Summary
Denna metod beskriver inkapsling av rabiesantigenet i biologiskt nedbrytbara polymera mikropartiklar med strukturella och materialegenskaper som möjliggör pulserande frisättning efter en förutbestämd fördröjning. ELISA-bedömning (Enzyme-linked immunosorbent assay) av antigenet som hämtats från partikelkärnan bekräftar förekomsten av intakt trimert rabiesvirusglykoprotein genom partikeltillverkning.
Abstract
De nuvarande riktlinjerna för rabiesprofylax efter exponering kräver flera injektioner administrerade under flera veckor. Detta kan vara oproportionerligt betungande för dem som bor i låg- och medelinkomstländer (LMIC), där majoriteten av dödliga exponeringar för rabies förekommer. Olika läkemedelsleveransstrategier har undersökts för att kondensera vaccinregimer till en enda injektion genom att kapsla in antigener i polymera partiklar. Hårda stressfaktorer under inkapslingsprocessen kan emellertid orsaka denaturering av det inkapslade antigenet. Denna artikel beskriver en metod för att kapsla in rabiesvirusantigenet (RABV) i polymera mikropartiklar som uppvisar avstämbar pulserande frisättning. Denna metod, benämnd partiklar enhetligt flytande och förseglade för att kapsla in läkemedel (PULSED), genererar mikropartiklar med mjuk litografi för att skapa inversa polydimetylsiloxan (PDMS) formar från en multifoton, 3D-tryckt masterform. Poly (mjölksyra-co-glykolsyra) (PLGA) -filmer formas sedan i PDMS-formarna för att generera öppna cylindrar som fylls med koncentrerad RABV med hjälp av en piezoelektrisk doseringsrobot. Dessa mikrostrukturer förseglas sedan genom uppvärmning av partiklarnas topp, vilket gör att materialet kan flöda och bilda en kontinuerlig, icke-porös polymerbarriär. Efter fabricering används en enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) som är specifik för detektion av intakt trimert rabiesvirusglykoprotein för att bekräfta den höga återhämtningen av immunogent antigen från mikropartiklarna.
Introduction
Vaccination är ett extremt effektivt hälso- och sjukvårdsverktyg som har förhindrat mer än 37 miljoner dödsfall mellan 2000 och 20191. Trots denna effektivitet fortsätter sjukdomar som kan förebyggas genom vaccination att utgöra en betydande risk för den globala hälsan, särskilt i låg- och medelinkomstländer där höga nivåer av o- och undervaccinering bidrar till 1,5 miljoner dödsfall som kan förebyggas genom vaccination årligen2. Rabies är inget undantag från dessa skillnader. Trots sin status som den mest dödliga sjukdomen som mänskligheten känner till, är rabies nästan universellt dödlig, rabies är fullt behandlingsbar och klassificeras som utrotad i många höginkomstländer. Istället bärs bördan av rabies oproportionerligt av människor som bor i delar av Asien och Afrika, där sjukdomen har förödande resultat på människor och boskap 3,4.
Vaccination är avgörande för att hantera den globala effekten av rabies5. Kostnaden för vaccination förbjuder utbredd implementering av preexponeringsprofylax (PrEP), med tanke på den övergripande låga förekomsten av sjukdomen. I LMIC:er begränsas dessutom nyttan av postexponeringsprofylax (PEP) av det socioekonomiska trycket på patienter som söker vård. Logistiska faktorer, såsom reseavstånd till tillgång till hälso- och sjukvård, förlorad lön under behandling, kostnaden för behandling, möten som stör dagliga aktiviteter och glömska, resulterar i PEP-följsamhet så låg som 60%6,7. Denna höga patientavgång utgör en möjlighet att förfina metoder för att ta itu med luckor i rabiesvaccination för att bekämpa sjukdomen.
Vaccinationssystem med en injektion (SI) som kontrollerar frisättningen av antigener har undersökts som sätt att få full immunisering i en injektion. Att eliminera behovet av flera besök hos en vårdgivare mildrar de bördor som hindrar individer från att söka adekvat vård. För att uppnå SI-vaccination är ett antigen typiskt inkapslat i en biologiskt nedbrytbar polymermatris som ofta har formen av injicerbara mikropartiklar. När polymeren har injicerats bryts den ned och frigör det sekvestrerade antigenet. Hittills har två primära frisättningsstrategier följts för att uppnå SI-vaccination. I ett tillvägagångssätt frisätts antigenet kontinuerligt under en längre tidsperiod. Även om det är avsett att förbättra immunogeniciteten hos en enda injektion är det oklart om detta tillvägagångssätt är tillräckligt för att framkalla ett skyddande immunsvar mot rabiesvirus (RABV) hos människor8. I den andra frigörs antigenet efter en förutbestämd fördröjning för att efterlikna en konventionell och beprövad prime-boost-vaccinregim. Spraytorkning och emulsions-/lösningsmedelsindunstningsbaserade mikropartikeltillverkningsmetoder uppvisar den tidigare strategin och har använts för att framgångsrikt kapsla in både modellvacciner9 och mycket stabila antigener, såsom tetanustoxoid10. Dessa inkapslingsmetoder involverar emellertid stressfaktorer, inklusive värme, lösningsmedelsinteraktion och fysiska krafter, som kan denaturera antigener11.
Partiklar enhetligt flytande och förseglade för att kapsla in läkemedel (PULSED) är en nyligen utvecklad tillverkningsmetod som kan användas för att kapsla in biologiska läkemedel i biologiskt nedbrytbara mikropartiklar. Micromolding används för att generera partiklar som fylls med en flytande nyttolast och värms upp för att tillåta polymeren att återflöda och helt kapsla in den centrala lastdepån i ett sammanhängande lager av den biologiskt nedbrytbara polymeren. Denna mikrostruktur resulterar i den pulserande frisättningen av nyttolasten, efter en varaktighet som är beroende av nedbrytningshastigheten för det polymera skalet12. Detta manuskript demonstrerar inkapslingen av inaktiverad RABV i mikropartiklar bestående av poly (mjölksyra-co-glykolsyra) (PLGA), en biologiskt nedbrytbar polymer som används i många FDA-godkända formuleringar13, med hjälp av PULSED-tillverkningsmetoden för att kapsla in stabilt RABV-antigen som utvärderats av en enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA). Genom att kombinera PLGA-partiklar med olika molekylvikt och/eller slutgrupper har detta tillvägagångssätt potential att efterlikna den nuvarande rabiesvaccinationstiden efter en enda injektion.
Protocol
1. Generering av partikelmasterform
3D-utskriftsprocessen kan utföras med vilken 3D-skrivare som helst med tillräcklig rumslig upplösning; Det nuvarande protokollet beskriver dock processen för en 3D-skrivare med flera fotoner.
- Designa mikropartikelstrukturer med hjälp av ett CAD-program (computer-aided design).
OBS: Designspecifikationerna är följande: 308 partiklar (diameter = 400 μm, höjd = 500 μm och väggtjocklek = 100 μm) är ordnade i en 22 x 14 matris, med 600 μm avstånd mellan dem. Motivet innehåller också en fyruddig stjärna och en femuddig stjärna som fiducialer omedelbart utanför matrisen (kompletterande figur 1). - Exportera den slutliga designen som en STL-fil (kompletterande kodningsfil 1) och ladda upp filen till programvara som kan definiera utskriftsparametrarna enligt nedan. Spara den sedan som en fil som är kompatibel med 3D-skrivaren (se Materialförteckning).
OBS: Skivavstånd = 5 μm, kläckningsavstånd = 1 μm, skalkontur = 50 μm, antal basskivor = 5 μm, byggnadsställningar = ihåliga, skanningsläge = galvo, z-axel = mikroskop z-enhet, skanningshastighet = 100 000, effekt = 100. - Förbehandla ett substrat för utskrift av kisel (se materialförteckning) med en plasmareningsprocess (gas:O2; effekt: 200 watt; temperatur: 25 °C; flöde: 20; tid: 5 minuter) och sänk sedan omedelbart ner substratet i en lösning av 30 ml etanol och 60 μl 3-(trimetoxisilyl) propylmetakrylat i en petriskål av glas. Täck med aluminiumfolie och låt inkubera över natten.
OBS: Detta steg ökar utskriftens vidhäftning till substratet, vilket är viktigt under PDMS-separation (steg 2.6). - Ladda upp utskriftsfilen till 3D-skrivaren med flera fotoner, applicera utskriftshartset på det behandlade substratet, ladda 10x-linsen (se materialförteckning) och skriv ut mikrostrukturerna.
- När du är klar, sänk ner trycket i propylenglykolmetyleteracetat (se materialförteckning) i 45 minuter för att ta bort oexponerad fotoresist och sänk sedan ner trycket i isopropylalkohol i 5 minuter. Efterhärda masterformen genom att utsätta den för UV-ljus vid 254 nm i 120 min.
OBS: Om tillgängligt kan UV-ljus i intervallet 405 till 365 nm användas i ~ 20 minuter för att efterhärda de tryckta strukturerna.
2. Polydimetylsiloxan (PDMS) mögel generation
- Behandla ytan på den 3D-tryckta huvudformen genom att placera den i en vakuumkammare som innehåller en glasskiva med 40 μL triklor (1H, 1H, 2H, 2H, -perfluoroktyl) (se materialförteckning) silan tillsatt till ytan. Dra i vakuumet (relativt tryck: -20 tum. Hg) i 1 h.
OBS: Detta steg säkerställer enkel separation vid avformning (steg 2.6). - Medan huvudformytan behandlas, blanda noggrant polydimetylsiloxan (PDMS) prepolymerbas med PDMS-prepolymerhärdningsmedlet i ett viktförhållande 9: 1 (minst 10 g material behövs för varje huvudform). När det är noggrant blandat, överför det ohärdade PDMS till ett 50 ml centrifugrör och centrifugera vid 300 x g i 3 minuter vid rumstemperatur.
- När ytbehandlingen är klar, placera huvudformen i en aluminiumfolieform och häll det ohärdade PDMS ovanpå formen, så att funktionerna är helt nedsänkta. Placera aluminiumfolieskålen i en vakuumkammare och dra vakuumet (relativt tryck: -20 tum. Hg) i 1 timme för att ta bort luftbubblor.
- Ta bort aluminiumfolieskålen från vakuumkammaren. Placera 800 μm distanser i ändarna av huvudformen och lägg över en ren glasglid på huvudformen, var försiktig så att du undviker att införa luftbubblor. Använd bindemedelsklämmor för att klämma ihop formen och glaset och lokalisera klämkraften över distanserna (kompletterande figur 2).
- Placera strukturen i en ugn inställd på 120 °C i minst 4 timmar för att härda prepolymeren i PDMS-formar.
- Ta bort strukturen från ugnen, släpp försiktigt bindemedelsklämmorna och separera försiktigt huvudformen från den härdade PDMS-formen med ett rakblad.
OBS: Den 3D-tryckta huvudformen kan återanvändas för att generera ytterligare PDMS-formar.
3. PLGA-filmtillverkning
- Väg upp 450 mg PLGA (se materialtabell) och placera den på ett 76 mm x 76 mm nonstick-polymerark i ett 250 μm tjockt ringmellanlägg med en innerdiameter på 50,8 mm. Placera ett andra nonstick-polymerark över PLGA och komprimera stapeln mellan två aluminiumblock med en 101,6 mm c-klämma tills den är fingertät.
OBS: 502H PLGA användes uteslutande i denna studie; andra typer av PLGA är dock kompatibla med denna process. - Placera den c-fastspända enheten i en vakuumugn inställd på 120 °C i 30 minuter under vakuum, med ett relativt tryck på -30 in.Hg. Ta sedan bort enheten och dra åt klämman ordentligt innan du sätter tillbaka den i vakuumugnen i ytterligare 30 minuter.
OBS: Det primära syftet med att använda ett vakuum är att undvika PLGA-nedbrytning, som accelereras vid höga temperaturer. - Ta ut enheten ur ugnen och låt den svalna i 4 timmar i en exsickator.
- När det är svalt, lossa klämman, ta bort PLGA-filmen från nonstick-polymerarken och placera filmen i en märkt petriskål. Förvara petriskålen i en exsickator för senare användning.
4. PLGA-partikelgenerering
- Behandla ytan på PDMS-formen enligt beskrivningen tidigare i steg 2.1.
- Använd pincett och / eller en skalpell, klipp ut och placera en del av 250 μm PLGA-filmen, ungefär storleken på matrisen, på den behandlade PDMS-formen.
- Överlägg ett rent glasmikroskopglas ovanpå PLGA-filmen och PDMS-formen och kläm fast komponenterna tillsammans genom att placera en fjäderklämma direkt över matrisen och PLGA-filmen.
- Placera den fastspända formenheten i vakuumugnen inställd på 120 ° C och dra vakuumet med ett relativt tryck på -30 tum. Hg i 1 h.
OBS: Den tid som behövs för att bilda partiklarna beror på PLGA och kan variera från 1-12 timmar. - Ta bort den fastspända formenheten från ugnen och låt den passivt svalna vid rumstemperatur i cirka 15 minuter, eller tills den är sval vid beröring.
- Använd ett rakblad och tryck försiktigt mellan PDMS-formen och PLGA-partikelmatrisen för att separera de två. Förvara PLGA-partiklarna i exsickator för framtida bruk.
5. Antigenkoncentration och rening
- Tina en alikvot av kommersiellt tillgängligt RABV-antigen (se Materialförteckning) vid rumstemperatur.
- Montera filtreringsinställningen genom att placera två centrifugalspinnfilter med en 100 kDa molekylviktsgräns (MWCO; se materialtabell) i två uppsamlingsrör.
- Förfukta de två centrifugalspinnfiltren genom att tillsätta 500 μL UltraPure-vatten.
- Snurra filtren vid 2 400 x g i 1 minut i en bänkcentrifug vid rumstemperatur.
- Ta bort vattnet från både det övre och nedre facket i filtreringsinställningen med en 200 μL pipett.
OBS: Låt inte det förfuktade centrifugeringsfiltret torka ut. - Tillsätt 400 μl destillerat vatten till det övre facket på varje centrifugeringsfilter, tillsätt sedan 100 μl av det tinade RABV-antigenet och blanda med pipetten.
OBS: Denna studie koncentrerade antigenet ungefär femfaldigt och minskade koncentrationen av hjälpämnen <100 kDa med ~ 50 gånger. - Ladda de två centrifugalspinnfiltren i en bänkcentrifug och se till att filtren vetter mot centrifugens mitt. Markera vilken sida av filtret som vetter mot centrifugens mitt.
OBS: Om de orienteras felaktigt kommer lösningarna inte att filtreras / koncentreras ordentligt. - Centrifugera filtren vid 14 000 x g i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Hämta filtren från centrifugen. Uppsamlingsrören kommer att innehålla filtratet, medan filtren kommer att innehålla det koncentrerade provet (kompletterande figur 3A).
- Ta bort filtratet i uppsamlingsrören med en pipett och kassera.
- Tillsätt 450 μl filtrerat destillerat vatten till varje filter och blanda det koncentrerade provet och vattnet genom att pipettera upp och ner sex gånger.
- Centrifugera de två centrifugeringsfiltren en andra gång vid 14 000 x g i 10 minuter vid rumstemperatur. Se till att filtren är vända mot centrifugens mitt i samma riktning som i steg 5.7.
- Hämta filterenheterna från centrifugen och, precis som tidigare, ta bort och kassera filtratet från varje rör med en pipett.
- Ta bort centrifugeringsfiltren från uppsamlingsrören och täck över filterhöljena med hjälp av uppsamlingsrörens ovansida (kompletterande figur 3B).
- Placera botten av centrifugeringsfilterhöljena direkt på en virvel och virvel vid 3 000 varv/min i 30 s medan du håller filterhöljena upprätt och i 45° vinklar (kompletterande figur 3C).
Anmärkning: Detta steg är avsett att resuspendera alla RABV-antigener som bildade en pellet under centrifugeringsprocessen. - Ta försiktigt bort locket på uppsamlingsrören från centrifugeringsfilterhöljena. Sätt tillbaka filterhöljena i de medföljande uppsamlingsrören och kör ett snabbt snurr (2-3 s) för att samla upp eventuell volym som kan ha fastnat i locket.
OBS: Denna snabba snurrning måste utföras i en bänkmikrocentrifug. Filtren ska vara tangentiella till centrifugen, motsatt den tidigare konfigurationen, för att säkerställa att ingen lösning går förlorad genom filtren. - Vänd varje centrifugeringsfilterenhet till ett nytt uppsamlingsrör som medföljer centrifugeringsfiltersatsen (se materialtabell) och centrifugera i 2 minuter vid 1 000 x g vid rumstemperatur för att samla upp de koncentrerade proverna.
- Konsolidera de koncentrerade proverna från de två uppsamlingsrören till ett uppsamlingsrör. Mät och registrera den resulterande volymen.
OBS: Det resulterande provet kommer att ha 5x den ursprungliga antigenkoncentrationen som stam, ha en liten hjälpämneskoncentration (<100 kDa) ungefär 50 gånger lägre än stammen och se något mjölkvit ut. Den totala volymen bör vara cirka 44-48 μL. - Förvara det 5x koncentrerade, två gånger tvättade antigenet vid 4 °C fram till doseringstillfället, men inte längre än 16 timmar. Innan du fyller partiklar med denna lösning, centrifugera röret vid 1 000 x g i 1 minut för att avlägsna eventuella bubblor. Lösningen kan spädas med destillerat vatten för att uppnå den nominella målkoncentrationen för dosering.
6. Fyllning av partiklar
- Vakuumfiltrera 500 ml avjoniserat vatten genom ett 0,22 μm vakuumfilter, avgasa sedan lösningen genom att applicera ett vakuum (relativt tryck: -20 tum. Hg) medan under ultraljudsbehandling för 20 min.
- Under denna tid, fäst piezodispensekapillärerna (PDC; se materialförteckning) på den piezoelektriska dispensern.
- Fyll maskinen enligt tillverkarens anvisningar (se materialförteckning) och placera glaset med PLGA-partiklarna i utmatningsområdet.
- Ställ in "Hitta målreferenspunkter", Kör och ställ sedan in "Målsubstrat", enligt kompletterande figur 4.
- Fyll 25 μL av det koncentrerade antigenet på källplattan och fyll på det i maskinen. Använd PDC, sug in 10 μL koncentrerat antigen i doseringsspetsen, tvätta utsidan av spetsen och kalibrera sedan doseringsinriktningen (kompletterande figur 5).
- Ange "Target Setup parameters" och klicka på Kör (kompletterande bild 6).
- När du är klar, ta bort de fyllda partiklarna och kontrollera att de är fyllda under ett stereoskop.
- Gå direkt till nästa steg i protokollet.
7. Partikeltätning och skörd
- Placera ett block av rostfritt stål (se Materialförteckning) på en kokplatta. Placera två mikroskopglas på blocket av rostfritt stål så att de är parallella. Se till att blocket av rostfritt stål är plant, slå sedan på kokplattan och ställ in temperaturen så att yttemperaturen på rostfritt stål är 200 °C. Kontrollera temperaturen på kokplattan innan du förseglar.
- Suspendera de fyllda PLGA-partiklarna ovanför kokplattan genom att placera dem på de två glasskivorna och starta sedan omedelbart en timer i 18 sekunder.
OBS: Mängden tid och värmepartiklar som behöver tätas varierar beroende på de kemiska egenskaperna hos PLGA som används för att göra partiklarna. En anpassad 3D-tryckt bildhållare kan användas för att hantera bilderna på ett säkert avstånd från kokplattan. STL-filen tillhandahålls som kompletterande kodningsfil 2. - När den är förseglad, ta bort partikelmatrisen från kokplattan och häng den över laboratoriebänken genom att placera partikelmatrisen på två separata glasskivor. Låt partiklarna svalna i 1 min.
- När de har kylts kan partiklarna skördas med en skalpell medan man tittar genom ett stereoskop. Håll skalpellen med bladet i 45 ° vinkel mot glaset och tryck på partikelns bas för att separera den från glasskivan.
- När du har skördat, använd skalpellen för att överföra partiklarna till 0,5 ml lågproteinbindningsrör (se materialförteckning). Fyll sedan rören med 250 μL av en 1x fosfatbuffertlösning (PBS) innehållande 30 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) och 1 mg/ml glukos.
OBS: 30 mg / ml BSA och 1 mg / ml glukoslösning framställd i PBS kommer att bibehålla stabiliteten hos RABV-antigenet. - Krossa partiklarna under ett stereoskop med en pincett. Se till att RABV-antigenet i partikelns kärna är tillgängligt för att lösas i den omgivande lösningen. Förvara proverna i kylskåp vid 4 °C tills antigenstyrkan kan utvärderas med hjälp av en ELISA. Proverna måste köras på en ELSIA inom 7 dagar efter beredningen.
8. Utvärdering av antigenet med ELISA
VARNING: Låt inte mikroplattorna torka ut vid något tillfälle. Stapla alltid tallrikar och täck alltid den övre plattan med en plastförsegling, en tom tallrik eller ett lock för att undvika uttorkning.
- Förbered buffertarna enligt anvisningarna i kompletterande fil 1.
- Bered 5 ml beläggningslösning (karbonat-bikarbonatbuffert, pH 9,6) i en koncentration av 2,5 μg/ml genom att tillsätta 25 μL av beläggningsantikroppen till 4975 μL beläggningsbuffert vid pH 9,4–9,6.
OBS: 5 ml behövs för att belägga 96 brunnar med 50 μL vardera (med extra volym för pipetteringsförlust). Öka den totala volymen med 5 ml för varje ytterligare ELISA-platta som behövs. - Använd en flerkanalig pipett för att dosera 50 μL av beläggningslösningen i varje brunn på mikroplattan. Lösningen måste användas för beläggning omedelbart efter det att den har beretts.
- Knacka försiktigt längs plattans kanter på en handske handflata för att säkerställa att botten av varje brunn är jämnt täckt med vätska.
- Försegla plattan med självhäftande film och placera den vid 37 °C i 1 timme och överför sedan till 4 °C över natten.
- Hämta plattorna från kylförvaringen och tvätta dem tre gånger med 200 μL tvättbuffert i varje brunn.
- Ta bort tvättbufferten och fördela 300 μL blockerande buffert i varje brunn.
VARNING: När du kör flera plattor med samma prover upprepade på olika plattor är det viktigt att fortsätta platta för platta (dvs. fyll platta 1 med materialet innan du fortsätter till platta 2 och sedan till platta 3 och så vidare). Applicera inte material X på alla plattor och sedan material Y, etc., eftersom detta skulle öka risken för att brunnar torkar ut. Efter det sista tvättsteget ska tvättbufferten ligga kvar i plattans brunnar och endast kasseras omedelbart innan prover läggs till på plattan. Ett plastplattlock med 96 brunnar måste användas för att täcka alla brunnar på ELISA-plattan som inte dispenseras in direkt, och locket flyttas sekventiellt för att avslöja ytterligare brunnar som ska fyllas med material. - Försegla plattorna med en självhäftande plastfilm (se Materialförteckning) och placera dem i en inkubator i 60 ± 5 minuter vid 37 ± 2 °C.
- Förbered standardkurvan och de testprover som skall utvärderas under inkubationen.
Anmärkning: Det antigen som utvärderas måste förspädas i spädningsbuffert vid en rekommenderad utspädning på 0,125 IE/ml, med en överskottsvolym på minst 40 μl för att ta hänsyn till pipetteringsförlusten. Alla prover utvärderas i två exemplar (två tekniska replikat) på varje ELISA-platta. För standardkurvan bör en tvåfaldig utspädningsserie för totalt åtta punkter inkluderas i kolumnerna 2 och 3 på varje ELISA-platta. En spädningsserie kan utföras för alla andra prover med ett lämpligt antal poäng baserat på den uppskattade mängden antigen som utvärderas. Även om det är mindre rigoröst för högre genomströmning kan en utspädning med ett enda prov användas som ett alternativ till pläteringen som beskrivs ovan. Den förväntade koncentrationen av en utspädning måste dock ligga inom standardkurvans intervall. - I 96-brunnsplattor med lågbindande protein eller lågbindande proteinrör (se Materialförteckning), utför en tvåfaldig utspädningsserie av varje prov längs plattans kolonner.
- Fyll början av utspädningsserien på rad A för varje prov med dubbelt så stor slutlig volym som krävs (per platta krävs 100 μL prov per brunn, så alla brunnar i A2-A11 bör innehålla minst 240 μL av ett prov, med en extra volym på 40 μL för att ta hänsyn till pipetteringsförlust).
- Fyll 120 μL spädningsbuffert i alla andra brunnar på den lågbindande proteinplattan, utom kolumnerna 1 och 12 (dvs. B2 till H11).
- Använd en flerkanalig pipett laddad med 10 spetsar och utför serieutspädning genom att överföra 120 μL prov från A2-A11 till B2-B11 och pipettera upp och ner flera gånger för att blanda samtidigt som stänk och bubblor undviks. Upprepa denna process, flytta ner plattan längs kolonnerna tills brunnar H2-H11. Kassera de återstående 120 μl volym som aspireras från den sista raden av brunnar.
OBS: Proverna är nu klara för analys. Om blockeringsfasen inte är klar vid denna tidpunkt, se till att proverna hålls på is. - Vid slutet av inkubationssteget, tvätta plattorna tre gånger med 200 μL tvättbuffert.
- Överför med hjälp av en flerkanalig pipett 100 μl spädningsbuffert till kolumnerna 1 och 12 som "blank".
- Överför med hjälp av en flerkanalig pipett 100 μl från varje brunn av den lågbindande proteinplattan med 96 brunnar som innehåller provutspädningar till den tvättade ELISA-plattan. Upprepa för alla ELISA-plattor som körs.
- Förslut plattorna med en självhäftande plastfilm och placera dem i en inkubator i 60 ± 5 minuter vid 37 ± 2 °C.
- Bered detektionsantikroppslösningen (se materialtabell) i en koncentration av 0,2 μg/ml genom att tillsätta 4,4 μl antikroppslösning till 10 995,6 μl spädningsbuffert och blanda väl genom pipettering uppåt och nedåt.
OBS: Totalt 11 ml behövs för 96 brunnar vid 100 μL vardera (med extra volym för pipetteringsförluster). Öka den totala volymen med 11 ml för varje ytterligare ELISA-platta som utvärderas. Lösningen måste användas omedelbart efter beredningen. - Vid slutet av inkubationssteget, tvätta plattorna fem gånger med 200 μL tvättbuffert.
- Aspirera den återstående tvättbufferten och fördela 100 μL av detektionsantikroppslösningen i varje brunn på mikroplattan med hjälp av en flerkanalig pipett.
- Förslut plattorna med en självhäftande plastfilm och placera dem i en inkubator i 60 ± 5 minuter vid 37 ± 2 °C.
- Bered konjugatet mot slutet av inkubationssteget för detektionsantikroppen genom att tillsätta 4,4 μl streptavidinperoxidaskonjugatlösning (se materialtabell) till 10 995,6 μl tvättbuffert.
OBS: Totalt 11 ml behövs för 96 brunnar vid 100 μL vardera (med extra volym för flerkanalig pipettering). Öka den totala volymen med 11 ml för varje ytterligare ELISA-platta som utvärderas. - Tvätta plattorna fem gånger med 200 μL tvättbuffert.
- Aspirera den återstående tvättbufferten och fördela 100 μL konjugatlösning till varje brunn.
- Förslut plattorna med en självhäftande plastfilm och placera dem i en inkubator på 37 °C i 60 ± 5 minuter vid 37 ± 2 °C.
- Förbered underlaget under det sista tvättsteget enligt tillverkarens anvisningar (se materialförteckning). Lös upp en tablett o-fenylendiamindihydroklorid (OPD; se materialförteckning) i 9 ml avjoniserat vatten i mörker för varje platta och fyll sedan på med 1 ml 10x stabil peroxidbuffert. Justera antalet tabletter och den totala volymen lösning (10 ml) enligt antalet plattor som utvärderas.
- Tvätta plattorna fem gånger med 200 μL tvättbuffert.
- Fördela 100 μL av underlaget till varje brunn med en flerkanalig pipett.
- Försegla plattorna med en självhäftande plastfilm och lämna dem på bänken i 10-20 minuter, skyddade från ljus, med aluminiumfolie.
Övervaka färgutvecklingen visuellt för att undvika mättnad. - Tillsätt 50 μl stopplösning till varje brunn och avläsningsplattan omedelbart för absorbans vid 492 nm och en referensabsorbans på 620 nm.
- Analysera data med hjälp av den korrigerade absorbansavläsningen (avläsning vid 492 nm minus avläsningen vid 620 nm) och subtrahera medelvärdet av ämnet från alla prover. Använd en sigmoidal 4PL-interpolationsmetod för att konvertera absorbansvärden till IE / ml. Slutligen multiplicera med 250 μL (total provvolym) för att konvertera till IE.
OBS: Denna analys kan göras med hjälp av dataanalysprogramvara.
Representative Results
Partikeltätning och fyllning är två av de mest kritiska stegen i detta protokoll. Partiklar fylldes med fluoresceinnatriumsalt för att visa idealisk fyllning och några vanliga fel. Fluoresceinnatriumsalt användes i stället för RABV-antigenet för att underlätta visualiseringen. Under fyllningen är det viktigt att dosera lösningen i botten av partikelkärnorna och sedan ge tillräckligt med tid för lösningsmedlet/vattnet att avdunsta. När det är klart finns en depå av lösningsmedlet kvar i botten av partikelkärnan (figur 1A). När de är fyllda är det viktigt att försegla partiklarna korrekt. Figur 1B visar flera resultat (framgångsrika och misslyckade) av tätningsprocessen. Efter 12 s tätningstid kvarstår en distinkt väg från partikelcentret till utsidan av partikeln, vilket visar en partikel som inte är helt förseglad. Omvänt, om den lämnas för att täta i 36 s, smälter PLGA nästan helt, vilket resulterar i en mikrostruktur med en grund profil. Den ideala morfologin kan visualiseras när partiklar förseglas i 18 och 24 s, eftersom de innehåller last helt inkapslad av polymeren samtidigt som en partikelstruktur bibehålls. Figur 1C visar flera potentiella resultat efter fyllning och tätning. Under dosering, om lösningsmedlet inte når partikelbotten, lämnar det löst ämne torkat i mitten av partikelkärnan (felaktigt fyllt); Även om dessa partiklar fortfarande kan täta, kan dålig lastning av last begränsa lastningseffektiviteten. Om partiklar fylls med för mycket last (överfylld) hämmas tätningsprocessen, eftersom lasten förhindrar att PLGA flyter över öppningen. När de är korrekt fyllda och förseglade är partiklar av denna geometri tillräckligt små för att enkelt passa in i en 19 G nål. Vidare flödade 10 partiklar konsekvent genom en 19 G nål (100% ± 0%) när de injicerades med en viskös lösning såsom 2% karboximetylcellulosa (kompletterande figur 7).
Figur 1: Vanliga problem med fyllnings- och tätningsprocessen . (A) Bilder visar avdunstning av lösningsmedel efter en påfyllningscykel, där partiklar fylls med 6 nL 100 mg/ml fluoresceinnatriumsalt upplöst i vatten. (B) Representativa bilder av 502H PLGA-partiklar avlägsnade från tätningsprocessen vid 0, 12, 18, 24 och 36 s. (C) Olika resultat av tätningsprocessen när partiklar fylls korrekt, felaktigt eller överfylls. Bilder genereras genom fokusstapling av flera bilder och sammanslagning av dem med hjälp av programvara för fokusstapling. Skalstapel = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bearbetning av antigenet genom ett spinnfilter innan det laddas i partiklarna är viktigt av två skäl. För det första tjänar centrifugeringen till att avlägsna lagerhjälpämnen i vaccinlösningen, som kan begränsa partikelbelastningskapaciteten samtidigt som RABV-antigenet bibehålls. Det nuvarande protokollet renar antigenet ungefär 50 gånger. För det andra koncentreras antigenet också under denna process. Figur 2A visar en mikrografi av intakta RABV-virioner i det koncentrerade antigenprovet. Detta antigen är ungefär 4,4 gånger mer koncentrerat än stamlösningen (figur 2B). Mängden antigen som initialt laddas i centrifugalspinnfiltren kan ändras för att modulera den slutliga vikningskoncentrationen som uppnås. Exempelvis resulterar laddning av 40 μl stamantigen i en ungefärlig 1,75-faldig koncentration. Kompletterande figur 8 visar vikten av virveling (steg 5.15) i koncentrationsprocessen. Att försumma virvel eller felaktigt virvla proverna begränsar koncentrationsprocessen.
Figur 2: Antigenkoncentration. Antigenkoncentrationen genom centrifugalfiltrering visad genom transmissionselektronmikroskopi (A) och bekräftad med ELISA (B). Felstaplar anger standardavvikelsen. Statistisk analys görs med hjälp av Tukeys multipla jämförelsetester med envägs ANOVA. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3A visar koncentrerat antigen fyllt i oförseglade och förseglade partiklar. Även om en betydande mängd antigen laddas i partiklarna (0,0469 ± 0,0086 IE), utgör detta material <90% av partikelkapaciteten, vilket ger gott om utrymme för laddning av ytterligare antigen. Intressant nog innehåller oförseglade partiklar endast 0,0396 ± 0,0077 IE, vilket endast omfattar 85% ± 16% av den totala mängden laddad. Även om det är en statistiskt obetydlig förlust kan en del av RABV-antigenet ha denaturerats under upprepad rehydrering och torkning i fyllningsprocessen. Efter tätning förblir 69% ± 5% av antigenet inkapslat i bioaktiv form. Även om detta tyder på betydande förlust under tätningsprocessen på grund av termisk stress, förblir det mesta av det inaktiverade virala antigenet intakt (figur 3B). Saminkapsling av stabiliserande hjälpämnen tillsammans med antigenet är en möjlig strategi för att ytterligare öka antigenstabiliteten under hela tillverkningsprocessen, och har tidigare varit framgångsrik med andra inaktiverade virusantigener14,15.
Figur 3: Bioaktivt RABV-antigen efter partikeltillverkning . (A) Bilder visar oförseglade och förseglade partiklar som innehåller RABV-antigenet. (B) Antigenstabilitet genom partikeltillverkningsprocessen (n = 4). Laddningskontroll genereras genom att antigenet doseras direkt i lösningen. Felstaplar anger standardavvikelsen. Skalstapel = 200 μm. Statistisk analys görs med hjälp av Tukeys multipla jämförelsetester med envägs ANOVA. *p < 0,05. Bilder genereras genom fokusstapling av flera bilder och sammanslagning av dem med hjälp av programvara för fokusstapling. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Partikel-, fiducial- och matrisdimensioner. Figuren visar de geometriska egenskaperna hos den fyruddiga stjärnfiducialen (A), den cylindriska mikropartikeln (B), den femuddiga stjärnfiducialen (C) och en rad partiklar med fiducials (D) som visas i CAD-programvaran. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Denna figur visar ett tvärsnitt av strukturen placerad i ugnen för att härda PDMS-formar. Pilar anger var bindemedelsklämmor appliceras. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Korrekt teknik för att effektivt återvinna koncentrerat antigen. I slutet av den första omgången behålls det koncentrerade provet inringat i rött (A) i filtret, medan filtratet samlas upp i botten av uppsamlingsröret (större ytterrör). För att resuspendera det pelleterade antigenet täcks centrifugalfilterenheten med hjälp av uppsamlingsröret (B) som förberedelse för virvling. Vid virvelvridning hålls rörets spets i kontakt med virveldynan och lockänden roteras runt samtidigt som en 45° vinkel bibehålls med virveldynan (C). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 4: Pre-run programmering piezoelektrisk dispenser. (A) Ställ in "Hitta målreferenspunkter" genom att navigera från "Huvudfliken" till funktionen Robotinställning > diverse >Div. > Hitta målreferenspunkter. Använd knapparna markerade i blått för att ställa in förtroendemärkena. Välj först Lär dig mall och rita en ruta runt förtroendemärket av intresse, verifiera mallens noggrannhet genom att klicka på Sökmall och spara mallen. Gör detta för de fyr- och femuddiga stjärnorna och spara filnamnen enligt anvisningarna under Använd två olika mallbilder. Se sedan till att alla parametrar i de svarta rutorna matchar. Ladda den fyruddiga stjärnfiducialen med hjälp av laddningsmallen (grön ruta). Spara programmet "Hitta målreferenspunkter" genom att välja Uppgiftslista (orange ruta). (B) Ställ in Kör genom att navigera till fliken Robotinställningar > Uppgifter och ladda sedan sekvensen av uppgifter som visas i den blå rutan genom att lägga till uppgifter från uppgiftslistan (svart ruta) med hjälp av Uppgift i Run-val (grön ruta). Spara slutligen uppgiften (orange ruta). (C) Ställ in "Målsubstrat" genom att navigera till Robotinställning > Målsubstrat och lägg sedan till ett mål (blå ruta). (D) Ange parametrarna som visas här och välj Spara (blå ruta). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 5: Laddning av antigen och kalibrering av väntande anpassning. (A) Navigera till fliken Nozzle Setup > Do Task och aspirera 10 μL av antigenet i doseringsspetsen genom att välja TakeProbe10 uL (svart ruta) och klicka på DO (svart ruta). (B) Ett separat fönster öppnas. Välj brunnen som det koncentrerade antigenet laddades i och välj OK (blå ruta). (C) Efter att antigenet har aspirerats, tvätta spetsen genom att välja den blå rutan och upprepa denna tvätt ytterligare två gånger. Välj kameran (svart ruta) och bestäm droppvolymen genom att välja släppvolym (grön ruta). Se till att en stabil droppe bildas med en volymstandardavvikelse (%) <2 (orange ruta). (D) Genom att följa dessa steg öppnas Snap Drop Cam; välj Bild (blå ruta) i rullgardinsmenyn och välj Guiden Munstyckshuvudkamera. Ett nytt fönster öppnas. Utför nästa stegsekvens snabbt. (E) Se till att målet i kompletterande bild 4 är laddat och välj sedan Flytta till mål (blå ruta). Justera dropparna till 15 och välj Spot (svart ruta). När du har upptäckt väljer du omedelbart Flytta (grön ruta). Se till att Auto Find är valt och ta bort partikelstorlek = 12 och klicka sedan på Start (orange rutor). Om den automatiska identifieringen misslyckas upprepar du den här processen efter att ha flyttat till ett annat område på bilden (lila ruta). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 6: Programmera spotting array och börja körningen. (A) Navigera till Target Setup > Target och fyll sedan i parametrarna som visas i den blå rutan. (B) Navigera sedan till fliken "Fältinställningar" och ange 20 i nr. av fältet Droppar (blå ruta), välj en brunn (svart ruta) och välj sedan mål/partiklar att dosera i (grön ruta). Genom att välja en annan brunn och välja om mål/partiklar utförs ytterligare fyllningscykler under en enda körning. (C) På huvudskärmen, se till att körningen och målet som skapats i kompletterande figur 5 är valda. (D) Navigera till fliken "Kör" och välj Starta körning (blå ruta). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 7: Injicerbarhet av mikropartiklar. (A–C) Fokusstaplade stereoskopbilder av mikropartiklar fyllda med fluoresceinnatriumsalt och förseglade i en 19 G nål. (D) Totalt 10 partiklar injicerades genom en 19 G nål med användning av en 2% karboximetylcellulosalösning (n = 8). Skalstång = 1 mm. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 8: Potentiella problem med antigenkoncentration. Den röda linjen indikerar den förväntade vikökningen i koncentrationen. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Statistisk analys gjordes med Tukeys multipla jämförelsetester med envägs ANOVA. p < 0,001, ****p < 0,0001. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 1: Beredning av buffertar och lösningar för RABV ELISA. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 1: STL-fil som innehåller partikelmatris. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 2: STL-fil som innehåller geometri för den anpassade glidhållaren som används för tätning av partiklar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Det är möjligt att ändra partikelgeometri för specifika behov; För cylindriska strukturer rekommenderar författarna dock att man behåller ett 5: 4: 1-förhållande av höjd: diameter: väggtjocklek som beskrivs i protokollet. Detta bildförhållande säkerställer att det finns tillräckligt med PLGA-material för att täta partiklarna och förbli mekaniskt robust nog för hantering. Partikeldimensioner och former kan enkelt ändras under CAD-processen, vilket gör att en myriad av geometrier kan genereras. Genom att kombinera CAD:s flexibilitet med 3D-utskrift möjliggörs snabb iteration av mikropartikelkonstruktioner. Även om detta protokoll använder en 3D-skrivare med flera fotoner, kan alla 3D-skrivare med specifikationer som kan skriva ut mikrostrukturdimensionerna i ett lämpligt material användas för att generera den ursprungliga huvudformen. Vidare har fotolitografi tidigare använts för att göra liknande strukturer i matriser mycket större än de som produceras i detta protokoll; Arbetet, förseningen av beställningen av skräddarsydda fotomasker och utrustningens tillgänglighet skulle dock bromsa den iterativa designprocessen16. Slutligen kan masterformgenerering outsourcas till avgiftsföretag om intern masterformtillverkning inte är möjlig. Oavsett vilken 3D-skrivare eller metod som används för att generera huvudformarna är utskriftens vidhäftning till substratet avgörande för nedströmssteg. Specifikt, om vidhäftningen är otillräcklig under PDMS-formgenerering, kommer tryckta partiklar att förbli kvar i PDMS-formen, vilket kräver manuell borttagning av de tryckta partiklarna och förstörelse av huvudformen.
Partikelfyllning är en annan kritisk aspekt att tänka på. Mikropartiklar har begränsad fyllningskapacitet, så filtrering används inte bara för att koncentrera RABV-antigenet utan också för att avlägsna stamhjälpämnen som annars skulle uppta en stor del av mikropartikelkärnvolymen. Med tanke på RABV-antigenets stora storlek (ca 60 nm × 180 nm)17 är det emellertid möjligt att delvis pelletera ut antigenet under centrifugeringsstegen. Av denna anledning är det viktigt att resuspendera antigenet genom pipettering eller virvelring efter centrifugering för att uppnå en hög återvinning av RABV-antigenet. En högkoncentrerad lösning är idealisk för dispensering, eftersom den minskar doseringscyklerna och därmed begränsar antigennedbrytningen under fyllningen. Viskositeten är dock en stor begränsning av piezoelektriska dispenseringsrobotar som bildar en stabil droppe, så dispensering av en lösning med mycket hög koncentration kanske inte är möjlig eller tillrådlig. Utspädning av fyllningslösningen är det enklaste sättet att uppnå en stabil droppbildning, men antigenstabilitet under de ytterligare påfyllningscykler som behövs för att uppnå önskad belastning och den längre tid som krävs för att fylla partiklar bör beaktas.
Begränsningar
Denna metod kräver högspecialiserad utrustning för att producera de ursprungliga formarna och ett specialiserat fyllningsinstrument för mikropartikelproduktion. Även om behovet av en 3D-skrivare med en utskriftsupplösning som kan generera de ursprungliga huvudformarna kan undergrävas av en avgift-för-service-strategi, är tillgängligheten till en piezoelektrisk dispenseringsrobot begränsande. Upphandling av en piezoelektrisk dispenseringsrobot kräver en betydande initial investering, ofta i intervallet $ 80,000 till $ 200,000, beroende på varumärke, genomströmning och kapacitet. Även om flera andra fyllningsmetoder är potentiella alternativ har dessa metoder inte validerats med RABV-antigen12.
Framtida tillämpningar
En betydande andel inkapslat RABV-antigen förblev stabilt genom förseglingsprocessen. I teorin, genom att införliva detta antigen i partiklar som består av olika typer av PLGA som efterliknar administreringstidslinjen för profylaxbehandling efter exponering, kan alla doser administreras i en enda injektion. Att eliminera behovet av upprepade sjukhusbesök för att administrera ytterligare doser kommer att förbättra patientens efterlevnad, vilket resulterar i bättre behandlingsresultat. Efter att ha visat förmågan att behålla ELISA-reaktiviteten hos det mycket komplexa inaktiverade rabiesviruset är det dessutom troligt att andra antigener, inklusive subenhetsvacciner, skulle vara kompatibla med denna inkapslingsmetod. Användning av andra profylaktiska antigener med PULSED-mikropartiklar kan rädda miljontals liv i LMIC genom att öka vaccinationsgraden för undervaccinerade populationer. För att uppnå detta måste vacciner dock förbli stabila genom inte bara inkapsling utan också frisättning, vilket kan vara utmanande eftersom nyttolasten kommer att utsättas för förhöjda temperaturer och en potentiellt sur mikromiljö på grund av kroppsvärme och PLGA-nedbrytningsprodukter18. Framtida arbete kommer att driva stabiliserande strategier för antigenet genom frisättning, vilket skulle öppna potentialen för en vaccinationsplattform med en injektion som är allmänt tillämplig för att förhindra många infektionssjukdomar.
Disclosures
Dr. McHugh har ett patent inlämnat baserat på det omfattande arbetet och är för närvarande konsult för Particles for Humanity. Mr Graf har ett patent inlämnat baserat på det omfattade arbetet. Dr. Kadasia, Mr. Yang och Ms. Brady är en del av Particles for Humanity, ett allmännyttigt företag som licensierade en liknande mikropartikelvaccinleveransteknik från MIT under detta arbete.
Acknowledgments
Vi tackar Chiron Behring och Bharat Biotech International för att ha försett Particles for Humanity med RABV-antigenet. Vi vill också tacka Charles Rupprecht, VMD, MS, PhD., för hans ovärderliga vägledning och tekniska bidrag. Författarna vill tacka generositeten hos Dr. Rebecca Richards-Kortum för att tillåta användning av hennes SciFLEXARRAYER S3 picoliter dispenseringsapparat och Dr. Chelsey Smiths instruktion om hur man använder enheten. Vi erkänner också University of Massachusetts Chan Medical School för att generera mikroskopibilder av rabiesantigenet. Slutligen tackar vi Don Chickering och Erin Euliano för att ha granskat dokumentet innan de skickades in. Detta arbete stöddes av ett bidrag (INV-004360) från Bill and Melinda Gates Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm PES filter | Cole-Parmer+B4B2:B63 | 04396-26 | |
| 0.25 mm Shims | McMaster Carr | 98090A935 | |
| 0.75 inch Binder Clips | Staples | 480114 | |
| 10 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309604 | |
| 10 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 101.6 mm C-Clamp | Amazon | PT-SD-CP01A | Black handle will eventually fall off. Use pliers to adjust once this happens. |
| 19 G needle | EXCELINT | 26438 | |
| 25 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11 | |
| 3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylate | Millipore Sigma | M6514-25ML | |
| 5 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Eppendorf | 22431081 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 352098 | |
| 50 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11F | |
| Acetone | Fisher | AC268310010 | |
| Aluminum Block | McMaster Carr | 9057K175 | |
| Aluminum Foil | VWR | 89079-069 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters, 100 kDa | Millipore Sigma | C82301 | |
| Anti-Rabies Virus Antibody, Serum Free Antibody, clone 1112-1, 100 | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| Anti-Rabies Virus Mouse Monoclonal Antibody, Clone D1-25, biotinylated | Fisherbrand | 14-388-100 | |
| Carboxymethyl Cellulose | Tokyo Chemical Industries | C0045 | |
| ClipTip 300, Filter, Racked | Fisherbrand | 13-678-11 | |
| Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3206 | |
| Costar 1.7 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3207 | |
| Describe | Nanoscribe | Software used to define the printing parameters for Nanoscribe 3D printer is step 1.2. Software provided with the printer. |
|
| Desiccator | Fisher Scientific | 10529901 | Or equivalent |
| Double-Sided Tape | Staples | 649280 | |
| DPBS (10x), No Calcium, No Magnesium | Gibco | 14200075 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 to 300 µL | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 0.1 – 10 µL | Fisherbrand | 13-678-11F | |
| Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 100 – 1000 µL | Fisherbrand | 03-448-17 | |
| Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 2 – 20 µL | Fisherbrand | FB14955202 | |
| Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 20 – 200 µL | Fisherbrand | 13-374-10 | |
| Fisherbrand Elite Pipette Kit | Fisherbrand | 05-408-137 | |
| Fisherbrand Pipet Controller | Fisherbrand | FB14955202 | |
| Glass Petri Dish, 90 mm | VWR | 470313-346 | |
| Glass Slides | Globe Scientific | 1380-10 | |
| Helicon Focus 8 | HeliconSoft | Software used to focus stack images | |
| IP-Q Resin | Nanoscribe | Printer resin is compatable with the 10x lens and is used for printing large microstructures on the Nanoscribe Photonic Professional GT2 | |
| Lascar EL-USB-TC-LCD Thermocouple | Amazon | 5053485896236 | Or equivalent |
| Microscope Slide Box | Millipore Sigma | Z374385-1EA | Or equivalent |
| Nanoscribe Photonic Professional GT2 with 10X Objective | Nanoscribe | ||
| NanoWrite | Nanoscribe | Software used to interface with nanoscrive 3D printer. Software provided with printer. |
|
| Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
| OPD Substrate Tablets (o-Phenylenediamine Dihydrochloride) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Parafilm M Wrapping Film, 4 in. | Fisherbrand | 13-374-10 | |
| PDC 60 with Type 3 Coating | Scienion | P-2020 | |
| PDMS Particle Molds | Rice University | n/a | N/A- Particles are 400 μm in diameter with a wall thickness of 100 μm, and a height of 500 μm, resulting in an inner diameter of 200 μm. The arrays are 14 x 22 particles spaced 600 μm apart from each other. 4- and 5-point stars are used as fiducials, positioned 600 μm to the right and left of the top right and top left particles on the array. |
| Petri Dish | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Plastic Cups | Fisher Scientific | S04170 | |
| PLGA Film, 502H | Sigma | 502H: 719897-1G | |
| Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate | Millipore Sigma | 484431 | |
| Rabies Antigen | Chiron Behring and Bharat Biotech International | Material was acquired by entering into a materials transfer agreement with the company. | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Scalpel | VWR | 21899-530 and 76457-512 | |
| SciFLEXARRAYER S3 with PCD 60 | Scienion | Or equivalent | |
| Sealing Tape for 96-Well Plates | Thermo Scientific | 15036 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | 1025 | |
| Spring Clamps | IRWIN | VGP58100 | |
| Stainless Steel Block | McMaster Carr | 9083K12 | |
| Streptavidin−Peroxidase Polymer, Ultrasensitive | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Sylgard 184 | DOW | 2646340 | |
| Teflon Sheet | McMaster Carr | 9266K12 | Used to make PLGA films. Must be cut into appropriately sized pieces. |
| Teflon Sheet, 0.8 mm-thick | McMaster Carr | 9266K81 | |
| Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silane | Sigma | 448931-10G | |
| Tweezers | Pixnor | ESD-16 | |
| UltraPure Distilled Water | Fisher Scientific | 10977015 | |
| UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker | UVP | 95-0174-01 | Or equivalent |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | F420100000 | Note you will need two of these. One will be used exclusively to pre-treat samples with trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane to prevent contamination. |
| Vacuum Oven Capable of Reaching 120 °C | VWR | 97027-664 | Or equivalent |
| Vacuum, CRVpro4 | Welch | 3041-01 | Or equivalent |
| Wooden Tongue Depressors | Electron Microscopy Sciences | 72320 |
References
- Li, X. Estimating the health impact of vaccination against ten pathogens in 98 low-income and middle-income countries from 2000 to 2030: a modelling study. The Lancet. 397, 398-408 (2021).
- Euliano, E. M., Sklavounos, A. A., Wheeler, A. R., McHugh, K. J. Translating diagnostics and drug delivery technologies to low-resource settings. Science Translational Medicine. 14 (666), eabm1732 (2022).
- Haider, S. Rabies: old disease, new challenges. Canadian Medical Association Journal. 178 (5), 562-563 (2008).
- Fisher, C. R., Streicker, D. G., Schnell, M. J. The spread and evolution of rabies virus: conquering new frontiers. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 241-255 (2018).
- Nagarajan, T., Rupprecht, C. E. Rabies and Rabies Vaccines. , Springer International Publishing. (2020).
- Shi, T., Dunham, E. F., Nyland, J. E. Rabies vaccination compliance and reasons for incompletion. The Western Journal of Emergency Medicine. 21 (4), 918-923 (2020).
- Shankaraiah, R. H., Rajashekar, R. A., Veena, V., Hanumanthaiah, A. N. D. Compliance to anti-rabies vaccination in post-exposure prophylaxis. Indian Journal of Public Health. 59 (1), 58-60 (2015).
- Cleland, J. L. Single-administration vaccines: controlled-release technology to mimic repeated immunizations. Trends in Biotechnology. 17 (1), 25-29 (1999).
- Yeh, M. K., Coombes, A. G. A., Jenkins, P. G., Davis, S. S. A novel emulsification-solvent extraction technique for production of protein loaded biodegradable microparticles for vaccine and drug delivery. Journal of Controlled Release. 33 (3), 437-445 (1995).
- Peyre, M., Sesardic, D., Merkle, H. P., Gander, B., Johansen, P. An experimental divalent vaccine based on biodegradable microspheres induces protective immunity against tetanus and diphtheria. Journal of Pharmaceutical Sciences. 92 (5), 957-966 (2003).
- Mvan de Weert, M., Hennink, W. E., Jiskoot, W.
- Graf, T. P., et al. A scalable platform for fabricating biodegradable microparticles with pulsatile drug release. Advanced Materials. , https://doi.org/10.1002/adma.202300228 e2300228 (2023).
- Wang, Y., Qin, B., Xia, G., Choi, S. H. FDA's poly (lactic-co-glycolic acid) research program and regulatory outcomes. The American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 23 (4), 92 (2021).
- Wan, Y. Development of stabilizing formulations of a trivalent inactivated poliovirus vaccine in a dried state for delivery in the NanopatchTM microprojection array. Journal of Pharmaceutical Sciences. 107 (6), 1540-1551 (2018).
- Smith, T. G., Siirin, M., Wu, X., Hanlon, C. A., Bronshtein, V. Rabies vaccine preserved by vaporization is thermostable and immunogenic. Vaccine. 33 (19), 2203-2206 (2015).
- McHugh, K. J. Fabrication of fillable microparticles and other complex 3D microstructures. Science. 357 (6356), 1138-1142 (2017).
- Sanchez, M. E. N. Rabies vaccine characterization by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 8149 (2020).
- Fu, K., Pack, D. W., Klibanov, A. M., Langer, R. Visual evidence of acidic environment within degrading poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres. Pharmaceutical Research. 17 (1), 100-106 (2000).
