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Summary
師部が豊富な樹皮の柑橘類のつぼみ組織を迅速に処理する機器を設計、製造、検証しました。現在の方法と比較して、バッドウッド組織抽出器(BTE)はサンプルスループットを向上させ、必要な人件費と設備コストを削減しました。
Abstract
ウイルス、ウイロイド、バクテリアなどの柑橘類の移植片伝染性の師部制限病原体は、世界中で壊滅的な流行と深刻な経済的損失の原因となっています。たとえば、柑橘類のトリステザウイルスは世界中で1億本以上の柑橘類の木を殺しましたが、「Candidatus Liberibacter asiaticus」はフロリダに90億ドルの費用をかけました。病原体でテストされた柑橘類の芽を樹木の繁殖に使用することは、そのような病原体の管理にとって重要です。カリフォルニア大学リバーサイド校の柑橘類クローン保護プログラム(CCPP)は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイを使用して、カリフォルニアの柑橘類を保護し、全米クリーンプラントネットワークにクリーンな繁殖ユニットを提供するために、毎年柑橘類の芽木源の木から数千のサンプルをテストしています。柑橘類ウイルスおよびウイロイドのハイスループット分子検出における深刻なボトルネックは、植物組織処理ステップです。
適切な組織調製は、高品質の核酸の抽出とPCRアッセイにおけるダウンストリーム使用に不可欠です。核酸の分解を避けるために、低温での植物組織の粉砕、計量、凍結乾燥、粉砕、および遠心分離は、時間と労力を要し、高価で特殊な実験装置を必要とします。この論文では、柑橘類の芽から師部に富む樹皮組織を迅速に処理するように設計された、芽木組織抽出器(BTE)と呼ばれる特殊な機器の検証を紹介します。BTEは、現在の方法と比較してサンプルスループットを100%向上させます。さらに、それは人件費と設備のコストを削減します。この研究では、BTEサンプルのDNA収量(80.25 ng / μL)は、CCPPのハンドチョッピングプロトコル(77.84 ng / μL)に匹敵しました。この機器と迅速な植物組織処理プロトコルは、カリフォルニアのいくつかの柑橘類診断研究所とプログラムに利益をもたらし、世界中の他の木本多年生作物の組織処理のモデルシステムになります。
Introduction
ウイロイド、ウイルス、バクテリアなどの柑橘類の移植片伝染性師部制限病原体は、世界のすべての柑橘類生産地域で壊滅的な流行と深刻な経済的損失を引き起こしています。柑橘類のウイロイドは、三葉、三葉の雑種、みかん、クレメンタイン、みかんなどの経済的に重要な柑橘類の種類で引き起こす外皮質と悪液質の病気のために、生産要因を制限しています1,2,3。カリフォルニアでは、これらのウイロイドに敏感な柑橘類の種類は、皮をむきやすく、セグメント化され、種のない果物に対する消費者の好みの変化傾向に続いて、「イージーピーラー」の成長と収益性の高い市場の基盤となっています4,5,6。したがって、柑橘類のウイロイドは、カリフォルニア州食品農業省(CDFA)の「柑橘類の苗床害虫清浄度プログラム-上院法案140」の下で規制されており、CDFAの植物害虫診断部門の研究所は、毎年何千もの柑橘類のウイロイド検査を実施しています7,8,9,10 .カンキツトリステザウイルス(CTV)は、1930年代の世界的な流行が始まって以来、1億本以上の柑橘類の木の死の原因となっています3,9,10,11。カリフォルニアでは、ウイルスの茎の孔食と三葉の破壊抵抗分離株が、36億ドルのカリフォルニアの柑橘類産業に深刻な脅威をもたらします12,13,14。その結果、CDFAはCTVを規制されたクラスAの植物害虫として分類し、中央カリフォルニアトリステザ根絶局(CCTEA)の研究所は毎年広範な現地調査と数千のウイルス検査を実施しています15,16。細菌「Candidatus Liberibacter asiaticus」(CLas)と黄龍峰(HLB)病は、柑橘類の作付面積が40%減少し、柑橘類の操業が57%減少し、約8,000人の雇用が失われた結果、フロリダに90億ドル近くの経済的損害をもたらしたと推定されています17,18。カリフォルニア州では、HLBによる柑橘類の作付面積の仮想的な20%の減少は、8,200人以上の失業と州の国内総生産の50億ドル以上の減少をもたらすと予測されました。したがって、柑橘類の害虫および疾病予防プログラムは、カリフォルニア14,17,19,20からのCLaをテスト、検出、および根絶するための調査に年間4,000万ドル以上を費やしています。
柑橘類のウイロイド、ウイルス、バクテリアの管理の重要な要素は、樹木生産のための病原体テストされた繁殖材料(すなわち、芽木)の使用です。病原体検査済みの柑橘類の芽は、高度な病原体除去および検出技術を採用した包括的な検疫プログラム内で生産および維持されています10,21。カリフォルニア大学リバーサイド校の柑橘類クローン保護プログラム(CCPP)は、カリフォルニアの柑橘類を保護し、柑橘類の全国クリーンプラントネットワークの機能をサポートするために、州と米国に新たに輸入された柑橘類の品種と柑橘類の芽木源の木から毎年何千もの芽材サンプルをテストしています10,17,22.大量の柑橘類検査を処理するために、ハイスループット、信頼性が高く、費用対効果の高い病原体検出アッセイは、CCPP 7,10,22などのプログラムの成功のための基本的な要素です。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの分子ベースの病原体検出アッセイにより、植物診断ラボのスループットが大幅に向上しましたが、私たちの経験では、ハイスループットプロトコルの実装における最も重要なボトルネックの1つは、植物組織サンプル処理ステップです。これは、葉の葉柄や芽木の樹皮などの師部に富む組織の処理に現在利用可能なプロトコルが労働集約的で時間がかかり、高価で特殊な実験装置を必要とするため、特に柑橘類に当てはまります。これらのプロトコルでは、核酸の分解を避けるために、低温での手切り、計量、凍結乾燥、粉砕、および遠心分離が必要です8,23,24。たとえば、CCPP診断ラボでは、サンプル処理には、(i)手切り(6〜9サンプル/時間/オペレーター)、(ii)凍結乾燥(16〜24時間)、(iii)粉砕(30〜60秒)、および(iv)遠心分離(1〜2時間)が含まれます。このプロセスには、特殊な消耗品(頑丈な安全ロックチューブ、ステンレス鋼の粉砕ボール、アダプター、ブレード、手袋など)と複数の高価なラボ機器(超低冷凍庫、凍結乾燥機、組織粉砕機、液体窒素凍結、冷蔵遠心分離機など)も必要です。
他の業界と同様に、機器のエンジニアリングとプロセスの自動化は、コストを削減し、スループットを向上させ、高品質で均一な製品とサービスを提供するための鍵です。柑橘類業界では、操作に最小限のスキルしか必要としない低コストの組織処理機器が必要であり、診断ラボやフィールド操作に簡単に転送できるため、下流の病原体を迅速に検出するための高いサンプル処理能力が可能になります。テクノロジーエボリュービングソリューション(TES)とCCPPは、師部に富む柑橘類の組織(すなわち、芽)を迅速に処理するための低コスト(すなわち、特殊な実験装置の必要性を排除した)機器を開発(すなわち、設計および製造)し、検証しました(すなわち、柑橘類のサンプルでテストし、標準的な実験室手順と比較して)、芽木組織抽出器(BTE)と名付けました。 図1に示すように、BTEには、電源と制御用のベースコンポーネントに加えて、柑橘類の芽を処理するための取り外し可能なチャンバーが含まれています。BTEチャンバーは、師部に富む樹皮組織を柑橘類の芽から取り除くために特別に設計された砥石で構成されています。細断された樹皮組織は、スライドポートから抽出バッファーを含むシリンジに迅速に排出され、ろ過され、追加の取り扱いや準備なしで核酸の抽出と精製の準備が整います(図1)。BTEシステムには、ペーパーレスのサンプル追跡アプリケーションと統合された計量アプリケーションも含まれており、サンプル処理情報をオンラインデータベースにリアルタイムで記録します。
BTEシステムは、CCPPのラボ診断能力を100%以上向上させ、PCRアッセイを使用した高品質の核酸の精製と柑橘類の移植片伝染性病原体の下流検出に適した柑橘類組織抽出物を一貫して製造してきました。具体的には、BTEは組織処理の時間をサンプルあたり24時間以上から~3分に短縮し、60,000ドルを超えるラボ機器を置き換え(図2、ステップ2-4)、より大きなサンプルサイズの処理を可能にしました。
この論文では、CCPP Rubidoux Quarantine FacilityとLindcove Foundation Facilityからのすべての適切なポジティブコントロールとネガティブコントロールを含む、ソースツリーからの柑橘類の芽木サンプルを使用したBTEハイスループット柑橘類樹皮組織処理、核酸抽出、および病原体検出検証データを紹介します。また、現在のラボ手順と比較したスループットと処理時間の変化も示します(図2)。さらに、この作業は、柑橘類病原体検査ラボに詳細な段階的なプロトコルを提供し、BTEが病原体クリーンな苗床、調査、および根絶プログラムの機能をどのようにサポートできるかを示しています。
図1:バッドウッド組織抽出器。 BTEには、電源と制御用のベースコンポーネントに加えて、柑橘類の芽を処理するための取り外し可能なチャンバーが含まれています。BTEチャンバーは、師部に富む樹皮組織を柑橘類の芽から取り除くために特別に設計された砥石で構成されています。細断された樹皮組織は、スライドポートからシリンジに迅速に排出され、ろ過され、追加の取り扱いや準備なしで核酸の抽出と精製の準備が整います。略語:BTE =バッドウッド組織抽出器。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:従来のハンドチョッピングラボ手順とBTE処理の段階的な比較。 BTE処理には、ハイスループットの柑橘類樹皮組織処理、核酸抽出、および病原体検出が含まれます。各ステップの時間は括弧内に示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
1.柑橘類のつぼみサンプルを収集して出荷する
- テクノロジー進化ソリューションにツリー情報のスプレッドシートを送信して、Webサーバーにロードします(最終的には、ユーザーは新しいツリーを作成します)。
- 電話アプリ TES トラッカー を使用してツリーを選択し、近距離無線通信 (NFC) カラー タグを電話機に保持してツリー情報をタグに読み込みます。
- 3〜4個の柑橘類のつぼみサンプルをBTE互換のビニール袋キャリアに挿入し、蓋をして閉じます。
- つぼみの長さが8インチを超えず、5インチ以上であることを確認してください。
- 長さが8インチを超える場合は、滅菌済みの使い捨てかみそりの刃を使用するか、10%漂白剤溶液(1%次亜塩素酸ナトリウム)で除染した剪定ばさみを使用して短くします。
- 長さが5インチ未満の場合は、別のつぼみのサンプルを収集してバッグに入れます。
- 腋窩の成長や大きなとげは、手で、または10%の漂白消毒された切削工具(1%次亜塩素酸ナトリウム)を使用して除去するようにしてください。
注意: このステップは、つぼみがチャンバーの開口部で操作しやすくするために重要です。 - 湾曲した特徴を持つつぼみのサンプルがないことを確認してください。その場合は、10%漂白消毒切削工具(1%次亜塩素酸ナトリウム)を使用してそれらを取り除き、サンプルのまっすぐな部分のみをBTEバッグに入れます。
注意: 湾曲したつぼみは、機器への操作が非常に難しく、樹皮の縞模様が不均一になります。
- つぼみの長さが8インチを超えず、5インチ以上であることを確認してください。
- 電話アプリの TESトラッカー を使用して、ツリーのNFCカラータグをスキャンし、サンプルバッグのNFCクリップタグにリンクします。
- オペレーターがBTEチャンバー内の師部に富んだ芽木の樹皮をどのように剥がすかを決定するため、芽の木の厚さに注意してください。
- つぼみの厚さが0.20インチ未満の場合、チャンバー内の高速回転糸が芽木全体を樹皮層を超えて師部に富む木と髄の組織に粉砕するため、つぼみを剥がすときは注意してください。
- 師部が豊富でない芽木の組織を避けながら樹皮組織を剥がす方が簡単であるため、より厚い芽木を選択してください。
- サンプルをいくつかのアイスパックを備えた断熱輸送コンテナに入れます。
2.ドラフト内のセットアップ
注意: BTEはドラフト内で操作することをお勧めします。これにより、植物組織の相互汚染や実験室汚染のリスクが軽減されます。
- 10%(1%次亜塩素酸ナトリウム)スプレーボトルを使用して消毒します。
- フードの表面にスプレーし、漂白剤を約1分間放置してから、ペーパータオルで拭きます。
- ペーパータオルに漂白剤溶液をスプレーします。TE ベース、重量計コンポーネント (はかり、エア シールド、タワー)、およびマーカー ペンを拭きます。
- 処理するサンプル数分のシリンジセットを開梱し、蓋付きの段ボール箱に入れます。
- 必要に応じて、フードの外側に綿棒のパックを用意してください。
- 体重計を準備します。
- ウェイトタワーをはかりから取り外し、電源ボタンを押したままにして電源を入れます。スケールが0を表示した後、スケールの中央にタワーを配置します。
- 重量計のエアシールドをはかりの前面にスライドさせます。
- 背面のスイッチを切り替えて、組織抽出ベースを準備します。ボックスの左側にあるスイッチが上部で押されていることを確認します。チャンバーの準備ができていることを示す緑色のLEDが点滅するのを待ちます。
3.クリーニングステーションをセットアップします(補足図S1)。
- 超音波洗浄機に1Lの水を入れます。
- 超音波洗浄機の上部に2つのゴミ袋を巻きます。
- 10%漂白剤(1%次亜塩素酸ナトリウム溶液)を超音波洗浄機に~5L注ぎます。
- チャンバーを沈めるのに十分な水で水槽を満たします。
- エアコンプレッサーをオンにしてバルブを開きます。
- チャンバーの乾燥中に液体をキャッチするように背景を設定します。
4.柑橘類のつぼみ樹皮ストリッピング用のBTEの材料の処理
- チャンバーをBTEベースにロードします。
- BTEチャンバーを準備します。
- 空のサンプルバッグをチャンバーの背面に取り付けます。2つのOリングを使用して、空のバッグをBTEチャンバーのバックノズルに固定します。
- ブレードに摩耗や損傷の兆候がないか調べます(ブレードがプラスチックに続くところに切り傷が形成されている、または先端に切り傷が形成されているなど)。ブレードの矢印が単一のロック記号と一致していることを確認します。
- チャンバーの底部の空気放出が O 記号に向かっていることを確認します。チャンバーの開口部に透明な蓋を置き、チャンバーの右側のトラックを使用して透明なBTEスライドをチャンバーにスライドさせます。チャンバーの下部にあるロックをスライドに入ることができる限り押します。プランジャーキャップがスライドの上部に取り付けられていることを確認します。
- BTEベースのノズルをチャンバーの背面に突き出させて、チャンバーをBTEベースに置きます。青いLEDが点滅して、配置が成功したことを示すのを待ちます。
- BTEチャンバーを準備します。
- NFCクリップタグの白いステッカーをボックスの右側のZに移動して、サンプルをBTEベースにロードします。黄色のライトが点滅し始めるまで、Z上でゆっくりと円を描くようにタグを動かします。サンプルをBTEベースに取り付け、サンプルバッグに穴がないことを確認します。穴がある場合は、テープでパッチを当てます。Oリングをサンプルバッグの上に置き、BTEノズルの前面に固定します。
- 未使用のシリンジセットをロードします。
- シリンジセットを風袋引きします。未使用のシリンジセットを計量スケールタワーに置きます。赤いライトが点滅し始めたとき、またはスケールに0が表示されたら、シリンジセットを取り外します。
- フィルター付きのシリンジからプランジャーを取り外します。液体がボトム(非フィルター)シリンジに入っていることを確認します。プランジャーをペーパータオルの上、または黒いプランジャーが表面に触れていないタワーの上に置きます。
- 出口ポートをシリンジに押し込み、90°回転させて、シリンジをスライド出口ポートに取り付けます。
- つぼみのサンプルを処理します。
注意: BTEには高速可動部品があります。すべての操作はドラフト内で行う必要があります。すべてのユーザーは、保護眼鏡、イヤーマフ(耳栓)、および手袋や白衣などの他のすべての個人用保護具(PPE)を使用する必要があります。- 上部の黒いボタンを押して、マシンを起動します。もう一度押すと、処理中いつでもモーターが停止します。
注意: ボックスには速度と温度の検知機能があり、正しく機能することを確認します。 - バッグを通して1本のバッドウッドスティックをつかみ、BTEノズル の上部 に通します。
- もう一方の手でチャンバーの反対側にあるつぼみの棒をつかみ、ゆっくりとブレードにインチダウンします。つぼみが樹皮から剥ぎ取られていることを示す穏やかなブーンという音を聞いてください。つぼみを回転させながらゆっくりと前後に動かします。
- 大きくて攻撃的なチョッピング音が聞こえる場合は、ブランチをすばやく一番上に移動するか、トップボタンを押してモーターを停止します。モーターを停止するには、右側のスイッチを使用して処理を終了します(手順4.4.3.2を参照)。
- 切断時に出口から材料が出ていない場合は、チャンバーに詰まりがあります。モーターの電源を切り、スライドプランジャーキャップを取り外し、綿棒のプラスチックを使用して詰まりを機械の出口から押し出します。右側のスイッチを使用して処理を終了します:上=前方切断。中央=モーターオフ。ダウン=逆カット。
- 残りのブランチに対して手順 4.4.2 と手順 4.4.3 を繰り返します。
注意: 十分な芽木の樹皮が剥がれたことを示す一般的な指標は、注射器の25%が植物組織で満たされたときです。柑橘類の移植片伝染性病原体は、木に不均一に分布している可能性があります。そのため、柑橘類の樹冠周辺から3〜4本の芽木サンプルが採取されます。BTEキャリーバッグ内のすべてのバッドウッドサンプルが最終的な粉砕組織サンプルに寄与し、完全な樹木代表サンプルが病原体についてテストされることを確認することが重要です。 - 上部の黒いボタンを押して処理を停止します。ライトが再び黄色に点滅し始めるのを待ちます。
- 上部の黒いボタンを押して、マシンを起動します。もう一度押すと、処理中いつでもモーターが停止します。
- サンプルの重量を確認します。
- シリンジを90°回転させ、引き下げて取り外します。プランジャーをシリンジに戻し、シリンジをタワーに置きます。
- スケールがサンプルを自動検出するのを待ち、適切な重量範囲(0.25 ± 0.05 g)内にあるかどうかを判断します。サンプル重量が低すぎる(<0.20 g)場合は、ステップ4.4を繰り返します。赤いLEDが点滅し始めます。サンプルの重量が高すぎる(>0.30 g)場合は、サンプル材料の一部を取り除きます。黄色のLEDがゆっくり点滅し始めます。サンプルが範囲内にある場合、緑色のLEDが点滅し始めます。
- 芽木サンプルの均質化
- サンプルの入ったシリンジからプランジャーを取り外し、サンプルと一緒にシリンジに液体を押し込み、プランジャーを再度追加します。プランジャーは、バッファーと植物樹液をメッシュフィルター(大きな樹皮組織片を差し控える)とゴムチューブ を介して 空のシリンジに押し込みます。
- バッファーと植物樹液を一方のシリンジからもう一方のシリンジに前後に押してサンプルを混合します。~3x-4xを繰り返し、サンプルが均質な緑色の液体混合物になるまで繰り返します。
- 十分に均質化されたら、メッシュフィルターなしで植物樹液サンプルをシリンジに押し込み、ゴムチューブとフィルター付きシリンジをサンプル付きのシリンジから取り外します。
- 植物樹液サンプルをシリンジから2 mL滅菌マイクロ遠心チューブに排出し、さらに使用するまで-20°Cで保存します。永久マーカーを使用して、サンプルにバッグ番号のラベルを付けます。
注:ステップ4.6.5の植物サンプル樹液は、利用可能な核酸、RNAまたはDNA、フェノール-クロロホルム、シリカカラム、または磁気ビーズ9,25,26,27に基づく抽出方法のいずれかで処理できるようになりました核酸抽出および精製(ステップ7を参照)および柑橘類の移植片伝染性病原体の下流検出(ステップ8を参照)。
5. BTEリムーバブルチャンバーの消毒
注意: シリンジセットのバッファーがチャンバーまたはスライドに付着した場合は、すすぎ、実験室のすべての安全規則に従って清掃してください。シリンジセットにはチオシアン酸グアニジンが含まれています。シリンジセットのバッファーが漂白剤と接触すると、シアン化物ガスが発生します。
- 10番目のサンプルがチャンバー内で処理された後、次の手順を実行します。緑色のLEDは青色の点滅に移動するのではなく、点滅し続けることに注意してください。
- BTEチャンバーを分解して、考えられるすべての汚染物質を洗浄します。透明なプラスチックカバーを取り外し、チャンバースライドを片付け、チャンバースライドの詰まりポートを外します。
- チャンバー底部のエアリリースバルブを開いた位置に回します(南京錠のマークが開いています)。チャンバーコンポーネントをセットアップ超音波洗浄機に配置します(手順3.1を参照)。チャンバーが浮かないように、チャンバーの下に蓋を置きます。超音波洗浄機を15分間実行します。
注意: 超音波洗浄槽(5 L)は、最大2つのチャンバーを保持できます。 - チャンバーコンポーネントを水浴(ステップ3.4)で少なくとも30秒間すすぎます。チャンバーコンポーネントを乾燥ステーションに移動します。
注意: 乾燥すると、チャンバー内の部品の動きが速くなり、大きな音(~85デシベル[dB])、および飛散する可能性があります。すべてのユーザーは、手術室の安全規則で義務付けられている保護眼鏡、イヤーマフ(耳栓)、白衣、およびその他すべてのPPEを使用する必要があります。 - BTEチャンバーを乾燥させます。
- エアガンをチャンバーの上部開口部の溝(通常はスライドがある場所)に沿って配置します。ガンの引き金を押して、~30秒間空気を分配します。
注意: 開口部がユーザーから背景に向かって離れていることを確認してください。これにより、ブレードセットが回転して、その下に閉じ込められた液体が除去されます。 - エアガンをチャンバーの上部ノズルに向けて配置します。エアガンのトリガーを押し、各ノズル入口の3つの完全な円をゆっくりとトレースします。
- エアガンをBTEの中央に配置します。最も内側のポイントから開始して、トリガーを押したまま、エアガンがスライドがある場所を指すまで移動します。
- チャンバー全体を前後にすばやく空気を流して、表面の水を外部から取り除きます。
- エアガンをチャンバーの上部開口部の溝(通常はスライドがある場所)に沿って配置します。ガンの引き金を押して、~30秒間空気を分配します。
- BTE スライドを乾かします。
- エアガンをスライドのプランジャースロットに配置し、トリガーを押してスライド出口から水を排出します。
- スライドの内面に沿ってエアガンを走らせて乾かします。
- スライド溝に沿ってエアガンを走らせて水を押し出します。
- 外装全体にすばやく空気を流して、地表水を取り除きます。
- コンポーネントを乾燥させます。
- スライドプランジャーキャップとOリングを手に持ち、トリガーを押します。
- 蓋の内面にエアガンをかぶせます。
- コンポーネントをチャンバーに入れ、スライドさせて乾燥を続けるか、再組み立てします。
注:複数の機能的なBTEを備えた高組織処理環境では、10個のチャンバーを同時に除染できるバッチ消毒システムを提供できます。
6.廃棄と消毒
- シリンジとゴムチューブは、指定されたグアニジン廃棄物容器に廃棄してください。
- バイオハザード廃棄物容器内の植物材料を廃棄してください。
- BTEチャンバーをBTEベースから取り外します。
- BTEチャンバーを分解し、手順5の説明に従って除染に進みます。
7.BTE柑橘類の芽木抽出物から精製されたRNAの組織処理と品質の評価
注:このプロトコルでは、255本の柑橘類の木からの芽木サンプルを使用して、柑橘類の芽木の組織処理に必要な時間と、BTEによって調製された樹皮組織抽出物から精製されたRNAの品質(図2、右側、ステップ1、ステップ5、およびステップ6)を、手の皮むきと切り刻みを利用する規制で承認された柑橘類のつぼみ組織処理法に従って調製したものと比較しました。 バーク組織の凍結乾燥、粉砕、および遠心分離は、Dangら23 によって記載されている(図2、左側、ステップ1〜6)。
- 現在の実験室手順:規制で承認された方法23に従って、組織処理用の芽木サンプルを準備します。
- Dangら23 (図2、左側、ステップ1〜6)に記載されているように、樹皮組織の手剥離および細断、凍結乾燥、粉砕、遠心分離、および植物液のRNA抽出チューブへの移し替えを行う(図2、左側、ステップ1〜6)。
- テストした各木から3〜4本の芽木サンプルを手で剥がした後、すべての芽木をBTE互換のビニール袋キャリアに入れ、BTE処理まで4°Cで保管します(ステップ7.2)。
- BTE手順:BTE柑橘類のつぼみ組織の処理を開始します(セクション4、ステップ4.1〜4.6; 図2、右側、ステップ1、ステップ5、およびステップ6)。
- ステップ7.1.2のBTEキャリーバッグ内に保管されているバッドウッドサンプルを使用します。
- 規制で承認された半自動磁気ビーズベースの方法8,23,28を使用して、現在の実験室手順(ステップ7.1.1)およびBTE手順(ステップ7.2.2)から得られた植物樹液からRNAを抽出して精製します。
- RNAの濃度、純度、完全性を測定することにより、RNAの品質を評価します8,23,24,29,3 3,31。
- 濃度を計算するには、波長260 nmでの分光光度法と光学密度(OD)を使用します。
- 純度を評価するには、260/280の分光光度OD比を使用します。
- 完全性をチェックするには、NADHデヒドロゲナーゼシトラス遺伝子24,32のmRNAを標的とする逆転写(RT)定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)反応を使用します。
8. BTE柑橘類の芽木抽出物から精製したRNAを用いた柑橘類ウイルスとウイロイドの交差汚染と検出の評価
注:このプロトコルでは、72本の非感染柑橘類の木とウイルスとウイロイドに混合感染した1本の木の芽木サンプルを使用して、BTEで処理した場合のサンプル間の相互汚染の可能性(図2、右側、ステップ1、ステップ5、およびステップ6)と、柑橘類ウイルスおよびウイロイドのRT-qPCR検出のテンプレートとして使用するBTEによって調製された樹皮組織抽出物から精製されたRNAの適合性を評価しました。
- 最初のBTEサンプル処理:72の非感染サンプルでベースライン実験を実施します。
- 3つの(A-C)BTEチャンバーを準備します(ステップ4.1.1)。
- すべての非感染柑橘類芽サンプル(1-72)をBTEキャリーバッグで準備し、2シリンジBTEサンプル収集システムで、各サンプルに1つのシリンジシステムで同数(72)を準備します(ステップ2.4)。
- サンプルキャリーバッグとサンプル収集シリンジを、それぞれ12サンプルの6つのバッチ(I-VI)に分けます。
- 以下のシーケンス(ステップ8.1.4.1-8.1.4.6)に従って、BTE柑橘類のつぼみ組織処理(ステップ4)を開始します( 表1、最初のBTEサンプル処理を参照)。
- バッチI/サンプル1〜12の場合、チャンバーAを使用して12サンプルを処理し、サンプル12の後にチャンバーAを消毒します(ステップ5)。
- バッチII/サンプル13〜24の場合、チャンバーBを使用して12サンプルを処理し、サンプル24の後にチャンバーBを消毒します(ステップ5)。
- バッチIII/サンプル25-36の場合、チャンバーCを使用して12サンプルを処理し、サンプル36の後にチャンバーCを消毒します(ステップ5)。
- バッチIV /サンプル37〜48の場合、消毒チャンバーAを使用して12サンプルを処理します(ステップ8.1.4.1)。
- バッチV /サンプル49--60の場合、消毒チャンバーBを使用して12サンプルを処理します(ステップ8.1.4.2)。
- バッチVI /サンプル60〜72の場合、消毒チャンバーCを使用して12サンプルを処理します(ステップ8.1.4.3)。
- すべてのサンプルが入ったBTEキャリーバッグは、ステップ8.2で使用するまで4°Cで保管してください。
- ステップ8.1.4.1-8.1.4.6で生成された72個の植物樹液サンプルから、規制で承認された半自動磁気ビーズベースの方法8,23,28を使用してRNAを抽出し、精製します。
- 前述のように、柑橘類ウイルスおよびウイロイドの検出のためにRT-qPCRを行う8、33。
- 2回目のBTEサンプル処理では、70個の非感染サンプルと2個の混合感染サンプルでクロスコンタミネーション実験を実行します。
- 3つの(A-C)BTEチャンバーを準備します(ステップ4.1.1)。
- 混合感染した柑橘類のつぼみサンプル(73)を2つのBTEキャリーバッグ(ステップ1.3)に入れて、合計2つの感染サンプルを調製します。
- サンプル3-バッチIとサンプル51-バッチV(ステップ8.2.4のサンプル交換を参照)を除く、ステップ8.1.5の非感染柑橘類の芽のサンプルを含むBTEキャリーバッグを収集し、感染していないサンプルの総数70個を収集します。
- バッチIのサンプル3の代わりに混合感染サンプル73を入れた最初のBTEキャリーバッグと、バッチVのサンプル51の代わりに2番目のBTEキャリーバッグを含めて、合計72サンプルにします。
- 2シリンジBTEサンプル収集システムに同数(72)を準備し、各サンプルに1つのダブルシリンジシステムを用意します(ステップ2.4)。
- 72個のサンプルキャリアバッグとサンプル収集シリンジを、それぞれ12サンプルの6つのバッチ(I-VI)に分けます。
- 手順 8.1.4.1-8.1.4.6 と同じ手順に従って、BTE 柑橘類のつぼみ組織の処理 (手順 4) を開始します。
注:唯一の違いは、バッチIのサンプル3とバッチVのサンプル51を感染したサンプル73に置き換えることです(ステップ8.2.4)(表1、2番目のBTEサンプル処理)。 - ステップ8.1.6と同様に、ステップ8.2.7で生成された72個の植物樹液サンプルからRNAを抽出して精製します。
- ステップ8.1.7のように、柑橘類のウイルスとウイロイドの検出のためにRT-qPCRを実行します。
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Representative Results
BTE処理した柑橘類組織を用いたRNA抽出・精製・品質および組織処理時間の評価
このテストでは、255本の代表的な柑橘類の木の芽木サンプルを使用して、BTEのRNA品質と標準的な手順を比較しました。サンプルは、バッドウッド組織抽出器(BTE)(プロトコルステップ4.1〜4.6および 図2、右側、ステップ1、ステップ5、およびステップ6)によって処理されるか、Dangらによって説明されているように、樹皮組織の手の剥離およびチョッピング、凍結乾燥、粉砕、および遠心分離を利用する規制的に承認された柑橘類のつぼみ組織処理方法に従って調製された23(図2、 左側、ステップ1〜6)。
BTEと柑橘類組織処理のための従来の手切りおよび実験装置プロトコルとを並べて比較したところ、抽出された核酸の品質(すなわち、濃度、純度、および完全性)(図3A-C)および柑橘類病原体のPCR検出のための下流使用への適合性(データは示されていません)は同等であることが示されました。同時に、TE/BTE システムを使用すると、サンプルの処理に費やす時間が大幅に短縮されました。BTEは、CCPPラボのサンプルスループットを2倍以上にし、ビーズビーター、遠心分離機、低温ステーションなどの数万ドルの機器の必要性を排除することで、人件費とラボ機器のコストを削減しました。
BTEで抽出された核酸の平均濃度は76.96 ng/μL±26.23 ng/μL(n = 181)で、高純度でタンパク質混入は低かった(A260/A280 2.27 ± 0.17, n = 181)(図3B,C)。これらの値は、CCPPの標準マニュアルプロトコル(濃度:82.25 ng/μL ± 33.95 ng/μL、n = 181およびA260/A280 2.22 ± 0.10、n = 181)によって産生された核酸に匹敵した(図3B、C)。核酸の完全性(柑橘類遺伝子nad5のRT-qPCR)は、BTE(Cq 20.97 ± 2.26、n = 181)および標準的な手動CCPPプロトコル(Cq 19.25 ± 1.53、n = 181)で非常に類似していました(図3A)。結果はまた、BTE装置が従来の方法と比較して同じ時間枠でより多くのサンプル量を処理できることを実証しました。従来のラボ手順では、サンプルあたり手で細断するのに~7〜10分、組織処理(凍結乾燥、粉砕、遠心分離)に合計12分かかりましたが、BTEは核酸抽出用の柑橘類組織をサンプルあたり~3分で処理できました。
図3:181の代表的な柑橘類の芽のサンプルの核酸抽出物の品質、濃度、純度、および完全性によって定義される。 サンプルは、BTEおよび従来の手切りおよび実験装置のプロトコルによって処理されました。(a)核酸濃度は、260nmの吸光度を用いて決定した。(b)純度は、260nmと280nmにおける吸光度の比(A260/280)として求めた。(c)NADHデヒドロゲナーゼ(Nad5)柑橘類遺伝子のmRNAを標的とするRT-qPCRにより核酸完全性を解析した。最適値の範囲は、赤い破線の円の間に示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
柑橘類の移植片伝染性病原体の検出、交差汚染の評価、およびBTE柑橘類の芽から精製したRNAを用いた柑橘類ウイルスおよびウイロイドの検出
組織処理方法の妥当性は、72の健康な柑橘類の芽のサンプルをすべての健康なサンプルと並べて処理し、ウイルスとウイロイドに感染した樹木ミックスからの2つのサンプルを導入することによって評価されました(表1 および 図4A、B)。両方のバッチから抽出された核酸を、前述のように従来のラボベースのq−PCRに供した8、33。最初のBTEサンプル処理からの72の健康なサンプルのいずれも、テストされた柑橘類病原体の増幅曲線(すなわち、偽陽性)を与えませんでした(図4A)。結果は、BTEが手切り法による標準的な実験室プロトコルと比較して、柑橘類組織を同等に処理できることを示唆しています。2回目のBTEサンプル処理では、BTEヘッド間および同じBTEヘッドで処理されたサンプル内のクロスコンタミネーションの可能性(ステップ1〜6)と、ダウンストリームアプリケーション(柑橘類ウイルスおよびウイロイドのRT-qPCR検出のテンプレートとして使用する)に対する核酸の適合性を評価しました。2つの混合感染サンプルを導入した2回目のBTEサンプル処理では、BTEプロトコルによって生成された核酸を使用して、さまざまな柑橘類ウイルスおよびウイロイド(トリプレックスウイルス、カンキツ葉斑ウイルス[CLBV]、カンキツ乾癬ウイルス[CPsV]、カンキツトリステザウイルス[CTV])、アプスカビロイド(柑橘類ベントリーフウイロイド[CBLVd]、カンキツ矮性ウイロイド[CDVd]、カンキツウイロイドV [CVd-V]、 カンキツウイロイドVI[CVd-VI]、およびカントラスウイロイドVII[CVd-VII])、バッチ1およびバッチ5の非アプスカビロイドホップスタントウイロイド(HSVd;ホストビロイド)、柑橘類樹皮クラッキングウイロイド(CBCVd;コカドビロイド)、およびカントラス外皮質ウイロイド(CEVd;ポスピビロイド)。バッチ1とバッチ5では、感染したサンプルに続くサンプルは、上記の植物病害に対して陽性でしたが、Cq値が増加していました。ただし、ヘッド間の相互汚染も、偽陽性または陰性の結果も検出されませんでした(図4B)。
| バッチ | 見本 | ティッカー | 最初の BTE | 2 番目の BTE |
| 室 | サンプル処理 | サンプル処理 | ||
| 私 | 1月12日 | ある | 1-12 非感染 | 1-2 & 4-12 非感染 |
| サンプル #3 は、ミックス感染に置き換えられます | ||||
| 2 | 13-24 | B | 13-24 | 13-24 |
| 非感染 | 非感染 | |||
| 三 | 25-36 | C | 25-36 | 25-36 |
| 非感染 | 非感染 | |||
| 四 | 37-48 | A-サニタイズ | 37-48 | 37-48 |
| 非感染 | 非感染 | |||
| V | 49-60 | B-サニタイズ | 49-60 | 49-50 & 52-60 非感染 |
| 非感染 | ||||
| サンプル #51 は、ミックス感染に置き換えられます | ||||
| 六 | 61-72 | C-サニタイズ | 61-72非感染 | 61-72非感染 |
表1:72の柑橘類の芽木サンプルを使用したBTE組織処理方法の検証のために続いたプロセス。 各処理を2回繰り返した。それぞれ12サンプルの6つのバッチがありました。最初のサンプル処理では、72の柑橘類の芽のサンプルすべてが健康でした。第2のBTEサンプル処理において、サンプル3およびサンプル51は、バッチ1およびバッチ5においてウイルスおよびウイロイドに混合感染した樹木からの2つのサンプルと交換した。
図4:72個の柑橘類の芽のサンプルを使用したBTE組織処理方法の検証。 各処理を2回繰り返した。それぞれ12サンプルの6つのバッチがありました。(A)72の柑橘類のつぼみのサンプルはすべて健康でした。(B)同じ72個の柑橘類の芽木サンプルに、バッチ1(サンプル3)およびバッチ5(サンプル51)にウイルスとウイロイドを混合した樹木からの2つのサンプルを導入した。NTCおよび水コントロールはすべて、未決定のCq値(すなわち、DNA標的がサンプル中に存在しない)を有していた。トリプレックスのポジティブコントロール(CLBV、CPsV、CTV)のCq値は、それぞれ23.9、25.2、および22.4でした。アプスカビロイド(CBLVd、CDVd、およびCBCVd)のポジティブコントロールのCq値は、それぞれ23.39、21.27、および25.17でした。非アプスカビロイド(CEVd、HSVd、IV)のポジティブコントロールは、それぞれ26.9、27.0、および26.5のCq値を示しました。略語:BTE =バッドウッド組織抽出器;NTC = テンプレートなしのコントロール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図S1:クリーニングステーションのセットアップ。 10番目のサンプルがチャンバーで処理された後、プロトコルステップ3.1〜3.6に従って、チャンバーを消毒するための洗浄ステーションを準備します。プロトコルステップ3.1と同様に、1Lの水を超音波洗浄機に入れます。2つのゴミ袋を超音波洗浄機の上部に巻き付け(プロトコルステップ3.2)、~5Lの10%漂白剤(1%次亜塩素酸ナトリウム溶液)を超音波洗浄機に注ぎます(プロトコルステップ3.3)。水槽はチャンバーを沈めるのに十分な水で満たされ(プロトコルステップ3.4)、エアコンプレッサーがオフになり、バルブが開きます(プロトコルステップ3.5)。チャンバーの乾燥中に液体をキャッチするように背景が設定されます(プロトコルステップ3.6)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
HLB柑橘類病の出現により、損失を減らすために、柑橘類産業、規制当局、および診断研究所は、病気管理の実践と組み合わせて、個々の樹木の検査のために、低スループットの手動サンプル処理およびqPCR34 などの病原体検出アッセイと組み合わせたハイスループット核酸抽出法に依存するように促されています35.カリフォルニア州のHLB陽性率は、2012年の0.01%から2020年には1.2%になりました。qPCRは強力で信頼性の高い病原体検出ツールですが、現在利用可能な技術では十分な量の植物組織をサンプリングして処理することができず、カリフォルニアの柑橘類の木のCLasの明確なアンダーサンプリングとアンダーテストが発生します。アンダーサンプリングとアンダーテストは、テストされた木の数と処理される木あたりの植物材料の量(つまり、葉の数)の両方に関連して発生し、樹冠内の感染した葉の散発的な分布のために、早期または軽度の感染を見逃す可能性が高くなります。サンプリングとCLasテストの現在の方法は、コスト(人件費や設備など)のために需要の増加に合わせて拡張できません。現在、カリフォルニアのほとんどの柑橘類診断研究所が柑橘類病原体検査に適した核酸を取得するために使用しているサンプル処理方法は、手動のサンプル処理と100,000万ドル以上の費用がかかる特殊な消耗品と機器に17時間以上かかります。
ここでは、柑橘類の蕾木樹皮組織を迅速に処理するために設計された特殊な機器(蕾木組織抽出器(BTE)と名付けられた)の検証と、柑橘類の診断ラボ向けのサンプル処理の詳細な段階的なプロトコルを紹介します。この研究は、現在の労働集約的な手作業によるつぼみサンプルの細断に取って代わり、可能な限り最高のスループットで最も費用効果の高い柑橘類のつぼみ処理装置を構築する革新的な組織処理方法の開発に焦点を当てました。結果は、BTEがサンプルスループットを向上させ、CCPP診断ラボで使用される機器と消耗品のコストを削減することを示しています。提示された技術および方法はまた、NFCタグ、電話アプリ、およびリアルタイムのサンプル情報追跡のためのオンラインデータベースの使用を含む。つぼみのサンプルが収集された後、電話アプリはNFCサンプルバッグクリップをNFCツリータグにリンクします。その後、サンプルはBTEマシンで処理するためにラボに出荷されます。各サンプルの情報は、BTE本体の側面をすばやくスワイプするだけで記録されます。サンプルNFCタグを介して、各サンプルの処理時間とサンプルの重量も記録され、リアルタイムでオンラインデータベースにアップロードされます。この方法は、非常に時間効率の良いシステムを提供し、品質管理を改善し(すなわち、サンプルIDエラーを回避することにより)、ラボの効率を向上させます。
BTEのハイスループット処理と検証は、「実生活/現場」の柑橘類サンプルで実施され、他の診断ラボでもこの技術と方法論を容易に採用できることが実証されました。この技術を採用することで、運用コストを削減し、診断能力と検査効率を高めることができるため、感染発生後の早い段階で病気の木を特定する可能性が高くなり、病気の蔓延の可能性が低くなります。BTEと従来の組織処理法を並べて比較すると、抽出された核酸の品質(すなわち、濃度、純度、および完全性)と下流の病原体検出の結果が同等であることがわかります(図3A-C)。ただし、サンプルの処理に費やす時間は、手動処理プロトコルと比較してBTEを使用すると大幅に短縮されます(つまり、3.3分対6.8分)。チャンバーとBTEベースには、定期的な清掃スケジュールが必要です。洗浄には時間がかかり、方法の制限を構成しますが、この技術により、チャンバーの洗浄が必要になる前に、複数のサンプルをBTEで迅速に処理できます。従来の方法では、各サンプルには独自の処理容器があり、多くの場合使い捨てであるため、洗浄が少なくて済みますが、より多くの容器と保管スペースが必要です(たとえば、4°Cの冷蔵庫と-20°Cまたは-80°Cの冷凍庫)。
BTEプロセスは、ホットスポットを特定できる少数のバルクテストを実行するだけで、バルクサンプル処理とテスト(つまり、大きな柑橘類の生殖質基盤ブロック、苗床、または果樹園内で病気の木を見つける) によって 問題のある領域を特定する確率を高めるために考案および構築されました。したがって、肯定的な結果が見つかった場合にのみ逸脱します。これが発生した場合(図4B、バッチ1およびバッチ5)、後続のサンプル処理と、陽性物質を含む同じバッチからの個々のサンプル(つまり、サンプルのサブセットのみ)のテストを使用して、どのサンプルが陽性であるかを判断する必要があります。したがって、この手順は主に感染率が低い場合に適しており、多くの木から大量の材料を検査することができ、その見返りとして、多数の個々のサンプルを検査することなく疾患検出の可能性が高まることに注意することが重要です。従来の方法は、各サンプルを個別にテストできるため、感染率が高い場合に最適なオプションです。これは、カリフォルニア20 でのHLB調査(依然としてHLB陽性率が低い)の場合に特に重要であり、CLas検出に利用されるPCRベースの方法は、主にCLas陽性のアジア柑橘類オオバコ(ACP)にさらされた無症候性の樹木(すなわち、典型的な斑点斑、樹冠の黄変、または樹木の衰退がない)におけるCLasの有無を確認することを目的としています。感染性ACPが樹木のどこで摂食したかがわからないという事実を考えると、少数のサンプルをテストすることによって、野外または他の広い領域または操作で感染したが無症候性の樹木を特定する可能性は非常に低いです(たとえば、カリフォルニアでは、現在20枚の葉が収集され、12枚の葉が木ごとにテストされます20)。明らかに、樹冠が大きいほど、CLasが検出される可能性は低くなります。サンプル処理に続くPCR自体(試薬、基本的な実験装置、サーモサイクラー)のコスト、および核酸の抽出と精製のコストはBTEプロセスで変わりませんが、無症候性の樹木からサンプルをどこで収集して感染しているかどうかを判断するかに関する不確実性は依然として続いており、私たちの意見では、 カリフォルニアでのHLB調査のアキレス腱です。提示された機器、技術、方法、および改善により、より大きなサンプルサイズをより短時間で低コストで処理できるようになります。したがって、この方法は、感染した樹木をタイムリーに特定する可能性を高め、カリフォルニアのHLBまたはその他の柑橘類の侵入病原体(たとえば、2022年8月にカリフォルニアで報告された柑橘類の黄色静脈除去ウイルス)の根絶努力を改善します。
自動化された組織処理方法と組み合わせることで、バルクサンプリングとテストにより、植物組織処理コストを削減できます。このコスト削減により、多くの診断研究所は多くの州で果樹園をより効果的にスクリーニングし、HLBやその他の病気の動きをより適切に追跡できるようになります。最終的に、これは、生産者がより効率的な大規模な検査を通じて病気の蔓延を遅らせるためのより効果的なツールを持っていることを意味します。BTE装置は、柑橘類研究所の現在の診断能力を向上させ、柑橘類産業全体に利益をもたらすと同時に、この技術を他の樹木作物に移転することもできます。ODによって推定された核酸濃度と純度の予備データは、BTEがアーモンド(59.87 ng/μL ± 7.43 ng/μLおよびA260/A280 1.17 ± 0.05、n = 9)、グレープバイン(135.74 ng/μL ± 50.74 ng/μLおよびA260/A280 1.17 ± 0.06、n = 9)、およびモモ(66.50 ng/μL ± 6.07 ng/μLおよびA260/A280 1.29 ± 0.05、 n = 9)(カリフォルニア大学デービス校の財団プラントサービスから親切に提供されたサンプル)。
ここで紹介するバッドウッド組織処理プラットフォームは、追加の植物組織処理装置の開発に影響を与えました。たとえば、葉組織抽出器(LTE)は現在開発中です。柑橘類の葉を使用した予備テスト結果では、LTE機器がカリフォルニア20で使用されている現在の標準的な12葉の方法よりも処理時間がわずか35%増加するだけで、約7倍の葉を処理できることが実証されています。LTEがサポートするバルクサンプリングおよびテストプロトコルにより、柑橘類の葉のテストあたりの全体的なコストを4分の1に削減できると推定しています。この技術の実用化の価値を証明するための研究は、現在、私たちの研究所でCDFA特殊作物ブロック助成金の下で進行中です。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
Acknowledgments
著者らは、カフイラの人々を実験作業が完了した土地の伝統的な管理者として認めています。カリフォルニア大学リバーサイド校のノーマン・エルストランド教授には、UCRカリフォルニア農業食品企業(CAFÉ)イニシアチブの下でこのプロジェクトの研究活動を行うためのラボスペースを提供していただき、感謝しています。この研究は、CDFA-特殊作物ブロック助成プログラム(助成金番号18-0001-055-SC)の支援を受けました。追加のサポートはCRBプロジェクト6100によっても提供されました。USDA国立食糧農業研究所、ハッチプロジェクト1020106;National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Health Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, & AP20PPQS&T00C049) がゲオルギオス・ヴィダラキスに授与されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.08" Hex Trimmer line | PowerCare | FPRO07065 | Needed to replace blades. |
| 1 Hp, 8 gal air compressor | California Air Tools | 8010 | Quickly dry chambers after rinsed |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Globe Scientific | 111558B | Store sample in after swishing with syinges |
| 10 mL Syringe Set | Technology Evolving Solutions | TE006-F1-10A-G1000-E1 | Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach |
| 12" Ruler | Westcott | 16012 | To measure trimmer line before cutting |
| 12% Sodium Hypochlorite | Hasa | 1041 | Disinfects chambers after processing |
| -20 C Freezer | Insignia | NS-CZ70WH0 | Store sample after processing |
| 4" x 12" plastic bags | Plymor | FP20-4x12-10 | Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal |
| 6" Cotton Swab | Puritan | 806-PCL | Swab to remove clogs |
| 7 Gallon Storage Tote | HDX | 206152 | Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers |
| Air blow gun | JASTIND | JTABG103A | Directs air into the chambers at high pressure |
| Black Sharpie | Sharpie | S-19421 | Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later |
| Bottle Top Dispensor | Brand | Z627569 | Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe |
| BTE Chamber | Technology Evolving Solutions | TE002BB-A05-E1 | Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool |
| Dish Soap | Dawn | 57445CT | Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber |
| Fume hood with hepa filter | Air Science | P5-36XT-A | Fume hood with hepa filter (ASTS-030) to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Insulated foam shipping container | PolarTech | 261/J50C | Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected |
| Lab coat | Red Kap | KP14WH LN 46 | Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Laptop | Microsoft | Surface | Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base |
| NFC Capable Phone | Samsung | Galaxy S9 | Phone to download and use TES phone app |
| NFC clip tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Clip-E1 | Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app |
| NFC Collar Tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Collar-E1 | Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app |
| Nitrile Gloves | Usa Scientific | 3915-4400 | Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Noise-Reducing Earmuff | 3M | 90565-4DC-PS | Protect ears while operating air compressor and tissue processing base |
| Polyurethane Recoil Air Hose | FYPower | 510019 | Attaches air gun to compressor |
| Saftey glasses | Solidwork | SW8329-US | Protect eyes for chemical and physical hazards |
| Spray bottle | JohnBee | B08QM81BJV | Spray bleach to deconatinate surfaces |
| Tissue Extractor Base | Technology Evolving Solutions | TE001-A-E1 | System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench |
| Tissue Processing Base Weight Scale | Technology Evolving Solutions | TE003-A05-200g-01-E1 | 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield |
| Vermiculite | EasyGoProducts | B07WQDZGRP | Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service |
| Wire Cutter | Boenfu | BOWC-06002-US | Wire cutters to cut trimmer line |
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- CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes. , Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019).
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バイオエンジニアリング、第194号、バッドウッド組織抽出、ハンドチョッピング、「カンディダトゥス・リベリバクター・アジアティカス」、CLas、黄龍峰、HLB、 カントラストリステザ ウイルス、CTVErratum
Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023.
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An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:
Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside
to:
Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside
