Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تصنيع الجسيمات الدقيقة البوليمرية النابضة التي تغلف مستضد داء الكلب

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65147
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 2, 1, 2, 1,4
1Department of Bioengineering, Rice University, 2Particles for Humanity, 3IMPACT Technology Development, 4Department of Chemistry, Rice University
* These authors contributed equally

Summary

تصف هذه الطريقة تغليف مستضد داء الكلب إلى جسيمات دقيقة بوليمرية قابلة للتحلل الحيوي ذات خصائص هيكلية ومادية تمكن من إطلاق النبض بعد تأخير محدد مسبقا. يؤكد تقييم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) للمستضد المسترد من قلب الجسيمات وجود بروتين سكري سليم لفيروس داء الكلب الثلاثي من خلال تصنيع الجسيمات.

Abstract

تتطلب المبادئ التوجيهية الحالية للوقاية من داء الكلب بعد التعرض إعطاء حقن متعددة على مدى عدة أسابيع. ويمكن أن يشكل ذلك عبئا غير متناسب على أولئك الذين يعيشون في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل، حيث تحدث غالبية حالات التعرض المميتة لداء الكلب. تم استكشاف استراتيجيات مختلفة لتوصيل الأدوية لتكثيف أنظمة اللقاح في حقنة واحدة عن طريق تغليف المستضدات في جزيئات بوليمرية. ومع ذلك ، يمكن أن تتسبب الضغوطات القاسية أثناء عملية التغليف في تمسخ المستضد المغلف. توضح هذه المقالة طريقة لتغليف مستضد فيروس داء الكلب (RABV) في جسيمات دقيقة بوليمرية تظهر إطلاقا نابضا قابلا للضبط. هذه الطريقة ، التي تسمى الجسيمات المسالة بشكل موحد ومختومة لتغليف الأدوية (PULSED) ، تولد الجسيمات الدقيقة باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة لإنشاء قوالب بوليديميثيل سيلوكسان معكوسة (PDMS) من قالب رئيسي متعدد الفوتون ، مطبوع 3D. ثم يتم تشكيل أفلام Poly (حمض اللاكتيك المشترك في الجليكوليك) (PLGA) بالضغط في قوالب PDMS لإنشاء أسطوانات مفتوحة الوجه مملوءة ب RABV المركز باستخدام روبوت توزيع كهرضغطية. ثم يتم إغلاق هذه الهياكل المجهرية عن طريق تسخين الجزء العلوي من الجسيمات ، مما يسمح للمادة بالتدفق وتشكيل حاجز بوليمري مستمر غير مسام. بعد التصنيع ، يتم استخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) الخاصة بالكشف عن البروتين السكري لفيروس داء الكلب الثلاثي السليم لتأكيد الانتعاش العالي للمستضد المناعي من الجسيمات الدقيقة.

Introduction

التطعيم هو أداة رعاية صحية فعالة للغاية ، حيث منع أكثر من 37 مليون حالة وفاة بين عامي 2000 و 20191. وعلى الرغم من هذه الفعالية، لا تزال الأمراض التي يمكن الوقاية منها باللقاحات تشكل خطرا كبيرا على الصحة العالمية، لا سيما في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل حيث تساهم المعدلات المرتفعة لعدم التطعيم أو نقصه في 1.5 مليون حالة وفاة يمكن الوقاية منها باللقاحاتسنويا2. داء الكلب ليس استثناء من هذه التفاوتات. على الرغم من وضعه باعتباره أكثر الأمراض فتكا التي عرفتها البشرية ، كونه مميتا على مستوى العالم تقريبا ، فإن داء الكلب قابل للعلاج بالكامل ويصنف على أنه تم القضاء عليه في العديد من البلدان المرتفعة الدخل. بدلا من ذلك ، يتحمل عبء داء الكلب بشكل غير متناسب الأشخاص الذين يعيشون في أجزاء من آسيا وأفريقيا ، حيث يكون للمرض نتائج مدمرة على البشر والماشية 3,4.

التطعيم أمر بالغ الأهمية لإدارة التأثير العالمي لداءالكلب 5. تحظر تكلفة التطعيم التنفيذ الواسع النطاق للوقاية قبل التعرض (PrEP) ، مع الأخذ في الاعتبار انخفاض معدل الإصابة بالمرض بشكل عام. علاوة على ذلك ، في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل ، تكون فائدة العلاج الوقائي بعد التعرض (PEP) محدودة بسبب الضغوط الاجتماعية والاقتصادية على المرضى الذين يسعون للحصول على الرعاية الصحية. تؤدي العوامل اللوجستية ، مثل مسافة السفر إلى نقاط الوصول إلى الرعاية الصحية ، والأجور المفقودة أثناء الحصول على العلاج ، وتكلفة العلاج ، والمواعيد التي تتداخل مع الأنشطة اليومية ، والنسيان ، إلى انخفاض معدلات الالتزام ب PEP إلى 60٪ 6,7. ويمثل معدل استنزاف المرضى المرتفع هذا فرصة لتحسين النهج لمعالجة الثغرات في التطعيم ضد داء الكلب من أجل مكافحة المرض.

تم استكشاف أنظمة التطعيم بحقنة واحدة (SI) التي تتحكم في إطلاق المستضدات كطرق للحصول على التحصين الكامل في حقنة واحدة. إن التخلص من الحاجة إلى زيارات متعددة لمقدم الرعاية الصحية يخفف من الأعباء التي تمنع الأفراد من طلب الرعاية الكافية. لتحقيق التطعيم ضد SI ، عادة ما يتم تغليف المستضد داخل مصفوفة بوليمرية قابلة للتحلل الحيوي والتي غالبا ما تأخذ شكل جسيمات دقيقة قابلة للحقن. بمجرد الحقن ، يتحلل البوليمر ويطلق المستضد المعزول. حتى الآن ، تم اتباع استراتيجيتين أوليتين للإطلاق لتحقيق التطعيم ضد SI. في إحدى الطرق، ينطلق مولد الضد باستمرار على مدى فترة زمنية طويلة. على الرغم من أن الهدف منه هو تعزيز الاستمناع لحقنة واحدة ، إلا أنه من غير الواضح ما إذا كان هذا النهج كافيا لاستنباط استجابة مناعية وقائية ضد فيروس داء الكلب (RABV) في البشر8. في الحالة الأخرى ، يتم إطلاق المستضد بعد تأخير محدد مسبقا لتقليد نظام اللقاح التقليدي والمثبت أولي التعزيز. وتظهر طرق التجفيف بالرذاذ وتصنيع الجسيمات الدقيقة القائمة على المستحلب/تبخر المذيبات الاستراتيجية السابقة، وقد استخدمت لتغليف كل من اللقاحات النموذجية9 والمستضدات عالية الاستقرار بنجاح، مثل ذيفانالكزاز 10. ومع ذلك ، فإن طرق التغليف هذه تتضمن ضغوطا ، بما في ذلك الحرارة وتفاعل المذيبات والقوى الفيزيائية ، التي يمكن أن تفسد المستضدات11.

الجسيمات المسالة بشكل موحد ومختومة لتغليف الأدوية (PULSED) هي طريقة تصنيع تم تطويرها مؤخرا ويمكن استخدامها لتغليف البيولوجيا في الجسيمات الدقيقة القابلة للتحلل. يستخدم Micromolding لتوليد جزيئات مملوءة بحمولة سائلة ويتم تسخينها للسماح للبوليمر بإعادة التدفق وتغليف المستودع المركزي للبضائع بالكامل داخل طبقة متجاورة من البوليمر القابل للتحلل. ينتج عن هذه البنية المجهرية إطلاق نابض للحمولة ، بعد مدة تعتمد على معدل تحلل الغلاف البوليمري12. توضح هذه المخطوطة تغليف RABV المعطل داخل الجسيمات الدقيقة المكونة من بولي (حمض اللاكتيك المشترك الجليكوليك) (PLGA) ، وهو بوليمر قابل للتحلل يستخدم في العديد من التركيبات المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء13 ، باستخدام طريقة تصنيع PULSED لتغليف مستضد RABV المستقر كما تم تقييمه بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). من خلال الجمع بين جسيمات PLGA ذات الوزن الجزيئي و / أو المجموعات النهائية المختلفة ، فإن هذا النهج لديه القدرة على تقليد الدورة الزمنية الحالية للتطعيم ضد داء الكلب بعد حقنة واحدة.

Protocol

1. توليد قالب الجسيمات الرئيسي

ملاحظة: يمكن إجراء عملية الطباعة ثلاثية الأبعاد باستخدام أي طابعة ثلاثية الأبعاد بدقة مكانية كافية ؛ ومع ذلك ، يصف البروتوكول الحالي عملية طابعة 3D متعددة الفوتونات.

  1. تصميم هياكل الجسيمات الدقيقة باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD).
    ملاحظة: مواصفات التصميم هي كما يلي: يتم ترتيب 308 جسيمات (القطر = 400 ميكرومتر ، الارتفاع = 500 ميكرومتر ، وسمك الجدار = 100 ميكرومتر) في صفيف 22 × 14 ، مع تباعد 600 ميكرومتر بينهما. يحتوي التصميم أيضا على نجمة رباعية ونجمة خماسية كائتمانات خارج المصفوفة مباشرة (الشكل التكميلي 1).
  2. تصدير التصميم النهائي كملف STL (ملف الترميز التكميلي 1) وتحميل الملف إلى برنامج قادر على تحديد معلمات الطباعة كما هو موضح أدناه. ثم احفظه كملف متوافق مع طابعة 3D (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: مسافة التقطيع = 5 ميكرومتر ، مسافة الفقس = 1 ميكرومتر ، كفاف القشرة = 50 ميكرومتر ، عدد شرائح القاعدة = 5 ميكرومتر ، السقالات = مجوفة ، وضع المسح = galvo ، المحور z = محرك z-drive المجهري ، سرعة المسح = 100000 ، الطاقة = 10000.
  3. قم بمعالجة ركيزة طباعة السيليكون مسبقا (انظر جدول المواد) باستخدام عملية تنظيف البلازما (الغاز: O2 ؛ الطاقة: 200 واط ؛ درجة الحرارة: 25 درجة مئوية ؛ التدفق: 20 ؛ الوقت: 5 دقائق) ، ثم اغمر الركيزة على الفور في محلول 30 مل من الإيثانول و 60 ميكرولتر من 3- (تريميثوكسيسيليل) بروبيل ميثاكريلات في طبق بتري زجاجي. غطيها بورق الألمنيوم واتركيها تحضن طوال الليل.
    ملاحظة: تزيد هذه الخطوة من التصاق الطباعة بالركيزة ، وهو أمر مهم أثناء فصل PDMS (الخطوة 2.6).
  4. قم بتحميل ملف الطباعة إلى طابعة 3D متعددة الفوتونات ، وقم بتطبيق راتنج الطباعة على الركيزة المعالجة ، وقم بتحميل عدسة 10x (انظر جدول المواد) ، واطبع الهياكل المجهرية.
  5. بمجرد الانتهاء ، اغمر الطباعة في أسيتات البروبيلين غليكول ميثيل الأثير (انظر جدول المواد) لمدة 45 دقيقة لإزالة مقاومة الضوء غير المكشوفة ، ثم اغمر الطباعة في كحول الأيزوبروبيل لمدة 5 دقائق. بعد معالجة القالب الرئيسي عن طريق تعريضه لضوء الأشعة فوق البنفسجية عند 254 نانومتر لمدة 120 دقيقة.
    ملاحظة: إذا كان ذلك متاحا ، يمكن استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية في نطاق 405 إلى 365 نانومتر لمدة ~ 20 دقيقة لمعالجة الهياكل المطبوعة بعد ذلك.

2. توليد قوالب بوليديميثيل سيلوكسان (PDMS)

  1. عالج سطح القالب الرئيسي المطبوع ثلاثي الأبعاد بوضعه في غرفة مفرغة تحتوي على شريحة زجاجية تحتوي على 40 ميكرولتر من ثلاثي كلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H ، -perfluorooctyl) (انظر جدول المواد) silane المضافة إلى السطح. اسحب الفراغ (الضغط النسبي: -20 بوصة. زئبق) لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: تضمن هذه الخطوة سهولة الفصل عند إزالة القوالب (الخطوة 2.6).
  2. أثناء معالجة سطح القالب الرئيسي ، امزج قاعدة البوليمر المسبق polydimethylsiloxane (PDMS) جيدا مع عامل معالجة البوليمر المسبق PDMS بنسبة 9: 1 بالكتلة (هناك حاجة إلى 10 جم على الأقل من المواد لكل قالب رئيسي). بمجرد الخلط التام ، انقل PDMS غير المعالج إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وأجهزة طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. بمجرد اكتمال المعالجة السطحية ، ضع القالب الرئيسي في طبق رقائق الألومنيوم واسكب PDMS غير المعالج أعلى القالب ، مما يضمن غمر الميزات بالكامل. ضع طبق رقائق الألومنيوم في غرفة مفرغة واسحب الفراغ (الضغط النسبي: -20 بوصة. Hg) لمدة 1 ساعة لإزالة فقاعات الهواء.
  4. قم بإزالة طبق رقائق الألومنيوم من غرفة التفريغ. ضع فواصل 800 ميكرومتر في نهايات القالب الرئيسي وقم بتراكب شريحة زجاجية نظيفة على القالب الرئيسي ، مع الحرص على تجنب إدخال فقاعات الهواء. استخدم مشابك الموثق لربط القالب والشريحة معا ، وتحديد موقع قوة التثبيت فوق الفواصل (الشكل التكميلي 2).
  5. ضع الهيكل في فرن مضبوط على 120 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل لمعالجة البوليمر الأولي في قوالب PDMS.
  6. قم بإزالة الهيكل من الفرن ، وحرر مشابك الموثق بعناية ، وافصل القالب الرئيسي بعناية عن قالب PDMS المعالج باستخدام شفرة حلاقة.
    ملاحظة: يمكن إعادة استخدام القالب الرئيسي المطبوع 3D لإنشاء قوالب PDMS إضافية.

3. تصنيع فيلم PLGA

  1. قم بوزن 450 مجم من PLGA (انظر جدول المواد) وضعه على لوح بوليمر غير لاصق مقاس 76 مم × 76 مم داخل رقاقة حلقية بسمك 250 ميكرومتر ، بقطر داخلي يبلغ 50.8 مم. ضع ورقة بوليمر ثانية غير لاصقة فوق PLGA وضغط المكدس بين كتلتين من الألومنيوم باستخدام مشبك c مقاس 101.6 مم حتى يتم إحكام الإصبع.
    ملاحظة: تم استخدام 502H PLGA حصريا في هذه الدراسة. ومع ذلك ، فإن الأنواع الأخرى من PLGA متوافقة مع هذه العملية.
  2. ضع المجموعة المثبتة على شكل حرف C في فرن مفرغ من الهواء مضبوط على 120 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تحت التفريغ ، مع ضغط نسبي يبلغ -30 بوصة زئبقية. بعد ذلك ، قم بإزالة التجميع وشد المشبك بإحكام قبل وضعه مرة أخرى في فرن التفريغ لمدة 30 دقيقة أخرى.
    ملاحظة: الغرض الأساسي من استخدام الفراغ هو تجنب تدهور PLGA ، والذي يتم تسريعه في درجات الحرارة العالية.
  3. أخرج التجميع من الفرن واتركه يبرد لمدة 4 ساعات في مجفف.
  4. بمجرد أن يبرد ، قم بفك المشبك ، وقم بإزالة فيلم PLGA من صفائح البوليمر غير اللاصقة ، وضع الفيلم في طبق بتري ملصق. قم بتخزين طبق بتري داخل مجفف لاستخدامه لاحقا.

4. توليد الجسيمات PLGA

  1. عالج سطح قالب PDMS كما هو موضح سابقا في الخطوة 2.1.
  2. باستخدام ملاقط و / أو مشرط ، قم بقص ووضع جزء من فيلم PLGA 250 ميكرومتر ، تقريبا حجم المصفوفة ، على قالب PDMS المعالج.
  3. قم بتراكب شريحة مجهر زجاجي نظيف أعلى فيلم PLGA وقالب PDMS وقم بتثبيت المكونات معا عن طريق وضع مشبك زنبركي مباشرة فوق الصفيف وفيلم PLGA.
  4. ضع مجموعة القالب المثبتة في فرن التفريغ مضبوطا على 120 درجة مئوية ، واسحب المكنسة الكهربائية بضغط نسبي يبلغ -30 بوصة. زئبق لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: يعتمد الوقت اللازم لتشكيل الجسيمات على PLGA ، ويمكن أن يختلف من 1-12 ساعة.
  5. أخرج مجموعة القالب المثبتة من الفرن واتركها تبرد بشكل سلبي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة تقريبا ، أو حتى تبرد عند لمسها.
  6. باستخدام شفرة حلاقة ، قم بالضغط برفق بين قالب PDMS ومجموعة جزيئات PLGA لفصل الاثنين. قم بتخزين جزيئات PLGA في مجفف للاستخدام في المستقبل.

5. تركيز المستضد وتنقيته

  1. قم بإذابة حصة واحدة من مستضد RABV المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بتجميع إعداد الترشيح عن طريق وضع مرشحين للدوران بالطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي 100 كيلو دالتون (MWCO ؛ انظر جدول المواد) في أنبوبي تجميع.
  3. بلل مرشحي الدوران بالطرد المركزي مسبقا بإضافة 500 ميكرولتر من الماء فائق النقاء.
  4. قم بتدوير المرشحات عند 2400 × جم لمدة 1 دقيقة في جهاز طرد مركزي على الطاولة في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بإزالة الماء من كل من الأجزاء العلوية والسفلية لإعداد الترشيح باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
    ملاحظة: لا تدع مرشح الدوران المبلل مسبقا يجف.
  6. أضف 400 ميكرولتر من الماء المقطر إلى الجزء العلوي من كل مرشح دوران ، ثم أضف 100 ميكرولتر من مستضد RABV المذاب واخلطه مع الماصة.
    ملاحظة: ركزت هذه الدراسة المستضد حوالي خمسة أضعاف وخفضت تركيز السواغات <100 كيلو دالتون بمقدار ~ 50 ضعفا.
  7. قم بتحميل مرشحي الدوران بالطرد المركزي في جهاز طرد مركزي على الطاولة ، مما يضمن أن المرشحات تواجه مركز جهاز الطرد المركزي. حدد أي جانب من المرشح يواجه مركز جهاز الطرد المركزي.
    ملاحظة: إذا تم توجيهها بشكل غير صحيح ، فلن يتم تصفية / تركيز الحلول بشكل صحيح.
  8. أجهزة الطرد المركزي المرشحات عند 14000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  9. استرجع المرشحات من جهاز الطرد المركزي. ستحتوي أنابيب التجميع على الراشح ، بينما ستحتوي المرشحات على العينة المركزة (الشكل التكميلي 3 أ).
  10. قم بإزالة المرشح في أنابيب التجميع باستخدام ماصة وتخلص منها.
  11. أضف 450 ميكرولتر من الماء المقطر المصفى إلى كل مرشح ، واخلط العينة المركزة والماء عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ست مرات.
  12. أجهزة الطرد المركزي مرشحات الدوران مرة ثانية عند 14000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن المرشحات تواجه مركز جهاز الطرد المركزي في نفس الاتجاه كما في الخطوة 5.7.
  13. استرجع وحدات المرشح من جهاز الطرد المركزي ، وكما كان من قبل ، قم بإزالة المرشح والتخلص منه من كل أنبوب باستخدام ماصة.
  14. قم بإزالة مرشحات الدوران من أنابيب التجميع وقم بتغطية أغلفة المرشح باستخدام الجزء العلوي من أنابيب التجميع (الشكل التكميلي 3B).
  15. ضع الجزء السفلي من أغلفة مرشح الدوران مباشرة على دوامة ودوامة عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية مع تثبيت أغلفة المرشح في وضع مستقيم وبزاوية 45 درجة (الشكل التكميلي 3C).
    ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى إعادة تعليق أي مستضد RABV شكل حبيبات أثناء عملية الطرد المركزي.
  16. قم بإزالة غطاء أنابيب التجميع بعناية من أغلفة مرشح الدوران. ضع أغلفة المرشح مرة أخرى في أنابيب التجميع المتوفرة وقم بتشغيل دوران سريع (2-3 ثوان) لجمع أي حجم قد يكون محاصرا في الغطاء.
    ملاحظة: يجب إجراء هذا الدوران السريع في جهاز طرد مركزي دقيق على الطاولة. يجب أن تكون المرشحات عرضية لجهاز الطرد المركزي ، عكس التكوين السابق ، لضمان عدم فقد أي حل من خلال المرشحات.
  17. اقلب كل وحدة مرشح دوران في أنبوب تجميع جديد مزود بمجموعة مرشح الدوران (انظر جدول المواد) ، وأجهزة طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 1000 × جم في درجة حرارة الغرفة لجمع العينات المركزة.
  18. دمج العينات المركزة من أنبوبي التجميع في أنبوب تجميع واحد. قياس وتسجيل الحجم الناتج.
    ملاحظة: سيكون للعينة الناتجة 5 أضعاف تركيز المستضد الأولي مثل المخزون ، ولها تركيز سواغ صغير (<100 كيلو دالتون) أقل بحوالي 50 ضعفا من المخزون ، وتظهر بيضاء حليبية قليلا. يجب أن يكون الحجم الكلي حوالي 44-48 ميكرولتر.
  19. قم بتخزين المستضد المركز 5x والمغسول مرتين عند 4 درجات مئوية حتى وقت الاستغناء ، ولكن لمدة لا تزيد عن 16 ساعة. قبل ملء الجسيمات بهذا المحلول ، قم بطرد الأنبوب عند 1000 × جم لمدة دقيقة واحدة لإزالة أي فقاعات. يمكن تخفيف المحلول باستخدام الماء المقطر للوصول إلى التركيز الاسمي المستهدف للتوزيع.

6. ملء الجسيمات

  1. مرشح فراغ 500 مل من الماء منزوع الأيونات من خلال مرشح فراغ 0.22 ميكرومتر ، ثم قم بإزالة الغاز من المحلول عن طريق تطبيق فراغ (الضغط النسبي: -20 بوصة. Hg) بينما تحت صوتنة لمدة 20 دقيقة.
  2. خلال هذا الوقت ، قم بتوصيل الشعيرات الدموية لتوزيع بيزو (PDCs ؛ انظر جدول المواد) بموزع كهرضغطية.
  3. قم بتجهيز الجهاز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) ، ثم ضع الشريحة مع جزيئات PLGA في منطقة الاستغناء.
  4. قم بإعداد "البحث عن النقاط المرجعية المستهدفة" ، وقم بتشغيل ، ثم قم بإعداد "الركيزة المستهدفة" ، وفقا للشكل التكميلي 4.
  5. قم بتحميل 25 ميكرولتر من المستضد المركز في لوحة المصدر وقم بتحميله في الجهاز. باستخدام PDCs ، قم بشفط 10 ميكرولتر من المستضد المركز في طرف التوزيع ، واغسل الجزء الخارجي من الطرف ، ثم قم بمعايرة محاذاة التوزيع (الشكل التكميلي 5).
  6. أدخل "معلمات الإعداد المستهدف" وانقر على تشغيل (الشكل التكميلي 6).
  7. بمجرد الانتهاء ، قم بإزالة الجسيمات المملوءة وتحقق من ملئها تحت مجسم.
  8. انتقل مباشرة إلى الخطوة التالية في البروتوكول.

7. ختم الجسيمات والحصاد

  1. ضع كتلة من الفولاذ المقاوم للصدأ (انظر جدول المواد) على لوح تسخين. ضع شريحتين مجهريتين على كتلة الفولاذ المقاوم للصدأ بحيث تكونان متوازيين. تأكد من أن كتلة الفولاذ المقاوم للصدأ مستوية ، ثم قم بتشغيل لوح التسخين واضبط درجة الحرارة بحيث تكون درجة حرارة سطح الفولاذ المقاوم للصدأ 200 درجة مئوية. تحقق من درجة حرارة لوح التسخين قبل الختم.
  2. قم بتعليق جزيئات PLGA المملوءة فوق لوح التسخين عن طريق وضعها على الشريحتين الزجاجيتين ، ثم ابدأ على الفور مؤقتا لمدة 18 ثانية.
    ملاحظة: سيختلف مقدار الوقت وجزيئات الحرارة التي تحتاجها الختم اعتمادا على الخواص الكيميائية ل PLGA المستخدمة في صنع الجسيمات. يمكن استخدام حامل شرائح مطبوع 3D مخصص للتعامل مع الشرائح على مسافة آمنة من لوح التسخين. يتم توفير ملف STL كملف ترميز تكميلي 2.
  3. بمجرد إغلاقها ، قم بإزالة مجموعة الجسيمات من لوح التسخين وعلقها فوق طاولة المختبر عن طريق وضع مجموعة الجسيمات على شريحتين زجاجيتين منفصلتين. اترك الجسيمات لتبرد لمدة 1 دقيقة.
  4. بمجرد تبريدها ، يمكن حصاد الجسيمات باستخدام مشرط أثناء النظر من خلال مجسم. أمسك المشرط بالشفرة بزاوية 45 درجة على الشريحة واضغط على قاعدة الجسيم لفصله عن الشريحة الزجاجية.
  5. بمجرد الحصاد ، استخدم المشرط لنقل الجسيمات إلى أنابيب ربط منخفضة البروتين سعة 0.5 مل (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، املأ الأنابيب ب 250 ميكرولتر من محلول عازل فوسفات 1x (PBS) يحتوي على 30 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار (BSA) و 1 مجم / مل من الجلوكوز.
    ملاحظة: سيحافظ محلول 30 مجم / مل BSA ومحلول الجلوكوز 1 مجم / مل المحضر في برنامج تلفزيوني على استقرار مستضد RABV.
  6. سحق الجسيمات تحت مجسمة باستخدام زوج من ملاقط ذات طرف رفيع. تأكد من توفر مستضد RABV في قلب الجسيم ليتم إذابته في المحلول المحيط. قم بتخزين العينات في ثلاجة 4 درجات مئوية حتى يمكن تقييم فعالية المستضد باستخدام ELISA. يجب تشغيل العينات على ELSIA في غضون 7 أيام من التحضير.

8. تقييم المستضد بواسطة ELISA

تنبيه: لا تدع الألواح الدقيقة تجف في أي وقت. قم دائما بتكديس الألواح ، وقم دائما بتغطية اللوحة العلوية بختم بلاستيكي أو لوحة فارغة أو غطاء لتجنب الجفاف.

  1. قم بإعداد المخازن المؤقتة كما هو موضح في الملف التكميلي 1.
  2. تحضير 5 مل من محلول الطلاء (عازلة كربونات بيكربونات ، درجة الحموضة 9.6) بتركيز 2.5 ميكروغرام / مل عن طريق إضافة 25 ميكرولتر من الجسم المضاد للطلاء إلى 4975 ميكرولتر من عازلة الطلاء عند درجة الحموضة 9.4-9.6.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى 5 مل لطلاء 96 بئرا ب 50 ميكرولتر لكل منها (مع حجم إضافي لفقدان الماصة). قم بزيادة الحجم الإجمالي بمقدار 5 مل لكل لوحة ELISA إضافية مطلوبة.
  3. استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع 50 ميكرولتر من محلول الطلاء في كل بئر من الصفيحة الدقيقة. يجب استخدام المحلول للطلاء فور تحضيره.
  4. اضغط برفق على طول حواف اللوحة على كف القفاز لضمان تغطية قاع كل بئر بالتساوي بالسائل.
  5. أغلق اللوحة بغشاء لاصق وضعها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، ثم انقلها إلى 4 درجات مئوية طوال الليل.
  6. استرجع الألواح من التخزين البارد واغسلها ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل في كل بئر.
  7. قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل ووزع 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع في كل بئر.
    تنبيه: عند تشغيل لوحات متعددة بنفس العينات المتكررة على لوحات مختلفة ، من المهم المتابعة لوحة تلو الأخرى (على سبيل المثال ، املأ اللوحة 1 بالمادة قبل الانتقال إلى اللوحة 2 ، ثم إلى اللوحة 3 وما إلى ذلك). لا تضع المادة X على جميع الألواح ثم المادة Y ، وما إلى ذلك ، لأن هذا من شأنه أن يزيد من خطر جفاف الآبار. بعد خطوة الغسيل النهائية ، يجب أن يظل المخزن المؤقت للغسيل في آبار اللوحة ولا يتم التخلص منه إلا مباشرة قبل إضافة عينات إلى اللوحة. يجب استخدام غطاء لوحة بلاستيكية مكونة من 96 بئرا لتغطية جميع آبار لوحة ELISA التي لا يتم الاستغناء عنها على الفور ، ويتم تحريك الغطاء بالتتابع للكشف عن آبار إضافية ليتم ملؤها بالمواد.
  8. أغلق الألواح بغشاء بلاستيكي لاصق (انظر جدول المواد) وضعها في حاضنة لمدة 60 ± 5 دقائق عند 37 ± 2 درجة مئوية.
  9. قم بإعداد المنحنى القياسي وعينات الاختبار ليتم تقييمها خلال هذه الحضانة.
    ملاحظة: يجب تخفيف المستضد الذي يتم تقييمه مسبقا في محلول مخفف عند تخفيف موصى به يبلغ 0.125 وحدة دولية / مل ، مع حجم زائد لا يقل عن 40 ميكرولتر لحساب فقدان الماصة. يتم تقييم جميع العينات في نسختين (نسختان تقنيتان) على كل لوحة ELISA. بالنسبة للمنحنى القياسي ، يجب تضمين سلسلة تخفيف مزدوجة لما مجموعه ثماني نقاط في العمودين 2 و 3 من كل لوحة ELISA. يمكن إجراء سلسلة تخفيف لجميع العينات الأخرى بعدد مناسب من النقاط بناء على الكمية المتوقعة من المستضد الذي يتم تقييمه. على الرغم من أنه أقل صرامة للإنتاجية العالية ، يمكن استخدام تخفيف عينة واحدة كبديل للطلاء الموصوف أعلاه. ومع ذلك ، يجب أن يقع التركيز المتوقع للتخفيف الفردي ضمن نطاق المنحنى القياسي.
  10. في ألواح البروتين منخفضة الارتباط 96 بئرا ، أو أنابيب البروتين منخفضة الارتباط (انظر جدول المواد) ، قم بإجراء سلسلة تخفيف مزدوجة لكل عينة على طول أعمدة اللوحة.
  11. قم بتحميل بداية سلسلة التخفيف في الصف A لكل عينة على حدة بضعف الحجم النهائي المطلوب (لكل لوحة ، يلزم 100 ميكرولتر من العينة لكل بئر ، لذلك يجب أن تحتوي جميع الآبار في A2-A11 على 240 ميكرولتر على الأقل من العينة ، مع حجم إضافي يبلغ 40 ميكرولتر لحساب فقد الماصة).
  12. قم بتحميل 120 ميكرولتر من المخزن المؤقت المخفف في جميع الآبار الأخرى على لوحة البروتين منخفضة الارتباط ، باستثناء العمودين 1 و 12 (أي من B2 إلى H11).
  13. باستخدام ماصة متعددة القنوات محملة ب 10 أطراف ، قم بإجراء التخفيف التسلسلي عن طريق نقل 120 ميكرولتر من العينة من A2-A11 إلى B2-B11 وسحب السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات للخلط مع تجنب الرش والفقاعات. كرر هذه العملية ، وتحرك لأسفل اللوحة على طول الأعمدة حتى الآبار H2-H11. تخلص من الحجم المتبقي البالغ 120 ميكرولتر المستنشق من الصف الأخير من الآبار.
    ملاحظة: العينات جاهزة الآن للتحليل. إذا لم تكتمل مرحلة الحجب بحلول هذا الوقت ، فتأكد من حفظ العينات على الجليد.
  14. في نهاية خطوة الحضانة ، اغسل الألواح ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من محلول الغسيل.
  15. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، انقل 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المخفف إلى العمودين 1 و 12 ك "فراغات".
  16. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، انقل 100 ميكرولتر من كل بئر من لوحة البروتين منخفضة الارتباط 96 بئرا التي تحتوي على تخفيفات عينة إلى لوحة ELISA المغسولة. كرر لجميع لوحات ELISA التي يتم تشغيلها.
  17. أغلق الألواح بغشاء بلاستيكي لاصق وضعها في حاضنة لمدة 60 ± 5 دقائق عند 37 ± 2 درجة مئوية.
  18. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة للكشف (انظر جدول المواد) بتركيز 0.2 ميكروغرام / مل عن طريق إضافة 4.4 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد إلى 10,995.6 ميكرولتر من المخزن المؤقت المخفف واخلطه جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى ما مجموعه 11 مل ل 96 بئرا عند 100 ميكرولتر لكل منها (مع حجم إضافي لخسائر الماصات). قم بزيادة الحجم الإجمالي بمقدار 11 مل لكل لوحة ELISA إضافية يتم تقييمها. يجب استخدام الحل مباشرة بعد التحضير.
  19. في نهاية خطوة الحضانة ، اغسل الألواح خمس مرات باستخدام 200 ميكرولتر من محلول الغسيل.
  20. قم بشفط المخزن المؤقت المتبقي للغسيل ووزع 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة للكشف في كل بئر على الصفيحة الدقيقة باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  21. أغلق الألواح بغشاء بلاستيكي لاصق وضعها في حاضنة لمدة 60 ± 5 دقائق عند 37 ± 2 درجة مئوية.
  22. قم بإعداد المترافق في نهاية خطوة حضانة الأجسام المضادة للكشف عن طريق إضافة 4.4 ميكرولتر من محلول اقتران ستربتافيدين بيروكسيديز (انظر جدول المواد) إلى 10,995.6 ميكرولتر من محلول الغسيل.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى ما مجموعه 11 مل ل 96 بئرا عند 100 ميكرولتر لكل منها (مع حجم إضافي للسحب متعدد القنوات). قم بزيادة الحجم الإجمالي بمقدار 11 مل لكل لوحة ELISA إضافية يتم تقييمها.
  23. اغسل الأطباق خمس مرات باستخدام 200 ميكرولتر من محلول الغسيل.
  24. قم بنضح المخزن المؤقت المتبقي للغسيل ووزع 100 ميكرولتر من المحلول المترافق على كل بئر.
  25. أغلق الألواح بغشاء بلاستيكي لاصق وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 60 ± 5 دقائق عند 37 ± 2 درجة مئوية.
  26. قم بإعداد الركيزة أثناء خطوة الغسيل النهائية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). لكل لوحة ، قم بإذابة قرص واحد من o-phenylenediamine dihydrochloride (OPD ؛ انظر جدول المواد) في 9 مل من الماء منزوع الأيونات في الظلام ، ثم قم بتعبئة 1 مل من محلول بيروكسيد مستقر 10x. اضبط عدد الأقراص والحجم الإجمالي للمحلول (10 مل) وفقا لعدد اللوحات التي يتم تقييمها.
  27. اغسل الأطباق خمس مرات باستخدام 200 ميكرولتر من محلول الغسيل.
  28. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من الركيزة على كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  29. أغلق الألواح بغشاء بلاستيكي لاصق واتركها على المقعد لمدة 10-20 دقيقة ، محمية من الضوء ، باستخدام رقائق الألومنيوم.
    ملاحظة: راقب تطور اللون بصريا لتجنب التشبع.
  30. أضف 50 ميكرولتر من محلول التوقف إلى كل بئر ولوحة القراءة على الفور للامتصاص عند 492 نانومتر وامتصاص مرجعي يبلغ 620 نانومتر.
  31. حلل البيانات باستخدام قراءة الامتصاص المصححة (القراءة عند 492 نانومتر مطروحا منها القراءة عند 620 نانومتر) واطرح متوسط الفراغ من جميع العينات. استخدم طريقة الاستيفاء السيني 4PL لتحويل قيم الامتصاص إلى IU / mL. أخيرا ، اضرب في 250 ميكرولتر (إجمالي حجم العينة) للتحويل إلى وحدة دولية.
    ملاحظة: يمكن إجراء هذا التحليل باستخدام برنامج تحليل البيانات.

Representative Results

يعد ختم الجسيمات وتعبئتها من أهم الخطوات في هذا البروتوكول. تم ملء الجسيمات بملح الصوديوم الفلوريسئين لإظهار الملء المثالي وبعض الأخطاء الشائعة. تم استخدام ملح الصوديوم الفلوريسئين بدلا من مستضد RABV لسهولة التصور. أثناء التعبئة ، من المهم توزيع المحلول في قاع نوى الجسيمات ، ثم إتاحة الوقت الكافي لتبخر المذيب / الماء. بمجرد اكتماله، يبقى مستودع المذاب في قاع قلب الجسيمات (الشكل 1 أ). بمجرد ملئها ، من الأهمية بمكان إغلاق الجسيمات بشكل صحيح. يوضح الشكل 1B العديد من النتائج (الناجحة وغير الناجحة) لعملية الختم. بعد 12 ثانية من وقت الختم ، يبقى مسار مميز من مركز الجسيمات إلى خارج الجسيم ، مما يدل على جسيم غير مغلق تماما. على العكس من ذلك ، إذا تركت لتغلق لمدة 36 ثانية ، فإن PLGA يذوب بالكامل تقريبا ، مما ينتج عنه بنية مجهرية ذات مظهر جانبي ضحل. يمكن تصور التشكل المثالي عندما تكون الجسيمات محكمة الغلق لمدة 18 و 24 ثانية ، لأنها تحتوي على حمولة مغلفة بالكامل بواسطة البوليمر مع الحفاظ على بنية الجسيمات. يوضح الشكل 1C العديد من النتائج المحتملة بعد التعبئة والختم. أثناء الاستغناء ، إذا لم يصل المذيب إلى قاع الجسيمات ، فإنه يترك المذاب جافا في منتصف قلب الجسيمات (مملوء بشكل غير صحيح) ؛ على الرغم من أن هذه الجسيمات قد لا تزال محكمة الغلق ، إلا أن التحميل السيئ للبضائع يمكن أن يحد من كفاءة التحميل. إذا كانت الجسيمات مملوءة بالكثير من البضائع (ممتلئة بشكل زائد) ، يتم تثبيط عملية الختم ، حيث تمنع الشحنة PLGA من التدفق فوق الفتحة. عند ملئها وإغلاقها بشكل صحيح ، تكون جزيئات هذه الهندسة صغيرة بما يكفي لوضعها بسهولة داخل إبرة 19 جرام. علاوة على ذلك ، تدفقت 10 جزيئات باستمرار عبر إبرة 19 جم (100٪ ± 0٪) عند حقنها بمحلول لزج مثل 2٪ كربوكسي ميثيل السليلوز (الشكل التكميلي 7).

Figure 1
الشكل 1: المشاكل الشائعة في عملية التعبئة والختم . (أ) توضح الصور تبخر المذيب بعد دورة تعبئة واحدة؛ حيث تحمل الجسيمات 6 nL من 100 mg/mL فلوريسئين ملح الصوديوم الذائب في الماء. (ب) صور تمثيلية لجسيمات 502H PLGA التي تمت إزالتها من عملية الختم عند 0 و 12 و 18 و 24 و 36 ثانية. (ج) نتائج مختلفة لعملية الختم عندما تمتلئ الجسيمات بشكل صحيح أو غير صحيح أو ممتلئة بشكل زائد. يتم إنشاء الصور عن طريق التركيز البؤري على تكديس صور متعددة ودمجها باستخدام برنامج تكديس التركيز. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تعد معالجة المستضد من خلال مرشح الدوران قبل تحميله في الجسيمات أمرا مهما لسببين. أولا ، يعمل الطرد المركزي على إزالة سواغ المخزون في محلول اللقاح ، والذي يمكن أن يحد من قدرة تحميل الجسيمات مع الاحتفاظ بمستضد RABV. ينقي البروتوكول الحالي المستضد بمقدار 50 ضعفا تقريبا. ثانيا، يتركز مولد الضد أيضا خلال هذه العملية. يوضح الشكل 2 أ صورة مجهرية لفيروسات RABV السليمة في عينة المستضد المركزة. هذا المستضد أكثر تركيزا بحوالي 4.4 أضعاف من محلول المخزون الأولي (الشكل 2 ب). يمكن تغيير كمية المستضد التي تم تحميلها في البداية في مرشحات الدوران بالطرد المركزي لتعديل تركيز الطية النهائي الذي تم تحقيقه. على سبيل المثال ، يؤدي تحميل 40 ميكرولتر من مستضد المخزون إلى تركيز تقريبي يبلغ 1.75 ضعفا. يوضح الشكل التكميلي 8 أهمية الدوامة (الخطوة 5.15) في عملية التركيز. إهمال الدوامة أو دوامة العينات بشكل غير صحيح يحد من عملية التركيز.

Figure 2
الشكل 2: تركيز مولد الضد. تركيز المستضد عن طريق الترشيح بالطرد المركزي الموضح بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (A) وأكده ELISA (B). تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. يتم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبارات المقارنة المتعددة ل Tukey مع ANOVA أحادي الاتجاه. ** ف < 0.01 ، **** ف < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يوضح الشكل 3 أ مولد الضد المركز المملوء في جسيمات غير محكمة الغلق ومختومة. على الرغم من تحميل كمية كبيرة من المستضد في الجسيمات (0.0469 ± 0.0086 وحدة دولية) ، فإن هذه المادة تشكل <90٪ من سعة الجسيمات ، مما يترك مساحة واسعة لتحميل مستضد إضافي. ومن المثير للاهتمام أن الجسيمات غير المختومة تحتوي فقط على 0.0396 ± 0.0077 وحدة دولية ، والتي تشكل 85٪ فقط ± 16٪ من إجمالي الكمية المحملة. على الرغم من أن الخسارة غير ذات دلالة إحصائية ، إلا أن بعض مستضد RABV قد يكون قد تغير طبيعته أثناء الإماهة المتكررة والتجفيف في عملية التعبئة. بعد الختم ، يبقى 69٪ ± 5٪ من المستضد مغلفا في شكل نشط بيولوجيا. على الرغم من أن هذا يشير إلى حدوث خسارة كبيرة أثناء عملية الختم بسبب الإجهاد الحراري ، إلا أن معظم المستضد الفيروسي المعطل يظل سليما (الشكل 3 ب). يعد التغليف المشترك لسواغ التثبيت جنبا إلى جنب مع المستضد إحدى الاستراتيجيات الممكنة لزيادة استقرار المستضد طوال عملية التصنيع ، وقد نجح سابقا مع مستضدات الفيروسات المعطلة الأخرى14,15.

Figure 3
الشكل 3: مستضد RABV النشط بيولوجيا بعد تصنيع الجسيمات . (أ) تظهر الصور جسيمات غير مختومة ومختومة تحتوي على مولد ضد RABV. (ب) استقرار مولد الضد من خلال عملية تصنيع الجسيمات (ن = 4). يتم إنشاء التحكم في التحميل عن طريق توزيع المستضد مباشرة في المحلول. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يتم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبارات المقارنة المتعددة ل Tukey مع ANOVA أحادي الاتجاه. * ص < 0.05. يتم إنشاء الصور عن طريق التركيز البؤري على تكديس صور متعددة ودمجها باستخدام برنامج تكديس التركيز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: أبعاد الجسيمات والأبعاد الإيمانية والصفيف. يوضح الشكل الخصائص الهندسية للنجم الإيماني رباعي الرؤوس (A) ، والجسيمات الدقيقة الأسطوانية (B) ، والنجم الخماسي (C) ، ومجموعة من الجسيمات ذات fiducials (D) المعروضة في برنامج CAD. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: يوضح هذا الشكل مقطعا عرضيا للهيكل موضوعا في الفرن لعلاج قوالب PDMS. تشير الأسهم إلى مكان تطبيق مشابك الموثق. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: التقنية المناسبة لاستعادة مولد الضد المركز بكفاءة. في نهاية الدوران الأول ، يتم الاحتفاظ بالعينة المركزة المحاطة بدائرة باللون الأحمر (A) في المرشح ، بينما يتم جمع المرشح في قاع أنبوب التجميع (أنبوب خارجي أكبر). لإعادة تعليق المستضد المحبب ، يتم تغطية وحدة مرشح الطرد المركزي باستخدام أنبوب التجميع (B) استعدادا للدوامة. عند الدوامة ، يتم الاحتفاظ بطرف الأنبوب على اتصال مع وسادة الدوامة ويتم تدوير طرف الغطاء مع الحفاظ على زاوية 45 درجة مع وسادة الدوامة (C). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: موزع كهرضغطية للبرمجة قبل التشغيل. (أ) قم بإعداد "البحث عن النقاط المرجعية المستهدفة" بالانتقال من "علامة التبويب الرئيسية" إلى إعداد الروبوت > وظيفة متنوعة >Div. > البحث عن النقاط المرجعية المستهدفة. استخدم الأزرار المميزة باللون الأزرق لتعيين العلامات الائتمانية. أولا ، حدد تعلم القالب وارسم مربعا حول علامة الاهتمام الائتمانية ، وتحقق من دقة القالب بالنقر فوق قالب البحث ، واحفظ القالب. قم بذلك للنجوم الأربعة والخماسية ، واحفظ أسماء الملفات وفقا للإرشادات الموجودة ضمن استخدام صورتين مختلفتين للقالب. بعد ذلك ، تأكد من تطابق جميع المعلمات في المربعات السوداء. قم بتحميل النجمة الإيمانية الرباعية باستخدام قالب التحميل (المربع الأخضر). احفظ برنامج "البحث عن النقاط المرجعية المستهدفة" عن طريق تحديد قائمة المهام (المربع البرتقالي). (ب) قم بإعداد ملف تشغيل بالانتقال إلى إعداد الروبوت > المهام علامة التبويب ، ثم قم بتحميل تسلسل المهام الموضح في المربع الأزرق عن طريق إضافة مهام من قائمة المهام (المربع الأسود) باستخدام المهمة في تشغيل التحديدات (المربع الأخضر). أخيرا ، احفظ المهمة (المربع البرتقالي). (ج) قم بإعداد "الركيزة المستهدفة" بالانتقال إلى إعداد الروبوت > الركيزة المستهدفة ، ثم أضف هدفا (المربع الأزرق). (د) أدخل المعلمات الموضحة هنا وحدد حفظ (المربع الأزرق). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 5: تحميل مولد الضد ومعايرة محاذاة الإنفاق. (أ) انتقل إلى علامة التبويب إعداد الفوهة > Do Task وقم بشفط 10 ميكرولتر من المستضد في طرف التوزيع عن طريق تحديد TakeProbe10 uL (الصندوق الأسود) والنقر فوق DO (الصندوق الأسود). (ب) هذا يفتح نافذة منفصلة. حدد البئر الذي تم تحميل المستضد المركز فيه وحدد موافق (المربع الأزرق). (ج) بعد شفط مولد الضد، اغسل الطرف باختيار المربع الأزرق، وكرر هذا الغسول مرتين أخريين. حدد الكاميرا (الصندوق الأسود) وحدد مستوى صوت الانخفاض عن طريق تحديد انخفاض مستوى الصوت (المربع الأخضر). تأكد من تشكل انخفاض مستقر مع انحراف معياري للحجم (٪) <2 (مربع برتقالي). (د) سيؤدي اتباع هذه الخطوات إلى فتح Snap Drop Cam ؛ حدد صورة (مربع أزرق) في القائمة المنسدلة وحدد معالج كاميرا رأس الفوهة. هذا يفتح نافذة جديدة. نفذ التسلسل التالي من الخطوات بسرعة. (ه) تأكد من تحميل الهدف المحدد في الشكل التكميلي 4 ، ثم حدد نقل إلى الهدف (المربع الأزرق). اضبط القطرات على 15 وحدد Spot (الصندوق الأسود). بمجرد رصدها ، حدد على الفور نقل (المربع الأخضر). تأكد من تحديد البحث التلقائي وحذف حجم الجسيمات = 12 ، ثم انقر فوق ابدأ (مربعات برتقالية). إذا فشل الاكتشاف التلقائي ، كرر هذه العملية بعد الانتقال إلى منطقة مختلفة على الشريحة (المربع الأرجواني). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 6: برمجة مصفوفة اكتشاف وبدء التشغيل. (أ) انتقل إلى إعداد الهدف > الهدف ، ثم املأ المعلمات الموضحة في المربع الأزرق. (ب) بعد ذلك ، انتقل إلى "علامة التبويب إعداد الحقل" وأدخل 20 في لا. من حقل الإسقاط (الصندوق الأزرق) ، حدد بئرا (الصندوق الأسود) ، ثم حدد الأهداف / الجسيمات لتوزيعها (الصندوق الأخضر). من خلال اختيار بئر مختلف وإعادة تحديد الأهداف / الجسيمات ، يتم إجراء دورات تعبئة إضافية خلال تشغيل واحد. (ج) على الشاشة الرئيسية ، تأكد من تحديد التشغيل والهدف الذي تم إنشاؤه في الشكل التكميلي 5 . (د) انتقل إلى "علامة التبويب تشغيل" وحدد بدء التشغيل (المربع الأزرق). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 7: حقن الجسيمات الدقيقة. (أ-ج) صور مجسمة مكدسة بالتركيز للجسيمات الدقيقة المملوءة بملح الصوديوم الفلوريسئين ومختومة بإبرة 19 جرام. (د) حقن ما مجموعه 10 جسيمات من خلال إبرة 19 G باستخدام محلول كربوكسي ميثيل السليلوز 2٪ (ن = 8). شريط المقياس = 1 مم. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 8: المشكلات المحتملة المتعلقة بتركيز مولد الضد. يشير الخط الأحمر إلى الزيادة المتوقعة في التركيز. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبارات المقارنة المتعددة ل Tukey مع ANOVA. ف < 0.001 ، **** ف < 0.0001. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: إعداد المخازن المؤقتة والحلول ل RABV ELISA. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 1: ملف STL يحتوي على مجموعة جسيمات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 2: ملف STL يحتوي على هندسة لحامل الشريحة المخصص المستخدم لختم الجسيمات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

من الممكن تغيير هندسة الجسيمات لتلبية احتياجات محددة ؛ ومع ذلك ، بالنسبة للهياكل الأسطوانية ، يوصي المؤلفون بالحفاظ على نسبة 5: 4: 1 من الارتفاع: القطر: سمك الجدار الموصوف في البروتوكول. تضمن نسبة العرض إلى الارتفاع هذه وجود مادة PLGA كافية لإغلاق الجسيمات وتظل قوية ميكانيكيا بما يكفي للمناولة. يمكن بسهولة تغيير أبعاد وأشكال الجسيمات أثناء عملية CAD ، مما يتيح إنشاء عدد لا يحصى من الأشكال الهندسية. يتيح الجمع بين مرونة CAD والطباعة ثلاثية الأبعاد 3D التكرار السريع لتصميمات الجسيمات الدقيقة. على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم طابعة ثلاثية الأبعاد متعددة الفوتونات ، إلا أنه يمكن استخدام أي طابعة ثلاثية الأبعاد بمواصفات قادرة على طباعة أبعاد البنية المجهرية في مادة مناسبة لإنشاء القالب الرئيسي الأولي. علاوة على ذلك ، تم استخدام الطباعة الحجرية الضوئية سابقا لجعل هياكل مماثلة في صفائف أكبر بكثير من تلك المنتجة في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، فإن العمالة ، والتأخير في طلب الأقنعة الضوئية المصنوعة حسب الطلب ، وإمكانية الوصول إلى المعدات من شأنه أن يبطئ عملية التصميم التكراري16. أخيرا ، يمكن الاستعانة بمصادر خارجية لتوليد القوالب الرئيسية لشركات الرسوم مقابل الخدمة إذا لم يكن تصنيع القوالب الرئيسية الداخلية ممكنا. بغض النظر عن طابعة 3D أو الطريقة المستخدمة لإنشاء القوالب الرئيسية ، فإن التصاق الطباعة بالركيزة أمر بالغ الأهمية لخطوات المصب. على وجه التحديد ، إذا كان الالتصاق غير كاف أثناء إنشاء قالب PDMS ، فستظل الجسيمات المطبوعة موجودة في قالب PDMS ، مما يتطلب إزالة يدوية للجسيمات المطبوعة وتدمير القالب الرئيسي.

ملء الجسيمات هو جانب مهم آخر يجب مراعاته. تتمتع الجسيمات الدقيقة بقدرات تعبئة محدودة ، لذلك يتم استخدام الترشيح ليس فقط لتركيز مستضد RABV ولكن أيضا لإزالة سواغ المخزون التي من شأنها أن تشغل جزءا كبيرا من حجم الجسيمات الدقيقة. ومع ذلك ، نظرا للحجم الكبير لمستضد RABV (حوالي 60 نانومتر × 180 نانومتر) 17 ، فمن الممكن إخراج المستضد جزئيا أثناء خطوات الطرد المركزي. لهذا السبب ، من المهم إعادة تعليق المستضد عن طريق السحب أو الدوامة بعد الطرد المركزي لتحقيق استرداد عالي لمستضد RABV. يعتبر المحلول عالي التركيز مثاليا للتوزيع ، لأنه يقلل من دورات التوزيع وبالتالي يحد من تدهور المستضد أثناء التعبئة. ومع ذلك ، فإن اللزوجة هي أحد القيود الرئيسية على روبوتات التوزيع الكهرضغطية التي تشكل قطرة مستقرة ، لذلك قد لا يكون الاستغناء عن محلول عالي التركيز ممكنا أو مستحسنا. يعد تخفيف محلول التعبئة أسهل طريقة لتحقيق تكوين قطرة مستقر ، ولكن يجب مراعاة استقرار المستضد خلال دورات التعبئة الإضافية اللازمة لتحقيق التحميل المطلوب ومقدار الوقت الأطول المطلوب لملء الجزيئات.

القيود
تتطلب هذه الطريقة معدات عالية التخصص لإنتاج القوالب الأولية وأداة تعبئة متخصصة لإنتاج الجسيمات الدقيقة. على الرغم من أن الحاجة إلى طابعة 3D بدقة طباعة قادرة على توليد القوالب الرئيسية الأولية يمكن تخريبها من خلال نهج الرسوم مقابل الخدمة ، إلا أن إمكانية الوصول إلى روبوت توزيع كهرضغطية محدودة. يتطلب شراء روبوت توزيع كهرضغطية استثمارا أوليا كبيرا مقدما ، غالبا في حدود 80,000 ألف دولار إلى 200,000 ألف دولار ، اعتمادا على العلامة التجارية والإنتاجية والقدرات. على الرغم من أن العديد من طرق التعبئة الأخرى هي بدائل محتملة ، إلا أن هذه الطرق لم يتم التحقق من صحتها باستخدام مستضد RABV12.

التطبيقات المستقبلية
ظلت نسبة كبيرة من مستضد RABV المغلف مستقرة خلال عملية الختم. من الناحية النظرية ، من خلال دمج هذا المستضد في جزيئات تتكون من أنواع مختلفة من PLGA تحاكي الجدول الزمني لإدارة العلاج الوقائي بعد التعرض ، يمكن إعطاء جميع الجرعات في حقنة واحدة. سيؤدي التخلص من الحاجة إلى تكرار زيارات المستشفى لإدارة جرعات إضافية إلى تعزيز امتثال المريض ، مما يؤدي إلى نتائج علاجية أفضل. علاوة على ذلك ، بعد إثبات القدرة على الاحتفاظ بتفاعل ELISA لفيروس داء الكلب المعطل المعقد للغاية ، من المحتمل أن تكون المستضدات الأخرى ، بما في ذلك لقاحات الوحدات الفرعية ، متوافقة مع طريقة التغليف هذه. يمكن أن يؤدي استخدام مستضدات وقائية أخرى مع الجسيمات الدقيقة النبضية إلى إنقاذ ملايين الأرواح في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل عن طريق زيادة معدلات التطعيم للسكان الذين لم يتم تطعيمهم بشكل كاف. ومع ذلك ، لتحقيق ذلك ، يجب أن تظل اللقاحات مستقرة ليس فقط من خلال التغليف ولكن أيضا من خلال الإطلاق ، الأمر الذي قد يكون صعبا لأن الحمولة ستخضع لدرجات حرارة مرتفعة وبيئة دقيقة حمضية محتملة بسبب حرارة الجسم ومنتجات تحلل PLGA18. سيتبع العمل المستقبلي استراتيجيات استقرار المستضد من خلال الإطلاق ، مما سيفتح إمكانية وجود منصة تطعيم بحقنة واحدة قابلة للتطبيق على نطاق واسع للوقاية من العديد من الأمراض المعدية.

Disclosures

الدكتور ماكهيو لديه براءة اختراع مقدمة بناء على العمل الشامل وهو حاليا مستشار للجسيمات من أجل الإنسانية. السيد غراف لديه براءة اختراع مودعة بناء على العمل الشامل. الدكتور كاداسيا والسيد يانغ والسيدة برادي هم جزء من Particles for Humanity ، وهي شركة ذات منفعة عامة قامت بترخيص تقنية مماثلة لتوصيل لقاح الجسيمات الدقيقة من معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا خلال هذا العمل.

Acknowledgments

نشكر Chiron Behring و Bharat Biotech International على تزويد الجسيمات للبشرية بمستضد RABV. نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لتشارلز روبريخت ، VMD ، MS ، PhD. ، لتوجيهاته ومساهماته الفنية التي لا تقدر بثمن. يود المؤلفون أن يشكروا كرم الدكتورة ريبيكا ريتشاردز كورتوم للسماح باستخدام جهاز توزيع بيكولتر SciFLEXARRAYER S3 وتعليمات الدكتورة تشيلسي سميث حول استخدام الجهاز. كما نعترف بكلية الطب بجامعة ماساتشوستس تشان لتوليد صور مجهرية لمستضد داء الكلب. وأخيرا، نشكر دون تشيكرينغ وإيرين يوليانو على مراجعة الوثيقة قبل تقديمها. تم دعم هذا العمل بمنحة (INV-004360) من مؤسسة بيل وميليندا غيتس.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm PES filter Cole-Parmer+B4B2:B63 04396-26
0.25 mm Shims McMaster Carr 98090A935
0.75 inch Binder Clips Staples 480114
10 mL Syringe Becton, Dickinson and Company 309604
10 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Fisherbrand 13-678-11E
101.6 mm C-Clamp Amazon PT-SD-CP01A Black handle will eventually fall off. Use pliers to adjust once this happens.
19 G needle EXCELINT 26438
25 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Fisherbrand 13-678-11
3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylate  Millipore Sigma M6514-25ML
5 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Eppendorf 22431081
50 mL Centrifuge Tubes Corning  352098
50 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe Fisherbrand 13-678-11F
Acetone Fisher AC268310010
Aluminum Block McMaster Carr 9057K175
Aluminum Foil VWR 89079-069
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters, 100 kDa Millipore Sigma C82301
Anti-Rabies Virus Antibody, Serum Free Antibody, clone 1112-1, 100 Fisherbrand 13-678-11D
Anti-Rabies Virus Mouse Monoclonal Antibody, Clone D1-25, biotinylated Fisherbrand 14-388-100
Carboxymethyl Cellulose Tokyo Chemical Industries C0045
ClipTip 300, Filter, Racked Fisherbrand 13-678-11
Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning  3206
Costar 1.7 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube Corning  3207
Describe Nanoscribe Software used to define the printing parameters for Nanoscribe 3D printer is step 1.2.
Software provided with the printer.
Desiccator Fisher Scientific 10529901 Or equivalent
Double-Sided Tape Staples 649280
DPBS (10x), No Calcium, No Magnesium Gibco 14200075
Ethanol VWR 89370-084
F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 to 300 µL Fisherbrand 13-678-11E
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 0.1 – 10 µL Fisherbrand 13-678-11F
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 100 – 1000 µL Fisherbrand 03-448-17
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 2 – 20 µL Fisherbrand FB14955202
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 20 – 200 µL Fisherbrand 13-374-10
Fisherbrand Elite Pipette Kit Fisherbrand 05-408-137
Fisherbrand Pipet Controller  Fisherbrand FB14955202
Glass Petri Dish, 90 mm VWR 470313-346
Glass Slides Globe Scientific 1380-10
Helicon Focus 8 HeliconSoft Software used to focus stack images
IP-Q Resin Nanoscribe Printer resin is compatable with the 10x lens and is used for printing large microstructures on the Nanoscribe Photonic Professional GT2
Lascar EL-USB-TC-LCD Thermocouple Amazon 5053485896236 Or equivalent
Microscope Slide Box Millipore Sigma Z374385-1EA Or equivalent
Nanoscribe Photonic Professional GT2 with 10X Objective Nanoscribe
NanoWrite Nanoscribe Software used to interface with nanoscrive 3D printer.
Software provided with printer.
Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate Invitrogen 44-2404-21
OPD Substrate Tablets (o-Phenylenediamine Dihydrochloride) Fisherbrand 02-707-432
Parafilm M Wrapping Film, 4 in. Fisherbrand 13-374-10
PDC 60 with Type 3 Coating Scienion P-2020
PDMS Particle Molds Rice University n/a N/A- Particles are 400 μm in diameter with a wall thickness of 100 μm, and a height of 500 μm, resulting in an inner diameter of 200 μm. The arrays are 14 x 22 particles spaced 600 μm apart from each other. 4- and 5-point stars are used as fiducials, positioned 600 μm to the right and left of the top right and top left particles on the array.
Petri Dish Fisher Scientific 08-757-100D
Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x) Fisherbrand 02-707-430
Plastic Cups Fisher Scientific S04170
PLGA Film, 502H Sigma 502H: 719897-1G
Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate Millipore Sigma 484431
Rabies Antigen Chiron Behring and Bharat Biotech International Material was acquired by entering into a materials transfer agreement with the company.
Razor Blades VWR 55411-050
Scalpel VWR 21899-530 and 76457-512
SciFLEXARRAYER S3 with PCD 60 Scienion Or equivalent
Sealing Tape for 96-Well Plates Thermo Scientific 15036
Silicon Wafer University Wafer 1025
Spring Clamps IRWIN VGP58100
Stainless Steel Block McMaster Carr 9083K12
Streptavidin−Peroxidase Polymer, Ultrasensitive Fisherbrand 02-707-404
Sylgard 184 DOW 2646340
Teflon Sheet McMaster Carr 9266K12 Used to make PLGA films. Must be cut into appropriately sized pieces.
Teflon Sheet, 0.8 mm-thick McMaster Carr 9266K81
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silane Sigma 448931-10G
Tweezers  Pixnor ESD-16
UltraPure Distilled Water Fisher Scientific 10977015
UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker UVP 95-0174-01 Or equivalent
Vacuum Desiccator Bel-Art F420100000 Note you will need two of these. One will be used exclusively to pre-treat samples with trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane to prevent contamination.
Vacuum Oven Capable of Reaching 120 °C VWR 97027-664 Or equivalent
Vacuum, CRVpro4  Welch 3041-01 Or equivalent
Wooden Tongue Depressors Electron Microscopy Sciences 72320

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, X. Estimating the health impact of vaccination against ten pathogens in 98 low-income and middle-income countries from 2000 to 2030: a modelling study. The Lancet. 397, 398-408 (2021).
  2. Euliano, E. M., Sklavounos, A. A., Wheeler, A. R., McHugh, K. J. Translating diagnostics and drug delivery technologies to low-resource settings. Science Translational Medicine. 14 (666), eabm1732 (2022).
  3. Haider, S. Rabies: old disease, new challenges. Canadian Medical Association Journal. 178 (5), 562-563 (2008).
  4. Fisher, C. R., Streicker, D. G., Schnell, M. J. The spread and evolution of rabies virus: conquering new frontiers. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 241-255 (2018).
  5. Nagarajan, T., Rupprecht, C. E. Rabies and Rabies Vaccines. , Springer International Publishing. (2020).
  6. Shi, T., Dunham, E. F., Nyland, J. E. Rabies vaccination compliance and reasons for incompletion. The Western Journal of Emergency Medicine. 21 (4), 918-923 (2020).
  7. Shankaraiah, R. H., Rajashekar, R. A., Veena, V., Hanumanthaiah, A. N. D. Compliance to anti-rabies vaccination in post-exposure prophylaxis. Indian Journal of Public Health. 59 (1), 58-60 (2015).
  8. Cleland, J. L. Single-administration vaccines: controlled-release technology to mimic repeated immunizations. Trends in Biotechnology. 17 (1), 25-29 (1999).
  9. Yeh, M. K., Coombes, A. G. A., Jenkins, P. G., Davis, S. S. A novel emulsification-solvent extraction technique for production of protein loaded biodegradable microparticles for vaccine and drug delivery. Journal of Controlled Release. 33 (3), 437-445 (1995).
  10. Peyre, M., Sesardic, D., Merkle, H. P., Gander, B., Johansen, P. An experimental divalent vaccine based on biodegradable microspheres induces protective immunity against tetanus and diphtheria. Journal of Pharmaceutical Sciences. 92 (5), 957-966 (2003).
  11. Mvan de Weert, M., Hennink, W. E., Jiskoot, W. Protein instability in poly(lactic-co-glycolic acid) microparticles. Pharmaceutical Research. 17 (10), 1159-1167 (2000).
  12. Graf, T. P., et al. A scalable platform for fabricating biodegradable microparticles with pulsatile drug release. Advanced Materials. , https://doi.org/10.1002/adma.202300228 e2300228 (2023).
  13. Wang, Y., Qin, B., Xia, G., Choi, S. H. FDA's poly (lactic-co-glycolic acid) research program and regulatory outcomes. The American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 23 (4), 92 (2021).
  14. Wan, Y. Development of stabilizing formulations of a trivalent inactivated poliovirus vaccine in a dried state for delivery in the NanopatchTM microprojection array. Journal of Pharmaceutical Sciences. 107 (6), 1540-1551 (2018).
  15. Smith, T. G., Siirin, M., Wu, X., Hanlon, C. A., Bronshtein, V. Rabies vaccine preserved by vaporization is thermostable and immunogenic. Vaccine. 33 (19), 2203-2206 (2015).
  16. McHugh, K. J. Fabrication of fillable microparticles and other complex 3D microstructures. Science. 357 (6356), 1138-1142 (2017).
  17. Sanchez, M. E. N. Rabies vaccine characterization by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 8149 (2020).
  18. Fu, K., Pack, D. W., Klibanov, A. M., Langer, R. Visual evidence of acidic environment within degrading poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres. Pharmaceutical Research. 17 (1), 100-106 (2000).

Tags

القيمة الفارغة ، العدد 195 ، الإطلاق الخاضع للرقابة ، التسليم النابض ، بولي (حمض اللاكتيك المشترك في الجليكوليك) ، داء الكلب ، ELISA ، الوقاية بعد التعرض ، التطعيم
تصنيع الجسيمات الدقيقة البوليمرية النابضة التي تغلف مستضد داء الكلب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Graf, T. P., Kadasia, K., Melhorn,… More

Graf, T. P., Kadasia, K., Melhorn, S., Kessler, E., Yang, H., Baryakova, T., Brady, S., McHugh, K. J. Fabrication of Pulsatile Polymeric Microparticles Encapsulating Rabies Antigen. J. Vis. Exp. (195), e65147, doi:10.3791/65147 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter