Summary
该方法描述了将狂犬病抗原封装到具有结构和材料特性的可生物降解聚合物微粒中,这些微粒能够在预定延迟后实现脉动释放。对从颗粒核心回收的抗原进行酶联免疫吸附测定 (ELISA) 评估,通过颗粒制造证实存在完整的三聚体狂犬病病毒糖蛋白。
Abstract
目前的狂犬病暴露后预防指南要求在数周内进行多次注射。这对生活在低收入和中等收入国家(LMICs)的人来说可能是不成比例的负担,大多数致命的狂犬病暴露都发生在这些国家。已经探索了不同的药物递送策略,通过将抗原封装到聚合物颗粒中,将疫苗方案浓缩为单次注射。然而,包封过程中的苛刻应力源会导致包封抗原变性。本文介绍了一种将狂犬病病毒 (RABV) 抗原包封到聚合物微粒中的方法,这些微粒表现出可调脉动释放。这种方法被称为均匀液化和密封以封装药物的颗粒(PULSED),使用软光刻技术产生微粒,以从多光子,3D打印母模中产生反向聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具。然后将聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)薄膜压缩成型到PDMS模具中,以产生使用压电点胶机器人填充浓缩RABV的开口圆筒。然后通过加热颗粒顶部来密封这些微观结构,使材料流动并形成连续的无孔聚合物屏障。制造后,使用特异性于检测完整三聚体狂犬病病毒糖蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)来确认免疫原性抗原从微粒中的高回收率。
Introduction
疫苗接种是一种极其有效的医疗保健工具,在2000年至2019年期间防止了3700多万人死亡1。尽管有这种有效性,但疫苗可预防的疾病继续对全球健康构成重大风险,特别是在低收入和中等收入国家,这些国家的未接种疫苗和疫苗接种不足率高,每年导致150万人死于疫苗可预防的死亡2。狂犬病也不例外。尽管狂犬病是人类已知的最致命的疾病,几乎普遍致命,但它是完全可以治疗的,并在许多高收入国家被归类为根除狂犬病。相反,生活在亚洲和非洲部分地区的人们不成比例地承担狂犬病的负担,该疾病对人类和牲畜造成毁灭性后果3,4。
疫苗接种对于管理狂犬病的全球影响至关重要5.考虑到该疾病的总体发病率较低,疫苗接种的成本禁止广泛实施暴露前预防(PrEP)。此外,在中低收入国家,暴露后预防(PEP)的效用受到寻求医疗保健的患者的社会经济压力的限制。后勤因素,例如到医疗保健接入点的旅行距离、获得治疗时的工资损失、治疗费用、干扰日常活动的预约和健忘,导致 PEP 依从率低至 60%6,7。这种高患者流失率为改进方法以解决狂犬病疫苗接种方面的差距以对抗该疾病提供了机会。
已经探索了控制抗原释放的单次注射(SI)疫苗接种系统,作为一次注射获得完全免疫的方法。消除多次访问医疗保健提供者的需要减轻了阻止个人寻求适当护理的负担。为了实现SI疫苗接种,抗原通常被封装在可生物降解的聚合物基质中,该基质通常采用可注射微粒的形式。一旦注射,聚合物降解并释放螯合的抗原。迄今为止,已经采取了两种主要释放策略来实现SI疫苗接种。在一种方法中,抗原在较长时间内连续释放。虽然旨在增强单次注射的免疫原性,但尚不清楚这种方法是否足以引起人类对狂犬病病毒(RABV)的保护性免疫反应8。另一种情况下,抗原在预定延迟后释放,以模仿常规且经过验证的初免加强疫苗方案。喷雾干燥和基于乳液/溶剂蒸发的微粒制造方法展示了前一种策略,并已成功包封模型疫苗9和高稳定性抗原,例如破伤风类毒素10。然而,这些封装方法涉及压力源,包括热、溶剂相互作用和物理力,这些压力会使抗原变性11。
均匀液化和密封以封装药物的颗粒(PULSED)是最近开发的一种制造方法,可用于将生物制剂封装在可生物降解的微粒中。微成型用于产生充满液体有效载荷并加热的颗粒,以使聚合物回流并完全封装在可生物降解聚合物的连续层内。这种微观结构导致有效载荷的脉冲释放,其持续时间取决于聚合物壳12的降解速率。本手稿演示了灭活的 RABV 封装在由聚(乳酸-共乙醇酸)(PLGA)(一种用于许多 FDA 批准的配方中的可生物降解聚合物13)组成的微粒中,使用 PULSED 制造方法来封装通过酶联免疫吸附测定 (ELISA) 评估的稳定 RABV 抗原。通过将具有不同分子量和/或端基的PLGA颗粒相结合,这种方法有可能模仿单次注射后的当前狂犬病疫苗接种时间过程。
Protocol
1. 颗粒母模生成
注意:3D打印过程可以使用任何具有足够空间分辨率的3D打印机执行;然而,目前的协议描述了多光子3D打印机的过程。
- 使用计算机辅助设计(CAD)程序设计微粒结构。
注意:设计规格如下:308 个颗粒(直径 = 400 μm,高度 = 500 μm,壁厚 = 100 μm)排列在 22 x 14 阵列中,它们之间的间距为 600 μm。该设计还包含一个四角星和一个五角星作为紧邻阵列外部的基准点(补充图 1)。 - 将最终设计导出为 STL 文件(补充编码文件 1),并将文件上传到能够定义打印参数的软件,如下所示。然后,将其另存为与3D打印机兼容的文件(请参阅 材料表)。
注意:切片距离 = 5 μm,孵化距离 = 1 μm,壳轮廓 = 50 μm,基础切片计数 = 5 μm,脚手架 = 空心,扫描模式 = 振镜,z 轴 = 显微镜 z 驱动,扫描速度 = 100,000,功率 = 100。 - 使用等离子清洗工艺(气体:O2;功率:200瓦;温度:25°C;流量:20;时间:5分钟)对硅印刷基板(见材料表)进行预处理,然后立即将基板浸入玻璃培养皿中的30mL乙醇和60μl3-(三甲氧基硅烷基)甲基丙烯酸丙酯的溶液中。用铝箔覆盖,孵育过夜。
注意:此步骤增加了印刷对基材的附着力,这在PDMS分离过程中很重要(步骤2.6)。 - 将打印文件上传到多光子3D打印机,将打印树脂涂在处理过的基材上,加载10倍镜头(见 材料表),然后打印微观结构。
- 完成后,将打印件浸入丙二醇甲醚醋酸酯(参见 材料表)中45分钟以除去未曝光的光刻胶,然后将印刷品浸入异丙醇中5分钟。通过将母模暴露在 254 nm 的紫外线下 120 分钟来对母模进行后固化。
注意:如果可用,可以使用 405 至 365 nm 范围内的紫外线 ~20 分钟对印刷结构进行后固化。
2. 聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具生成
- 通过将 3D 打印母模的表面放入包含载玻片的真空室中处理 3D 打印母模的表面,并向表面添加 40 μL 三氯(1H,1H,2H,2H,-全氟辛基)(参见 材料表)硅烷。拉真空(相对压力:-20 英寸。Hg)1小时。
注意:此步骤可确保在脱模时易于分离(步骤2.6)。 - 在处理母模表面时,将聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚物基料与PDMS预聚物固化剂以9:1的质量比充分混合(每个母模至少需要10g材料)。完全混合后,将未固化的PDMS转移到50 mL离心管中,并在室温下以300 x g 离心3分钟。
- 表面处理完成后,将母模放入铝箔盘中,将未固化的PDMS倒在模具顶部,确保特征完全浸没。将铝箔盘放入真空室并拉动真空(相对压力:-20 in.Hg)1小时以去除气泡。
- 从真空室中取出铝箔盘。将 800 μm 垫片放在母模的末端,并将干净的载玻片覆盖在母模上,注意避免引入气泡。使用粘合剂夹将模具和滑块夹在一起,将锁模力定位在垫片上(补充图2)。
- 将结构置于设置为120°C的烘箱中至少4小时,以将预聚物固化到PDMS模具中。
- 从烤箱中取出结构,小心地释放粘合剂夹,并使用剃须刀片小心地将母模与固化的PDMS模具分开。
注意:3D 打印母模可以重复使用以生成其他 PDMS 模具。
3. PLGA薄膜制造
- 称取 450 mg PLGA(见 材料表),并将其放置在 76 mm x 76 mm 的不粘聚合物片上,位于 250 μm 厚的环垫片内,内径为 50.8 mm。将第二块不粘聚合物片放在 PLGA 上,并使用 101.6 mm C 形夹压缩两个铝块之间的堆栈,直到手指拧紧。
注:502H PLGA仅用于本研究;但是,其他类型的 PLGA 与此过程兼容。 - 将c夹紧组件置于真空下设置为120°C的真空烘箱中30分钟,相对压力为-30英寸汞柱。然后,卸下组件并牢固地拧紧夹子,然后将其放回真空烤箱中再放置 30 分钟。
注意:使用真空的主要目的是避免PLGA降解,PLGA在高温下会加速降解。 - 从烤箱中取出组件,让它在干燥器中冷却4小时。
- 冷却后,松开夹子,从不粘聚合物片上取下PLGA膜,然后将膜放入标记的培养皿中。将培养皿储存在干燥器内以备后用。
4. PLGA粒子生成
- 按照前面的步骤2.1中所述处理PDMS模具的表面。
- 使用镊子和/或手术刀,切出并将250μm PLGA薄膜的一部分(大致与阵列的大小)放在处理过的PDMS模具上。
- 将干净的玻璃显微镜载玻片覆盖在PLGA薄膜和PDMS模具的顶部,并通过将弹簧夹直接放在阵列和PLGA薄膜上将组件夹紧在一起。
- 将夹紧的模具组件放入设置为120°C的真空炉中,并以-30英寸的相对压力拉真空。汞1小时。
注意:形成颗粒所需的时间取决于PLGA,可以从1-12小时不等。 - 从烤箱中取出夹紧的模具组件,让它在室温下被动冷却约 15 分钟,或直到触摸冷却。
- 使用剃须刀片,在PDMS模具和PLGA颗粒阵列之间轻轻施加压力,以将两者分开。将PLGA颗粒储存在干燥器中以备将来使用。
5. 抗原浓缩和纯化
- 在室温下解冻一等分试样的市售RABV抗原(见 材料表)。
- 通过将两个截止分子量为 100 kDa (MWCO;参见 材料表) 的离心离心过滤器放入两个收集管中来组装过滤装置。
- 通过加入 500 μL 超纯水预润湿两个离心旋转过滤器。
- 在室温下以2,400× g 旋转过滤器在台式离心机中旋转1分钟。
- 使用 200 μL 移液器从过滤装置的顶部和底部隔室中取出水。
注意:不要让预润湿的旋转过滤器变干。 - 向每个离心过滤器的顶部隔室中加入 400 μL 蒸馏水,然后加入 100 μL 解冻的 RABV 抗原并与移液器混合。
注意:本研究将抗原浓缩约五倍,并将赋形剂的浓度<100 kDa降低~50倍。 - 将两个离心旋转过滤器装入台式离心机中,确保过滤器面向离心机的中心。标记过滤器的哪一侧朝向离心机的中心。
注意:如果方向不正确,溶液将无法正确过滤/浓缩。 - 在室温下以14,000× g 离心过滤器10分钟。
- 从离心机中取出过滤器。收集管将包含滤液,而过滤器将包含浓缩样品(补充图3A)。
- 使用移液管取出收集管中的滤液并丢弃。
- 向每个过滤器中加入 450 μL 过滤蒸馏水,并通过上下移液六次将浓缩样品和水混合。
- 在室温下以14,000× g 第二次离心两个离心过滤器10分钟。确保过滤器以与步骤5.7中相同的方向朝向离心机的中心。
- 从离心机中取出过滤单元,并像以前一样,使用移液器从每个管中取出并丢弃滤液。
- 从收集管中取出旋转过滤器,并使用收集管的顶部盖上过滤器外壳(补充图3B)。
- 将自旋过滤器外壳的底部直接放在涡流上,并以 3,000 rpm 的速度涡旋 30 秒,同时保持过滤器外壳直立并以 45° 角(补充图 3C)。
注意:此步骤旨在重悬在离心过程中形成沉淀的任何RABV抗原。 - 小心地从旋转过滤器外壳上取下收集管的盖子。将过滤器外壳放回提供的收集管中,然后快速旋转(2-3秒)以收集可能被困在盖子中的任何体积。
注意:此快速旋转必须在台式微量离心机中进行。过滤器应与离心机相切,与先前的配置相反,以确保不会通过过滤器丢失溶液。 - 将每个离心过滤单元倒置到带有离心过滤器套件的新收集管中(参见 材料表),并在室温下以1,000× g 离心2分钟以收集浓缩的样品。
- 将来自两个收集管的浓缩样品合并到一个收集管中。测量并记录结果体积。
注意:所得样品将具有初始抗原浓度的 5 倍作为原液,具有比原液低约 50 倍的小赋形剂 (<100 kDa) 浓度,并且呈现略带乳白色。总体积应约为 44-48 μL。 - 将5x浓缩的,两次洗涤的抗原储存在4°C直至分配时间,但不超过16小时。在用该溶液填充颗粒之前,将管以1,000× g 离心1分钟以除去任何气泡。可以使用蒸馏水稀释溶液以达到分配的标称目标浓度。
6. 颗粒填充
- 真空过滤500 mL的去离子水通过0.22 μm真空过滤器,然后通过施加真空(相对压力:-20英寸)对溶液进行脱气。Hg),同时超声处理20分钟。
- 在此期间,将压电分配毛细管(PDC;见 材料表)连接到压电分配器。
- 根据制造商的说明(见 材料表)对机器进行灌注,并将装有PLGA颗粒的载玻片放入点胶区域。
- 设置“查找目标参考点”, 运行,然后根据 补充图4设置“目标基板”。
- 将 25 μL 浓缩抗原加载到源板中并将其加载到机器中。使用 PDC 将 10 μL 浓缩抗原吸入分配吸头中,清洗尖端外部,然后校准分配对齐(补充图 5)。
- 输入“目标设置参数”,然后单击“运行”(补充图6)。
- 完成后,移除填充的颗粒并验证它们是否在立体镜下填充。
- 直接转到协议中的下一步。
7. 颗粒密封和收获
- 将不锈钢块(见 材料表)放在电炉上。将两个显微镜载玻片放在不锈钢块上,使它们平行。确保不锈钢块水平,然后打开加热板并设置温度,使不锈钢的表面温度为200°C。 密封前验证加热板的温度。
- 通过将填充的 PLGA 颗粒放在两个载玻片上,将它们悬挂在加热板上,然后立即启动计时器 18 秒。
注意:颗粒需要密封的时间和热量将根据用于制造颗粒的PLGA的化学性质而变化。定制的3D打印载玻片支架可用于在距加热板安全距离的情况下处理载玻片。STL 文件作为 补充编码文件 2 提供。 - 密封后,从加热板上取出颗粒阵列,并将颗粒阵列放在两个单独的载玻片上,将其悬挂在实验室工作台上。让颗粒冷却1分钟。
- 冷却后,可以使用手术刀在通过立体镜观察时收获颗粒。用刀片与载玻片成 45° 角握住手术刀,并对颗粒底部施加压力以将其与载玻片分离。
- 收获后,使用手术刀将颗粒转移到 0.5 mL 低蛋白结合管中(参见 材料表)。然后,用含有 30 mg/mL 牛血清白蛋白 (BSA) 和 1 mg/mL 葡萄糖的 250 μL 1x 磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 填充管中。
注意:在PBS中制备的30mg / mL BSA和1 mg / mL葡萄糖溶液将保持RABV抗原的稳定性。 - 使用一对细尖镊子在立体镜下粉碎颗粒。确保颗粒核心中的RABV抗原可以溶解在周围的溶液中。将样品储存在4°C冰箱中,直到可以使用ELISA评估抗原效力。样品必须在制备后 7 天内在 ELSIA 上运行。
8. 通过酶联免疫吸附法评估抗原
注意:任何时候都不要让微孔板变干。始终堆叠板,并始终用塑料密封件、空板或盖子覆盖上板以避免变干。
- 按照 补充文件 1 中的说明准备缓冲区。
- 通过将 25 μL 包衣抗体添加到 pH 9.4-9.6 的 4975 μL 包衣缓冲液中,制备浓度为 2.5 μg/mL 的 5 mL 包衣溶液(碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液,pH 9.6)。
注意:需要 5 mL 才能包被 96 个孔,每个孔 50 μL(移液损失有额外的体积)。每增加一个 ELISA 板,总体积增加 5 mL。 - 使用多通道移液器将 50 μL 包衣溶液分配到微孔板的每个孔中。溶液必须在制备后立即用于涂层。
- 在戴手套的手掌上轻轻敲击板边缘,以确保每个孔的底部均匀地被液体覆盖。
- 用胶膜密封板,并将其置于37°C下1小时,然后转移到4°C过夜。
- 从冷藏库中取出板,并在每个孔中用 200 μL 洗涤缓冲液洗涤它们三次。
- 取出洗涤缓冲液,将 300 μL 封闭缓冲液分配到每个孔中。
注意:当在不同板上重复使用相同样品运行多个板时,重要的是逐个板进行(即,在进行板 2 之前用材料填充板 1,然后到板 3,依此类推)。不要先将材料X涂在所有板上,然后再涂上材料Y等,因为这会增加孔变干的风险。在最后的洗涤步骤之后,洗涤缓冲液应保留在板的孔中,并且仅在将样品添加到板之前立即丢弃。需要使用塑料 96 孔板盖覆盖 ELISA 板的所有孔,这些孔未立即分配到其中,并且盖子按顺序移动以显示要填充材料的其他孔。 - 用粘性塑料薄膜密封板(参见 材料表),并将其置于培养箱中,在37±2°C下培养60±5分钟。
- 准备标准曲线和测试样品,以便在孵育期间进行评估。
注意:被评估的抗原必须在稀释剂缓冲液中以推荐的0.125 IU / mL稀释度预稀释,过量体积至少为40μL,以考虑移液损失。所有样品在每个ELISA板上一式两份(两次技术重复)进行评估。对于标准曲线,每个 ELISA 板的第 2 列和第 3 列中应包括总共 8 个点的两倍稀释系列。可以根据所评估的抗原的预测量,对所有其他样品进行稀释系列,并具有适当的点数。虽然对于更高的通量不太严格,但单样品稀释液可以用作上述电镀的替代方案。但是,单次稀释的预期浓度必须在标准曲线范围内。 - 在低结合蛋白96孔板或低结合蛋白管(参见 材料表)中,沿板柱对每个样品进行双重稀释系列。
- 以所需最终体积的两倍加载每个相应样品的 A 行中稀释系列的开始(每块板每孔需要 100 μL 样品,因此 A2-A11 中的所有孔都应包含至少 240 μL 的样品,额外体积为 40 μL 以考虑移液损失)。
- 将 120 μL 稀释缓冲液加载到低结合蛋白板上的所有其他孔中,不包括第 1 列和第 12 列(即 B2 至 H11)。
- 使用装有 10 个吸头的多通道移液器,通过将 120 μL 样品从 A2-A11 转移到 B2-B11 并上下移液数次进行混合,同时避免飞溅和气泡,进行连续稀释。重复此过程,沿色谱柱向下移动板,直到孔H 2-H11。丢弃从最后一排孔中吸出的剩余 120 μL 体积。
注意:样品现在已准备好进行分析。如果此时阻塞阶段尚未完成,请确保将样品保存在冰上。 - 在孵育步骤结束时,用 200 μL 洗涤缓冲液洗涤板 3 次。
- 使用多通道移液器,将 100 μL 稀释缓冲液作为“空白”转移到第 1 列和第 12 列中。
- 使用多通道移液器,将 100 μL 从含有样品稀释液的低结合蛋白 96 孔板的每个孔转移到洗涤的 ELISA 板中。对所有正在运行的 ELISA 板重复此操作。
- 用粘性塑料薄膜密封板,并将其置于培养箱中,在37±2°C下培养60±5分钟。
- 通过将 4.4 μL 抗体溶液加入 10,995.6 μL 稀释剂缓冲液中,制备浓度为 0.2 μg/mL 的检测抗体溶液(参见 材料表),并通过上下移液充分混合。
注意:96 个孔总共需要 11 mL,每个孔 100 μL(移液损失有额外的体积)。每评估一个额外的 ELISA 板,总体积增加 11 mL。该溶液必须在制备后立即使用。 - 在孵育步骤结束时,用 200 μL 洗涤缓冲液洗涤板 5 次。
- 吸出剩余的洗涤缓冲液,并使用多通道移液器将 100 μL 检测抗体溶液分配到微孔板上的每个孔中。
- 用粘性塑料薄膜密封板,并将其置于培养箱中,在37±2°C下培养60±5分钟。
- 在检测抗体孵育步骤结束时,将 4.4 μL 链霉亲和素-过氧化物酶偶联物溶液(参见 材料表)加入 10,995.6 μL 洗涤缓冲液中,制备偶联物。
注意:96 个孔总共需要 11 mL,每个孔 100 μL(多通道移液具有额外的体积)。每评估一个额外的 ELISA 板,总体积增加 11 mL。 - 用 200 μL 洗涤缓冲液洗涤板五次。
- 吸出剩余的洗涤缓冲液,并向每个孔中分配 100 μL 偶联液。
- 用粘性塑料薄膜密封板,并将其置于37°C培养箱中60±5分钟,在37±2°C下。
- 根据制造商的说明在最后的洗涤步骤中准备基材(参见 材料表)。对于每个板,在黑暗中将一片邻苯二胺二盐酸盐(OPD;参见 材料表)溶解在9 mL去离子水中,然后加注1 mL 10x稳定过氧化物缓冲液。根据被评估的板数调整片剂数量和溶液总体积(10 mL)。
- 用 200 μL 洗涤缓冲液洗涤板五次。
- 使用多通道移液器将 100 μL 底物分配到每个孔中。
- 用粘性塑料薄膜密封板,并将它们放在工作台上10-20分钟,避光,使用铝箔。
注意:以目视方式监控颜色发展以避免饱和。 - 立即向每个孔和读板中加入 50 μL 终止溶液,以获得 492 nm 处的吸光度和 620 nm 的参比吸光度。
- 使用校正后的吸光度读数(492 nm处的读数减去620 nm处的读数)分析数据,并从所有样品中减去空白的平均值。使用乙状结肠 4PL 插值法将吸光度值转换为 IU/mL。最后,乘以 250 μL(总样品体积)以转换为 IU。
注意:可以使用数据分析软件完成此分析。
Representative Results
颗粒密封和填充是该协议中最关键的两个步骤。用荧光素钠盐填充颗粒以证明理想的填充和一些常见错误。荧光素钠盐代替RABV抗原,便于可视化。在填充过程中,重要的是将溶液分配到颗粒核心的底部,然后留出足够的时间让溶剂/水蒸发。完成后,溶质的仓库保留在颗粒核心的底部(图1A)。填充后,正确密封颗粒至关重要。 图1B 显示了密封过程的几种结果(成功和不成功)。经过12秒的密封时间后,从粒子中心到粒子外部仍然存在一条明显的路径,表明颗粒没有完全密封。相反,如果密封36秒,PLGA几乎完全熔化,导致微观结构呈浅轮廓。当颗粒密封18和24秒时,可以可视化理想形态,因为它们包含完全被聚合物封装的货物,同时保持颗粒结构。 图1C 显示了填充和密封后的几种潜在结果。在分配过程中,如果溶剂没有到达颗粒底部,则在颗粒核心中间留下干燥的溶质(填充不正确);虽然这些颗粒可能仍然密封,但货物装载不良会限制装载效率。如果颗粒中装满了过多的货物(过量填充),则密封过程会受到抑制,因为货物会阻止PLGA流过开口。正确填充和密封后,这种几何形状的颗粒足够小,可以轻松放入 19 G 针内。此外,当注入粘性溶液(例如2%羧甲基纤维素)时,10个颗粒一致地流过19G针(100%±0%)(补充图7)。
图 1:灌装和密封过程中的常见问题 。 (A)图像显示一个填充循环后溶剂的蒸发,其中颗粒加载6nL溶解在水中的100mg / mL荧光素钠盐。(B)在0、12、18、24和36秒处从密封过程中去除的502H PLGA颗粒的代表性图像。 (C)当颗粒正确填充,不正确或过度填充时,密封过程的不同结果。图像是通过焦点堆叠多个图像并使用焦点堆叠软件合并它们来生成的。比例尺 = 200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
在将抗原加载到颗粒中之前,通过自旋过滤器处理抗原很重要,原因有两个。首先,离心用于去除疫苗溶液中的储备赋形剂,这些赋形剂可以在保留RABV抗原的同时限制颗粒负载能力。目前的方案将抗原纯化了大约50倍。其次,抗原也在这个过程中被浓缩。 图2A 显示了浓缩抗原样品中完整RABV病毒粒子的显微照片。该抗原的浓度约为起始储备溶液的4.4倍(图2B)。可以改变最初加载到离心离心过滤器中的抗原量,以调节达到的最终折叠浓度。例如,上样 40 μL 原液抗原会产生大约 1.75 倍的浓度。 补充图8 显示了涡旋(步骤5.15)在浓缩过程中的重要性。忽略涡旋或不恰当地涡旋样品会限制浓缩过程。
图2:抗原浓度。通过透射电子显微镜(A)显示的离心过滤抗原浓度,并由ELISA(B)确认。误差线表示标准偏差。统计分析是使用Tukey的单因子方差分析的多重比较测试完成的。**p < 0.01,****p < 0.0001。请点击此处查看此图的大图。
图3A 描述了填充到未密封和密封颗粒中的浓缩抗原。尽管颗粒中负载了大量的抗原(0.0469±0.0086 IU),但该材料占颗粒容量的<90%,为加载其他抗原留下了充足的空间。有趣的是,未密封的颗粒仅含有0.0396±0.0077 IU,仅占总量的85%±16%。虽然在统计学上不显着的损失,但一些RABV抗原可能在填充过程中的反复补液和干燥过程中变性。密封后,69%±5%的抗原仍以生物活性形式包封。尽管这表明由于热应力,在密封过程中会发生显着损失,但大多数失活的病毒抗原保持完整(图3B)。稳定赋形剂与抗原的共包封是在整个制造过程中进一步提高抗原稳定性的一种可能策略,并且之前已经成功地与其他灭活病毒抗原14,15一起使用。
图3:颗粒制造后的生物活性RABV抗原 。 (A)图像显示含有RABV抗原的未密封和密封颗粒。(B)通过颗粒制造过程的抗原稳定性(n = 4)。通过将抗原直接分配到溶液中来产生上样对照。误差线表示标准偏差。比例尺 = 200 μm。统计分析是使用Tukey的单因子方差分析的多重比较测试完成的。*p < 0.05。图像是通过焦点堆叠多个图像并使用焦点堆叠软件合并它们来生成的。 请点击此处查看此图的大图。
补充图1:粒子、基准和阵列尺寸。 该图显示了 CAD 软件中显示的四角星基准点 (A)、圆柱形微粒 (B)、五角星形基准点 (C) 以及带有基准点的粒子阵列 (D) 的几何特性。 请点击此处下载此文件。
补充图2:该图显示了放入烘箱中以固化PDMS模具的结构的横截面。 箭头指示粘结夹的应用位置。 请点击此处下载此文件。
补充图3:有效回收浓缩抗原的正确技术。 在第一次旋转结束时,用红色(A)圈出的浓缩样品保留在过滤器中,而滤液收集在收集管(较大的外管)的底部。为了重悬沉淀的抗原,使用收集管(B)盖住离心过滤单元以准备涡旋。涡旋时,管子的尖端与涡旋垫保持接触,盖端旋转,同时与涡旋垫(C)保持45°角。 请点击此处下载此文件。
补充图4:预运行编程压电分配器。(A) 通过从“主选项卡”导航到机器人设置>杂项>分区功能>查找目标参考点来设置“查找目标参考点”。使用蓝色突出显示的按钮设置信托标记。首先,选择学习模板并在感兴趣的信托标记周围画一个框,通过单击搜索模板来验证模板的准确性,然后保存模板。对四角星和五角星执行此操作,并根据使用两个不同的模板图像下的说明保存文件名。接下来,确保黑盒中的所有参数匹配。使用加载模板(绿色框)加载四角星基准点。通过选择任务列表(橙色框)保存“查找目标参考点”程序。(B) 通过导航到“机器人设置>任务”选项卡来设置“运行”,然后使用“运行中的任务”选项(绿色框)从“任务列表”(黑框)添加任务,加载蓝色框中显示的任务序列。最后,保存任务(橙色框)。(C) 通过导航到目标基板>机器人设置来设置“目标基板”,然后添加目标(蓝色框)。(D) 输入此处显示的参数,然后选择“保存”(蓝色框)。请点击此处下载此文件。
补充图5:上样抗原并校准分配比对。(A) 导航到“喷嘴设置”>“执行任务”选项卡,通过选择 TakeProbe 10 uL(黑框)并单击 DO(黑框)将 10 μL 抗原吸出到分配尖端中。(B) 这将打开一个单独的窗口。选择将浓缩抗原加载到的孔中,然后选择确定(蓝色框)。(C)吸入抗原后,通过选择蓝色框清洗尖端,并再次重复洗涤两次。选择相机(黑匣子)并通过选择投射体积(绿框)来确定液滴量。确保形成稳定的液滴,体积标准偏差 (%) <2(橙色框)。(D) 按照以下步骤操作将打开捕捉下降凸轮;在下拉菜单中选择图像(蓝色框),然后选择喷嘴头相机向导。这将打开一个新窗口。快速执行后续步骤序列。(E) 确保已加载补充图 4 中的目标,然后选择移动到目标(蓝色框)。将液滴调整为 15,然后选择点(黑框)。一旦发现,立即选择“移动”(绿色框)。确保选中“自动查找”并删除粒度 = 12,然后单击“开始”(橙色框)。如果自动检测失败,请在移动到幻灯片上的其他区域(紫色框)后重复此过程。请点击此处下载此文件。
补充图 6:编程发现阵列并开始运行。(A) 导航到“目标设置”>“目标”,然后填写蓝色框中显示的参数。(B)接下来,导航到“字段设置选项卡”,然后在no中输入20。在滴剂字段(蓝色框)中,选择一个孔(黑框),然后选择要分配到的目标/颗粒(绿色框)。通过选择不同的孔并重新选择目标/颗粒,在单次运行期间执行额外的填充循环。(C) 在主屏幕上,确保选择了补充图 5 中创建的运行和目标。(D) 导航到“运行选项卡”并选择开始运行(蓝色框)。请点击此处下载此文件。
补充图7:微粒注射性。(A-C)填充有荧光素钠盐并密封在 19 G 针中的微粒的焦点堆叠立体镜图像。(D)使用2%羧甲基纤维素溶液(n = 8)通过19G针头共注射10个颗粒。比例尺 = 1 毫米。误差线表示标准偏差。请点击此处下载此文件。
补充图8:抗原浓度的潜在问题。红线表示浓度的预期倍数增加。误差线表示标准偏差。统计分析是使用Tukey的多对比测试与单因子方差分析完成的。 p < 0.001,****p < 0.0001。请点击此处下载此文件。
补充文件1:制备RABV ELISA的缓冲液和溶液。请点击此处下载此文件。
补充编码文件1:包含粒子数组的STL文件。请点击此处下载此文件。
补充编码文件2:STL文件,包含用于密封颗粒的自定义滑块支架的几何形状。请点击此处下载此文件。
Discussion
可以根据特定需求改变粒子几何形状;然而,对于圆柱形结构,作者建议保持协议中描述的高度:直径:壁厚的5:4:1比例。这种纵横比可确保存在足够的PLGA材料来密封颗粒,并保持足够的机械坚固性以进行处理。在CAD过程中可以轻松更改颗粒尺寸和形状,从而生成无数的几何形状。将CAD的灵活性与3D打印相结合,可以快速迭代微粒设计。尽管该协议使用多光子3D打印机,但任何具有能够以适当材料打印微观结构尺寸的规格的3D打印机都可用于生成初始母模。此外,光刻以前已被用于在阵列中制造类似的结构,其结构比本协议中产生的结构大得多;然而,劳动力、订购定制光掩模的延迟以及设备的可访问性将减慢迭代设计过程16.最后,如果内部母模制造不可行,母模生产可以外包给有偿服务公司。无论使用3D打印机或用于生成母模的方法如何,打印件与基材的附着力对于下游步骤都至关重要。具体来说,如果在PDMS模具生成过程中附着力不足,打印颗粒将保留在PDMS模具中,需要手动去除打印颗粒并破坏母模。
颗粒填充是另一个需要考虑的关键方面。微粒的填充能力有限,因此过滤不仅用于浓缩RABV抗原,还用于去除原本会占据微粒核心体积很大一部分的原液赋形剂。然而,鉴于RABV抗原的大尺寸(约60 nm×180 nm)17,在离心步骤中可以部分沉淀出抗原。因此,重要的是在离心后通过移液或涡旋重悬抗原,以实现RABV抗原的高回收率。高浓度溶液是分液的理想选择,因为它减少了分液周期,从而限制了分样过程中的抗原降解。然而,粘度是压电点胶机器人形成稳定液滴的主要限制,因此可能不可能或不可取地分配非常高浓度的溶液。稀释填充溶液是实现稳定液滴形成的最简单方法,但应考虑实现所需负载所需的额外填充周期内的抗原稳定性以及填充颗粒所需的较长时间。
局限性
这种方法需要高度专业化的设备来生产初始模具和用于微粒生产的专用填充仪器。尽管通过按服务收费的方法可以颠覆对具有能够生成初始母模的打印分辨率的3D打印机的需求,但压电点胶机器人的可访问性是有限的。采购压电点胶机器人需要大量的初始前期投资,通常在 80,000 美元到 200,000 美元之间,具体取决于品牌、吞吐量和功能。尽管其他几种填充方法是潜在的替代方案,但这些方法尚未使用RABV抗原12进行验证。
未来应用
相当大比例的包封RABV抗原在密封过程中保持稳定。理论上,通过将这种抗原掺入由不同类型的PLGA组成的颗粒中,模仿暴露后预防治疗的给药时间表,所有剂量都可以在一次注射中给药。消除重复就诊以管理额外剂量的需要将提高患者的依从性,从而获得更好的治疗结果。此外,在证明能够保留高度复杂的灭活狂犬病病毒的ELISA反应性之后,其他抗原(包括亚单位疫苗)很可能与这种包封方法兼容。使用带有脉冲微粒的其他预防性抗原可以通过提高疫苗接种不足人群的疫苗接种率来挽救低收入和中等收入国家的数百万人的生命。然而,为了实现这一目标,疫苗不仅必须通过封装保持稳定,还必须通过释放保持稳定,这可能具有挑战性,因为有效载荷将受到体温和由于体热和PLGA降解产物而可能出现的酸性微环境的影响18。未来的工作将通过释放来稳定抗原的策略,这将为广泛适用于预防许多传染病的单次注射疫苗接种平台开辟潜力。
Disclosures
McHugh博士拥有基于所涵盖的工作的专利申请,目前是Particle for Humanity的顾问。格拉夫先生根据所包含的工作申请了专利。Kadasia博士,Yang先生和Brady女士是Particle for Humanity的一部分,这是一家公益公司,在这项工作中从麻省理工学院获得了类似的微粒疫苗输送技术。
Acknowledgments
我们感谢Chiron Behring和Bharat Biotech International为人类提供RABV抗原颗粒。我们还要感谢Charles Rupprecht,VMD,MS,PhD.的宝贵指导和技术贡献。作者要感谢Rebecca Richards-Kortum博士的慷慨,允许使用她的SciFLEXARRAYER S3皮升分配设备,以及Chelsey Smith博士关于使用该设备的指导。我们还感谢马萨诸塞大学陈医学院生成狂犬病抗原的显微镜图像。最后,我们感谢Don Chickering和Erin Eulano在提交之前审查了该文件。这项工作得到了比尔和梅林达·盖茨基金会的资助(INV-004360)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 µm PES filter | Cole-Parmer+B4B2:B63 | 04396-26 | |
0.25 mm Shims | McMaster Carr | 98090A935 | |
0.75 inch Binder Clips | Staples | 480114 | |
10 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309604 | |
10 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11E | |
101.6 mm C-Clamp | Amazon | PT-SD-CP01A | Black handle will eventually fall off. Use pliers to adjust once this happens. |
19 G needle | EXCELINT | 26438 | |
25 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11 | |
3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylate | Millipore Sigma | M6514-25ML | |
5 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Eppendorf | 22431081 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 352098 | |
50 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe | Fisherbrand | 13-678-11F | |
Acetone | Fisher | AC268310010 | |
Aluminum Block | McMaster Carr | 9057K175 | |
Aluminum Foil | VWR | 89079-069 | |
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters, 100 kDa | Millipore Sigma | C82301 | |
Anti-Rabies Virus Antibody, Serum Free Antibody, clone 1112-1, 100 | Fisherbrand | 13-678-11D | |
Anti-Rabies Virus Mouse Monoclonal Antibody, Clone D1-25, biotinylated | Fisherbrand | 14-388-100 | |
Carboxymethyl Cellulose | Tokyo Chemical Industries | C0045 | |
ClipTip 300, Filter, Racked | Fisherbrand | 13-678-11 | |
Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3206 | |
Costar 1.7 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3207 | |
Describe | Nanoscribe | Software used to define the printing parameters for Nanoscribe 3D printer is step 1.2. Software provided with the printer. |
|
Desiccator | Fisher Scientific | 10529901 | Or equivalent |
Double-Sided Tape | Staples | 649280 | |
DPBS (10x), No Calcium, No Magnesium | Gibco | 14200075 | |
Ethanol | VWR | 89370-084 | |
F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 to 300 µL | Fisherbrand | 13-678-11E | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 0.1 – 10 µL | Fisherbrand | 13-678-11F | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 100 – 1000 µL | Fisherbrand | 03-448-17 | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 2 – 20 µL | Fisherbrand | FB14955202 | |
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 20 – 200 µL | Fisherbrand | 13-374-10 | |
Fisherbrand Elite Pipette Kit | Fisherbrand | 05-408-137 | |
Fisherbrand Pipet Controller | Fisherbrand | FB14955202 | |
Glass Petri Dish, 90 mm | VWR | 470313-346 | |
Glass Slides | Globe Scientific | 1380-10 | |
Helicon Focus 8 | HeliconSoft | Software used to focus stack images | |
IP-Q Resin | Nanoscribe | Printer resin is compatable with the 10x lens and is used for printing large microstructures on the Nanoscribe Photonic Professional GT2 | |
Lascar EL-USB-TC-LCD Thermocouple | Amazon | 5053485896236 | Or equivalent |
Microscope Slide Box | Millipore Sigma | Z374385-1EA | Or equivalent |
Nanoscribe Photonic Professional GT2 with 10X Objective | Nanoscribe | ||
NanoWrite | Nanoscribe | Software used to interface with nanoscrive 3D printer. Software provided with printer. |
|
Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
OPD Substrate Tablets (o-Phenylenediamine Dihydrochloride) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
Parafilm M Wrapping Film, 4 in. | Fisherbrand | 13-374-10 | |
PDC 60 with Type 3 Coating | Scienion | P-2020 | |
PDMS Particle Molds | Rice University | n/a | N/A- Particles are 400 μm in diameter with a wall thickness of 100 μm, and a height of 500 μm, resulting in an inner diameter of 200 μm. The arrays are 14 x 22 particles spaced 600 μm apart from each other. 4- and 5-point stars are used as fiducials, positioned 600 μm to the right and left of the top right and top left particles on the array. |
Petri Dish | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
Plastic Cups | Fisher Scientific | S04170 | |
PLGA Film, 502H | Sigma | 502H: 719897-1G | |
Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate | Millipore Sigma | 484431 | |
Rabies Antigen | Chiron Behring and Bharat Biotech International | Material was acquired by entering into a materials transfer agreement with the company. | |
Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
Scalpel | VWR | 21899-530 and 76457-512 | |
SciFLEXARRAYER S3 with PCD 60 | Scienion | Or equivalent | |
Sealing Tape for 96-Well Plates | Thermo Scientific | 15036 | |
Silicon Wafer | University Wafer | 1025 | |
Spring Clamps | IRWIN | VGP58100 | |
Stainless Steel Block | McMaster Carr | 9083K12 | |
Streptavidin−Peroxidase Polymer, Ultrasensitive | Fisherbrand | 02-707-404 | |
Sylgard 184 | DOW | 2646340 | |
Teflon Sheet | McMaster Carr | 9266K12 | Used to make PLGA films. Must be cut into appropriately sized pieces. |
Teflon Sheet, 0.8 mm-thick | McMaster Carr | 9266K81 | |
Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) Silane | Sigma | 448931-10G | |
Tweezers | Pixnor | ESD-16 | |
UltraPure Distilled Water | Fisher Scientific | 10977015 | |
UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker | UVP | 95-0174-01 | Or equivalent |
Vacuum Desiccator | Bel-Art | F420100000 | Note you will need two of these. One will be used exclusively to pre-treat samples with trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane to prevent contamination. |
Vacuum Oven Capable of Reaching 120 °C | VWR | 97027-664 | Or equivalent |
Vacuum, CRVpro4 | Welch | 3041-01 | Or equivalent |
Wooden Tongue Depressors | Electron Microscopy Sciences | 72320 |
References
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