 통한 항원의 안정화 전략을 추구할 것이며, 이는 많은 전염병을 예방하는 데 광범위하게 적용할 수 있는 단일 주사 백신 접종 플랫폼의 가능성을 열어줄 것입니다.
Disclosures
McHugh 박사는 포괄적 인 연구를 기반으로 특허를 출원했으며 현재 Particles for Humanity의 컨설턴트입니다. Mr. Graf는 포함된 작업을 기반으로 특허를 출원했습니다. Kadasia 박사, Yang 및 Brady는 이 작업 중에 MIT로부터 유사한 미세 입자 백신 전달 기술을 라이선스한 공익 법인인 Particles for Humanity의 일원입니다.
Acknowledgments
Particles for Humanity에 RABV 항원을 제공한 Chiron Behring과 Bharat Biotech International에 감사드립니다. 또한 Charles Rupprecht, VMD, MS, PhD.의 귀중한 지침과 기술적 공헌에 감사드립니다. 저자는 SciFLEXARRAYER S3 피코리터 디스펜싱 장치의 사용을 허용한 Dr. Rebecca Richards-Kortum의 관대함과 장치 사용에 대한 Dr. Chelsey Smith의 지시에 감사드립니다. 우리는 또한 광견병 항원의 현미경 이미지를 생성한 매사추세츠 챈 의과대학(University of Massachusetts Chan Medical School)을 인정합니다. 마지막으로 제출 전에 문서를 검토해 주신 Don Chickering과 Erin Euliano에게 감사드립니다. 이 작업은 빌 앤 멜린다 게이츠 재단(Bill and Melinda Gates Foundation)의 보조금(INV-004360)으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm PES filter | Cole-Parmer+B4B2:B63 | 04396-26 | |
| 0.25 mm Shims | McMaster Carr | 98090A935 | |
| 0.75 inch Binder Clips | Staples | 480114 | |
| 10 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309604 | |
| 10 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 101.6 mm C-Clamp | Amazon | PT-SD-CP01A | Black handle will eventually fall off. Use pliers to adjust once this happens. |
| 19 G needle | EXCELINT | 26438 | |
| 25 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11 | |
| 3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylate | Millipore Sigma | M6514-25ML | |
| 5 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Eppendorf | 22431081 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 352098 | |
| 50 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11F | |
| Acetone | Fisher | AC268310010 | |
| Aluminum Block | McMaster Carr | 9057K175 | |
| Aluminum Foil | VWR | 89079-069 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters, 100 kDa | Millipore Sigma | C82301 | |
| Anti-Rabies Virus Antibody, Serum Free Antibody, clone 1112-1, 100 | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| Anti-Rabies Virus Mouse Monoclonal Antibody, Clone D1-25, biotinylated | Fisherbrand | 14-388-100 | |
| Carboxymethyl Cellulose | Tokyo Chemical Industries | C0045 | |
| ClipTip 300, Filter, Racked | Fisherbrand | 13-678-11 | |
| Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3206 | |
| Costar 1.7 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3207 | |
| Describe | Nanoscribe | Software used to define the printing parameters for Nanoscribe 3D printer is step 1.2. Software provided with the printer. |
|
| Desiccator | Fisher Scientific | 10529901 | Or equivalent |
| Double-Sided Tape | Staples | 649280 | |
| DPBS (10x), No Calcium, No Magnesium | Gibco | 14200075 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 to 300 µL | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 0.1 – 10 µL | Fisherbrand | 13-678-11F | |
| Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 100 – 1000 µL | Fisherbrand | 03-448-17 | |
| Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 2 – 20 µL | Fisherbrand | FB14955202 | |
| Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 20 – 200 µL | Fisherbrand | 13-374-10 | |
| Fisherbrand Elite Pipette Kit | Fisherbrand | 05-408-137 | |
| Fisherbrand Pipet Controller | Fisherbrand | FB14955202 | |
| Glass Petri Dish, 90 mm | VWR | 470313-346 | |
| Glass Slides | Globe Scientific | 1380-10 | |
| Helicon Focus 8 | HeliconSoft | Software used to focus stack images | |
| IP-Q Resin | Nanoscribe | Printer resin is compatable with the 10x lens and is used for printing large microstructures on the Nanoscribe Photonic Professional GT2 | |
| Lascar EL-USB-TC-LCD Thermocouple | Amazon | 5053485896236 | Or equivalent |
| Microscope Slide Box | Millipore Sigma | Z374385-1EA | Or equivalent |
| Nanoscribe Photonic Professional GT2 with 10X Objective | Nanoscribe | ||
| NanoWrite | Nanoscribe | Software used to interface with nanoscrive 3D printer. Software provided with printer. |
|
| Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
| OPD Substrate Tablets (o-Phenylenediamine Dihydrochloride) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Parafilm M Wrapping Film, 4 in. | Fisherbrand | 13-374-10 | |
| PDC 60 with Type 3 Coating | Scienion | P-2020 | |
| PDMS Particle Molds | Rice University | n/a | N/A- Particles are 400 μm in diameter with a wall thickness of 100 μm, and a height of 500 μm, resulting in an inner diameter of 200 μm. The arrays are 14 x 22 particles spaced 600 μm apart from each other. 4- and 5-point stars are used as fiducials, positioned 600 μm to the right and left of the top right and top left particles on the array. |
| Petri Dish | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Plastic Cups | Fisher Scientific | S04170 | |
| PLGA Film, 502H | Sigma | 502H: 719897-1G | |
| Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate | Millipore Sigma | 484431 | |
| Rabies Antigen | Chiron Behring and Bharat Biotech International | Material was acquired by entering into a materials transfer agreement with the company. | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Scalpel | VWR | 21899-530 and 76457-512 | |
| SciFLEXARRAYER S3 with PCD 60 | Scienion | Or equivalent | |
| Sealing Tape for 96-Well Plates | Thermo Scientific | 15036 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | 1025 | |
| Spring Clamps | IRWIN | VGP58100 | |
| Stainless Steel Block | McMaster Carr | 9083K12 | |
| Streptavidin−Peroxidase Polymer, Ultrasensitive | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Sylgard 184 | DOW | 2646340 | |
| Teflon Sheet | McMaster Carr | 9266K12 | Used to make PLGA films. Must be cut into appropriately sized pieces. |
| Teflon Sheet, 0.8 mm-thick | McMaster Carr | 9266K81 | |
| Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silane | Sigma | 448931-10G | |
| Tweezers | Pixnor | ESD-16 | |
| UltraPure Distilled Water | Fisher Scientific | 10977015 | |
| UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker | UVP | 95-0174-01 | Or equivalent |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | F420100000 | Note you will need two of these. One will be used exclusively to pre-treat samples with trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane to prevent contamination. |
| Vacuum Oven Capable of Reaching 120 °C | VWR | 97027-664 | Or equivalent |
| Vacuum, CRVpro4 | Welch | 3041-01 | Or equivalent |
| Wooden Tongue Depressors | Electron Microscopy Sciences | 72320 |
References
- Li, X. Estimating the health impact of vaccination against ten pathogens in 98 low-income and middle-income countries from 2000 to 2030: a modelling study. The Lancet. 397, 398-408 (2021).
- Euliano, E. M., Sklavounos, A. A., Wheeler, A. R., McHugh, K. J. Translating diagnostics and drug delivery technologies to low-resource settings. Science Translational Medicine. 14 (666), eabm1732 (2022).
- Haider, S. Rabies: old disease, new challenges. Canadian Medical Association Journal. 178 (5), 562-563 (2008).
- Fisher, C. R., Streicker, D. G., Schnell, M. J. The spread and evolution of rabies virus: conquering new frontiers. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 241-255 (2018).
- Nagarajan, T., Rupprecht, C. E. Rabies and Rabies Vaccines. , Springer International Publishing. (2020).
- Shi, T., Dunham, E. F., Nyland, J. E. Rabies vaccination compliance and reasons for incompletion. The Western Journal of Emergency Medicine. 21 (4), 918-923 (2020).
- Shankaraiah, R. H., Rajashekar, R. A., Veena, V., Hanumanthaiah, A. N. D. Compliance to anti-rabies vaccination in post-exposure prophylaxis. Indian Journal of Public Health. 59 (1), 58-60 (2015).
- Cleland, J. L. Single-administration vaccines: controlled-release technology to mimic repeated immunizations. Trends in Biotechnology. 17 (1), 25-29 (1999).
- Yeh, M. K., Coombes, A. G. A., Jenkins, P. G., Davis, S. S. A novel emulsification-solvent extraction technique for production of protein loaded biodegradable microparticles for vaccine and drug delivery. Journal of Controlled Release. 33 (3), 437-445 (1995).
- Peyre, M., Sesardic, D., Merkle, H. P., Gander, B., Johansen, P. An experimental divalent vaccine based on biodegradable microspheres induces protective immunity against tetanus and diphtheria. Journal of Pharmaceutical Sciences. 92 (5), 957-966 (2003).
- Mvan de Weert, M., Hennink, W. E., Jiskoot, W.
- Graf, T. P., et al. A scalable platform for fabricating biodegradable microparticles with pulsatile drug release. Advanced Materials. , https://doi.org/10.1002/adma.202300228 e2300228 (2023).
- Wang, Y., Qin, B., Xia, G., Choi, S. H. FDA's poly (lactic-co-glycolic acid) research program and regulatory outcomes. The American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 23 (4), 92 (2021).
- Wan, Y. Development of stabilizing formulations of a trivalent inactivated poliovirus vaccine in a dried state for delivery in the NanopatchTM microprojection array. Journal of Pharmaceutical Sciences. 107 (6), 1540-1551 (2018).
- Smith, T. G., Siirin, M., Wu, X., Hanlon, C. A., Bronshtein, V. Rabies vaccine preserved by vaporization is thermostable and immunogenic. Vaccine. 33 (19), 2203-2206 (2015).
- McHugh, K. J. Fabrication of fillable microparticles and other complex 3D microstructures. Science. 357 (6356), 1138-1142 (2017).
- Sanchez, M. E. N. Rabies vaccine characterization by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 8149 (2020).
- Fu, K., Pack, D. W., Klibanov, A. M., Langer, R. Visual evidence of acidic environment within degrading poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres. Pharmaceutical Research. 17 (1), 100-106 (2000).
