Candidatus Liberibacter asiaticus" ، CLas ، huanglongbing، HLB، فيروس تريستيزا الحمضيات ، CTV, scientific video journal" />

Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

أتمتة معالجة خشب براعم الحمضيات للكشف عن مسببات الأمراض النهائية من خلال هندسة الأدوات

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65159
Automatic Translation
*1,6, *2, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5, *1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside, 2Technology Evolving Solutions (TES), 3Department of Bioengineering, University of California Riverside, 4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV, 5University of California Riverside, 6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

لقد قمنا بتصميم وتصنيع والتحقق من صحة أداة تعالج بسرعة أنسجة خشب براعم الحمضيات الغنية باللحاء اللحاء. مقارنة بالطرق الحالية ، زاد مستخرج أنسجة البراعم (BTE) من إنتاجية العينة وقلل من تكاليف العمالة والمعدات المطلوبة.

Abstract

مسببات الأمراض المنقولة بالكسب غير المشروع ومحدودة اللحاء من الحمضيات مثل الفيروسات والفيروسات والبكتيريا هي المسؤولة عن الأوبئة المدمرة والخسائر الاقتصادية الجسيمة في جميع أنحاء العالم. على سبيل المثال ، قتل فيروس تريستيزا الحمضيات أكثر من 100 مليون شجرة حمضيات على مستوى العالم ، في حين أن "Candidatus Liberibacter asiaticus" كلف فلوريدا 9 مليارات دولار. يعد استخدام خشب براعم الحمضيات الذي تم اختباره بواسطة مسببات الأمراض لتكاثر الأشجار أمرا أساسيا لإدارة مسببات الأمراض هذه. يستخدم برنامج حماية استنساخ الحمضيات (CCPP) في جامعة كاليفورنيا ، ريفرسايد ، مقايسات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لاختبار آلاف العينات من أشجار مصدر خشب براعم الحمضيات كل عام لحماية الحمضيات في كاليفورنيا وتوفير وحدات إكثار نظيفة للشبكة الوطنية للنباتات النظيفة. عنق الزجاجة الشديد في الكشف الجزيئي عالي الإنتاجية لفيروسات الحمضيات والفيروسات هو خطوة معالجة الأنسجة النباتية.

يعد التحضير السليم للأنسجة أمرا بالغ الأهمية لاستخراج الأحماض النووية عالية الجودة واستخدامها في فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل. إن تقطيع الأنسجة النباتية ووزنها وتجفيفها بالتجميد وطحنها وطردها مركزيا في درجات حرارة منخفضة لتجنب تدهور الحمض النووي يستغرق وقتا طويلا ويتطلب عمالة مكثفة ويتطلب معدات مخبرية باهظة الثمن ومتخصصة. تقدم هذه الورقة التحقق من صحة أداة متخصصة مصممة لمعالجة أنسجة اللحاء الغنية باللحاء بسرعة من خشب براعم الحمضيات ، وتسمى مستخرج أنسجة خشب البراعم (BTE). يزيد BTE من إنتاجية العينة بنسبة 100٪ مقارنة بالطرق الحالية. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يقلل من العمالة وتكلفة المعدات. في هذا العمل ، كان لعينات BTE عائد DNA (80.25 نانوغرام / ميكرولتر) يمكن مقارنته ببروتوكول التقطيع اليدوي ل CCPP (77.84 نانوغرام / ميكرولتر). يمكن أن تفيد هذه الأداة وبروتوكول المعالجة السريعة للأنسجة النباتية العديد من مختبرات وبرامج تشخيص الحمضيات في كاليفورنيا وتصبح نظاما نموذجيا لمعالجة الأنسجة للمحاصيل الخشبية المعمرة الأخرى في جميع أنحاء العالم.

Introduction

تسببت مسببات الأمراض المحدودة باللحاء والمنقولة بالكسب غير المشروع للحمضيات ، مثل الفيروسات والفيروسات والبكتيريا ، في أوبئة مدمرة وخسائر اقتصادية خطيرة في كل منطقة منتجة للحمضيات في العالم. تحد فيروسات الحمضيات من عوامل الإنتاج بسبب أمراض القشرة الخارجية والدنف التي تسببها في أنواع الحمضيات المهمة اقتصاديا ، مثل الهجينة ثلاثية الأوراق ، والهجينة ثلاثية الأوراق ، واليوسفي ، والكليمنتين ، واليوسفي1،2،3. في كاليفورنيا ، تعد أنواع الحمضيات الحساسة للفيروسات هذه أساس السوق المتنامي والمربح ل "أدوات التقشير السهلة" ، بعد الاتجاه المتغير في تفضيل المستهلكين للفواكه التي يسهل تقشيرها وتجزئتها وبدون بذور4،5،6. وبالتالي ، يتم تنظيم فيروسات الحمضيات بموجب وزارة الأغذية والزراعة في كاليفورنيا (CDFA) "برنامج نظافة آفات مخزون مشاتل الحمضيات - مشروع قانون مجلس الشيوخ 140" ، وتقوم مختبرات فرع تشخيص الآفات النباتية التابع ل CDFA بإجراء الآلاف من اختبارات فيروس الحمضيات سنويا7،8،9،10. كان فيروس تريستيزا الحمضيات (CTV) مسؤولا عن وفاة أكثر من 100 مليون شجرة حمضيات منذ بداية الوباء العالمي في ثلاثينيات القرن العشرين3،9،10،11. في كاليفورنيا ، تشكل عزلات مقاومة كسر الساق والأوراق الثلاثية للفيروس تهديدا خطيرا لصناعة الحمضيات في كاليفورنيا التي تبلغ قيمتها 3.6 مليار دولار12،13،14. وبالتالي ، يصنف CDFA CTV على أنه آفة نباتية منظمة من الفئة A ، ويقوم مختبر وكالة القضاء على Tristeza في وسط كاليفورنيا (CCTEA) بإجراء مسوحات ميدانية مكثفة وآلاف اختبارات الفيروسات كل عام15,16. تشير التقديرات إلى أن بكتيريا "Candidatus Liberibacter asiaticus" (CLas) ومرض huanglongbing (HLB) قد تسببوا في ما يقرب من 9 مليارات دولار من الأضرار الاقتصادية لفلوريدا نتيجة لانخفاض مساحة الحمضيات بنسبة 40٪ ، وانخفاض بنسبة 57٪ في عمليات الحمضيات ، وفقدان ما يقرب من 8000 وظيفة17,18. في كاليفورنيا ، كان من المتوقع أن يؤدي انخفاض افتراضي بنسبة 20٪ في مساحة الحمضيات بسبب HLB إلى فقدان أكثر من 8,200 وظيفة وانخفاض يزيد عن نصف مليار دولار في الناتج المحلي الإجمالي للولاية. لذلك ، ينفق برنامج الوقاية من آفات الحمضيات والأمراض أكثر من 40 مليون دولار سنويا على المسوحات لاختبار واكتشاف واستئصال CLas من كاليفورنيا14،17،19،20.

أحد العناصر الرئيسية لإدارة فيروسات الحمضيات والفيروسات والبكتيريا هو استخدام مواد إكثارية مختبرة من قبل مسببات الأمراض (أي خشب البراعم) لإنتاج الأشجار. يتم إنتاج خشب براعم الحمضيات الذي تم اختباره بواسطة مسببات الأمراض وصيانته ضمن برامج الحجر الصحي الشاملة التي تستخدم تقنيات متقدمة للتخلص من مسببات الأمراض والكشفعنها 10,21. يقوم برنامج حماية استنساخ الحمضيات (CCPP) في جامعة كاليفورنيا ، ريفرسايد ، باختبار الآلاف من عينات خشب البراعم كل عام من أصناف الحمضيات المستوردة حديثا إلى الولاية والولايات المتحدة الأمريكية ، بالإضافة إلى أشجار مصدر خشب براعم الحمضيات ، لحماية حمضيات كاليفورنيا ودعم وظائف الشبكة الوطنية للنباتات النظيفة للحمضيات10،17،22. للتعامل مع الحجم الكبير من اختبارات الحمضيات ، تعد فحوصات الكشف عن مسببات الأمراض عالية الإنتاجية والموثوقة والفعالة من حيث التكلفة مكونا أساسيا لنجاح برامج مثل CCPP7،10،22.

في حين أن فحوصات الكشف عن مسببات الأمراض الجزيئية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) قد سمحت بزيادات كبيرة في الإنتاجية في مختبرات التشخيص النباتي ، في تجربتنا ، فإن واحدة من أهم الاختناقات في تنفيذ البروتوكولات عالية الإنتاجية هي خطوة معالجة عينات الأنسجة النباتية. وينطبق هذا بشكل خاص على الحمضيات لأن البروتوكولات المتاحة حاليا لمعالجة الأنسجة الغنية باللحاء مثل أعناق الأوراق ولحاء خشب البراعم كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا وتتطلب معدات مخبرية باهظة الثمن ومتخصصة. تتطلب هذه البروتوكولات التقطيع اليدوي والوزن والتجفيف بالتجميد والطحن والطرد المركزي في درجات حرارة منخفضة لتجنب تدهور الحمض النووي8،23،24. على سبيل المثال ، في مختبر التشخيص CCPP ، تشمل معالجة العينات (i) التقطيع اليدوي (6-9 عينات / ساعة / مشغل) ، (ii) التجفيف بالتجميد (16-24 ساعة) ، (iii) السحق (30-60 ثانية) ، و (iv) الطرد المركزي (1-2 ساعة). تتطلب العملية أيضا إمدادات متخصصة (على سبيل المثال ، أنابيب القفل الآمن للخدمة الشاقة ، وكرات الطحن المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، والمحولات ، والشفرات ، والقفازات) وقطع متعددة من معدات المختبرات المكلفة (على سبيل المثال ، الفريزر المنخفض للغاية ، ومجفف التجميد ، وسحق الأنسجة ، وتبريد النيتروجين السائل ، وأجهزة الطرد المركزي المبردة).

كما هو الحال في أي صناعة ، تعد هندسة المعدات وأتمتة العمليات أساسية لخفض التكاليف وزيادة الإنتاجية وتوفير منتجات وخدمات موحدة عالية الجودة. تحتاج صناعة الحمضيات إلى أدوات معالجة الأنسجة منخفضة التكلفة التي تتطلب الحد الأدنى من المهارة لتشغيلها ، وعلى هذا النحو ، يسهل نقلها إلى مختبرات التشخيص والعمليات الميدانية للسماح بقدرة عالية على معالجة العينات للكشف السريع عن مسببات الأمراض. طورت شركة Technology Evolved Solutions (TES) و CCPP (أي التصميم والتصنيع) والتحقق من صحتها (أي اختبارها بعينات الحمضيات ومقارنتها بالإجراءات المختبرية القياسية) أداة منخفضة التكلفة (أي ألغت الحاجة إلى معدات مخبرية متخصصة) للمعالجة السريعة لأنسجة الحمضيات الغنية باللحاء (أي خشب البراعم) ، تسمى مستخرج أنسجة خشب البراعم (BTE). كما هو موضح في الشكل 1 ، يشتمل BTE على مكون أساسي للطاقة وأدوات التحكم ، بالإضافة إلى غرفة قابلة للإزالة لمعالجة خشب براعم الحمضيات. تتكون غرفة BTE من عجلة طحن مصممة خصيصا لتجريد أنسجة اللحاء الغنية باللحاء من خشب براعم الحمضيات. يتم إخراج أنسجة اللحاء الممزقة بسرعة من خلال منفذ منزلق إلى حقنة تحتوي على مخزن مؤقت للاستخراج ، ويتم ترشيحها وجعلها جاهزة لاستخراج الحمض النووي وتنقيته دون أي معالجة أو تحضير إضافي (الشكل 1). يتضمن نظام BTE أيضا تطبيقا لتتبع العينات غير الورقية وتطبيقا متكاملا للوزن ، والذي يسجل معلومات معالجة العينات في قاعدة بيانات عبر الإنترنت في الوقت الفعلي.

زاد نظام BTE من القدرة التشخيصية المعملية ل CCPP بأكثر من 100٪ وأنتج باستمرار مستخلصات أنسجة الحمضيات المناسبة لتنقية الأحماض النووية عالية الجودة والكشف النهائي عن مسببات الأمراض المنقولة بالكسب غير المشروع للحمضيات باستخدام فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل. وبشكل أكثر تحديدا ، قلل BTE من وقت معالجة الأنسجة من أكثر من 24 ساعة إلى ~ 3 دقائق لكل عينة ، واستبدل الأدوات المختبرية التي تكلف أكثر من 60000 دولار (الشكل 2 ، الخطوات 2-4) ، وسمح بمعالجة أحجام عينات أكبر.

تقدم هذه الورقة بيانات BTE عالية الإنتاجية لمعالجة أنسجة لحاء الحمضيات ، واستخراج الحمض النووي ، والتحقق من صحة الكشف عن مسببات الأمراض مع عينات من خشب براعم الحمضيات من أشجار المصدر ، بما في ذلك جميع الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة من مرفق الحجر الصحي CCPP Rubidoux ومرفق مؤسسة Lindcove ، على التوالي. نقدم أيضا تغييرات الإنتاجية ووقت المعالجة مقارنة بالإجراء المختبري الحالي (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك ، يوفر هذا العمل بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة لمختبرات اختبار مسببات الأمراض الحمضية ويوضح كيف يمكن ل BTE دعم وظائف مخزون الحضانة النظيف من مسببات الأمراض وبرامج المسح والاستئصال.

Figure 1
الشكل 1: مستخرج أنسجة خشب البراعم. يشتمل BTE على مكون أساسي للطاقة وأدوات التحكم ، بالإضافة إلى غرفة قابلة للإزالة لمعالجة خشب براعم الحمضيات. تتكون غرفة BTE من عجلة طحن مصممة خصيصا لتجريد أنسجة اللحاء الغنية باللحاء من خشب براعم الحمضيات. يتم إخراج أنسجة اللحاء الممزقة بسرعة من خلال منفذ منزلق إلى حقنة ، وتصفيتها ، وجعلها جاهزة لاستخراج الحمض النووي وتنقيته دون أي معالجة أو تحضير إضافي. اختصار: BTE = مستخرج أنسجة خشب البراعم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مقارنة خطوة بخطوة بين إجراء معمل التقطيع اليدوي التقليدي ومعالجة BTE. تتضمن معالجة BTE معالجة أنسجة لحاء الحمضيات عالية الإنتاجية ، واستخراج الحمض النووي ، واكتشاف مسببات الأمراض. يشار إلى وقت كل خطوة بين قوسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. جمع عينات من خشب براعم الحمضيات لشحنها

  1. أرسل إلى Technology Evolved Solutions جدول بيانات لمعلومات الشجرة لتحميلها في خادم الويب الخاص بهم (في النهاية ، سيقوم المستخدم بإنشاء أشجار جديدة).
  2. استخدم متعقب TES لتطبيق الهاتف لتحديد شجرة ، وأمسك علامة طوق الاتصال قريب المدى (NFC) بالهاتف لتحميل معلومات الشجرة إلى العلامة.
  3. أدخل ثلاث إلى أربع عينات من خشب براعم الحمضيات في حامل الأكياس البلاستيكية المتوافق مع BTE ، وأغلقها بالغطاء.
    1. تأكد من أن طول خشب البراعم لا يتجاوز 8 بوصات ولا يقل عن 5 بوصات.
      1. إذا كان الطول أكبر من 8 بوصات ، فاستخدم شفرة حلاقة معقمة يمكن التخلص منها أو مقصات تقليم مطهرة بمحلول مبيض بنسبة 10٪ (1٪ هيبوكلوريت الصوديوم) لجعلها أقصر.
      2. إذا كان الطول أقل من 5 بوصات ، اجمع عينة مختلفة من خشب البراعم لوضعها في الكيس.
    2. تأكد من إزالة أي نمو إبطي أو أشواك كبيرة يدويا أو باستخدام أدوات قطع معقمة بنسبة 10٪ (1٪ هيبوكلوريت الصوديوم).
      ملاحظة: هذه الخطوة مهمة حتى يسهل مناورة خشب البراعم في فتحة الغرفة.
    3. تأكد من عدم وجود عينات من خشب البراعم ذات ميزات منحنية. إذا فعلوا ذلك ، فقم بإزالتها باستخدام أدوات القطع المعقمة بنسبة 10٪ (1٪ هيبوكلوريت الصوديوم) ، وضعها في أكياس BTE فقط الأجزاء المستقيمة من العينة.
      ملاحظة: من الصعب جدا المناورة بخشب البراعم المنحني في الجهاز ، مما يؤدي إلى شريط لحاء غير متساو.
  4. استخدم متعقب TES لتطبيق الهاتف لمسح علامة طوق NFC للشجرة وربطها بعلامة مشبك NFC الموجودة على حقيبة العينة.
  5. انتبه إلى سمك خشب البراعم لأن ذلك يحدد كيف سيقوم المشغل بتجريد لحاء خشب البراعم الغني باللحاء داخل غرفة BTE.
    1. إذا كان سمك خشب البراعم أقل من 0.20 بوصة ، فكن حذرا أثناء تجريد خشب البراعم لأن خيوط الغزل عالية السرعة في الحجرة ستسحق خشب البراعم بالكامل إلى قلبه ، خارج طبقة اللحاء وفي الأنسجة غير الغنية باللحاء من الخشب واللب.
    2. حدد خشب البراعم السميك لأنه من الأسهل تجريد أنسجة اللحاء مع تجنب أنسجة خشب البراعم غير الغنية باللحاء.
  6. ضع العينات في حاوية شحن معزولة مع عدد قليل من عبوات الثلج.

2. الإعداد في غطاء الدخان

ملاحظة: يفضل تشغيل BTE داخل غطاء دخان. هذا سوف يقلل من خطر التلوث المتبادل للأنسجة النباتية والتلوث المختبري.

  1. قم بالتطهير باستخدام زجاجة رذاذ 10٪ (1٪ هيبوكلوريت الصوديوم).
    1. رش سطح الغطاء ، واترك المبيض لمدة 1 دقيقة قبل مسحه بمنشفة ورقية.
    2. رش منشفة ورقية بمحلول التبييض. امسح قاعدة TE ومكونات ميزان الوزن (الميزان والدرع الهوائي والبرج) وقلم تحديد.
  2. قم بفك مجموعة حقنة لعدد العينات المراد معالجتها ، وضعها داخل صندوق من الورق المقوى المغطى.
  3. احصل على حزمة من المسحات المتاحة خارج غطاء المحرك في حالة الحاجة إليها.
  4. تحضير مقياس الوزن.
    1. قم بإزالة برج الوزن من الميزان ، مع الاستمرار على زر الطاقة لتشغيله. ضع البرج في مركز المقياس بعد أن يعرض المقياس 0.
    2. حرك الحاجب الهوائي لميزان الوزن فوق مقدمة الميزان.
  5. قم بإعداد قاعدة مستخرج الأنسجة عن طريق قلب المفتاح الموجود على الظهر. تأكد من الضغط على المفتاح الموجود على الجانب الأيسر من الصندوق لأسفل في الأعلى. انتظر مؤشر LED الأخضر الوامض ، مما يشير إلى أن الغرفة جاهزة.

3. قم بإعداد محطات التنظيف (الشكل التكميلي S1).

  1. ضع 1 لتر من الماء في منظف بالموجات فوق الصوتية.
  2. لف كيسين من القمامة فوق الجزء العلوي من المنظف بالموجات فوق الصوتية.
  3. صب ~ 5 لتر من 10٪ مبيض (1٪ محلول هيبوكلوريت الصوديوم) في منظف بالموجات فوق الصوتية.
  4. املأ حوض الماء بما يكفي من الماء لغمر الغرفة.
  5. قم بتشغيل ضاغط الهواء وافتح الصمام.
  6. قم بإعداد خلفية لالتقاط السائل أثناء تجفيف الغرفة.

4. معالجة المواد الخاصة ب BTE لتجريد لحاء براعم الحمضيات

  1. قم بتحميل الحجرة على قاعدة BTE.
    1. إعداد غرفة التعليم والتدريب المهني.
      1. قم بتوصيل كيس عينة فارغ بالجزء الخلفي من الغرفة. استخدم حلقتين على شكل حرف O لتثبيت الكيس الفارغ في الفوهة الخلفية لحجرة BTE.
      2. افحص الشفرة بحثا عن علامات التآكل أو التلف ، مثل الجروح التي تتشكل على الشفرة حيث تستمر في البلاستيك أو الجروح التي تتشكل على الطرف. تأكد من أن السهم الموجود على الشفرة يصطف مع رمز القفل الفردي.
      3. تأكد من أن إطلاق الهواء في الجزء السفلي من الحجرة يتم توجيهه نحو الرمز O . ضع الغطاء الشفاف فوق فتحة الحجرة ، وحرك شريحة BTE الشفافة على الحجرة باستخدام المسار الموجود على يمين الحجرة. ادفع القفل الموجود أسفل الغرفة بقدر ما يمكن أن يدخل في الشريحة. تأكد من تركيب غطاء المكبس أعلى الشريحة.
    2. ضع الحجرة على قاعدة BTE مع فوهة قاعدة BTE البارزة في الجزء الخلفي من الحجرة. انتظر حتى يومض مؤشر LED الأزرق ، مما يشير إلى نجاح الموضع.
  2. قم بتحميل العينة على قاعدة BTE عن طريق تحريك الملصق الأبيض على علامة مشبك NFC إلى Z على الجانب الأيمن من الصندوق. حرك العلامة بحركة دائرية بطيئة على Z حتى يبدأ الضوء الأصفر في الوميض. قم بتوصيل العينة بقاعدة BTE ، وتأكد من عدم وجود ثقوب في كيس العينة ؛ إذا كان هناك ثقب ، فقم بتصحيحه بشريط. ضع الحلقة O فوق كيس العينة لتثبيتها في مقدمة فوهة BTE.
  3. قم بتحميل مجموعة المحاقن غير المستخدمة.
    1. الفارغة مجموعة حقنة. ضع المحقنة غير المستخدمة الموضوعة على برج ميزان الوزن. قم بإزالة المحقنة التي تم ضبطها عندما يبدأ الضوء الأحمر في الوميض أو عندما يعرض المقياس 0.
    2. أخرج المكبس من المحقنة باستخدام الفلتر. تأكد من وجود السائل في المحقنة السفلية (غير الفلترية). ضع المكبس جانبا على منشفة ورقية أو على البرج حيث لا يلمس المكبس الأسود أي أسطح.
    3. قم بتوصيل المحقنة بمنفذ خروج الشريحة عن طريق الضغط على منفذ الخروج في المحقنة وتدوير 90 درجة.
  4. معالجة عينة خشب البراعم.
    تنبيه: يحتوي BTE على أجزاء متحركة عالية السرعة. يجب أن تحدث جميع العمليات داخل غطاء الدخان. يجب على جميع المستخدمين استخدام النظارات الواقية وأغطية الأذن (سدادات الأذن) وجميع معدات الحماية الشخصية الأخرى (PPE) ، مثل القفازات ومعاطف المختبر.
    1. اضغط على الزر الأسود العلوي لبدء تشغيل الجهاز. اضغط مرة ثانية لإيقاف المحرك في أي وقت أثناء المعالجة.
      ملاحظة: يحتوي الصندوق على مستشعر السرعة ودرجة الحرارة لضمان عمله بشكل صحيح.
    2. أمسك بعصا واحدة من خشب البراعم من خلال الكيس ، وضعها في الجزء العلوي من فوهة BTE.
    3. أمسك عصا خشب البراعم على الجانب الآخر من الحجرة باليد الأخرى ، وببطء بوصة لأسفل في النصل. استمع إلى صوت طنين لطيف يشير إلى تجريد خشب البراعم من لحاءه. حرك خشب البراعم ببطء ذهابا وإيابا أثناء تدويره.
      1. إذا سمع صوت تقطيع عال وقوي ، فقم بتحريك الفرع بسرعة إلى الأعلى و / أو اضغط على الزر العلوي لإيقاف المحرك. لإيقاف المحرك ، استخدم المفتاح الأيمن لإنهاء المعالجة (انظر الخطوة 4.4.3.2).
      2. إذا لم تخرج أي مادة من المخرج عند القطع ، فإن الغرفة بها انسداد. قم بإيقاف تشغيل المحرك ، وإزالة غطاء المكبس المنزلق ، واستخدم بلاستيك المسحة لدفع الانسداد خارج مخرج الماكينة. استخدم مفتاح الجانب الأيمن لإنهاء المعالجة: أعلى = قطع أمامي ؛ الأوسط = إيقاف المحرك ؛ أسفل = قطع عكسي.
    4. كرر الخطوة 4.4.2 والخطوة 4.4.3 للفروع المتبقية.
      ملاحظة: المؤشر العام على تجريد ما يكفي من لحاء خشب البراعم هو عندما يتم ملء 25٪ من المحقنة بالأنسجة النباتية. يمكن توزيع مسببات الأمراض المنقولة بالكسب غير المشروع من الحمضيات بشكل غير متساو في الشجرة. لذلك ، يتم جمع ثلاث إلى أربع عينات من خشب البراعم من حول مظلة شجرة الحمضيات. من المهم لكل عينة من خشب البراعم في كيس حامل BTE المساهمة في عينة الأنسجة الأرضية النهائية لضمان اختبار عينة تمثيلية كاملة للشجرة بحثا عن مسببات الأمراض.
    5. اضغط على الزر الأسود العلوي لإيقاف المعالجة. انتظر حتى يبدأ الضوء في الوميض باللون الأصفر مرة أخرى.
  5. تحقق من وزن العينة.
    1. قم بتدوير المحقنة 90 درجة ، واسحبها لأسفل لفصلها. ضع المكبس مرة أخرى على المحقنة ، وضع المحقنة على البرج.
    2. انتظر حتى يكتشف الميزان العينة تلقائيا، وحدد ما إذا كانت ضمن نطاق الوزن المناسب (0.25 ± 0.05 جم). إذا كان وزن العينة منخفضا جدا (<0.20 جم) ، كرر الخطوة 4.4 ؛ سيبدأ مؤشر LED الأحمر في الوميض. إذا كان وزن العينة مرتفعا جدا (>0.30 جم) ، فقم بإزالة بعض مواد العينة ؛ سيبدأ مؤشر LED الأصفر في الوميض ببطء أكثر. إذا كانت العينة ضمن النطاق ، فسيبدأ مؤشر LED الأخضر في الوميض.
  6. تجانس عينة خشب البراعم
    1. قم بإزالة المكبس من المحقنة مع العينة ، وادفع السائل إلى المحقنة مع العينة ، وأعد إضافة المكبس. يدفع المكبس المخزن المؤقت وعصارة النبات من خلال مرشح الشبكة (حجب أي قطع كبيرة من أنسجة اللحاء) وعبر الأنبوب المطاطي في المحقنة الفارغة.
    2. امزج العينة عن طريق دفع المخزن المؤقت وعصارة النبات ذهابا وإيابا من حقنة إلى أخرى. كرر ~ 3x-4x وحتى تصبح العينة خليط سائل أخضر متجانس.
    3. بمجرد التجانس جيدا ، ادفع عينة عصارة النبات إلى المحقنة بدون مرشح الشبكة ، وافصل الأنبوب المطاطي والمحقنة بالمرشح عن المحقنة بالعينة.
    4. اطرد عينة عصارة النبات من المحقنة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 2 مل ، واحفظه في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى. استخدم علامة دائمة لتسمية العينة برقم الكيس.
      ملاحظة: يمكن الآن معالجة عصارة عينة النبات من الخطوة 4.6.5 بأي من الحمض النووي المتاح أو الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي ، أو طرق الاستخراج القائمة على الفينول كلوروفورم ، أو عمود السيليكا ، أو الخرز المغناطيسي9،25،26،27 لاستخراج الحمض النووي وتنقيته (انظر الخطوة 7) والكشف النهائي عن مسببات الأمراض المنقولة بالكسب غير المشروع للحمضيات (انظر الخطوة 8).

5. تعقيم غرفة BTE القابلة للإزالة

تنبيه: إذا وصل المخزن المؤقت من مجموعة المحقنة إلى الحجرة أو الشريحة ، اشطفها واتبع جميع قواعد السلامة الخاصة بالمختبر قبل التنظيف. تحتوي مجموعة المحاقن على ثيوسيانات جواندين. إذا لامس المخزن المؤقت من مجموعة المحقنة مادة التبييض ، فسوف ينتج غاز السيانيد.

  1. نفذ الخطوات التالية بعد معالجة العينة 10 في الغرفة. لاحظ أن مؤشر LED الأخضر سيستمر في الوميض بدلا من الانتقال إلى الوميض الأزرق.
  2. تفكيك غرفة BTE لتنظيف جميع الملوثات المحتملة ؛ قم بإزالة الغطاء البلاستيكي الشفاف ، وقم بإزالة شريحة الحجرة ، وقم بمسح منفذ الانسداد على شريحة الحجرة.
  3. أدر صمام تحرير الهواء الموجود أسفل الحجرة إلى الوضع المفتوح (علامة القفل المفتوحة). ضع مكونات الحجرة في منظف الإعداد بالموجات فوق الصوتية (انظر الخطوة 3.1). ضع الغطاء تحت الحجرة لمنعها من الطفو. قم بتشغيل المنظف بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن لحمام التنظيف بالموجات فوق الصوتية (5 لتر) استيعاب ما يصل إلى غرفتين.
  4. شطف مكونات الغرفة في حمام مائي (الخطوة 3.4) لمدة 30 ثانية على الأقل. انقل مكونات الغرفة إلى محطة التجفيف.
    تنبيه: سيؤدي التجفيف إلى أجزاء سريعة الحركة داخل الحجرة ، وضوضاء عالية (~ 85 ديسيبل [ديسيبل]) ، ورذاذ محتمل. يجب على جميع المستخدمين استخدام النظارات الواقية وأغطية الأذن (سدادات الأذن) ومعاطف المختبر وجميع معدات الوقاية الشخصية الأخرى كما هو مطلوب بموجب قواعد السلامة الخاصة بمختبر التشغيل.
  5. جفف غرفة BTE.
    1. ضع مسدس الهواء في خط مع أخدود الفتحة العلوية للغرفة (حيث تكون الشريحة عادة). اضغط على زناد البندقية لتوزيع الهواء لمدة ~ 30 ثانية.
      ملاحظة: تأكد من أن الفتحة بعيدة عن المستخدم باتجاه الخلفية. يجب أن يؤدي ذلك إلى تدوير مجموعة الشفرة لإزالة السائل المحبوس تحتها.
    2. ضع مسدس الهواء باتجاه الفوهات العلوية للغرفة. اضغط على زناد مسدس الهواء ، وتتبع ببطء ثلاث دوائر كاملة لكل مدخل فوهة.
    3. ضع مسدس الهواء في وسط BTE. بدءا من النقطة الأعمق ، اضغط مع الاستمرار على الزناد ، وتحرك حتى يشير مسدس الهواء نحو مكان الشريحة.
    4. قم بتشغيل الهواء بسرعة فوق الغرفة بأكملها ، من الأمام والخلف ، لإخراج المياه السطحية من الخارج.
  6. جفف شريحة BTE.
    1. ضع مسدس الهواء في فتحة المكبس للشريحة ، واضغط على الزناد لإخراج الماء من مخرج الشريحة.
    2. قم بتشغيل مسدس هوائي على طول السطح الداخلي للشريحة لتجفيفه.
    3. قم بتشغيل مسدس هوائي على طول أخدود الشريحة لدفع الماء للخارج.
    4. قم بتشغيل الهواء بسرعة على السطح الخارجي بالكامل للحصول على المياه السطحية منه.
  7. تجفيف المكونات.
    1. أمسك غطاء المكبس المنزلق والحلقات O في متناول اليد ، واضغط على الزناد.
    2. قم بتشغيل مسدس هوائي على السطح الداخلي للغطاء.
    3. ضع المكونات في الحجرة وحركها لمواصلة تجفيفها أو إعادة تجميعها.
      ملاحظة: بالنسبة لبيئة معالجة الأنسجة العالية مع BTEs وظيفية متعددة ، يمكن توفير نظام تعقيم دفعي قادر على تطهير 10 غرف في وقت واحد.

6. التخلص والتعقيم

  1. تخلص من المحاقن والأنابيب المطاطية في حاوية نفايات الغوانيدين المخصصة.
  2. تخلص من أي مادة نباتية في حاوية النفايات الخطرة بيولوجيا.
  3. قم بإزالة حجرة BTE من قاعدة BTE.
  4. قم بتفكيك غرفة BTE وانتقل إلى إزالة التلوث منها ، كما هو موضح في الخطوة 5.

7. تقييم معالجة الأنسجة وجودة الحمض النووي الريبي المنقى من مستخلصات خشب براعم الحمضيات BTE

ملاحظة: في هذا البروتوكول ، استخدمنا عينات من خشب البراعم من 255 شجرة حمضيات لمقارنة الوقت اللازم لمعالجة أنسجة خشب براعم الحمضيات وجودة الحمض النووي الريبي المنقى من مستخلصات أنسجة اللحاء المحضرة بواسطة BTE (الشكل 2 ، الجانب الأيمن ، الخطوة 1 ، الخطوة 5 ، والخطوة 6) مقابل تلك المعدة باتباع طريقة معالجة أنسجة خشب الحمضيات المعتمدة تنظيميا باستخدام التقشير اليدوي والتقطيع ، التجفيف بالتجميد والسحق والطرد المركزي لأنسجة اللحاء ، كما وصفها Dang et al.23 (الشكل 2 ، الجانب الأيسر ، الخطوات 1-6).

  1. الإجراء المختبري الحالي: تحضير عينات خشب البراعم لمعالجة الأنسجة وفقا للطريقة المعتمدة تنظيميا23.
    1. قم بإجراء تقشير وتقطيع أنسجة اللحاء يدويا ، والتجفيف بالتجميد ، والسحق ، والطرد المركزي ، ونقل عصارة النبات إلى أنبوب استخراج الحمض النووي الريبي ، كما هو موضح بواسطة Dang et al.23 (الشكل 2 ، الجانب الأيسر ، الخطوات 1-6).
    2. بعد تقشير ثلاث إلى أربع عينات من خشب البراعم يدويا من كل شجرة تم اختبارها ، ضع كل خشب البراعم داخل حامل أكياس بلاستيكية متوافق مع BTE ، وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى معالجة BTE (الخطوة 7.2).
  2. إجراء BTE: بدء معالجة أنسجة براعم الحمضيات BTE (القسم 4 ، الخطوات 4.1-4.6 ؛ الشكل 2 ، الجانب الأيمن ، الخطوة 1 ، الخطوة 5 ، والخطوة 6).
    1. استخدم عينات خشب البراعم المخزنة داخل أكياس حامل BTE من الخطوة 7.1.2.
  3. استخراج وتنقية الحمض النووي الريبي من عصارة النبات التي تم الحصول عليها من الإجراء المختبري الحالي (الخطوة 7.1.1) وإجراء BTE (الخطوة 7.2.2) باستخدام الطريقة شبه الآلية المعتمدة تنظيميا القائمة على الخرزة المغناطيسية8،23،28.
  4. تقييم جودة الحمض النووي الريبي من خلال قياس تركيزه ونقاوته وسلامته8،23،24،29،3 3،31.
    1. لحساب التركيز ، استخدم القياس الطيفي والكثافة الضوئية (OD) بطول موجي 260 نانومتر.
    2. لتقييم النقاء ، استخدم نسبة OD الطيفية 260/280.
    3. للتحقق من السلامة ، استخدم تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) بالنسخ العكسي (RT) الذي يستهدف mRNA لجين الحمضيات NADH dehydrogenase24,32.

8. تقييم التلوث المتبادل والكشف عن فيروسات الحمضيات والفيروسات باستخدام الحمض النووي الريبي المنقى من مستخلصات خشب براعم الحمضيات BTE

ملاحظة: في هذا البروتوكول، استخدمنا عينات من خشب البراعم من 72 شجرة حمضيات غير مصابة ومزيج شجرة واحدة مصابة بالفيروسات والفيروسات لتقييم إمكانية التلوث المتبادل بين العينات عند معالجتها بواسطة BTE (الشكل 2، الجانب الأيمن، الخطوة 1، الخطوة 5، والخطوة 6) ومدى ملاءمة الحمض النووي الريبي المنقى من مستخلصات أنسجة اللحاء التي أعدها بنك تونس و الإمارات لاستخدامه كنموذج للكشف عن RT-qPCR لفيروسات الحمضيات والفيروسات.

  1. المعالجة الأولى لعينات BTE: إجراء تجربة أساسية مع 72 عينة غير مصابة.
    1. قم بإعداد ثلاث غرف (A-C) BTE (الخطوة 4.1.1).
    2. تحضير جميع عينات خشب براعم الحمضيات غير المصابة (1-72) في أكياس حاملة ل BTE ، وإعداد عدد متساو (72) في نظام جمع العينات BTE ثنائي الحقن ، مع نظام حقنة واحد لكل عينة (الخطوة 2.4).
    3. افصل أكياس حامل العينات ومحاقن جمع العينات إلى ست دفعات (I-VI) من 12 عينة لكل منها.
    4. ابدأ معالجة أنسجة براعم الحمضيات BTE (الخطوة 4) باتباع التسلسل أدناه (الخطوات 8.1.4.1-8.1.4.6) (انظر الجدول 1 ، معالجة عينة BTE الأولى).
      1. بالنسبة للدفعة الأولى / العينات 1-12 ، قم بمعالجة 12 عينة باستخدام الحجرة A. تعقيم الغرفة A بعد العينة 12 (الخطوة 5).
      2. بالنسبة للدفعة الثانية / العينات 13-24 ، قم بمعالجة 12 عينة باستخدام الحجرة B. تعقيم الغرفة B بعد العينة 24 (الخطوة 5).
      3. بالنسبة للدفعة الثالثة / العينات 25-36 ، قم بمعالجة 12 عينة باستخدام الحجرة C. تعقيم الغرفة C بعد العينة 36 (الخطوة 5).
      4. بالنسبة للدفعة الرابعة/العينات 37-48، عالج 12 عينة باستخدام الحجرة المعقمة A (الخطوة 8-1-4-1).
      5. بالنسبة للدفعة V/العينات 49--60، عالج 12 عينة باستخدام الحجرة المعقمة B (الخطوة 8-1-4-2).
      6. بالنسبة للدفعة السادسة/العينات 60-72، قم بمعالجة 12 عينة باستخدام الحجرة المعقمة C (الخطوة 8-1-4-3).
    5. قم بتخزين أكياس ناقل BTE مع جميع العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام في الخطوة 8.2.
    6. استخراج وتنقية الحمض النووي الريبي من 72 عينة من عصارة النبات المتولدة في الخطوات 8.1.4.1-8.1.4.6 باستخدام الطريقة شبه الآلية المعتمدة تنظيميا القائمة على الخرزة المغناطيسية8،23،28.
    7. إجراء RT-qPCR للكشف عن فيروسات الحمضيات والفيروسات ، كما هو موضح سابقا 8,33.
  2. بالنسبة لمعالجة عينة BTE الثانية ، قم بإجراء تجربة التلوث المتبادل مع 70 عينة غير مصابة وعينتين مصابتين مختلطتين.
    1. قم بإعداد ثلاث غرف (A-C) BTE (الخطوة 4.1.1).
    2. تحضير عينة خشب براعم الحمضيات المصابة بالمزيج (73) في كيسين حاملين ل BTE (الخطوة 1.3) لإجمالي عدد عينتين مصابتين.
    3. اجمع أكياس حامل BTE مع عينات خشب براعم الحمضيات غير المصابة من الخطوة 8.1.5 ، باستثناء العينة 3-Batch I والعينة 51-Batch V (انظر استبدال العينة في الخطوة 8.2.4) ، لإجمالي عدد 70 عينة غير مصابة.
    4. قم بتضمين الحقيبة الحاملة الأولى ل BTE مع العينة المصابة بالمزيج 73 بدلا من العينة 3 في الدفعة الأولى والثانية بدلا من العينة 51 في الدفعة V لإجمالي عدد 72 عينة.
    5. إعداد عدد متساو (72) في نظام جمع العينات BTE ثنائي الحقن، مع نظام حقنة مزدوجة لكل عينة (الخطوة 2.4).
    6. افصل أكياس نقل العينات البالغ عددها 72 ومحاقن جمع العينات إلى ست دفعات (I-VI) من 12 عينة لكل منها.
    7. ابدأ معالجة أنسجة براعم الحمضيات BTE (الخطوة 4) ، باتباع نفس التسلسل كما في الخطوات 8.1.4.1-8.1.4.6.
      ملاحظة: الفرق الوحيد هو استبدال العينة 3 في الدفعة الأولى والعينة 51 في الدفعة الخامسة بالعينة المصابة 73 (الخطوة 8.2.4) (الجدول 1 ، معالجة عينة BTE الثانية).
    8. استخراج وتنقية الحمض النووي الريبي من 72 عينة من عصارة النبات المتولدة في الخطوة 8.2.7 كما في الخطوة 8.1.6.
    9. قم بإجراء RT-qPCR للكشف عن فيروسات الحمضيات والفيروسات ، كما في الخطوة 8.1.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخراج الحمض النووي الريبي وتنقيته وجودته باستخدام أنسجة حمضيات خشب البراعم المعالجة ب BTE وتقييم الوقت اللازم لمعالجة الأنسجة
استخدمنا عينات من خشب البراعم من 255 شجرة حمضيات تمثيلية لهذا الاختبار لمقارنة جودة الحمض النووي الريبي من BTE مقابل الإجراء القياسي. تمت معالجة العينات بواسطة مستخرج أنسجة خشب البراعم (BTE) (خطوات البروتوكول 4.1-4.6 والشكل 2 ، الجانب الأيمن ، الخطوة 1 ، الخطوة 5 ، والخطوة 6) أو تم تحضيرها باتباع طريقة معالجة أنسجة خشب براعم الحمضيات المعتمدة تنظيميا ، والتي تستخدم تقشير اليدين وتقطيعه ، والتجفيف بالتجميد ، والسحق ، والطرد المركزي لأنسجة اللحاء ، كما هو موضح بواسطة Dang et al.23 (الشكل 2 ، الجانب الأيسر ، الخطوات 1-6).

أظهرت المقارنة جنبا إلى جنب بين BTE وبروتوكول التقطيع اليدوي التقليدي والمعدات المختبرية لمعالجة أنسجة الحمضيات أن جودة (أي تركيز ونقاوة وسلامة) الأحماض النووية المستخرجة (الشكل 3A-C) ومدى ملاءمتها للاستخدام النهائي للكشف عن PCR لمسببات الأمراض الحمضيات (البيانات غير معروضة) كانت قابلة للمقارنة. وفي الوقت نفسه، تم تقليل الوقت المستغرق في معالجة العينات بشكل كبير باستخدام نظام TE/BTE. وضاعف برنامج BTE إنتاجية العينات في مختبر CCPP ، مما قلل من تكاليف العمالة ومعدات المختبرات من خلال القضاء على الحاجة إلى عشرات الآلاف من الدولارات من الأدوات ، مثل مضارب الخرز وأجهزة الطرد المركزي ومحطات التبريد.

كان متوسط تركيز الأحماض النووية المستخرجة باستخدام BTE 76.96 نانوغرام / ميكرولتر ± 26.23 نانوغرام / ميكرولتر (ن = 181) وكانت عالية النقاء ، مع تلوث منخفض بالبروتين (A260 / A280 2.27 ± 0.17 ، ن = 181) (الشكل 3B ، C). كانت هذه القيم قابلة للمقارنة مع الأحماض النووية التي ينتجها البروتوكول اليدوي القياسي ل CCPP (التركيز: 82.25 نانوغرام / ميكرولتر ± 33.95 نانوغرام / ميكرولتر ، ن = 181 و A260 / A280 2.22 ± 0.10 ، ن = 181) (الشكل 3 ب ، ج). كانت سلامة الحمض النووي (RT-qPCR لجين الحمضيات nad5) متشابهة جدا مع BTE (Cq 20.97 ± 2.26 ، n = 181) وبروتوكول CCPP اليدوي القياسي (Cq 19.25 ± 1.53 ، n = 181) (الشكل 3A). وأظهرت النتائج أيضا أن أداة BTE يمكنها معالجة حجم عينة أكبر في نفس الإطار الزمني مقارنة بالطريقة التقليدية. يتطلب إجراء المختبر التقليدي ~ 7-10 دقائق للتقطيع اليدوي لكل عينة وما مجموعه 12 دقيقة لمعالجة الأنسجة (التجفيف بالتجميد والطحن والطرد المركزي) ، بينما يمكن ل BTE معالجة أنسجة الحمضيات لاستخراج الحمض النووي في ~ 3 دقائق لكل عينة.

Figure 3
الشكل 3: جودة مستخلصات الحمض النووي ل 181 عينة تمثيلية من خشب براعم الحمضيات ، كما هو محدد بالتركيز والنقاء والسلامة. تمت معالجة العينات من قبل BTE وبروتوكول التقطيع اليدوي التقليدي ومعدات المختبرات. (أ) حدد تركيز الحمض النووي باستخدام الامتصاص عند 260 نانومتر؛ (ب) تم تحديد النقاء على أنه نسبة الامتصاص عند 260 نانومتر و 280 نانومتر (A260/280). (ج) تم تحليل سلامة الحمض النووي بواسطة RT-qPCR الذي استهدف mRNA لجين الحمضيات NADH dehydrogenase (Nad5). يشار إلى نطاقات القيم المثلى بين الدوائر الحمراء المتقطعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكشف عن مسببات الأمراض المنقولة بالكسب غير المشروع للحمضيات ، وتقييم التلوث المتبادل ، والكشف عن فيروسات الحمضيات والفيروسات باستخدام الحمض النووي الريبي المنقى من مستخلصات براعم الحمضيات BTE
تم تقييم صحة طريقة معالجة الأنسجة من خلال معالجة 72 عينة صحية من خشب براعم الحمضيات جنبا إلى جنب مع جميع العينات الصحية ومع إدخال عينتين من مزيج الأشجار المصابة بالفيروسات والفيروسات (الجدول 1 والشكل 4 أ ، ب). خضعت الأحماض النووية المستخرجة من كلتا الدفعتين ل q-PCR التقليدي القائم على المختبر كما هو موضح سابقا 8,33. لم تقدم أي من العينات الصحية ال 72 من معالجة عينات BTE الأولى منحنيات تضخيم لمسببات الأمراض الحمضية التي تم اختبارها (أي الإيجابيات الكاذبة) (الشكل 4 أ). تشير النتائج إلى أن BTE يمكنه معالجة أنسجة الحمضيات بشكل جيد على قدم المساواة مقارنة بالبروتوكول المختبري القياسي باستخدام طرق التقطيع اليدوي. في المعالجة الثانية لعينات BTE ، قمنا بتقييم إمكانية التلوث المتبادل بين رؤوس BTE وداخل العينات المعالجة بنفس رأس BTE (الخطوات 1-6) ومدى ملاءمة الأحماض النووية للتطبيقات النهائية (أي لاستخدامها كنموذج للكشف عن RT-qPCR لفيروسات الحمضيات والفيروسات). في معالجة عينة BTE الثانية مع عينتين مصابتين بالمزيج ، تم استخدام الأحماض النووية التي ينتجها بروتوكول BTE بنجاح للكشف عن فيروسات وفيروسات الحمضيات المختلفة (على سبيل المثال ، الفيروس الثلاثي ، فيروس بقع أوراق الحمضيات [CLBV] ، فيروس الصدفية الحمضية [CPsV] ، فيروس تريستيزا الحمضيات [CTV]) ، apscaviroids (فيروس أوراق الحمضيات المنحنية [CBLVd] ، فيروسي تقزم الحمضيات [CDVd] ، فيروسي الحمضيات V [CVd-V] ، فيروسي الحمضيات السادس [CVd-VI] ، وفيروسي الحمضيات السابع [CVd-VII]) ، فيروسي حيلة هوب غير apscaviroids (HSVd ؛ hostuviroid) ، فيروسي تكسير لحاء الحمضيات (CBCVd ؛ cocadviroid) ، وفيروسي الحمضيات exocortis (CEVd ؛ pospiviroid) في الدفعة 1 والدفعة 5. ضمن الدفعة 1 والدفعة 5 ، كانت العينات التي تلت الدفعة المصابة إيجابية للأمراض النباتية المذكورة أعلاه ولكن كانت قيم Cq متزايدة. ومع ذلك ، لم يتم الكشف عن أي تلوث متبادل بين الرؤوس ولا أي نتائج إيجابية أو سلبية خاطئة (الشكل 4 ب).

الدفعه عينة بي تي إي أول بنك تونس و تي إي بنك تونس و الإمارات الثاني
غرفة معالجة العينات معالجة العينات
أنا 12-يناير A 1-12 غير مصاب 1-2 و 4-12 غير مصاب
يتم استبدال العينة # 3 بمزيج مصاب
الثاني 13-24 B 13-24 13-24
غير مصاب غير مصاب
الثالث 25-36 C 25-36 25-36
غير مصاب غير مصاب
رابعا 37-48 أ- معقم 37-48 37-48
غير مصاب غير مصاب
V 49-60 ب-معقم 49-60 49-50 و 52-60 غير مصاب
غير مصاب
يتم استبدال العينة # 51 بمزيج مصاب
السادس 61-72 ج- معقم 61-72 غير مصاب 61-72 غير مصاب

الجدول 1: العملية المتبعة للتحقق من صحة طريقة معالجة الأنسجة BTE باستخدام 72 عينة من خشب براعم الحمضيات. تم تكرار كل معالجة مرتين. كان هناك 6 دفعات مع 12 عينة لكل منها. في معالجة العينة الأولى ، كانت جميع عينات خشب براعم الحمضيات البالغ عددها 72 عينة صحية. في المعالجة الثانية لعينة BTE ، تم استبدال العينة 3 والعينة 51 بعينتين من مزيج شجرة مصاب بالفيروسات والفيروسات في الدفعة 1 والدفعة 5.

Figure 4
الشكل 4: التحقق من صحة طريقة معالجة الأنسجة BTE باستخدام 72 عينة من خشب براعم الحمضيات. تم تكرار كل معالجة مرتين. كان هناك 6 دفعات مع 12 عينة لكل منها. (أ) كانت جميع عينات خشب براعم الحمضيات البالغ عددها 72 عينة سليمة. (ب) نفس عينات خشب براعم الحمضيات البالغ عددها 72 عينة مع إدخال عينتين من مزيج شجرة مصاب بالفيروسات والفيروسات في الدفعة 1 (العينة 3) والدفعة 5 (العينة 51). كان لكل من NTC وضوابط المياه قيم Cq غير محددة (أي هدف الحمض النووي غير موجود في العينة). كانت الضوابط الإيجابية للثلاثي (CLBV و CPsV و CTV) تحتوي على قيم Cq 23.9 و 25.2 و 22.4 على التوالي. كانت الضوابط الإيجابية ل apscaviroids (CBLVd و CDVd و CBCVd) تحتوي على قيم Cq 23.39 و 21.27 و 25.17 على التوالي. كانت الضوابط الإيجابية لغير apscaviroids (CEVd ، HSVd ، IV) لها قيم Cq 26.9 و 27.0 و 26.5 على التوالي. الاختصارات: BTE = مستخرج أنسجة خشب البراعم ؛ NTC = عنصر تحكم بدون قالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: إعداد محطة التنظيف. بعد معالجة العينة العاشرة في الغرفة ، يجب اتباع خطوات البروتوكول 3.1-3.6 لإعداد محطة التنظيف لتعقيم الغرفة. كما هو الحال في بروتوكول الخطوة 3.1 ، يتم وضع 1 لتر من الماء في منظف بالموجات فوق الصوتية. يتم لف كيسين من القمامة فوق الجزء العلوي من منظف الموجات فوق الصوتية (خطوة البروتوكول 3.2) ، ويتم سكب ~ 5 لتر من التبييض بنسبة 10٪ (محلول هيبوكلوريت الصوديوم 1٪) في منظف الموجات فوق الصوتية (خطوة البروتوكول 3.3). يمتلئ حوض الماء بما يكفي من الماء لغمر غرفة (خطوة البروتوكول 3.4) ، ويتم إيقاف تشغيل ضاغط الهواء ، ويتم فتح الصمام (خطوة البروتوكول 3.5). يتم إعداد خلفية لالتقاط السائل أثناء تجفيف الغرفة (خطوة البروتوكول 3.6). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مع ظهور مرض الحمضيات HLB ، لتقليل الخسائر ، تم حث صناعة الحمضيات والوكالات التنظيمية ومختبرات التشخيص على الاعتماد على طرق استخراج الحمض النووي عالية الإنتاجية جنبا إلى جنب مع المعالجة اليدوية منخفضة الإنتاجية للعينات وفحوصات الكشف عن مسببات الأمراض مثل qPCR34 لاختبار الأشجار الفردية ، جنبا إلى جنب مع ممارسات إدارة الأمراض35. ارتفع معدل إيجابية HLB في كاليفورنيا من 0.01٪ في عام 2012 إلى 1.2٪ في عام 2020. على الرغم من أن qPCR هو أداة قوية وموثوقة للكشف عن مسببات الأمراض ، إلا أن التقنيات المتاحة حاليا لا تسمح بأخذ عينات كافية من الأنسجة النباتية ومعالجتها ، مما يؤدي إلى نقص واضح في أخذ العينات ونقص الاختبار ل CLas في أشجار الحمضيات في كاليفورنيا. يحدث نقص العينات والاختبار الناقص فيما يتعلق بكل من عدد الأشجار التي تم اختبارها وكمية المواد النباتية لكل شجرة تتم معالجتها (أي عدد الأوراق) ، وبسبب التوزيع المتقطع للأوراق المصابة داخل مظلة الشجرة ، هناك احتمال كبير لفقدان العدوى المبكرة أو الخفيفة. لا يمكن للطرق الحالية لأخذ العينات واختبار CLas أن تتوسع مع زيادة الطلب بسبب التكاليف (مثل العمالة والمعدات). حاليا ، تتطلب طريقة معالجة العينات التي تستخدمها معظم مختبرات تشخيص الحمضيات في كاليفورنيا للحصول على الأحماض النووية المناسبة لاختبار مسببات الأمراض الحمضيات أكثر من 17 ساعة للتعامل اليدوي مع العينات والإمدادات والمعدات المتخصصة التي تكلف أكثر من 100000 دولار.

هنا ، نقدم التحقق من صحة أداة متخصصة مصممة لمعالجة أنسجة لحاء براعم الحمضيات بسرعة ، تسمى مستخرج أنسجة خشب البراعم (BTE) ، وبروتوكول مفصل خطوة بخطوة لمعالجة العينات لمختبرات تشخيص الحمضيات. ركز البحث على تطوير طريقة مبتكرة لمعالجة الأنسجة لتحل محل التقطيع اليدوي الحالي كثيف العمالة لعينات خشب البراعم وبناء أعلى إنتاجية وأكثرها فعالية من حيث التكلفة أداة معالجة خشب براعم الحمضيات. أظهرت النتائج أن BTE يزيد من إنتاجية العينة ويقلل من تكلفة المعدات واللوازم المستخدمة في مختبر التشخيص CCPP. تتضمن التكنولوجيا والطريقة المقدمة أيضا استخدام علامات NFC وتطبيق الهاتف وقاعدة بيانات عبر الإنترنت لتتبع معلومات العينات في الوقت الفعلي. بعد جمع عينات خشب البراعم ، يربط تطبيق الهاتف مقطع حقيبة عينة NFC بعلامة شجرة NFC. ثم يتم شحن العينات إلى المختبر لمعالجتها باستخدام آلة BTE. يتم تسجيل المعلومات الخاصة بكل عينة بتمريرة سريعة عبر جانب جسم بنك تونس و إمر. من خلال علامة NFC النموذجية ، يتم أيضا تسجيل وقت المعالجة لكل عينة ووزن العينة وتحميلها إلى قاعدة البيانات عبر الإنترنت في الوقت الفعلي. توفر هذه الطريقة نظاما فعالا للغاية من حيث الوقت ، وتحسن مراقبة الجودة (أي عن طريق تجنب أخطاء تحديد هوية العينة) ، وتزيد من كفاءة المختبر.

تم إجراء المعالجة عالية الإنتاجية والتحقق من BTE مع عينات الحمضيات "الواقعية / الميدانية" ، مما يدل على أن مختبرات التشخيص الأخرى يمكنها بسهولة اعتماد التكنولوجيا والمنهجية. سيسمح اعتماد هذه التقنية بتقليل التكاليف التشغيلية وزيادة القدرة التشخيصية وكفاءة المختبر ، وبالتالي زيادة فرص تحديد الأشجار المريضة في مرحلة مبكرة بعد حدوث العدوى وتقليل فرص انتشار المرض. توضح المقارنة جنبا إلى جنب بين BTE وطرق معالجة الأنسجة التقليدية أن جودة الحمض النووي المستخرج (أي التركيز والنقاء والسلامة) ونتائج الكشف عن مسببات الأمراض النهائية قابلة للمقارنة (الشكل 3A-C). ومع ذلك، يتم تقليل الوقت المستغرق في معالجة العينات بشكل كبير باستخدام BTE مقارنة ببروتوكولات المعالجة اليدوية (أي 3.3 دقيقة مقابل 6.8 دقيقة). تتطلب الغرف وقاعدة BTE جدول تنظيف منتظم. على الرغم من أن التنظيف يستغرق وقتا طويلا ويشكل قيدا على الطريقة ، إلا أن التكنولوجيا تسمح بمعالجة عينات متعددة بسرعة في BTE قبل الحاجة إلى تنظيف الغرفة. تتطلب الطرق التقليدية تنظيفا أقل لأن كل عينة لها حاوية معالجة خاصة بها ، والتي ، في كثير من الحالات ، يمكن التخلص منها ، لكنها تحتاج إلى المزيد من الحاويات ومساحة التخزين (على سبيل المثال ، ثلاجات 4 درجات مئوية ومجمدات -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية).

تم تصميم وبناء عملية BTE لزيادة احتمالية تحديد منطقة مشكلة عن طريق معالجة العينات السائبة واختبارها (أي العثور على شجرة مريضة داخل كتلة أساس كبيرة للبلازما الوراثية للحمضيات أو مشتل أو بستان) عن طريق إجراء عدد صغير فقط من الاختبارات المجمعة التي يمكنها تحديد النقاط الساخنة. لذلك ، فإنه ينحرف فقط عند العثور على نتيجة إيجابية. عندما يحدث هذا (الشكل 4B ، الدفعة 1 والدفعة 5) ، يلزم معالجة العينات اللاحقة واختبار العينات الفردية من نفس الدفعة التي تحتوي على المادة الإيجابية (أي مجموعة فرعية فقط من العينات) لتحديد العينات الإيجابية. وبالتالي ، من المهم ملاحظة أن هذا الإجراء مناسب بشكل أساسي للحالات ذات معدلات الإصابة المنخفضة ، حيث يسمح باختبار كمية كبيرة من المواد من العديد من الأشجار ، مما يزيد في المقابل من احتمال اكتشاف المرض دون الحاجة إلى اختبار عدد كبير من العينات الفردية. ستكون الطرق التقليدية هي الخيار الأمثل في الحالات ذات معدلات الإصابة المرتفعة ، لأنها تسمح باختبار كل عينة على حدة. هذا مهم بشكل خاص في حالة مسوحات HLB في كاليفورنيا20 (لا يزال معدل إيجابية HLB منخفضا) ، حيث تهدف الطرق المستخدمة القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل للكشف عن CLas في المقام الأول إلى تأكيد وجود أو عدم وجود CLas في الأشجار التي لا تظهر عليها أعراض (أي عدم وجود بقع نموذجية أو اصفرار المظلة أو انخفاض الأشجار) التي تعرضت لسيلليدات الحمضيات الآسيوية الإيجابية CLas (ACP). بالنظر إلى حقيقة أننا لا نعرف أين تغذى ACP المعدية في الشجرة ، فإن فرص تحديد شجرة مصابة ولكن بدون أعراض في الحقل أو في أي منطقة أو عملية كبيرة أخرى عن طريق اختبار عدد صغير من العينات منخفضة للغاية (على سبيل المثال ، في كاليفورنيا ، يتم حاليا جمع 20 ورقة ، ويتم اختبار 12 ورقة لكل شجرة20). من الواضح أنه كلما كانت مظلة الشجرة أكبر ، قلت فرص اكتشاف CLas. على الرغم من أن تكاليف تفاعل البوليميراز المتسلسل نفسه (أي الكواشف ، ومعدات المختبرات الأساسية ، والدورة الحرارية) ، التي تتبع معالجة العينات ، واستخراج الحمض النووي وتنقيته تستمر دون تغيير في عملية BTE ، فإن عدم اليقين بشأن مكان جمع العينات من الأشجار التي لا تظهر عليها أعراض لتحديد ما إذا كانت مصابة أم لا لا يزال قائما ، وفي رأينا ، هو كعب أخيل لمسح HLB في كاليفورنيا. ستسمح الأداة المقدمة والتكنولوجيا والطريقة والتحسينات بمعالجة أحجام عينات أكبر في وقت أقصر وبتكلفة أقل. لذلك ، ستزيد هذه الطريقة من احتمالية تحديد الأشجار المصابة في الوقت المناسب وتحسين جهود القضاء على HLB أو مسببات الأمراض الغازية الأخرى للحمضيات في كاليفورنيا (على سبيل المثال ، فيروس إزالة الوريد الأصفر للحمضيات المبلغ عنه في كاليفورنيا في أغسطس 2022).

وإلى جانب أساليب المعالجة الآلية للأنسجة، فإن أخذ العينات والاختبار بالجملة سيسمح بتخفيض تكاليف معالجة الأنسجة النباتية. سيسمح هذا التخفيض في التكلفة للعديد من مختبرات التشخيص بفحص البساتين بشكل أكثر فعالية في العديد من الولايات وتتبع حركة HLB والأمراض الأخرى بشكل أفضل. في نهاية المطاف ، هذا يعني أن المزارعين سيكون لديهم أداة أكثر فعالية لإبطاء انتشار الأمراض من خلال اختبارات أكثر كفاءة على نطاق واسع. في حين أن أداة BTE يمكن أن تحسن القدرة التشخيصية الحالية لمختبرات الحمضيات وتفيد صناعة الحمضيات بأكملها ، في الوقت نفسه ، يمكن أيضا نقل التكنولوجيا إلى محاصيل الأشجار الأخرى. أشارت البيانات الأولية لتركيز الحمض النووي ونقاوته ، كما قدرت OD ، إلى أن BTE يمكنها معالجة الأنسجة بشكل فعال من اللوز (59.87 نانوغرام / ميكرولتر ± 7.43 نانوغرام / ميكرولتر و A260 / A280 1.17 ± 0.05 ، ن = 9) ، كرمة العنب (135.74 نانوغرام / ميكرولتر ± 50.74 نانوغرام / ميكرولتر و A260 / A280 1.17 ± 0.06 ، ن = 9) ، والخوخ (66.50 نانوغرام / ميكرولتر ± 6.07 نانوغرام / ميكرولتر و A260 / A280 1.29 ± 0.05 ، n = 9) (العينات مقدمة من خدمات مصنع الأساس في جامعة كاليفورنيا في ديفيس).

ألهمت منصة معالجة الأنسجة من خشب البراعم المعروضة هنا تطوير معدات إضافية لمعالجة الأنسجة النباتية. على سبيل المثال ، مستخرج أنسجة الأوراق (LTE) قيد التطوير حاليا. أظهرت نتائج الاختبارات الأولية باستخدام أوراق الحمضيات أن أداة LTE يمكنها معالجة حوالي سبعة أضعاف الأوراق مع زيادة بنسبة 35٪ فقط في وقت المعالجة مقارنة بالطريقة القياسية الحالية المكونة من 12 ورقة المستخدمة في كاليفورنيا20. لقد قدرنا أن بروتوكول أخذ العينات والاختبار بالجملة المدعوم من LTE يمكن أن يقلل التكلفة الإجمالية لكل اختبار لأوراق الحمضيات بمقدار الربع. البحث لإثبات قيمة التطبيق العملي لهذه التكنولوجيا مستمر حاليا في إطار منحة CDFA المتخصصة في كتلة المحاصيل في مختبراتنا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

يعترف المؤلفون بشعب كاهويلا باعتباره الوصي التقليدي على الأرض التي تم الانتهاء من العمل التجريبي عليها. نحن ممتنون للبروفيسور نورمان إلستراند في جامعة كاليفورنيا ، ريفرسايد ، لتوفير مساحة مختبرية لتنفيذ الأنشطة البحثية لهذا المشروع في إطار مبادرة UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ). تم دعم هذا البحث من قبل CDFA - برنامج منحة كتلة المحاصيل المتخصصة (منحة رقم 18-0001-055-SC). وقدم أيضا دعم إضافي من مشروع CRB 6100؛ المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأمريكية ، 1020106 مشروع هاتش ؛ والشبكة الوطنية للنباتات النظيفة - خدمة فحص صحة الحيوان والنبات التابعة لوزارة الزراعة الأمريكية (AP17PPQS&T00C118 ، AP18PPQS&T00C107 ، AP19PPQS&T00C148 ، &AP20PPQS&T00C049) الممنوحة لجورجيوس فيدالاكيس.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.08" Hex Trimmer line PowerCare FPRO07065 Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor California Air Tools 8010 Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube Globe Scientific 111558B Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set Technology Evolving Solutions TE006-F1-10A-G1000-E1 Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach
12" Ruler Westcott ‎16012 To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite Hasa 1041 Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer Insignia NS-CZ70WH0 Store sample after processing
4" x 12" plastic bags Plymor FP20-4x12-10 Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab Puritan 806-PCL Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote HDX 206152 Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun JASTIND ‎JTABG103A Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie Sharpie  S-19421 Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor Brand Z627569 Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber Technology Evolving Solutions TE002BB-A05-E1 Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap Dawn 57445CT Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter Air Science P5-36XT-A Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container PolarTech 261/J50C Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat Red Kap KP14WH LN 46 Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop Microsoft Surface Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone Samsung Galaxy S9 Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag Technology Evolving Solutions TE005-Clip-E1 Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag Technology Evolving Solutions TE005-Collar-E1 Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves Usa Scientific 3915-4400 Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff 3M 90565-4DC-PS Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose FYPower ‎510019 Attaches air gun to compressor
Saftey glasses Solidwork SW8329-US Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle JohnBee B08QM81BJV Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base Technology Evolving Solutions TE001-A-E1 System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale Technology Evolving Solutions TE003-A05-200g-01-E1 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield 
Vermiculite EasyGoProducts B07WQDZGRP Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter Boenfu ‎BOWC-06002-US Wire cutters to cut trimmer line

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
  2. Vernière, C., et al. Citrus viroids: Symptom expression and effect on vegetative growth and yield of clementine trees grafted on trifoliate orange. Plant Disease. 88 (11), 1189-1197 (2004).
  3. Zhou, C., et al. Chapter 19 - Citrus viruses and viroids. The Genus Citrus. Talon, M., Caruso, M., Gmitter, F. G. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 391-410 (2020).
  4. Luckstead, J., Devadoss, S. Trends and issues facing the U.S. citrus industry. Choices Magazine Online. 36 (2), Available from: https://www.choicesmagazine.org/choices-magazine/theme-articles/trends-and-challenges-in-fruit-and-tree-nut-sectors/trends-and-issues-facing-the-us-citrus-industry (2021).
  5. Simnitt, S., Calvin, L. Fruit and Tree Nuts Outlook. United States Department of Agriculture-Economic Research Service. , Available from: https://www.ers.usda.gov/webdocs/outlooks/98171/fts-370.pdf?v=5697 (2020).
  6. Forsyth, J., Fruits Damiani, J. C. itrus Citrus Fruits. Types on the market. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. , Academic Press. Cambridge, MA. 1329-1335 (2003).
  7. Bostock, R. M., Thomas, C. S., Hoenisch, R. W., Golino, D. A., Vidalakis, G. Plant health: How diagnostic networks and interagency partnerships protect plant systems from pests and pathogens. California Agriculture. 68 (4), 117-124 (2014).
  8. Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).
  9. Wang, J., et al. Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale. Frontiers in Microbiology. 4, 366 (2013).
  10. Gergerich, R. C., et al. Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization. Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).
  11. Moreno, P., Ambrós, S., Albiach-Martí, M. R., Guerri, J., Peña, L. Citrus tristeza virus: A pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology. 9 (2), 251-268 (2008).
  12. Yokomi, R. K., et al. Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California. Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).
  13. Selvaraj, V., Maheshwari, Y., Hajeri, S., Yokomi, R. A rapid detection tool for VT isolates of Citrus tristeza virus by immunocapture-reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay. PLoS One. 14 (9), 0222170 (2019).
  14. Babcock, B. A. Economic impact of California's citrus industry in 2020. Journal of Citrus Pathology. 9, (2022).
  15. Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).
  16. Yokomi, R., et al. Molecular and biological characterization of a novel mild strain of citrus tristeza virus in California. Archives of Virology. 163 (7), 1795-1804 (2018).
  17. Fuchs, M., et al. Economic studies reinforce efforts to safeguard specialty crops in the United States. Plant Disease. 105 (1), 14-26 (2021).
  18. Singerman, A. The real cost of HLB in Florida. Citrus Industry Magazine. , Available from: https://citrusindustry.net/2019/07/30/the-real-cost-of-hib-in-florida/ (2019).
  19. McRoberts, N., et al. Using models to provide rapid programme support for California's efforts to suppress Huanglongbing disease of citrus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1776), 20180281 (2019).
  20. Albrecht, C., et al. Action plan for Asian citrus psyllid and huanglongbing (citrus greening) in California. Journal of Citrus Pathology. 7 (1), (2020).
  21. Navarro, L., et al. The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the period 1975-2001. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15 (15), (2002).
  22. Vidalakis, G., Gumpf, D. J., Polek, M. L., Bash, J. A. The California Citrus Clonal Protection Program. Citrus Production Manual. Ferguson, L., Grafton-Cardwell, E. E. , University of California, Agriculture and Natural Resources. Oakland, California. 117-130 (2014).
  23. Dang, T., et al. High-throughput RNA extraction from citrus tissues for the detection of viroids. In Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  24. Osman, F., Vidalakis, G. Real-time detection of viroids using singleplex and multiplex quantitative polymerase chain reaction. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  25. Li, R., et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Saponari, M., Manjunath, K., Yokomi, R. K. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 147 (1), 43-53 (2008).
  27. Damaj, M. B., et al. Reproducible RNA preparation from sugarcane and citrus for functional genomic applications. International Journal of Plant Genomics. 2009, 765367 (2009).
  28. Dang, T., et al. First report of citrus leaf blotch virus infecting Bearss lime tree in California. Plant Disease. 104 (11), 3088 (2020).
  29. Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques. 20 (6), 968-970 (1996).
  30. Teare, J. M., et al. Measurement of nucleic acid concentrations using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques. 22 (6), 1170-1174 (1997).
  31. Imbeaud, S. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 56-56 (2005).
  32. Menzel, W., Jelkmann, W., Maiss, E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods. 99 (1-2), 81-92 (2002).
  33. Vidalakis, G., et al. SYBR Green RT-qPCR for the universal detection of citrus viroids. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. , Humana. New York, NY. 211-217 (2022).
  34. Arredondo Valdés, R., et al. A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus. Canadian Journal of Microbiology. 62 (10), 803-811 (2016).
  35. Li, S., Wu, F., Duan, Y., Singerman, A., Guan, Z. Citrus greening: Management strategies and their economic impact. HortScience. 55 (5), 604-612 (2020).
  36. CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes. , Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 194 ، استخراج أنسجة البراعم ، تقطيع اليد ، "Candidatus Liberibacter asiaticus" ، CLas ، huanglongbing، HLB، فيروس تريستيزا الحمضيات ، CTV

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

to:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

أتمتة معالجة خشب براعم الحمضيات للكشف عن مسببات الأمراض النهائية من خلال هندسة الأدوات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E.,… More

Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E., Uribe, G., De Francesco, A., Milton, R., De La Torre, A., Mounkam, A., Dang, T., Bodaghi, S., Lavagi-Craddock, I., Syed, A., Grover, W., Okamba, A., Vidalakis, G. Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. J. Vis. Exp. (194), e65159, doi:10.3791/65159 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter