Wir haben ein Instrument entwickelt, hergestellt und validiert, das phloemreiches Rindenknospenknospengewebe schnell verarbeitet. Im Vergleich zu aktuellen Methoden hat der Knospenholz-Gewebeextraktor (HdO) den Probendurchsatz erhöht und die erforderlichen Arbeits- und Gerätekosten gesenkt.
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Methodenartikel
Automatisierung der Verarbeitung von Zitrusblütenholz für den nachgelagerten Nachweis von Krankheitserregern durch Gerätetechnik
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Erratum-Hinweis
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Durch Transplantate übertragbare, phloembegrenzte Krankheitserreger von Zitrusfrüchten wie Viren, Viroide und Bakterien sind weltweit für verheerende Epidemien und schwerwiegende wirtschaftliche Verluste verantwortlich. Zum Beispiel hat das Citrus-Tristeza-Virus weltweit über 100 Millionen Zitrusbäume getötet, während "Candidatus Liberibacter asiaticus" Florida 9 Milliarden Dollar gekostet hat. Die Verwendung von pathogengetestetem Zitrusknospenholz für die Baumvermehrung ist der Schlüssel zur Bekämpfung solcher Krankheitserreger. Das Citrus Clonal Protection Program (CCPP) an der University of California, Riverside, verwendet Polymerase-Kettenreaktions-Assays (PCR), um jedes Jahr Tausende von Proben von Zitrusblütenbäumen zu testen, um die kalifornischen Zitrusfrüchte zu schützen und dem National Clean Plant Network saubere Vermehrungseinheiten zur Verfügung zu stellen. Ein schwerwiegender Engpass beim molekularen Hochdurchsatznachweis von Zitrusviren und Viroiden ist der Verarbeitungsschritt des Pflanzengewebes.
Die richtige Gewebepräparation ist entscheidend für die Extraktion hochwertiger Nukleinsäuren und die nachgelagerte Verwendung in PCR-Assays. Das Zerkleinern, Wiegen, Gefriertrocknen, Mahlen und Zentrifugieren von Pflanzengewebe bei niedrigen Temperaturen, um den Abbau von Nukleinsäuren zu vermeiden, ist zeit- und arbeitsintensiv und erfordert teure und spezialisierte Laborgeräte. In diesem Artikel wird die Validierung eines speziellen Instruments vorgestellt, das entwickelt wurde, um phloemreiches Rindengewebe aus Zitrusknospenholz schnell zu verarbeiten, das als Knospengewebeextraktor (HdO) bezeichnet wird. Das HdO erhöht den Probendurchsatz um 100 % im Vergleich zu aktuellen Methoden. Darüber hinaus senkt es den Arbeitsaufwand und die Kosten für die Ausrüstung. In dieser Arbeit wiesen die HdO-Proben eine DNA-Ausbeute (80,25 ng/μL) auf, die mit dem Handhackprotokoll des CCPP (77,84 ng/μL) vergleichbar war. Dieses Instrument und das Protokoll zur schnellen Verarbeitung von Pflanzengewebe können mehreren diagnostischen Zitruslaboren und -programmen in Kalifornien zugute kommen und zu einem Modellsystem für die Gewebeverarbeitung für andere holzige mehrjährige Kulturen weltweit werden.
Einleitung
Durch Transplantate übertragbare phloembegrenzte Krankheitserreger von Zitrusfrüchten, wie Viroide, Viren und Bakterien, haben in allen Zitrusanbaugebieten der Welt verheerende Epidemien und schwerwiegende wirtschaftliche Verluste verursacht. Zitrusviroide sind limitierende Produktionsfaktoren aufgrund der Exokortis- und Kachexie-Krankheiten, die sie bei wirtschaftlich wichtigen Zitrusarten wie Dreiblatt, Dreiblatthybriden, Mandarinen, Clementinen und Mandarinen verursachen 1,2,3. In Kalifornien sind diese viroidempfindlichen Zitrussorten die Grundlage für den wachsenden und ....
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Protokoll
1. Sammeln der Zitrusknospenholzproben für den Versand
- Senden Sie Technology Evolving Solutions eine Tabelle mit Bauminformationen, die sie in ihren Webserver laden können (schließlich wird der Benutzer neue Bäume erstellen).
- Verwenden Sie den TES-Tracker der Telefon-App, um einen Baum auszuwählen, und halten Sie ein NFC-Halsband-Tag (Near Field Communication) an das Telefon, um die Bauminformationen in den Tag zu laden.
- Legen Sie drei bis vier Zitrusknospenholzproben in den BTE-kompatiblen Plastikbeutelträger und verschließen Sie ihn mit dem Deckel.
- Stellen Sie sicher, dass die Länge des Knospenho....
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Ergebnisse
RNA-Extraktion, -Aufreinigung und -Qualität unter Verwendung von HdO-verarbeitetem Knospenholz-Zitrusgewebe und Bewertung der Zeit für die Gewebeverarbeitung
Für diesen Test haben wir Knospenholzproben von 255 repräsentativen Zitrusbäumen verwendet, um die RNA-Qualität des HdO mit dem Standardverfahren zu vergleichen. Die Proben wurden mit dem Knospenholz-Gewebeextraktor (HdO) verarbeitet (Protokollschritte 4.1-4.6 und Abbildung 2, rechte Seite, Schritt 1, Schritt 5 und Schritt 6) oder nach der behörd.......
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Diskussion
Mit dem Aufkommen der HLB-Zitruskrankheit wurden die Zitrusindustrie, die Zulassungsbehörden und die Diagnoselabore aufgefordert, sich auf Nukleinsäureextraktionsmethoden mit hohem Durchsatz in Kombination mit manueller Probenverarbeitung mit niedrigem Durchsatz und Assays zum Nachweis von Krankheitserregern wie qPCR34 für die Untersuchung einzelner Bäume in Kombination mit Krankheitsmanagementpraktikenzu verlassen 35. Die HLB-Positivitätsrate in Kalifornien ist von 0,01 % .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden finanziellen Interessen gibt.
Danksagungen
Die Autoren erkennen das Volk der Cahuilla als die traditionellen Hüter des Landes an, auf dem die experimentelle Arbeit durchgeführt wurde. Wir danken Professor Norman Ellstrand von der University of California, Riverside, für die Bereitstellung von Laborräumen für die Durchführung von Forschungsaktivitäten für dieses Projekt im Rahmen der UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ) Initiative. Diese Forschung wurde durch das CDFA - Specialty Crop Block Grant Program (Grant Nr. 18-0001-055-SC) unterstützt. Zusätzliche Unterstützung kam auch durch das CRB-Projekt 6100; USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch-Projekt 1020106; und der National C....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,08" Sechskant-Trimmerfaden | PowerCare | FPRO07065 | Zum Wechseln der Klingen erforderlich. |
| 1 PS, 8 Gallonen Luftkompressor | California Air Tools | 8010 | Schnelles Trocknen von Kammern nach dem Spülen |
| 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen | Globe Scientific | 111558B | Lagern Sie die Probe nach dem Schwenken mit Spritzen |
| 10 mL Spritzenset | Technologie Evolving Solutions | TE006-F1-10A-G1000-E1 | Spritzenmaterial wird eingeschnitten. 1 L Flasche mit Guanidinthiocyanat-Puffer. WARNUNG - enthält Guanidinthiocyanat, Sondermüll Service erforderlich - nicht mit Bleiche |
| mischen 12" Lineal | Westcott | 16012 | Zum Messen des Trimmerfadens vor dem Schneiden |
| 12% Natriumhypochlorit | Hasa | 1041 | Desinfiziert die Kammern nach der |
| Verarbeitung-20 C Gefrierschrank | Insignia | NS-CZ70WH0 | Lagern Sie die Probe nach der Verarbeitung |
| 4" x 12" Plastiktüten | Plymor | FP20-4x12-10 | Beutel zum Halten von Ästen während des Versands. O-Ringe befestigen den Beutel an der HdO-Kammer zum Versiegeln |
| von 6" Wattestäbchen | Puritan | 806-PCL | Tupfer zum Entfernen von Verstopfungen |
| 7-Gallonen-Aufbewahrungstasche | HDX | 206152 | Hält Natriumhypochloritlösung zur Desinfektion der Kammern und Wasser zum Spülen der Kammern |
| Luftblaspistole | JASTIND | JTABG103A | Leitet Luft mit hohem Druck in die Kammern |
| Black Sharpie | Sharpie | S-19421 | Markieren Sie 1,5-ml-Röhrchen, damit Sie die Probe später identifizieren können |
| Flaschenaufsatz-Dispensor | Marke | Z627569 | Verstellbarer Flaschendeckel-Dispensator zur Abgabe von Guandin in die Spritze |
| BTE-Kammer-Technologie | Evolving Solutions | TE002BB-A05-E1 | Wird zur Verarbeitung von Knospenholz verwendet. Enthält O-Ringe, HdO-Schieber, Schiebekolben, Ablassventil, Deckel, Klingensatz und Werkzeug zum Entfernen des Klingensatzes |
| Spülmittel | Dawn | 57445CT | Surfektivmittel zur Verbesserung des Eindringens von Natriumhypochlorit in die Kammer |
| Abzug mit Hepa-Filter | Air Science | P5-36XT-A | Abzug mit Hepa-Filter (ASTS-030) & zur Begrenzung möglicher Kontamination und zum Schutz vor verschütteten Chemikalien |
| Isolierter Versandbehälter | aus SchaumstoffPolarTech | 261/J50C | Isolierter Versandbehälter zum Versenden von Proben auf Eis nach der Entnahme |
| Laborkittel | Red Kap | KP14WH LN 46 | Laborkittel zur Begrenzung möglicher Kontaminationen und zum Schutz vor verschütteten Chemikalien |
| Laptop | Microsoft | Surface | Wifi-fähiger Laptop zum Ausführen der TES-GUI. Wird für die Ersteinrichtung benötigt und bietet detailliertere Informationen über die Gewebeverarbeitungsbasis |
| NFC-fähiges Telefon | Samsung | Galaxy S9 | Telefon zum Herunterladen und Verwenden der TES-Telefon-App |
| NFC-Clip-Tag | Technologie Entwickelnde Lösungen | TE005-Clip-E1 | Probenetikett, das mit Bäumen verknüpft werden kann. Kompatibel mit der TES-Telefon-App |
| NFC Collar Tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Collar-E1 | Tag, das an einem Baum befestigt ist. Hergestellt für die Funktion mit der TES-Telefon-App |
| Nitrilhandschuhe | Usa Scientific | 3915-4400 | Handschuhe zur Begrenzung möglicher Kontaminationen und zum Schutz vor verschütteten Chemikalien |
| Geräuschreduzierender Kapselgehörschutz | 3M | 90565-4DC-PS | Schützen Sie die Ohren während des Betriebs Luftkompressor und Gewebeverarbeitungsbasis |
| Polyurethan-Rückstoß-Luftschlauch | FYPower | 510019 | Befestigt die Luftpistole am Kompressor |
| Sicherheitsbrille | Solidwork | SW8329-US | Schützt die Augen vor chemischen und physikalischen Gefahren |
| Sprühflasche | JohnBee | B08QM81BJV | Sprühbleiche zur Dekontamination von Oberflächen |
| Tissue Extractor Base Technology | Evolving Solutions | TE001-A-E1 | System zur Verarbeitung von Pflanzengewebe. Benötigt HdO- oder LTE-Kammern, um zu funktionieren. Inklusive Netzkabel, Klingenadapter und 8/32-Zoll-Inbusschlüssel |
| für die Tissue-Verarbeitungsbasis | Evolving Solutions | TE003-A05-200G-01-E1 | Waage mit einer Auflösung von 200 g, Auflösung von 0,01, die mit der Tissue-Processing-Basis verbunden werden kann, um Gewichtsbereiche durchzusetzen und/oder Gewichte mit der Probe zu verknüpfen. Inklusive Waage, Netzkabel, Verbindungskabel, 5-ml-Spritzenhalter, Tower-Luftschild |
| Vermiculit | EasyGoProducts | B07WQDZGRP | Wird für den Transport von gefährlichen Abfällen (Guanidinthiocyanat) mit Hilfe eines Entsorgungsdienstes für gefährliche Abfälle |
| benötigt Drahtschneider | Boenfu | BOWC-06002-US | Drahtschneider zum Schneiden von Trimmerfäden |
Referenzen
- Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
- Vernière, C., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:
Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside
to:
Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside
