Summary
Bu yöntem, kuduz antijeninin, önceden belirlenmiş bir gecikmeden sonra pulsatil salınımı sağlayan yapısal ve malzeme özelliklerine sahip biyolojik olarak parçalanabilir polimerik mikropartiküllere kapsüllenmesini açıklar. Partikül çekirdeğinden alınan antijenin enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) değerlendirmesi, partikül üretimi yoluyla bozulmamış trimerik kuduz virüsü glikoproteininin varlığını doğrulamaktadır.
Abstract
Maruziyet sonrası kuduz profilaksisi için mevcut kılavuzlar, birkaç hafta boyunca uygulanan çoklu enjeksiyonları gerektirir. Bu, kuduza ölümcül maruziyetlerin çoğunun meydana geldiği düşük ve orta gelirli ülkelerde (LMIC'ler) yaşayanlar için orantısız derecede külfetli olabilir. Antijenleri polimerik parçacıklara kapsülleyerek aşı rejimlerini tek bir enjeksiyona yoğunlaştırmak için farklı ilaç dağıtım stratejileri araştırılmıştır. Bununla birlikte, kapsülleme işlemi sırasında sert stresörler, kapsüllenmiş antijenin denatürasyonuna neden olabilir. Bu makalede, kuduz virüsü (RABV) antijenini, ayarlanabilir pulsatil salınım gösteren polimerik mikropartiküllere kapsüllemek için bir yöntem açıklanmaktadır. İlaçları Kapsüllemek için Düzgün Sıvılaştırılmış ve Mühürlenmiş Partiküller (PULSED) olarak adlandırılan bu yöntem, çok fotonlu, 3D baskılı bir ana kalıptan ters polidimetilsiloksan (PDMS) kalıpları oluşturmak için yumuşak litografi kullanarak mikropartiküller üretir. Poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) filmler daha sonra bir piezoelektrik dağıtım robotu kullanılarak konsantre RABV ile doldurulmuş açık yüzlü silindirler üretmek için PDMS kalıplarına sıkıştırılarak kalıplanır. Bu mikroyapılar daha sonra parçacıkların üst kısmı ısıtılarak kapatılır ve malzemenin akmasına ve sürekli, gözeneksiz bir polimerik bariyer oluşturmasına izin verilir. Post-fabrikasyon, bozulmamış trimerik kuduz virüsü glikoproteininin tespitine özgü enzime bağlı bir immünosorbent testi (ELISA), immünojenik antijenin mikropartiküllerden yüksek geri kazanımını doğrulamak için kullanılır.
Introduction
Aşılama, 2000 ve 2019 yılları arasında 37 milyondan fazla ölümü önleyen son derece etkili bir sağlık aracıdır1. Bu etkinliğe rağmen, aşıyla önlenebilir hastalıklar, özellikle yüksek aşılama oranlarının yılda 1,5 milyon aşı ile önlenebilir ölüme katkıda bulunduğu düşük ve orta gelirli ülkelerde (LMIC'ler) küresel sağlık için önemli bir risk oluşturmaya devam etmektedir2. Kuduz bu eşitsizliklerin bir istisnası değildir. İnsanlığın bildiği en ölümcül hastalık olmasına rağmen, neredeyse evrensel olarak ölümcül olmasına rağmen, kuduz tamamen tedavi edilebilir ve birçok yüksek gelirli ülkede yok edilmiş olarak sınıflandırılır. Bunun yerine, kuduz yükü, hastalığın insanlar ve hayvancılık üzerinde yıkıcı sonuçlara yol açtığı Asya ve Afrika'nın bazı bölgelerinde yaşayan insanlar tarafından orantısız bir şekilde karşılanmaktadır 3,4.
Aşılama, kuduzun küresel etkisini yönetmek için kritik öneme sahiptir5. Aşılama maliyeti, hastalığın genel olarak düşük insidansı göz önüne alındığında, maruziyet öncesi profilaksinin (PrEP) yaygın olarak uygulanmasını yasaklamaktadır. Ayrıca, LMIC'lerde, maruziyet sonrası profilaksinin (PEP) yararı, sağlık hizmeti arayan hastalar üzerindeki sosyoekonomik baskılarla sınırlıdır. Sağlık hizmetlerine erişim noktalarına seyahat mesafesi, tedavi alırken ücret kaybı, tedavi maliyeti, günlük aktivitelere müdahale eden randevular ve unutkanlık gibi lojistik faktörler, PEP uyum oranlarının %60'a kadar düşmesine neden olmaktadır6,7. Bu yüksek hasta yıpranma oranı, hastalıkla mücadele etmek için kuduz aşılamasındaki boşlukları gidermek için yaklaşımları rafine etmek için bir fırsat sunmaktadır.
Antijenlerin salınımını kontrol eden tek enjeksiyonlu (SI) aşılama sistemleri, tek enjeksiyonda tam bağışıklama elde etmenin yolları olarak araştırılmıştır. Bir sağlık hizmeti sağlayıcısına birden fazla ziyaret ihtiyacını ortadan kaldırmak, bireylerin yeterli bakım aramasını engelleyen yükleri hafifletir. SI aşılamasını başarmak için, bir antijen tipik olarak genellikle enjekte edilebilir mikropartiküller şeklini alan biyolojik olarak parçalanabilir bir polimerik matris içinde kapsüllenir. Enjekte edildikten sonra, polimer ayrışır ve tutulan antijeni serbest bırakır. Bugüne kadar, SI aşılamasını başarmak için iki birincil salım stratejisi izlenmiştir. Bir yaklaşımda, antijen uzun bir süre boyunca sürekli olarak salınır. Tek bir enjeksiyonun immünojenisitesini arttırmayı amaçlamasına rağmen, bu yaklaşımın insanlarda kuduz virüsüne (RABV) karşı koruyucu bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak için yeterli olup olmadığı açık değildir8. Diğerinde, antijen, geleneksel ve kanıtlanmış bir prime-boost aşı rejimini taklit etmek için önceden belirlenmiş bir gecikmeden sonra serbest bırakılır. Sprey kurutma ve emülsiyon/solvent buharlaştırma bazlı mikropartikül üretim yöntemleri eski stratejiyi sergilemektedir ve hem model aşıları9'u hem de tetanoz toksoid10 gibi oldukça kararlı antijenleri başarılı bir şekilde kapsüllemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu kapsülleme yöntemleri, antijenleri denatüre edebilen ısı, çözücü etkileşimi ve fiziksel kuvvetler dahil olmak üzere stresörleri içerir11.
İlaçları Kapsüllemek için Düzgün Sıvılaştırılmış ve Mühürlenmiş Partiküller (PULSED), biyolojik olarak parçalanabilen mikropartiküllerde biyolojiklerin kapsüllenmesi için kullanılabilecek yeni geliştirilmiş bir üretim yöntemidir. Mikro kalıplama, polimerin yeniden akmasını ve merkezi kargo deposunu biyolojik olarak parçalanabilir polimerin bitişik bir tabakası içinde tamamen kapsüllemesini sağlamak için sıvı bir yük ile doldurulmuş ve ısıtılmış parçacıklar üretmek için kullanılır. Bu mikroyapı, polimerik kabuk12'nin bozunma hızına bağlı bir süre sonra yükün pulsatil salınımına neden olur. Bu makale, inaktive edilmiş RABV'nin, enzime bağlı bir immünosorbent testi (ELISA) tarafından değerlendirilen stabil RABV antijenini kapsüllemek için PULSED imalat yöntemini kullanarak, FDA onaylı birçok formülasyonda kullanılan biyolojik olarak parçalanabilen bir polimer olan poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) 'dan oluşan mikropartiküller içinde kapsüllenmesini göstermektedir13. PLGA partiküllerini farklı moleküler ağırlık ve / veya son gruplarla birleştirerek, bu yaklaşım tek bir enjeksiyondan sonra mevcut kuduz aşılama süresi seyrini taklit etme potansiyeline sahiptir.
Protocol
1. Partikül ana kalıp üretimi
NOT: 3D baskı işlemi, yeterli uzamsal çözünürlüğe sahip herhangi bir 3D yazıcı ile gerçekleştirilebilir; Bununla birlikte, mevcut protokol çoklu foton 3D yazıcı için süreci açıklamaktadır.
- Bilgisayar destekli tasarım (CAD) programı kullanarak mikroparçacık yapıları tasarlayın.
NOT: Tasarım özellikleri aşağıdaki gibidir: 308 parçacık (çap = 400 μm, yükseklik = 500 μm ve duvar kalınlığı = 100 μm), aralarında 600 μm boşluk olacak şekilde 22 x 14 dizide düzenlenmiştir. Tasarım ayrıca dizinin hemen dışında referans olarak dört köşeli bir yıldız ve beş köşeli bir yıldız içerir (Ek Şekil 1). - Son tasarımı STL dosyası olarak dışa aktarın (Ek Kodlama Dosyası 1) ve dosyayı aşağıda gösterildiği gibi yazdırma parametrelerini tanımlayabilen bir yazılıma yükleyin. Ardından, 3B yazıcıyla uyumlu bir dosya olarak kaydedin (bkz.
NOT: Dilimleme mesafesi = 5 μm, tarama mesafesi = 1 μm, kabuk konturu = 50 μm, taban dilim sayısı = 5 μm, iskele = içi boş, tarama modu = galvo, z ekseni = mikroskop z-sürücüsü, tarama hızı = 100.000, güç = 100. - Bir plazma temizleme işlemi (gaz: O2; güç: 200 watt; sıcaklık: 25 °C; akış: 20; zaman: 5 dakika) kullanarak bir silikon baskı substratını (Malzeme Tablosuna bakınız) ön işlemden geçirin, ardından hemen substratı bir cam Petri kabında 30 mL etanol ve 60 μl 3-(trimetoksisilil) propil metakrilat çözeltisine daldırın. Alüminyum folyo ile örtün ve gece boyunca inkübe edilmesine izin verin.
NOT: Bu adım, PDMS ayırma işlemi sırasında önemli olan alt tabakaya baskı yapışmasını artırır (adım 2.6). - Baskı dosyasını çoklu foton 3D yazıcıya yükleyin, baskı reçinesini işlenmiş alt tabakaya uygulayın, 10x lensi takın (bkz.
- İşiniz bittiğinde, baskıyı propilen glikol metil eter asetatına (bkz. Malzeme Tablosu) batırarak maruz kalmamış fotodirenci giderin, ardından baskıyı 5 dakika boyunca izopropil alkole batırın. Ana kalıbı 120 dakika boyunca 254 nm'de UV ışığına maruz bırakarak kürleyin.
NOT: Varsa, 405 ila 365 nm aralığındaki UV ışığı, basılı yapıları sonradan kürlemek için ~ 20 dakika boyunca kullanılabilir.
2. Polidimetilsiloksan (PDMS) kalıp üretimi
- 3D baskılı ana kalıbın yüzeyini, yüzeye 40 μL Trikloro (1H, 1H, 2H, 2H, -perflorooktil) silan eklenmiş bir cam slayt içeren bir vakum odasına yerleştirerek tedavi edin ( bkz. Vakumu çekin (bağıl basınç: -20 inç. Hg) 1 saat boyunca.
NOT: Bu adım, kalıp çözme sırasında kolay ayırma sağlar (adım 2.6). - Ana kalıp yüzeyi arıtılırken, polidimetilsiloksan (PDMS) prepolimer bazını, kütlece 9: 1 oranında PDMS prepolimer kürleme maddesi ile iyice karıştırın (her ana kalıp için en az 10 g malzeme gerekir). İyice karıştırıldıktan sonra, kürlenmemiş PDMS'yi 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
- Yüzey işlemi tamamlandıktan sonra, ana kalıbı bir alüminyum folyo kabına yerleştirin ve kürlenmemiş PDMS'yi kalıbın üzerine dökün, böylece özelliklerin tamamen suya batırılmasını sağlayın. Alüminyum folyo kabı bir vakum odasına yerleştirin ve vakumu çekin (bağıl basınç: -20 inç. Hg) hava kabarcıklarını gidermek için 1 saat boyunca.
- Alüminyum folyo kabı vakum odasından çıkarın. Ana kalıbın uçlarına 800 μm ara parçalar yerleştirin ve hava kabarcıklarının karışmasını önlemeye özen göstererek ana kalıbın üzerine temiz bir cam sürgü yerleştirin. Kalıbı ve sürgüyü birbirine sıkıştırmak için bağlayıcı klipsler kullanın, sıkıştırma kuvvetini ara parçalar üzerinde lokalize edin (Ek Şekil 2).
- Prepolimeri PDMS kalıplarına kürlemek için yapıyı en az 4 saat boyunca 120 ° C'ye ayarlanmış bir fırına yerleştirin.
- Yapıyı fırından çıkarın, bağlayıcı klipsleri dikkatlice serbest bırakın ve ana kalıbı bir tıraş bıçağı kullanarak kürlenmiş PDMS kalıbından dikkatlice ayırın.
NOT: 3D baskılı ana kalıp, ek PDMS kalıpları oluşturmak için yeniden kullanılabilir.
3. PLGA film imalatı
- 450 mg PLGA'yı tartın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve iç çapı 50,8 mm olan 250 μm kalınlığında bir halka şimi içinde 76 mm x 76 mm'lik yapışmaz bir polimer levha üzerine yerleştirin. PLGA'nın üzerine ikinci bir yapışmaz polimer tabaka yerleştirin ve yığını parmak sızdırmazlığına kadar 101,6 mm'lik bir c-kelepçesi kullanarak iki alüminyum blok arasında sıkıştırın.
NOT: Bu çalışmada sadece 502H PLGA kullanılmış; ancak, diğer PLGA türleri bu işlemle uyumludur. - C-kelepçeli tertibatı, -30 in.Hg bağıl basınçla, vakum altında 30 dakika boyunca 120 °C'ye ayarlanmış bir vakumlu fırına yerleştirin. Ardından, tertibatı çıkarın ve 30 dakika daha vakumlu fırına geri koymadan önce kelepçeyi sıkıca sıkın.
NOT: Vakum kullanmanın temel amacı, yüksek sıcaklıklarda hızlanan PLGA bozulmasını önlemektir. - Tertibatı fırından çıkarın ve bir kurutucuda 4 saat soğumaya bırakın.
- Soğuduktan sonra, kelepçeyi gevşetin, PLGA filmini yapışmaz polimer tabakalardan çıkarın ve filmi etiketli bir Petri kabına yerleştirin. Petri kabını daha sonra kullanmak üzere bir kurutucunun içinde saklayın.
4. PLGA partikül üretimi
- PDMS kalıbının yüzeyini daha önce adım 2.1'de açıklandığı gibi işlemden geçirin.
- Cımbız ve/veya neşter kullanarak, 250 μm PLGA filminin bir kısmını, kabaca dizinin büyüklüğünü kesin ve işlenmiş PDMS kalıbına yerleştirin.
- PLGA filminin ve PDMS kalıbının üzerine temiz bir cam mikroskop sürgüsü yerleştirin ve doğrudan dizinin ve PLGA filminin üzerine bir yaylı kelepçe yerleştirerek bileşenleri birbirine kenetleyin.
- Kelepçeli kalıp tertibatını 120 °C'ye ayarlanmış vakum fırınına yerleştirin ve vakumu -30 inç bağıl basınçla çekin. 1 saat boyunca Hg.
NOT: Parçacıkları oluşturmak için gereken süre PLGA'ya bağlıdır ve 1-12 saat arasında değişebilir. - Kelepçeli kalıp tertibatını fırından çıkarın ve oda sıcaklığında yaklaşık 15 dakika boyunca veya dokunulacak kadar soğuyana kadar pasif olarak soğumaya bırakın.
- Bir tıraş bıçağı kullanarak, ikisini ayırmak için PDMS kalıbı ile PLGA parçacık dizisi arasına yavaşça basınç uygulayın. PLGA partiküllerini ileride kullanmak üzere bir kurutucuda saklayın.
5. Antijen konsantrasyonu ve saflaştırma
- Ticari olarak temin edilebilen RABV antijeninin bir alikotunu (bakınız Malzeme Tablosu) oda sıcaklığında çözün.
- İki toplama tüpüne 100 kDa moleküler ağırlık kesmeli iki santrifüj spin filtresi (MWCO; bakınız Malzeme Tablosu) yerleştirerek filtreleme kurulumunu birleştirin.
- İki santrifüjlü sıkma filtresini 500 μL UltraPure su ekleyerek önceden ıslatın.
- Filtreleri oda sıcaklığında bir tezgah üstü santrifüjde 1 dakika boyunca 2.400 x g'de döndürün.
- 200 μL pipet kullanarak filtreleme kurulumunun hem üst hem de alt bölmelerindeki suyu çıkarın.
NOT: Önceden ıslatılmış sıkma filtresinin kurumasına izin vermeyin. - Her bir sıkma filtresinin üst bölmesine 400 μL damıtılmış su ekleyin, ardından 100 μL çözünmüş RABV antijeni ekleyin ve pipetle karıştırın.
NOT: Bu çalışma antijeni yaklaşık beş kat yoğunlaştırdı ve eksipiyanların konsantrasyonunu ~ 50 kat <100 kDa azalttı. - İki santrifüj dönüş filtresini bir tezgah üstü santrifüje yerleştirin ve filtrelerin santrifüjün merkezine bakmasını sağlayın. Filtrenin hangi tarafının santrifüjün merkezine doğru baktığını işaretleyin.
NOT: Yanlış yönlendirilirse, çözeltiler uygun şekilde filtrelenmez/konsantre edilmez. - Filtreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj edin.
- Filtreleri santrifüjden alın. Toplama tüpleri filtratı içerecek, filtreler ise konsantre numuneyi içerecektir (Ek Şekil 3A).
- Toplama tüplerindeki filtratı bir pipet kullanarak çıkarın ve atın.
- Her filtreye 450 μL filtrelenmiş damıtılmış su ekleyin ve konsantre numune ile suyu altı kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
- İki spin filtresini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 14.000 x g'de ikinci kez santrifüj edin. Filtrelerin santrifüjün merkezine adım 5.7'deki gibi aynı yönde baktığından emin olun.
- Filtre ünitelerini santrifüjden alın ve daha önce olduğu gibi, bir pipet kullanarak filtratı her tüpten çıkarın ve atın.
- Sıkma filtrelerini toplama tüplerinden çıkarın ve toplama tüplerinin üst kısmını kullanarak filtre muhafazalarını kapatın (Ek Şekil 3B).
- Filtre muhafazalarını dik ve 45° açılarda tutarken 30 sn boyunca 3.000 rpm'de spin filtresi muhafazalarının tabanını doğrudan bir vorteks ve vorteks üzerine yerleştirin (Ek Şekil 3C).
NOT: Bu adım, santrifüjleme işlemi sırasında bir pelet oluşturan herhangi bir RABV antijenini yeniden askıya almayı amaçlamaktadır. - Toplama borularının kapağını sıkma filtresi muhafazalarından dikkatlice çıkarın. Filtre muhafazalarını birlikte verilen toplama tüplerine geri yerleştirin ve kapakta sıkışmış olabilecek herhangi bir hacmi toplamak için hızlı bir dönüş (2-3 s) çalıştırın.
NOT: Bu hızlı döndürme, tezgah üstü mikrosantrifüjde gerçekleştirilmelidir. Filtreler, filtrelerden hiçbir çözelti kaybolmamasını sağlamak için önceki konfigürasyonun aksine, santrifüje teğet geçmelidir. - Her bir sıkma filtresi ünitesini, sıkma filtresi kiti ile birlikte verilen yeni bir toplama tüpüne ters çevirin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve konsantre numuneleri toplamak için oda sıcaklığında 1.000 x g'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın.
- İki toplama tüpündeki konsantre numuneleri tek bir toplama tüpünde birleştirin. Elde edilen hacmi ölçün ve kaydedin.
NOT: Elde edilen numune, stok olarak başlangıçtaki antijen konsantrasyonunun 5 katına sahip olacak, stoktan yaklaşık 50 kat daha düşük küçük bir eksipiyan (<100 kDa) konsantrasyonuna sahip olacak ve hafif süt beyazı görünecektir. Toplam hacim yaklaşık 44-48 μL olmalıdır. - 5x konsantre, iki kez yıkanmış antijeni, dağıtım zamanına kadar 4 ° C'de, ancak 16 saatten fazla olmamak üzere saklayın. Partikülleri bu çözelti ile doldurmadan önce, herhangi bir kabarcığı gidermek için tüpü 1 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj edin. Çözelti, dağıtım için nominal hedef konsantrasyona ulaşmak için damıtılmış su kullanılarak seyreltilebilir.
6. Partikül doldurma
- 0,22 μm'lik bir vakum filtresinden 500 mL deiyonize suyu vakum filtresiyle filtreleyin, ardından bir vakum uygulayarak çözeltinin gazını giderin (bağıl basınç: -20 inç. Hg) 20 dakika boyunca sonikasyon altındayken.
- Bu süre zarfında, piezo dağıtım kılcal damarlarını (PDC'ler; bakınız Malzeme Tablosu) piezoelektrik dağıtıcıya takın.
- Makineyi üreticinin talimatlarına göre hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu) ve PLGA parçacıkları ile slaytı dağıtım alanına yerleştirin.
- Ek Şekil 4'e göre "Hedef Referans Noktalarını Bul"u ayarlayın, Çalıştırın ve ardından "Hedef Alt Tabakayı" ayarlayın.
- Konsantre antijenin 25 μL'sini kaynak plakasına yükleyin ve makineye yükleyin. PDC'leri kullanarak, dağıtım ucuna 10 μL konsantre antijen aspire edin, ucun dışını yıkayın, ardından dağıtım hizalamasını kalibre edin (Ek Şekil 5).
- "Hedef Kurulum parametreleri" girin ve Çalıştır'a tıklayın (Ek Şekil 6).
- Tamamlandığında, doldurulmuş parçacıkları çıkarın ve bir stereoskop altında doldurulduklarını doğrulayın.
- Doğrudan protokoldeki bir sonraki adıma geçin.
7. Partikül sızdırmazlığı ve hasadı
- Bir ocak plakasına paslanmaz çelik bir blok yerleştirin (bakınız Malzeme Tablosu). Paslanmaz çelik bloğun üzerine iki mikroskop slaytı yerleştirin, böylece paralel olurlar. Paslanmaz çelik bloğun düz olduğundan emin olun, ardından ocak plakasını açın ve sıcaklığı paslanmaz çeliğin yüzey sıcaklığı 200 ° C olacak şekilde ayarlayın. Sızdırmazlıktan önce ocak plakasının sıcaklığını doğrulayın.
- Doldurulmuş PLGA parçacıklarını iki cam slaytın üzerine yerleştirerek ocak plakasının üzerinde askıya alın, ardından hemen 18 sn için bir zamanlayıcı başlatın.
NOT: Sızdırmazlık için gereken zaman ve ısı parçacıklarının miktarı, parçacıkları yapmak için kullanılan PLGA'nın kimyasal özelliklerine bağlı olarak değişecektir. Slaytları ocaktan güvenli bir mesafede tutmak için özel bir 3D baskılı slayt tutucu kullanılabilir. STL dosyası Ek Kodlama Dosyası 2 olarak sağlanır. - Kapatıldıktan sonra, parçacık dizisini ocaktan çıkarın ve parçacık dizisini iki ayrı cam slayta yerleştirerek laboratuvar tezgahının üzerine asın. Parçacıkların 1 dakika soğumasını bekleyin.
- Soğutulduktan sonra, parçacıklar bir stereoskoptan bakarken bir neşter kullanılarak toplanabilir. Neşteri bıçakla slayta 45° açıyla tutun ve cam kızaktan ayırmak için parçacığın tabanına basınç uygulayın.
- Hasat edildikten sonra, parçacıkları 0,5 mL düşük proteinli bağlayıcı tüplere aktarmak için neşteri kullanın (bkz. Ardından, tüpleri 30 mg / mL sığır serum albümini (BSA) ve 1 mg / mL glikoz içeren 250 μL 1x fosfat tampon çözeltisi (PBS) ile doldurun.
NOT: PBS'de hazırlanan 30 mg/mL BSA ve 1 mg/mL glukoz çözeltisi RABV antijeninin stabilitesini koruyacaktır. - Bir çift ince uçlu cımbız kullanarak parçacıkları stereoskop altında ezin. Parçacığın çekirdeğindeki RABV antijeninin çevreleyen çözelti içinde çözünmeye hazır olduğundan emin olun. Antijen potansiyeli bir ELISA kullanılarak değerlendirilene kadar numuneleri 4 ° C'lik bir buzdolabında saklayın. Numuneler, hazırlandıktan sonraki 7 gün içinde bir ELSIA'da çalıştırılmalıdır.
8. Antijenin ELISA ile değerlendirilmesi
DİKKAT: Mikro plakaların hiçbir noktada kurumasına izin vermeyin. Her zaman plakaları istifleyin ve kurumasını önlemek için üst plakayı daima plastik bir conta, boş bir plaka veya bir kapakla örtün.
- Arabellekleri Ek Dosya 1'de belirtildiği gibi hazırlayın.
- pH 9.4-9.6'da 4975 μL kaplama tamponuna 25 μL kaplama antikoru ekleyerek 2.5 μg/mL konsantrasyonda 5 mL kaplama çözeltisi (karbonat-bikarbonat tamponu, pH 9.6) hazırlayın.
NOT: Her biri 50 μL olan 96 kuyucuğu kaplamak için 5 mL gereklidir (pipetleme kaybı için ekstra hacimle). Gerekli her ilave ELISA plakası için toplam hacmi 5 mL artırın. - Mikroplakanın her bir kuyucuğuna 50 μL kaplama çözeltisi dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Çözelti, hazırlandıktan hemen sonra kaplama için kullanılmalıdır.
- Her bir kuyucuğun tabanının sıvı ile eşit şekilde kaplandığından emin olmak için eldivenli bir avuç içi üzerinde plaka kenarları boyunca hafifçe hafifçe vurun.
- Plakayı yapışkan filmle kapatın ve 1 saat boyunca 37 ° C'ye yerleştirin, ardından gece boyunca 4 ° C'ye aktarın.
- Plakaları soğuk hava deposundan alın ve her bir kuyucukta 200 μL yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.
- Yıkama tamponunu çıkarın ve her bir kuyucuğa 300 μL blokaj tamponu dağıtın.
DİKKAT: Farklı plakalarda tekrarlanan aynı numunelerle birden fazla plaka çalıştırırken, plaka plaka ilerlemek önemlidir (yani, plaka 2'ye geçmeden önce plaka 1'i malzeme ile doldurun ve ardından plaka 3'e vb.). X malzemesini tüm plakalara ve daha sonra Y malzemesine vb. uygulamayın, çünkü bu, kuyuların kuruma riskini artırır. Son yıkama adımından sonra, yıkama tamponu plakanın kuyucuklarında kalmalı ve sadece plakaya numune eklemeden hemen önce atılmalıdır. ELISA plakasının hemen dağıtılmayan tüm kuyucuklarını örtmek için plastik bir 96 delikli plaka kapağı kullanılmalı ve kapak, malzeme ile doldurulacak ek kuyucukları ortaya çıkarmak için sırayla hareket ettirilmelidir. - Plakaları yapışkan plastik bir filmle kapatın (bakınız Malzeme Tablosu) ve 37 ± 2 ° C'de 60 ± 5 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
- Bu inkübasyon sırasında değerlendirilecek standart eğriyi ve test numunelerini hazırlayın.
NOT: Değerlendirilen antijen, pipetleme kaybını hesaba katmak için önerilen 0,125 IU/mL seyreltmede seyreltici tamponda önceden seyreltilmeli ve en az 40 μL'lik bir aşırı hacim sağlanmalıdır. Tüm numuneler her bir ELISA plakasında çift (iki teknik kopya) olarak değerlendirilir. Standart eğri için, her bir ELISA plakasının 2. ve 3. sütunlarına toplam sekiz noktadan oluşan iki katlı bir seyreltme serisi dahil edilmelidir. Değerlendirilmekte olan tahmini antijen miktarına bağlı olarak uygun sayıda noktaya sahip diğer tüm numuneler için bir seyreltme serisi gerçekleştirilebilir. Daha yüksek verim için daha az titiz olmasına rağmen, yukarıda açıklanan kaplamaya alternatif olarak tek bir numune seyreltme kullanılabilir. Bununla birlikte, tek bir seyreltmenin beklenen konsantrasyonu standart eğri aralığında olmalıdır. - Düşük bağlı protein 96 delikli plakalarda veya düşük bağlı protein tüplerinde ( bakınız Malzeme Tablosu), plakanın sütunları boyunca her numunenin iki katlı seyreltme serisini gerçekleştirin.
- Her bir ilgili numune için seyreltme serisinin başlangıcını gereken son hacmin iki katı kadar A satırına yükleyin (plaka başına, kuyucuk başına 100 μL numune gerekir, bu nedenle A2-A11'deki tüm kuyucuklar en az 240 μL numune içermeli ve pipetleme kaybını hesaba katmak için ekstra hacim 40 μL olmalıdır).
- Düşük bağlı protein plakasındaki diğer tüm kuyucuklara 120 μL seyreltici tampon yükleyin, sütun 1 ve 12 hariç (yani, B2 ila H11).
- 10 uçlu çok kanallı bir pipet kullanarak, 120 μL numuneyi A2-A11'den B2-B11'e aktararak ve sıçramayı ve kabarcıkları önlerken karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek seri seyreltme gerçekleştirin. Bu işlemi tekrarlayın, plakayı sütunlar boyunca H2-H11 kuyularına kadar hareket ettirin. Son kuyu sırasından aspire edilen kalan 120 μL hacmini atın.
NOT: Numuneler artık analiz için hazırdır. Blokaj aşaması bu zamana kadar tamamlanmazsa, numunelerin buz üzerinde tutulduğundan emin olun. - Kuluçka adımının sonunda, plakaları 200 μL yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.
- Çok kanallı pipet kullanarak 100 μL seyreltici tamponu sütun 1 ve 12'ye "boşluklar" olarak aktarın.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak, numune seyreltmeleri içeren düşük bağlanmış protein 96 delikli plakanın her bir kuyucuğundan 100 μL'yi yıkanmış ELISA plakasına aktarın. Çalıştırılan tüm ELISA plakaları için bu işlemi tekrarlayın.
- Plakaları yapışkan bir plastik filmle kapatın ve 37 ± 2 ° C'de 60 ± 5 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
- Seyreltici tamponun 10.995,6 μL'sine 4,4 μL antikor çözeltisi ekleyerek algılama antikor çözeltisini ( Malzeme Tablosuna bakınız) 0,2 μg/mL konsantrasyonda hazırlayın ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
NOT: Her biri 100 μL'de 96 kuyu için toplam 11 mL gereklidir (pipetleme kayıpları için ekstra hacim ile). Değerlendirilen her ilave ELISA plakası için toplam hacmi 11 mL artırın. Çözelti hazırlıktan hemen sonra kullanılmalıdır. - Kuluçka adımının sonunda, plakaları 200 μL yıkama tamponu ile beş kez yıkayın.
- Kalan yıkama tamponunu aspire edin ve çok kanallı bir pipet kullanarak mikroplakadaki her bir kuyucuğa 100 μL algılama antikor çözeltisi dağıtın.
- Plakaları yapışkan bir plastik filmle kapatın ve 37 ± 2 ° C'de 60 ± 5 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
- 10.995.6 μL yıkama tamponuna 4.4 μL streptavidin-peroksidaz konjugat çözeltisi ( bakınız Malzeme Tablosu) ekleyerek konjugatı tespit antikor inkübasyon adımının sonuna doğru hazırlayın.
NOT: Her biri 100 μL'de 96 kuyucuk için toplam 11 mL gereklidir (çok kanallı pipetleme için ekstra hacim ile). Değerlendirilen her ilave ELISA plakası için toplam hacmi 11 mL artırın. - Plakaları 200 μL yıkama tamponu ile beş kez yıkayın.
- Kalan yıkama tamponunu aspire edin ve her bir kuyucuğa 100 μL konjuge çözelti dağıtın.
- Plakaları yapışkan bir plastik filmle kapatın ve 37 ± 2 ° C'de 60 ± 5 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
- Son yıkama adımı sırasında alt tabakayı üreticinin talimatlarına göre hazırlayın (bkz. Her plaka için, bir tablet o-fenilendiamin dihidroklorür (OPD; bakınız Malzeme Tablosu) karanlıkta 9 mL deiyonize su içinde çözün, ardından 1 mL 10x stabil peroksit tamponu ile doldurun. Değerlendirilen plaka sayısına göre tablet sayısını ve toplam çözelti hacmini (10 mL) ayarlayın.
- Plakaları 200 μL yıkama tamponu ile beş kez yıkayın.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak her bir kuyucuğa 100 μL substrat dağıtın.
- Plakaları yapışkan bir plastik filmle kapatın ve alüminyum folyo kullanarak ışıktan korunmuş 10-20 dakika boyunca tezgahta bırakın.
NOT: Doygunluğu önlemek için renk gelişimini görsel olarak izleyin. - Her bir kuyucuğa 50 μL durdurma çözeltisi ekleyin ve 492 nm'de absorbans ve 620 nm'lik bir referans absorbansı için hemen okuma plakasını ekleyin.
- Düzeltilmiş absorbans okumasını kullanarak verileri analiz edin (492 nm'de okuma eksi 620 nm'de okuma) ve boşluğun ortalamasını tüm örneklerden çıkarın. Absorbans değerlerini IU/mL'ye dönüştürmek için sigmoidal 4PL enterpolasyon yöntemi kullanın. Son olarak, IU'ya dönüştürmek için 250 μL (toplam numune hacmi) ile çarpın.
NOT: Bu analiz, veri analiz yazılımı kullanılarak yapılabilir.
Representative Results
Partikül sızdırmazlığı ve dolumu, bu protokoldeki en kritik adımlardan ikisidir. Parçacıklar, ideal dolguyu ve bazı yaygın hataları göstermek için floresein sodyum tuzu ile dolduruldu. Floresein sodyum tuzu, görselleştirme kolaylığı için RABV antijeni yerine kullanıldı. Dolum sırasında, çözeltinin parçacık çekirdeklerinin tabanına dağıtılması, daha sonra çözücünün / suyun buharlaşması için yeterli zaman tanınması önemlidir. Tamamlandığında, çözünen maddenin bir deposu parçacık çekirdeğinin dibinde kalır (Şekil 1A). Doldurulduktan sonra, parçacıkların doğru şekilde kapatılması çok önemlidir. Şekil 1B , sızdırmazlık işleminin çeşitli sonuçlarını (başarılı ve başarısız) göstermektedir. 12 sn sızdırmazlık süresinden sonra, parçacık merkezinden parçacığın dışına doğru ayrı bir yol kalır ve tamamen kapatılmamış bir parçacığı gösterir. Tersine, 36 sn boyunca sızdırmazlığa bırakılırsa, PLGA neredeyse tamamen erir ve sığ profilli bir mikro yapı ile sonuçlanır. İdeal morfoloji, parçacıklar 18 ve 24 s boyunca kapatıldığında görselleştirilebilir, çünkü bir parçacık yapısını korurken polimer tarafından tamamen kapsüllenmiş kargo içerirler. Şekil 1C , doldurma ve sızdırmazlıktan sonra çeşitli potansiyel sonuçları göstermektedir. Dağıtım sırasında, çözücü parçacık tabanına ulaşmazsa, parçacık çekirdeğinin ortasında kurutulmuş çözünür bırakır (yanlış doldurulmuş); Bu parçacıklar hala sızdırmaz olsa da, kargonun zayıf yüklenmesi yükleme verimliliğini sınırlayabilir. Partiküller çok fazla kargo ile doldurulursa (aşırı doldurulursa), kargo PLGA'nın açıklık üzerinden akmasını önlediği için sızdırmazlık işlemi engellenir. Doğru şekilde doldurulup kapatıldığında, bu geometrinin parçacıkları 19 G'lik bir iğnenin içine kolayca sığacak kadar küçüktür. Ayrıca, 10 parçacık,% 2 karboksimetil selüloz gibi viskoz bir çözelti enjekte edildiğinde 19 G'lik bir iğneden (% 100 ±% 0) sürekli olarak aktı (Ek Şekil 7).
Şekil 1: Dolum ve sızdırmazlık işlemiyle ilgili sık karşılaşılan sorunlar . (A) Görüntüler, parçacıkların suda çözünmüş 6 nL 100 mg/mL floresein sodyum tuzu ile yüklendiği bir doldurma döngüsünden sonra çözücünün buharlaşmasını göstermektedir. (B) 0, 12, 18, 24 ve 36 s'de sızdırmazlık işleminden çıkarılan 502H PLGA partiküllerinin temsili görüntüleri. (C) Partiküller doğru, yanlış veya aşırı doldurulduğunda sızdırmazlık işleminin farklı sonuçları. Görüntüler, birden fazla görüntünün odağın istiflenmesi ve odak istifleme yazılımı kullanılarak birleştirilmesiyle oluşturulur. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Antijenin partiküllere yüklenmeden önce bir spin filtresinden geçirilmesi iki nedenden dolayı önemlidir. İlk olarak, santrifüjleme, aşı çözeltisindeki stok eksipiyanların uzaklaştırılmasına hizmet eder, bu da RABV antijenini korurken partikül yükleme kapasitesini sınırlayabilir. Mevcut protokol antijeni yaklaşık 50 kat arındırır. İkincisi, antijen de bu işlem sırasında konsantre edilir. Şekil 2A , konsantre antijen örneğindeki bozulmamış RABV viryonlarının mikrografisini göstermektedir. Bu antijen, başlangıç stok çözeltisinden yaklaşık 4.4 kat daha konsantredir (Şekil 2B). Başlangıçta santrifüj spin filtrelerine yüklenen antijen miktarı, elde edilen son kıvrım konsantrasyonunu modüle etmek için değiştirilebilir. Örneğin, 40 μL stok antijeninin yüklenmesi, yaklaşık 1,75 kat konsantrasyonla sonuçlanır. Ek Şekil 8 , konsantrasyon sürecinde vortekslemenin (adım 5.15) önemini göstermektedir. Vorteksi ihmal etmek veya numuneleri yanlış vortekslemek, konsantrasyon sürecini sınırlar.
Şekil 2: Antijen konsantrasyonu. Santrifüj filtrasyonu ile antijen konsantrasyonu transmisyon elektron mikroskobu (A) ile gösterilir ve ELISA (B) ile doğrulanır. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. İstatistiksel analiz, Tukey'in tek yönlü ANOVA ile çoklu karşılaştırma testleri kullanılarak yapılır. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3A, mühürlenmemiş ve kapatılmış parçacıklara doldurulmuş konsantre antijeni göstermektedir. Partiküllere önemli miktarda antijen yüklenmesine rağmen (0.0469 ± 0.0086 IU), bu malzeme partikül kapasitesinin% 90'ını
Şekil 3: Partikül üretiminden sonra biyoaktif RABV antijeni. (A) Görüntüler, RABV antijenini içeren mühürlenmemiş ve kapatılmış parçacıkları göstermektedir. (B) Partikül üretim işlemi yoluyla antijen stabilitesi (n = 4). Yükleme kontrolü, antijenin doğrudan çözeltiye dağıtılmasıyla oluşturulur. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Ölçek çubuğu = 200 μm. İstatistiksel analiz, Tukey'in tek yönlü ANOVA ile çoklu karşılaştırma testleri kullanılarak yapılır. *p < 0.05. Görüntüler, birden fazla görüntünün odağın istiflenmesi ve odak istifleme yazılımı kullanılarak birleştirilmesiyle oluşturulur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Parçacık, referans ve dizi boyutları. Şekil, dört köşeli yıldız fiducial (A), silindirik mikropartikül (B), beş köşeli yıldız fiducial (C) ve CAD yazılımında görüntülenen fiducials (D) ile bir dizi parçacık geometrik özelliklerini göstermektedir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Bu şekil, PDMS kalıplarını kürlemek için fırına yerleştirilen yapının bir kesitini göstermektedir. Oklar, bağlayıcı kelepçelerin nereye uygulandığını gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: Konsantre antijeni etkili bir şekilde geri kazanmak için uygun teknik. İlk dönüşün sonunda, kırmızı (A) ile daire içine alınmış konsantre numune filtrede tutulurken, filtrat toplama tüpünün dibinde (daha büyük dış tüp) toplanır. Peletlenmiş antijeni yeniden askıya almak için, santrifüj filtre ünitesi, vortekslemeye hazırlık olarak toplama tüpü (B) kullanılarak kapatılır. Vorteks yaparken, tüpün ucu vorteks pedi ile temas halinde tutulur ve kapak ucu vorteks pedi (C) ile 45 ° 'lik bir açı korunurken etrafında döndürülür. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 4: Önceden çalıştırılan programlama piezoelektrik dağıtıcı. (A) "Ana sekme"den Robot Kurulumuna > Çeşitli >Div. İşlevi > Hedef Referans Noktalarını Bul'a giderek "Hedef Referans Noktalarını Bul"u ayarlayın. Güven işaretlerini ayarlamak için mavi renkle vurgulanmış düğmeleri kullanın. İlk olarak, Şablonu Öğren'i seçin ve ilgilendiğiniz güven işaretinin etrafına bir kutu çizin, Arama Şablonu'na tıklayarak şablonun doğruluğunu doğrulayın ve şablonu kaydedin. Bunu dört ve beş köşeli yıldızlar için yapın ve dosya adlarını İki Farklı Şablon Görüntüsü Kullan altındaki yönergelere göre kaydedin. Ardından, kara kutulardaki tüm parametrelerin eşleştiğinden emin olun. Dört köşeli yıldız referansını Yük Şablonu'nu (yeşil kutu) kullanarak yükleyin. Görev Listesi'ni (turuncu kutu) seçerek "Hedef Referans Noktalarını Bul" programını kaydedin. (B) Robot Kurulumu > Görevler sekmesine giderek Çalıştır'ı ayarlayın, ardından Çalıştır seçimlerindeki Görev'i (yeşil kutu) kullanarak Görev Listesi'nden (kara kutu) görevler ekleyerek mavi kutuda gösterilen görevlerin sırasını yükleyin. Son olarak, görevi kaydedin (turuncu kutu). (C) Robot Kurulumu > Hedef Alt Katmanına giderek "Hedef Alt Tabakayı" ayarlayın, ardından bir hedef ekleyin (mavi kutu). (D) Burada gösterilen parametreleri girin ve Kaydet'i seçin (mavi kutu). Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 5: Antijenin yüklenmesi ve dispending hizalamasının kalibre edilmesi. (A) Nozul Kurulumu > Do Task sekmesine gidin ve TakeProbe 10 uL'yi (kara kutu) seçip DO'ya (kara kutu) tıklayarak 10 μL antijeni dağıtım ucuna aspire edin. (B) Bu ayrı bir pencere açar. Konsantre antijenin yüklendiği kuyucuğu seçin ve Tamam'ı (mavi kutu) seçin. (C) Antijen aspire edildikten sonra, mavi kutuyu seçerek ucu yıkayın ve bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Fotoğraf makinesini (kara kutu) seçin ve düşürme ses düzeyini (yeşil kutu) seçerek düşme ses düzeyini belirleyin. Hacim standart sapması (%) <2 (turuncu kutu) ile kararlı bir düşüş oluştuğundan emin olun. (D) Bu adımları takip etmek Snap Drop Cam'ı açacaktır; açılır menüden Görüntü (mavi kutu) öğesini seçin ve Püskürtme Ucu Kafası Kamera Sihirbazı'nı seçin. Bu işlem yeni bir pencere açar. Sonraki adım dizisini hızlı bir şekilde gerçekleştirin. (E) Ek Şekil 4'te yapılan hedefin yüklendiğinden emin olun, ardından Hedefe Taşı (mavi kutu) öğesini seçin. Damlaları 15'e ayarlayın ve Nokta (kara kutu) öğesini seçin. Tespit edildikten sonra hemen Taşı'yı seçin (yeşil kutu). Otomatik Bul'un seçili olduğundan emin olun ve parçacık boyutu = 12'yi silin, ardından Başlat'a tıklayın (turuncu kutular). Otomatik algılama başarısız olursa, slaytta farklı bir alana (mor kutu) geçtikten sonra bu işlemi tekrarlayın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 6: Tespit dizisini programlama ve çalıştırmaya başlama. (A) Hedef Kurulum > Hedef'e gidin, ardından mavi kutuda gösterilen parametreleri doldurun. (B) Ardından, "Saha Kurulumu sekmesine" gidin ve hayır kısmına 20 girin. damla alanı (mavi kutu), bir kuyu seçin (kara kutu), sonra içine dağıtılacak hedefleri/parçacıkları seçin (yeşil kutu). Farklı bir kuyucuk seçerek ve hedefleri/parçacıkları yeniden seçerek, tek bir çalışma sırasında ek dolum döngüleri gerçekleştirilir. (C) Ana ekranda, Ek Şekil 5'te oluşturulan koşu ve hedefin seçildiğinden emin olun. (D) "Çalıştır sekmesine" gidin ve Çalıştırmayı Başlat'ı seçin (mavi kutu). Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 7: Mikropartikül enjekte edilebilirliği. (A-C) Floresein sodyum tuzu ile doldurulmuş ve 19 G'lık bir iğne ile kapatılmış mikropartiküllerin odaklanmış stereoskop görüntüleri. (D) %2 karboksimetil selüloz çözeltisi (n = 8) kullanılarak 19 G'lik bir iğneden toplam 10 parçacık enjekte edildi. Ölçek çubuğu = 1 mm. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 8: Antijen konsantrasyonu ile ilgili potansiyel sorunlar. Kırmızı çizgi, konsantrasyonda beklenen kat artışını gösterir. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. İstatistiksel analiz, Tukey'in tek yönlü ANOVA ile çoklu karşılaştırma testleri kullanılarak yapıldı. p < 0,001, ****p < 0,0001. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: RABV ELISA için tamponların ve çözeltilerin hazırlanması. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyası 1: Parçacık dizisi içeren STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyası 2: Parçacıkların sızdırmazlığı için kullanılan özel slayt tutucu için geometri içeren STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Parçacık geometrisini belirli ihtiyaçlar için değiştirmek mümkündür; Bununla birlikte, silindirik yapılar için, yazarlar protokolde açıklanan yükseklik: çap: duvar kalınlığının 5: 4: 1 oranının korunmasını önermektedir. Bu en boy oranı, parçacıkları sızdırmaz hale getirmek için yeterli PLGA malzemesinin mevcut olmasını ve taşıma için mekanik olarak yeterince sağlam kalmasını sağlar. Parçacık boyutları ve şekilleri CAD işlemi sırasında kolayca değiştirilebilir, böylece sayısız geometri üretilebilir. CAD'in esnekliğini 3D baskı ile birleştirmek, mikroparçacık tasarımlarının hızlı bir şekilde yinelenmesini sağlar. Bu protokol çok fotonlu bir 3D yazıcı kullanmasına rağmen, mikroyapı boyutlarını uygun bir malzemede basabilen özelliklere sahip herhangi bir 3D yazıcı, ilk ana kalıbı oluşturmak için kullanılabilir. Ayrıca, fotolitografi daha önce dizilerdeki benzer yapıları bu protokolde üretilenlerden çok daha büyük yapmak için kullanılmıştır; Bununla birlikte, işçilik, ısmarlama fotomaskelerin sipariş edilmesinin gecikmesi ve ekipman erişilebilirliği, yinelemeli tasarım sürecini yavaşlatacaktır16. Son olarak, ana kalıp üretimi, şirket içi ana kalıp imalatı mümkün değilse, hizmet bedeli olan şirketlere dış kaynak olarak sağlanabilir. Ana kalıpları oluşturmak için kullanılan 3D yazıcı veya yöntemden bağımsız olarak, baskının alt tabakaya yapışması, aşağı akış adımları için kritik öneme sahiptir. Özellikle, PDMS kalıp üretimi sırasında yapışma yetersizse, basılı parçacıklar PDMS kalıbında kalacak ve basılı parçacıkların manuel olarak çıkarılmasını ve ana kalıbın imha edilmesini gerektirecektir.
Partikül dolgusu, dikkate alınması gereken bir başka kritik husustur. Mikropartiküller sınırlı dolum kapasitelerine sahiptir, bu nedenle filtrasyon sadece RABV antijenini konsantre etmek için değil, aynı zamanda mikropartikül çekirdek hacminin büyük bir bölümünü kaplayacak stok eksipiyanları uzaklaştırmak için de kullanılır. Bununla birlikte, RABV antijeninin büyüklüğü göz önüne alındığında (yaklaşık 60 nm x 180 nm)17, santrifüjleme adımları sırasında antijeni kısmen dışarı atmak mümkündür. Bu nedenle, RABV antijeninin yüksek bir geri kazanımını sağlamak için santrifüjlemeden sonra pipetleme veya vorteks yoluyla antijeni yeniden askıya almak önemlidir. Yüksek konsantrasyonlu bir çözelti dağıtım için idealdir, çünkü dağıtım döngülerini azaltır ve böylece dolum sırasında antijen bozulmasını sınırlar. Bununla birlikte, viskozite, kararlı bir düşüş oluşturan piezoelektrik dağıtım robotlarının önemli bir sınırlamasıdır, bu nedenle çok yüksek konsantrasyonlu bir çözeltinin dağıtılması mümkün olmayabilir veya tavsiye edilmeyebilir. Dolum çözeltisinin seyreltilmesi, kararlı bir damla oluşumu elde etmenin en kolay yoludur, ancak istenen yüklemeyi elde etmek için gereken ek dolum döngüleri boyunca antijen stabilitesi ve partikülleri doldurmak için gereken daha uzun süre dikkate alınmalıdır.
Sınırlama
Bu yöntem, ilk kalıpları üretmek için son derece özel ekipman ve mikropartikül üretimi için özel bir doldurma cihazı gerektirir. İlk ana kalıpları üretebilen bir baskı çözünürlüğüne sahip bir 3D yazıcıya duyulan ihtiyaç, hizmet ücreti yaklaşımı ile tersine çevrilebilse de, bir piezoelektrik dağıtım robotuna erişilebilirlik sınırlayıcıdır. Piezoelektrik dağıtım robotunun satın alınması, markaya, verime ve yeteneklere bağlı olarak genellikle 80.000 ila 200.000 dolar aralığında önemli bir ilk ön yatırım gerektirir. Diğer bazı dolgu yöntemleri potansiyel alternatifler olmasına rağmen, bu yöntemler RABV antijeni12 kullanılarak doğrulanmamıştır.
Gelecekteki uygulamalar
Kapsüllenmiş RABV antijeninin önemli bir kısmı sızdırmazlık işlemi boyunca stabil kalmıştır. Teorik olarak, bu antijeni, maruziyet sonrası profilaksi tedavisinin uygulama zaman çizelgesini taklit eden farklı PLGA tiplerinden oluşan parçacıklara dahil ederek, tüm dozlar tek bir enjeksiyonda uygulanabilir. Ek dozların uygulanması için tekrar hastane ziyaretlerine duyulan ihtiyacın ortadan kaldırılması, hasta uyumunu artıracak ve daha iyi tedavi sonuçları sağlayacaktır. Ayrıca, oldukça karmaşık inaktive edilmiş kuduz virüsünün ELISA-reaktivitesini tutma yeteneğini gösterdikten sonra, alt birim aşıları da dahil olmak üzere diğer antijenlerin bu kapsülleme yöntemiyle uyumlu olması muhtemeldir. Diğer profilaktik antijenlerin PULSED mikropartikülleri ile kullanılması, eksik aşılanmış popülasyonların aşılama oranlarını artırarak LMIC'lerde milyonlarca hayat kurtarabilir. Bununla birlikte, bunu başarmak için, aşılar sadece kapsülleme yoluyla değil, aynı zamanda salınım yoluyla da stabil kalmalıdır, bu da yük vücut ısısı ve PLGA bozunma ürünleri nedeniyle yüksek sıcaklıklara ve potansiyel olarak asidik bir mikro ortama maruz kalacağından zorolabilir18. Gelecekteki çalışmalar, antijenin salınım yoluyla stabilize edici stratejilerini izleyecek ve bu da birçok bulaşıcı hastalığı önlemek için geniş çapta uygulanabilir tek enjeksiyonlu bir aşılama platformu potansiyelini ortaya çıkaracaktır.
Disclosures
Dr. McHugh, kapsanan çalışmaya dayanarak dosyalanmış bir patente sahiptir ve şu anda İnsanlık için Parçacıklar için bir danışmandır. Bay Graf, kapsanan çalışmaya dayanarak dosyalanmış bir patente sahiptir. Dr. Kadasia, Bay Yang ve Bayan Brady, bu çalışma sırasında MIT'den benzer bir mikropartikül aşısı dağıtım teknolojisini lisanslayan kamu yararına çalışan bir şirket olan İnsanlık için Parçacıklar'ın bir parçasıdır.
Acknowledgments
Chiron Behring ve Bharat Biotech International'a İnsanlık için Parçacıklara RABV antijeni sağladıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca Charles Rupprecht, VMD, MS, PhD., paha biçilmez rehberliği ve teknik katkıları için teşekkür ederiz. Yazarlar, Dr. Rebecca Richards-Kortum'un SciFLEXARRAYER S3 pikoliter dağıtım aparatının kullanımına izin verdiği için cömertliğine ve Dr. Chelsey Smith'in cihazı kullanma talimatına teşekkür eder. Ayrıca, kuduz antijeninin mikroskopi görüntülerini oluşturduğu için Massachusetts Üniversitesi Chan Tıp Fakültesi'ni de kabul ediyoruz. Son olarak, Don Chickering ve Erin Euliano'ya belgeyi göndermeden önce inceledikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma Bill ve Melinda Gates Vakfı'ndan bir hibe (INV-004360) ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm PES filter | Cole-Parmer+B4B2:B63 | 04396-26 | |
| 0.25 mm Shims | McMaster Carr | 98090A935 | |
| 0.75 inch Binder Clips | Staples | 480114 | |
| 10 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309604 | |
| 10 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 101.6 mm C-Clamp | Amazon | PT-SD-CP01A | Black handle will eventually fall off. Use pliers to adjust once this happens. |
| 19 G needle | EXCELINT | 26438 | |
| 25 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11 | |
| 3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylate | Millipore Sigma | M6514-25ML | |
| 5 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Eppendorf | 22431081 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 352098 | |
| 50 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11F | |
| Acetone | Fisher | AC268310010 | |
| Aluminum Block | McMaster Carr | 9057K175 | |
| Aluminum Foil | VWR | 89079-069 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters, 100 kDa | Millipore Sigma | C82301 | |
| Anti-Rabies Virus Antibody, Serum Free Antibody, clone 1112-1, 100 | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| Anti-Rabies Virus Mouse Monoclonal Antibody, Clone D1-25, biotinylated | Fisherbrand | 14-388-100 | |
| Carboxymethyl Cellulose | Tokyo Chemical Industries | C0045 | |
| ClipTip 300, Filter, Racked | Fisherbrand | 13-678-11 | |
| Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3206 | |
| Costar 1.7 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3207 | |
| Describe | Nanoscribe | Software used to define the printing parameters for Nanoscribe 3D printer is step 1.2. Software provided with the printer. |
|
| Desiccator | Fisher Scientific | 10529901 | Or equivalent |
| Double-Sided Tape | Staples | 649280 | |
| DPBS (10x), No Calcium, No Magnesium | Gibco | 14200075 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 to 300 µL | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 0.1 – 10 µL | Fisherbrand | 13-678-11F | |
| Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 100 – 1000 µL | Fisherbrand | 03-448-17 | |
| Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 2 – 20 µL | Fisherbrand | FB14955202 | |
| Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 20 – 200 µL | Fisherbrand | 13-374-10 | |
| Fisherbrand Elite Pipette Kit | Fisherbrand | 05-408-137 | |
| Fisherbrand Pipet Controller | Fisherbrand | FB14955202 | |
| Glass Petri Dish, 90 mm | VWR | 470313-346 | |
| Glass Slides | Globe Scientific | 1380-10 | |
| Helicon Focus 8 | HeliconSoft | Software used to focus stack images | |
| IP-Q Resin | Nanoscribe | Printer resin is compatable with the 10x lens and is used for printing large microstructures on the Nanoscribe Photonic Professional GT2 | |
| Lascar EL-USB-TC-LCD Thermocouple | Amazon | 5053485896236 | Or equivalent |
| Microscope Slide Box | Millipore Sigma | Z374385-1EA | Or equivalent |
| Nanoscribe Photonic Professional GT2 with 10X Objective | Nanoscribe | ||
| NanoWrite | Nanoscribe | Software used to interface with nanoscrive 3D printer. Software provided with printer. |
|
| Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
| OPD Substrate Tablets (o-Phenylenediamine Dihydrochloride) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Parafilm M Wrapping Film, 4 in. | Fisherbrand | 13-374-10 | |
| PDC 60 with Type 3 Coating | Scienion | P-2020 | |
| PDMS Particle Molds | Rice University | n/a | N/A- Particles are 400 μm in diameter with a wall thickness of 100 μm, and a height of 500 μm, resulting in an inner diameter of 200 μm. The arrays are 14 x 22 particles spaced 600 μm apart from each other. 4- and 5-point stars are used as fiducials, positioned 600 μm to the right and left of the top right and top left particles on the array. |
| Petri Dish | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Plastic Cups | Fisher Scientific | S04170 | |
| PLGA Film, 502H | Sigma | 502H: 719897-1G | |
| Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate | Millipore Sigma | 484431 | |
| Rabies Antigen | Chiron Behring and Bharat Biotech International | Material was acquired by entering into a materials transfer agreement with the company. | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Scalpel | VWR | 21899-530 and 76457-512 | |
| SciFLEXARRAYER S3 with PCD 60 | Scienion | Or equivalent | |
| Sealing Tape for 96-Well Plates | Thermo Scientific | 15036 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | 1025 | |
| Spring Clamps | IRWIN | VGP58100 | |
| Stainless Steel Block | McMaster Carr | 9083K12 | |
| Streptavidin−Peroxidase Polymer, Ultrasensitive | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Sylgard 184 | DOW | 2646340 | |
| Teflon Sheet | McMaster Carr | 9266K12 | Used to make PLGA films. Must be cut into appropriately sized pieces. |
| Teflon Sheet, 0.8 mm-thick | McMaster Carr | 9266K81 | |
| Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silane | Sigma | 448931-10G | |
| Tweezers | Pixnor | ESD-16 | |
| UltraPure Distilled Water | Fisher Scientific | 10977015 | |
| UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker | UVP | 95-0174-01 | Or equivalent |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | F420100000 | Note you will need two of these. One will be used exclusively to pre-treat samples with trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane to prevent contamination. |
| Vacuum Oven Capable of Reaching 120 °C | VWR | 97027-664 | Or equivalent |
| Vacuum, CRVpro4 | Welch | 3041-01 | Or equivalent |
| Wooden Tongue Depressors | Electron Microscopy Sciences | 72320 |
References
- Li, X. Estimating the health impact of vaccination against ten pathogens in 98 low-income and middle-income countries from 2000 to 2030: a modelling study. The Lancet. 397, 398-408 (2021).
- Euliano, E. M., Sklavounos, A. A., Wheeler, A. R., McHugh, K. J. Translating diagnostics and drug delivery technologies to low-resource settings. Science Translational Medicine. 14 (666), eabm1732 (2022).
- Haider, S. Rabies: old disease, new challenges. Canadian Medical Association Journal. 178 (5), 562-563 (2008).
- Fisher, C. R., Streicker, D. G., Schnell, M. J. The spread and evolution of rabies virus: conquering new frontiers. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 241-255 (2018).
- Nagarajan, T., Rupprecht, C. E. Rabies and Rabies Vaccines. , Springer International Publishing. (2020).
- Shi, T., Dunham, E. F., Nyland, J. E. Rabies vaccination compliance and reasons for incompletion. The Western Journal of Emergency Medicine. 21 (4), 918-923 (2020).
- Shankaraiah, R. H., Rajashekar, R. A., Veena, V., Hanumanthaiah, A. N. D. Compliance to anti-rabies vaccination in post-exposure prophylaxis. Indian Journal of Public Health. 59 (1), 58-60 (2015).
- Cleland, J. L. Single-administration vaccines: controlled-release technology to mimic repeated immunizations. Trends in Biotechnology. 17 (1), 25-29 (1999).
- Yeh, M. K., Coombes, A. G. A., Jenkins, P. G., Davis, S. S. A novel emulsification-solvent extraction technique for production of protein loaded biodegradable microparticles for vaccine and drug delivery. Journal of Controlled Release. 33 (3), 437-445 (1995).
- Peyre, M., Sesardic, D., Merkle, H. P., Gander, B., Johansen, P. An experimental divalent vaccine based on biodegradable microspheres induces protective immunity against tetanus and diphtheria. Journal of Pharmaceutical Sciences. 92 (5), 957-966 (2003).
- Mvan de Weert, M., Hennink, W. E., Jiskoot, W.
- Graf, T. P., et al. A scalable platform for fabricating biodegradable microparticles with pulsatile drug release. Advanced Materials. , https://doi.org/10.1002/adma.202300228 e2300228 (2023).
- Wang, Y., Qin, B., Xia, G., Choi, S. H. FDA's poly (lactic-co-glycolic acid) research program and regulatory outcomes. The American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 23 (4), 92 (2021).
- Wan, Y. Development of stabilizing formulations of a trivalent inactivated poliovirus vaccine in a dried state for delivery in the NanopatchTM microprojection array. Journal of Pharmaceutical Sciences. 107 (6), 1540-1551 (2018).
- Smith, T. G., Siirin, M., Wu, X., Hanlon, C. A., Bronshtein, V. Rabies vaccine preserved by vaporization is thermostable and immunogenic. Vaccine. 33 (19), 2203-2206 (2015).
- McHugh, K. J. Fabrication of fillable microparticles and other complex 3D microstructures. Science. 357 (6356), 1138-1142 (2017).
- Sanchez, M. E. N. Rabies vaccine characterization by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 8149 (2020).
- Fu, K., Pack, D. W., Klibanov, A. M., Langer, R. Visual evidence of acidic environment within degrading poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres. Pharmaceutical Research. 17 (1), 100-106 (2000).
