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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Automatisierung der Verarbeitung von Zitrusblütenholz für den nachgelagerten Nachweis von Krankheitserregern durch Gerätetechnik

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65159
Automatic Translation
*1,6, *2, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5, *1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside, 2Technology Evolving Solutions (TES), 3Department of Bioengineering, University of California Riverside, 4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV, 5University of California Riverside, 6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Wir haben ein Instrument entwickelt, hergestellt und validiert, das phloemreiches Rindenknospenknospengewebe schnell verarbeitet. Im Vergleich zu aktuellen Methoden hat der Knospenholz-Gewebeextraktor (HdO) den Probendurchsatz erhöht und die erforderlichen Arbeits- und Gerätekosten gesenkt.

Abstract

Durch Transplantate übertragbare, phloembegrenzte Krankheitserreger von Zitrusfrüchten wie Viren, Viroide und Bakterien sind weltweit für verheerende Epidemien und schwerwiegende wirtschaftliche Verluste verantwortlich. Zum Beispiel hat das Citrus-Tristeza-Virus weltweit über 100 Millionen Zitrusbäume getötet, während "Candidatus Liberibacter asiaticus" Florida 9 Milliarden Dollar gekostet hat. Die Verwendung von pathogengetestetem Zitrusknospenholz für die Baumvermehrung ist der Schlüssel zur Bekämpfung solcher Krankheitserreger. Das Citrus Clonal Protection Program (CCPP) an der University of California, Riverside, verwendet Polymerase-Kettenreaktions-Assays (PCR), um jedes Jahr Tausende von Proben von Zitrusblütenbäumen zu testen, um die kalifornischen Zitrusfrüchte zu schützen und dem National Clean Plant Network saubere Vermehrungseinheiten zur Verfügung zu stellen. Ein schwerwiegender Engpass beim molekularen Hochdurchsatznachweis von Zitrusviren und Viroiden ist der Verarbeitungsschritt des Pflanzengewebes.

Die richtige Gewebepräparation ist entscheidend für die Extraktion hochwertiger Nukleinsäuren und die nachgelagerte Verwendung in PCR-Assays. Das Zerkleinern, Wiegen, Gefriertrocknen, Mahlen und Zentrifugieren von Pflanzengewebe bei niedrigen Temperaturen, um den Abbau von Nukleinsäuren zu vermeiden, ist zeit- und arbeitsintensiv und erfordert teure und spezialisierte Laborgeräte. In diesem Artikel wird die Validierung eines speziellen Instruments vorgestellt, das entwickelt wurde, um phloemreiches Rindengewebe aus Zitrusknospenholz schnell zu verarbeiten, das als Knospengewebeextraktor (HdO) bezeichnet wird. Das HdO erhöht den Probendurchsatz um 100 % im Vergleich zu aktuellen Methoden. Darüber hinaus senkt es den Arbeitsaufwand und die Kosten für die Ausrüstung. In dieser Arbeit wiesen die HdO-Proben eine DNA-Ausbeute (80,25 ng/μL) auf, die mit dem Handhackprotokoll des CCPP (77,84 ng/μL) vergleichbar war. Dieses Instrument und das Protokoll zur schnellen Verarbeitung von Pflanzengewebe können mehreren diagnostischen Zitruslaboren und -programmen in Kalifornien zugute kommen und zu einem Modellsystem für die Gewebeverarbeitung für andere holzige mehrjährige Kulturen weltweit werden.

Introduction

Durch Transplantate übertragbare phloembegrenzte Krankheitserreger von Zitrusfrüchten, wie Viroide, Viren und Bakterien, haben in allen Zitrusanbaugebieten der Welt verheerende Epidemien und schwerwiegende wirtschaftliche Verluste verursacht. Zitrusviroide sind limitierende Produktionsfaktoren aufgrund der Exokortis- und Kachexie-Krankheiten, die sie bei wirtschaftlich wichtigen Zitrusarten wie Dreiblatt, Dreiblatthybriden, Mandarinen, Clementinen und Mandarinen verursachen 1,2,3. In Kalifornien sind diese viroidempfindlichen Zitrussorten die Grundlage für den wachsenden und profitablen Markt der "Easy-Peeler" und folgen damit dem sich wandelnden Trend in der Präferenz der Verbraucher für Früchte, die leicht zu schälen, segmentiert und kernlos sind 4,5,6. So werden Zitrusviroide im Rahmen des California Department of Food and Agriculture (CDFA) "Citrus Nursery Stock Pest Cleanliness Program-Senate Bill 140" reguliert, und die Labore der Plant Pest Diagnostics Branch der CDFA führen jährlich Tausende von Zitrusviroidtests durch 7,8,9,10 . Das Citrus-Tristeza-Virus (CTV) ist seit Beginn der globalen Epidemie in den 1930er Jahren für das Absterben von über 100 Millionen Zitrusbäumen verantwortlich 3,9,10,11. In Kalifornien stellen Lochfraß und Isolate des Virus, die Trifoliate brechen, eine ernsthafte Bedrohung für die 3,6 Milliarden Dollar schwere kalifornische Zitrusindustrie dar12,13,14. Folglich stuft die CDFA CTV als regulierten Pflanzenschädling der Klasse A ein, und das Labor der Central California Tristeza Eradication Agency (CCTEA) führt jedes Jahr umfangreiche Felduntersuchungen und Tausende von Virustests durch15,16. Es wird geschätzt, dass das Bakterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" (CLas) und die Huanglongbing-Krankheit (HLB) in Florida einen wirtschaftlichen Schaden von fast 9 Milliarden US-Dollar verursacht haben, was auf eine Reduzierung der Zitrusanbaufläche um 40 %, einen Rückgang der Zitrusproduktion um 57 % und einen Verlust von fast 8.000 Arbeitsplätzen zurückzuführenist 17,18. In Kalifornien wurde prognostiziert, dass eine hypothetische Reduzierung der Zitrusanbaufläche um 20 % aufgrund von HLB zu mehr als 8.200 Arbeitsplatzverlusten und einer Verringerung des Bruttoinlandsprodukts des Staates um über eine halbe Milliarde Dollar führen würde. Daher gibt das Citrus Pest and Disease Prevention Program jährlich über 40 Millionen US-Dollar für Erhebungen aus, um CLas aus Kalifornien zu testen, zu erkennen und auszurotten14,17,19,20.

Ein Schlüsselelement bei der Bekämpfung von Zitrusviroiden, Viren und Bakterien ist die Verwendung von pathogengetestetem Vermehrungsmaterial (z. B. Knospenholz) für die Baumproduktion. Auf Krankheitserreger getestetes Zitrusblütenholz wird im Rahmen umfassender Quarantäneprogramme produziert und gepflegt, die fortschrittliche Techniken zur Eliminierung und zum Nachweis von Krankheitserregern einsetzen10,21. Das Citrus Clonal Protection Program (CCPP) an der University of California, Riverside, testet jedes Jahr Tausende von Knospenholzproben von Zitrussorten, die neu in den Bundesstaat und die USA importiert wurden, sowie von Zitrusblütenbäumen, um die kalifornischen Zitrusfrüchte zu schützen und die Funktionen des National Clean Plant Network for Citruszu unterstützen 10,17,22. Um das große Volumen an Zitrustests bewältigen zu können, sind zuverlässige und kostengünstige Assays zum Nachweis von Krankheitserregern mit hohem Durchsatz eine grundlegende Komponente für den Erfolg von Programmen wie dem CCPP 7,10,22.

Während molekularbasierte Assays zum Nachweis von Krankheitserregern wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eine deutliche Steigerung des Durchsatzes in pflanzendiagnostischen Laboren ermöglicht haben, ist unserer Erfahrung nach einer der kritischsten Engpässe bei der Implementierung von Hochdurchsatzprotokollen der Verarbeitungsschritt der Probe von Pflanzengewebe. Dies gilt insbesondere für Zitrusfrüchte, da die derzeit verfügbaren Protokolle für die Verarbeitung von phloemreichen Geweben wie Blattstielen und Knospenholzrinde arbeitsintensiv und zeitaufwändig sind und teure und spezialisierte Laborgeräte erfordern. Diese Protokolle erfordern manuelles Zerkleinern, Wiegen, Gefriertrocknen, Mahlen und Zentrifugieren bei niedrigen Temperaturen, um den Abbau von Nukleinsäuren zu vermeiden 8,23,24. Im CCPP-Diagnoselabor umfasst die Probenverarbeitung beispielsweise (i) Häckseln von Hand (6-9 Proben/h/Bediener), (ii) Gefriertrocknung (16-24 h), (iii) Pulverisierung (30-60 s) und (iv) Zentrifugation (1-2 h). Der Prozess erfordert auch spezielle Verbrauchsmaterialien (z. B. hochbelastbare Safe-Lock-Röhrchen, Edelstahl-Mahlkugeln, Adapter, Klingen, Handschuhe) und mehrere kostspielige Laborgeräte (z. B. Ultratiefkühlschrank, Gefriertrockner, Gewebepulverisierer, Kryostation mit flüssigem Stickstoff, gekühlte Zentrifuge).

Wie in jeder Branche sind der Anlagenbau und die Automatisierung von Prozessen der Schlüssel, um Kosten zu senken, den Durchsatz zu erhöhen und qualitativ hochwertige, einheitliche Produkte und Dienstleistungen bereitzustellen. Die Zitrusindustrie benötigt kostengünstige Tissue-Verarbeitungsinstrumente, die nur minimale Fähigkeiten erfordern und daher leicht in diagnostische Labore und Feldbetriebe übertragen werden können, um eine hohe Probenverarbeitungskapazität für einen schnellen nachgeschalteten Nachweis von Krankheitserregern zu ermöglichen. Technology Evolving Solutions (TES) und das CCPP entwickelten (d. h. entwerfen und herstellen) und validierten (d. h. getestet mit Zitrusproben und verglichen mit Standard-Laborverfahren) ein kostengünstiges Instrument für die schnelle Verarbeitung von phloemreichem Zitrusgewebe (d. h. Knospenholz) und validierten (d. h. es wurde mit Zitrusproben getestet und mit Standard-Laborverfahren verglichen), das als Knospenholz-Gewebeextraktor (HdO) bezeichnet wird. Wie in Abbildung 1 zu sehen ist, enthält das HdO eine Basiskomponente für die Stromversorgung und Steuerung sowie eine herausnehmbare Kammer für die Verarbeitung von Zitrusknospenholz. Die HdO-Kammer besteht aus einer Mahlscheibe, die speziell entwickelt wurde, um das phloemreiche Rindengewebe aus dem Zitrusknospenholz zu entfernen. Das zerkleinerte Rindengewebe wird schnell durch einen Schieber in eine Spritze mit Extraktionspuffer ausgestoßen, filtriert und ohne zusätzliche Handhabung oder Vorbereitung für die Nukleinsäureextraktion und -reinigung vorbereitet (Abbildung 1). Das HdO-System umfasst auch eine papierlose Probenverfolgungsanwendung und eine integrierte Wägeanwendung, die die Informationen zur Probenverarbeitung in Echtzeit in einer Online-Datenbank aufzeichnen.

Das HdO-System hat die labordiagnostische Kapazität des CCPP um über 100 % gesteigert und hat durchgängig Zitrusgewebeextrakte produziert, die für die Aufreinigung hochwertiger Nukleinsäuren und den nachgeschalteten Nachweis von durch Transplantate übertragbaren Krankheitserregern von Zitrusfrüchten mittels PCR-Assays geeignet sind. Genauer gesagt hat HdO die Zeit für die Gewebeverarbeitung von über 24 Stunden auf ~3 Minuten pro Probe reduziert, Laborinstrumente ersetzt, die über 60.000 US-Dollar gekostet haben (Abbildung 2, Schritte 2-4) und die Verarbeitung größerer Probengrößen ermöglicht.

In diesem Artikel werden die Validierungsdaten für die Verarbeitung von Zitrusrindengewebe, die Nukleinsäureextraktion und den Nachweis von Krankheitserregern mit Zitrusblütenholzproben von Quellbäumen vorgestellt, einschließlich aller geeigneten Positiv- und Negativkontrollen aus der CCPP Rubidoux Quarantine Facility bzw. der Lindcove Foundation Facility. Außerdem stellen wir die Durchsatz- und Bearbeitungszeitveränderungen im Vergleich zum aktuellen Laborverfahren dar (Abbildung 2). Darüber hinaus bietet diese Arbeit ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für Testlabore für Zitruspathogene und zeigt, wie das HdO-System die Funktionen von Krankheitserreger-sauberen Baumschulbeständen, Erhebungs- und Eradikationsprogrammen unterstützen kann.

Figure 1
Abbildung 1: Knospenholz-Gewebeextraktor. Das HdO enthält eine Basiskomponente für Leistung und Steuerung sowie eine herausnehmbare Kammer für die Verarbeitung von Zitrusknospenholz. Die HdO-Kammer besteht aus einer Schleifscheibe, die speziell entwickelt wurde, um das phloemreiche Rindengewebe von Zitrusknospen zu entfernen. Das zerkleinerte Rindengewebe wird schnell durch einen Schieber in eine Spritze ausgeworfen, filtriert und ohne zusätzliche Handhabung oder Vorbereitung für die Nukleinsäureextraktion und -reinigung vorbereitet. Abkürzung: HdO = Knospenholz-Gewebeextraktor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Schritt-für-Schritt-Vergleich zwischen dem konventionellen Handhackverfahren im Labor und der HdO-Verarbeitung. Die HdO-Verarbeitung umfasst die Verarbeitung von Zitrusrindengewebe mit hohem Durchsatz, die Nukleinsäureextraktion und den Nachweis von Krankheitserregern. Die Zeit für jeden Schritt wird in Klammern angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protocol

1. Sammeln der Zitrusknospenholzproben für den Versand

  1. Senden Sie Technology Evolving Solutions eine Tabelle mit Bauminformationen, die sie in ihren Webserver laden können (schließlich wird der Benutzer neue Bäume erstellen).
  2. Verwenden Sie den TES-Tracker der Telefon-App, um einen Baum auszuwählen, und halten Sie ein NFC-Halsband-Tag (Near Field Communication) an das Telefon, um die Bauminformationen in den Tag zu laden.
  3. Legen Sie drei bis vier Zitrusknospenholzproben in den BTE-kompatiblen Plastikbeutelträger und verschließen Sie ihn mit dem Deckel.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Länge des Knospenholzes 8 Zoll nicht überschreitet und nicht weniger als 5 Zoll beträgt.
      1. Wenn die Länge größer als 8 Zoll ist, verwenden Sie eine sterile Einweg-Rasierklinge oder eine Gartenschere, die mit 10%iger Bleichlösung (1% Natriumhypochlorit) dekontaminiert ist, um sie kürzer zu machen.
      2. Wenn die Länge weniger als 5 Zoll beträgt, entnehmen Sie eine andere Knospenholzprobe, um sie in den Beutel zu geben.
    2. Stellen Sie sicher, dass alle Achselwucherungen oder großen Dornen von Hand oder mit 10 % bleichmitteldesinfizierten Schneidwerkzeugen (1 % Natriumhypochlorit) entfernt werden.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, damit das Knospenholz in der Öffnung der Kammer leichter zu manövrieren ist.
    3. Stellen Sie sicher, dass es keine Knospenholzproben gibt, die gekrümmte Merkmale aufweisen. Wenn dies der Fall ist, entfernen Sie sie mit 10 % bleichgereinigten Schneidwerkzeugen (1 % Natriumhypochlorit) und geben Sie nur die geraden Teile der Probe in die HdO-Beutel.
      HINWEIS: Gebogenes Knospenholz lässt sich sehr schwer in das Instrument manövrieren, was zu ungleichmäßigen Rindenstreifen führt.
  4. Verwenden Sie den TES-Tracker der Telefon-App, um das NFC-Halsband-Tag des Baumes zu scannen und es mit dem NFC-Clip-Tag auf dem Probenbeutel zu verknüpfen.
  5. Achten Sie auf die Dicke des Knospenholzes, da diese bestimmt, wie der Bediener die phloemreiche Knospenholzrinde in der HdO-Kammer abstreift.
    1. Wenn das Knospenholz eine Dicke von weniger als 0,20 Zoll hat, seien Sie vorsichtig, wenn Sie das Knospenholz abziehen, da die sich mit hoher Geschwindigkeit drehenden Fäden in der Kammer das gesamte Knospenholz bis zum Kern pulverisieren, über die Rindenschicht hinaus und in das nicht phloemreiche Gewebe von Holz und Mark.
    2. Wählen Sie dickeres Knospenholz, da es einfacher ist, das Rindengewebe abzustreifen und gleichzeitig das nicht phloemreiche Knospenholzgewebe zu vermeiden.
  6. Geben Sie die Proben in einen isolierten Versandbehälter mit ein paar Kühlbeuteln.

2. Einrichtung im Abzug

HINWEIS: Es wird bevorzugt, das HdO in einem Abzug zu betreiben. Dadurch wird das Risiko einer Kreuzkontamination von Pflanzengewebe und einer Laborkontamination verringert.

  1. Desinfizieren Sie mit einer Sprühflasche mit 10 % (1 % Natriumhypochlorit).
    1. Besprühen Sie die Oberfläche der Haube und lassen Sie das Bleichmittel etwa 1 Minute einwirken, bevor Sie es mit einem Papiertuch abwischen.
    2. Besprühe ein Papiertuch mit der Bleichlösung. Wischen Sie die TE-Basis, die Komponenten der Gewichtswaage (Waage, Luftschild und Turm) und einen Filzstift ab.
  2. Packen Sie ein Spritzenset für die Anzahl der zu verarbeitenden Proben aus und legen Sie sie in einen abgedeckten Karton.
  3. Halten Sie eine Packung Tupfer außerhalb der Haube bereit, falls sie benötigt werden.
  4. Bereiten Sie die Waage vor.
    1. Entfernen Sie den Gewichtsturm von der Waage und halten Sie die Ein-/Aus-Taste gedrückt, um sie einzuschalten. Platzieren Sie den Turm in der Mitte der Waage, nachdem die Waage 0 angezeigt hat.
    2. Schieben Sie die Luftabdeckung der Waage über die Vorderseite der Waage.
  5. Bereiten Sie die Basis des Gewebeextraktors vor, indem Sie den Schalter auf der Rückseite umlegen. Stellen Sie sicher, dass der Schalter auf der linken Seite der Box auf der Oberseite gedrückt ist. Warten Sie, bis eine grüne LED blinkt, die anzeigt, dass die Kammer bereit ist.

3. Richten Sie die Reinigungsstationen ein (Ergänzungsbild S1).

  1. Geben Sie 1 L Wasser in den Ultraschallreiniger.
  2. Wickeln Sie zwei Müllsäcke über den Ultraschallreiniger.
  3. Gießen Sie ~5 l 10%iges Bleichmittel (1%ige Natriumhypochloritlösung) in den Ultraschallreiniger.
  4. Füllen Sie die Wasserwanne mit so viel Wasser, dass eine Kammer untergetaucht werden kann.
  5. Schalten Sie den Luftkompressor ein und öffnen Sie das Ventil.
  6. Richten Sie einen Hintergrund ein, um die Flüssigkeit aufzufangen, während die Kammer trocknet.

4. Aufbereitung des Materials für das HdO zum Abbeizen der Zitrusknospenrinde

  1. Laden Sie die Kammer auf die HdO-Basis.
    1. Bereiten Sie die HdO-Kammer vor.
      1. Befestigen Sie einen leeren Probenbeutel an der Rückseite der Kammer. Verwenden Sie zwei O-Ringe, um den leeren Beutel an der hinteren Düse der HdO-Kammer zu befestigen.
      2. Untersuchen Sie die Klinge auf Anzeichen von Verschleiß oder Beschädigungen, wie z. B. Schnitte, die sich an der Klinge bilden, wo sie in den Kunststoff eindringt, oder Schnitte, die sich an der Spitze bilden. Stellen Sie sicher, dass der Pfeil auf der Klinge mit dem Symbol für ein einzelnes Schloss ausgerichtet ist.
      3. Stellen Sie sicher, dass der Luftauslass am Boden der Kammer in Richtung des O-Symbols gedreht ist. Setzen Sie den durchsichtigen Deckel über die Kammeröffnung und schieben Sie den durchsichtigen HdO-Schieber mit der Schiene auf der rechten Seite der Kammer auf die Kammer. Schieben Sie die Verriegelung am Boden der Kammer so weit wie möglich in den Schlitten hinein. Stellen Sie sicher, dass die Kolbenkappe auf der Oberseite des Objektträgers montiert ist.
    2. Platzieren Sie die Kammer auf der HdO-Basis, wobei die Düse der HdO-Basis in die Rückseite der Kammer hineinragt. Warten Sie, bis die blaue LED blinkt, um anzuzeigen, dass die Platzierung erfolgreich war.
  2. Laden Sie die Probe auf die HdO-Basis, indem Sie den weißen Aufkleber auf dem NFC-Clip-Tag auf ein Z auf der rechten Seite der Box schieben. Bewegen Sie das Tag in einer langsamen, kreisförmigen Bewegung auf Z, bis das gelbe Licht zu blinken beginnt. Befestigen Sie die Probe an der HdO-Basis und stellen Sie sicher, dass der Probenbeutel keine Löcher aufweist. Wenn es ein Loch gibt, flicken Sie es mit Klebeband. Legen Sie den O-Ring über den Probenbeutel, um ihn an der Vorderseite der HdO-Düse zu befestigen.
  3. Legen Sie das unbenutzte Spritzenset ein.
    1. Tarieren Sie das Spritzenset. Setzen Sie das unbenutzte Spritzenset auf den Waagenturm. Entfernen Sie das Spritzenset, wenn ein rotes Licht zu blinken beginnt oder die Waage 0 anzeigt.
    2. Entfernen Sie den Kolben von der Spritze mit dem Filter. Stellen Sie sicher, dass sich die Flüssigkeit in der Bodenspritze (ohne Filter) befindet. Legen Sie den Kolben beiseite auf ein Papiertuch oder auf den Turm, wo der schwarze Kolben keine Oberflächen berührt.
    3. Befestigen Sie die Spritze an der Austrittsöffnung des Objektträgers, indem Sie die Austrittsöffnung in die Spritze drücken und um 90° drehen.
  4. Verarbeiten Sie die Knospenholzprobe.
    VORSICHT: HdO hat bewegliche Teile mit hoher Geschwindigkeit. Alle Vorgänge müssen in einem Abzug erfolgen. Alle Benutzer sollten Schutzbrillen, Ohrenschützer (Ohrstöpsel) und alle anderen persönlichen Schutzausrüstungen (PSA) wie Handschuhe und Laborkittel verwenden.
    1. Drücken Sie die obere schwarze Taste, um das Gerät zu starten. Drücken Sie ein zweites Mal, um den Motor während der Verarbeitung jederzeit zu stoppen.
      HINWEIS: Die Box verfügt über eine Geschwindigkeits- und Temperaturerfassung, um sicherzustellen, dass sie ordnungsgemäß funktioniert.
    2. Nimm einen Knospenbaumstab durch den Beutel und stecke ihn durch die Oberseite der HdO-Düse.
    3. Greife mit der anderen Hand den Knospenholzstab auf der anderen Seite der Kammer und schiebe ihn langsam in die Klinge. Achte auf ein leises Summen, das darauf hinweist, dass das Knospenholz von seiner Rinde befreit wird. Bewegen Sie das Knospenholz langsam hin und her, während Sie es drehen.
      1. Wenn ein lautes, aggressives Hackgeräusch zu hören ist, bewegen Sie den Ast schnell nach oben und/oder drücken Sie die obere Taste, um den Motor zu stoppen. Um den Motor zu stoppen, verwenden Sie den Schalter auf der rechten Seite, um die Verarbeitung zu beenden (siehe Schritt 4.4.3.2).
      2. Wenn beim Schneiden kein Material aus dem Ausgang austritt, ist die Kammer verstopft. Schalten Sie den Motor aus, entfernen Sie die Kappe des Schiebekolbens und drücken Sie die Verstopfung mit dem Kunststoff des Tupfers aus dem Ausgang des Geräts. Verwenden Sie den Schalter auf der rechten Seite, um die Bearbeitung zu beenden: Nach oben = Vorwärtsschnitt; Mitte = Motor aus; Nach unten = umgekehrter Schnitt.
    4. Wiederholen Sie Schritt 4.4.2 und Schritt 4.4.3 für die restlichen Verzweigungen.
      HINWEIS: Ein allgemeiner Indikator dafür, dass genügend Knospenrinde entfernt wurde, ist, wenn 25 % der Spritze mit Pflanzengewebe gefüllt sind. Durch Transplantate übertragbare Erreger von Zitrusfrüchten könnten im Baum ungleichmäßig verteilt sein. Dazu werden drei bis vier Knospenholzproben aus dem Blätterdach der Zitrusbäume entnommen. Es ist wichtig, dass jede Knospenholzprobe im HdO-Tragebeutel zur endgültigen gemahlenen Gewebeprobe beiträgt, um sicherzustellen, dass eine vollständige, für den Baum repräsentative Probe auf Krankheitserreger getestet wird.
    5. Drücken Sie die obere schwarze Taste, um die Verarbeitung zu stoppen. Warten Sie, bis das Licht wieder gelb zu blinken beginnt.
  5. Überprüfen Sie das Probengewicht.
    1. Drehen Sie die Spritze um 90° und ziehen Sie sie nach unten, um sie zu lösen. Setzen Sie den Kolben wieder auf die Spritze und setzen Sie die Spritze auf den Turm.
    2. Warten Sie, bis die Waage die Probe automatisch erkennt, und stellen Sie fest, ob sie innerhalb des richtigen Gewichtsbereichs (0,25 ± 0,05 g) liegt. Ist das Probengewicht zu niedrig (<0,20 g), wiederholen Sie Schritt 4.4. die rote LED beginnt zu blinken. Wenn das Probengewicht zu hoch ist (>0,30 g), ist ein Teil des Probenmaterials zu entfernen. die gelbe LED beginnt langsamer zu blinken. Wenn sich die Probe innerhalb des Bereichs befindet, beginnt die grüne LED zu blinken.
  6. Homogenisierung der Knospenholzprobe
    1. Entfernen Sie den Kolben von der Spritze mit der Probe, drücken Sie die Flüssigkeit in die Spritze mit der Probe und setzen Sie den Kolben wieder ein. Der Kolben drückt den Puffer und den Pflanzensaft durch den Siebfilter (der große Rindengewebestücke zurückhält) und über den Gummischlauch in die leere Spritze.
    2. Mischen Sie die Probe, indem Sie den Puffer und den Pflanzensaft von einer Spritze zur anderen hin und her schieben. Wiederholen Sie dies ~3x-4x und bis die Probe zu einer homogenen grünen Flüssigkeitsmischung wird.
    3. Sobald die Probe gut homogenisiert ist, drücken Sie die Pflanzensaftprobe ohne den Siebfilter in die Spritze und lösen Sie den Gummischlauch und die Spritze mit dem Filter von der Spritze mit der Probe.
    4. Die Pflanzensaftprobe wird aus der Spritze in ein steriles 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ausgestoßen und bis zur weiteren Verwendung bei −20 °C gelagert. Verwenden Sie einen Permanentmarker, um die Probe mit der Beutelnummer zu beschriften.
      ANMERKUNG: Der Pflanzenprobensaft aus Schritt 4.6.5 kann nun mit jedem der verfügbaren Nukleinsäure-, RNA- oder DNA-Extraktionsmethoden auf der Basis von Phenol-Chloroform, Kieselsäuresäule oder magnetischen Kügelchen 9,25,26,27 für die Nukleinsäureextraktion und -reinigung (siehe Schritt 7) und den nachgeschalteten Nachweis von durch Transplantate übertragbaren Krankheitserregern von Zitrusfrüchten (siehe Schritt 8) verarbeitet werden.

5. Desinfizieren der herausnehmbaren HdO-Kammer

VORSICHT: Wenn der Puffer aus dem Spritzenset auf die Kammer oder den Objektträger gelangt, spülen Sie ihn ab und befolgen Sie vor der Reinigung alle Sicherheitsregeln des Labors. Das Spritzenset enthält Guanidinthiocyanat. Wenn der Puffer aus dem Spritzenset mit Bleichmittel in Berührung kommt, entsteht Zyanidgas.

  1. Führen Sie die folgenden Schritte durch, nachdem die 10. Probe in der Kammer verarbeitet wurde. Beachten Sie, dass die grüne LED weiter blinkt, anstatt zu blauem Blinken überzugehen.
  2. Zerlegen Sie die HdO-Kammer, um alle möglichen Verunreinigungen zu entfernen. Entfernen Sie die durchsichtige Kunststoffabdeckung, reinigen Sie den Kammerschieber und reinigen Sie die Verstopfungsöffnung am Kammerschieber.
  3. Drehen Sie das Entlüftungsventil am Boden der Kammer in die geöffnete Position (Vorhängeschloss-Markierung öffnen). Legen Sie die Kammerkomponenten in den eingestellten Ultraschallreiniger (siehe Schritt 3.1). Legen Sie den Deckel unter die Kammer, um zu verhindern, dass er schwimmt. Lassen Sie den Ultraschallreiniger 15 Minuten lang laufen.
    HINWEIS: Das Ultraschall-Reinigungsbad (5 l) kann bis zu zwei Kammern aufnehmen.
  4. Die Kammerkomponenten werden im Wasserbad (Schritt 3.4) mindestens 30 s lang gespült. Bringen Sie die Kammerkomponenten in die Trocknungsstation.
    VORSICHT: Das Trocknen führt zu sich schnell bewegenden Teilen in der Kammer, lauten Geräuschen (~85 Dezibel [dB]) und möglichen Spritzern. Alle Benutzer sollten Schutzbrillen, Ohrenschützer (Ohrstöpsel), Laborkittel und alle anderen PSA gemäß den Sicherheitsvorschriften des operierenden Labors verwenden.
  5. Trocknen Sie die HdO-Kammer.
    1. Positionieren Sie die Luftpistole in einer Linie mit der Nut der oberen Öffnung der Kammer (wo sich normalerweise der Schlitten befindet). Drücken Sie den Auslöser der Pistole, um ~30 s lang Luft abzugeben.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Öffnung vom Benutzer weg zum Hintergrund zeigt. Dadurch sollte sich der Klingensatz drehen, um die darunter eingeschlossene Flüssigkeit zu entfernen.
    2. Positionieren Sie die Luftpistole in Richtung der oberen Düsen der Kammer. Drücken Sie den Auslöser der Luftpistole und ziehen Sie langsam drei volle Kreise von jedem Düseneingang.
    3. Positionieren Sie das Luftgewehr in der Mitte des HdO. Beginnen Sie mit dem innersten Punkt, halten Sie den Abzug gedrückt und bewegen Sie sich, bis das Luftgewehr in die Richtung des Schlittens zeigt.
    4. Lassen Sie schnell Luft über die gesamte Kammer laufen, vorne und hinten, um das Oberflächenwasser von außen zu entfernen.
  6. Trocknen Sie den HdO-Objektträger.
    1. Positionieren Sie die Druckluftpistole in den Kolbenschlitz des Schlittens und drücken Sie den Abzug, um Wasser aus dem Schlittenausgang auszustoßen.
    2. Fahren Sie mit einer Luftpistole über die Innenfläche des Objektträgers, um ihn zu trocknen.
    3. Führe eine Luftpistole entlang der Schiebernut, um Wasser herauszudrücken.
    4. Lassen Sie schnell Luft über die gesamte Außenseite laufen, um Oberflächenwasser von der Außenseite zu entfernen.
  7. Trocknen Sie die Bauteile.
    1. Halten Sie die Schiebekolbenkappe und die O-Ringe in der Hand und drücken Sie den Abzug.
    2. Fahre mit einer Luftpistole über die Innenseite des Deckels.
    3. Legen Sie die Komponenten in die Kammer und schieben Sie sie, um sie weiter zu trocknen oder wieder zusammenzubauen.
      HINWEIS: Für eine Umgebung mit hoher Gewebeverarbeitung und mehreren funktionellen HdO-Geräten kann ein Batch-Desinfektionssystem bereitgestellt werden, das in der Lage ist, 10 Kammern gleichzeitig zu dekontaminieren.

6. Entsorgen und desinfizieren

  1. Entsorgen Sie die Spritzen und Gummischläuche in dem dafür vorgesehenen Guanidin-Abfallbehälter.
  2. Entsorgen Sie jegliches Pflanzenmaterial im Behälter für biogefährliche Abfälle.
  3. Entferne die HdO-Kammer von der HdO-Basis.
  4. Zerlegen Sie die HdO-Kammer und fahren Sie mit der Dekontamination fort, wie in Schritt 5 beschrieben.

7. Bewertung der Gewebeverarbeitung und der Qualität der RNA, die aus den HdO-Zitrusknospenextrakten gereinigt wurde

HINWEIS: In diesem Protokoll haben wir Knospenholzproben von 255 Zitrusbäumen verwendet, um die Zeit, die für die Verarbeitung von Zitrusknospengewebe benötigt wird, und die Qualität der RNA, die aus Rindengewebeextrakten gereinigt wurde, die mit HdO hergestellt wurden (Abbildung 2, rechte Seite, Schritt 1, Schritt 5 und Schritt 6), mit der Qualität zu vergleichen, die nach der behördlich genehmigten Methode zur Verarbeitung von Zitrusknospengewebe unter Verwendung von Handschälen und Hacken hergestellt wurde. Gefriertrocknung, Pulverisierung und Zentrifugation des Rindengewebes, wie von Dang et al.23 beschrieben (Abbildung 2, linke Seite, Schritte 1-6).

  1. Derzeitiges Laborverfahren: Vorbereitung der Knospenholzproben für die Gewebeverarbeitung nach der behördlich zugelassenen Methode23.
    1. Schälen und Zerkleinern des Rindengewebes von Hand, Gefriertrocknung, Pulverisierung, Zentrifugation und Transfer des Pflanzensaftes in das RNA-Extraktionsröhrchen, wie von Dang et al.23 beschrieben (Abbildung 2, linke Seite, Schritte 1-6).
    2. Nachdem Sie die drei bis vier Knospenholzproben von jedem getesteten Baum von Hand geschält haben, legen Sie das gesamte Knospenholz in einen BTE-kompatiblen Plastikbeutelträger und lagern Sie es bei 4 °C bis zur HdO-Verarbeitung (Schritt 7.2).
  2. HdO-Verfahren: Initiieren Sie die HdO-Verarbeitung von Zitrusknospengewebe (Abschnitt 4, Schritte 4.1-4.6; Abbildung 2, rechte Seite, Schritt 1, Schritt 5 und Schritt 6).
    1. Verwenden Sie die Knospenholzproben, die in den HdO-Tragetaschen aus Schritt 7.1.2 aufbewahrt werden.
  3. Extrahieren und reinigen Sie die RNA aus dem Pflanzensaft, der aus dem aktuellen Laborverfahren (Schritt 7.1.1) und dem HdO-Verfahren (Schritt 7.2.2) gewonnen wird, unter Verwendung der behördlich zugelassenen halbautomatischen Methodeauf der Basis von magnetischen Kügelchen 8,23,28.
  4. Beurteilen Sie die RNA-Qualität, indem Sie ihre Konzentration, Reinheit und Integrität messen 8,23,24,29,3 3,31.
    1. Um die Konzentration zu berechnen, verwenden Sie Spektrophotometrie und optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm.
    2. Um die Reinheit zu beurteilen, verwenden Sie ein spektralphotometrisches OD-Verhältnis von 260/280.
    3. Um die Integrität zu überprüfen, verwenden Sie die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) der reversen Transkription (RT), die auf die mRNA des NADH-Dehydrogenase-Zitrusgens24,32 abzielt.

8. Bewertung der Kreuzkontamination und Nachweis von Zitrusviren und -viroiden unter Verwendung von RNA, die aus HdO-Zitrusknospenextrakten gereinigt wurde

HINWEIS: In diesem Protokoll haben wir Knospenholzproben von 72 nicht infizierten Zitrusbäumen und einer Baummischung verwendet, die mit Viren und Viroiden infiziert waren, um das Potenzial einer Kreuzkontamination zwischen den Proben bei der Verarbeitung mit HdO zu bewerten (Abbildung 2, rechte Seite, Schritt 1, Schritt 5 und Schritt 6) und die Eignung von RNA, die aus Rindengewebeextrakten gereinigt wurde, die mit HdO hergestellt wurden, um als Vorlage für den RT-qPCR-Nachweis von Zitrusviren und Viroiden verwendet zu werden.

  1. Erste HdO-Probenverarbeitung: Durchführung eines Baseline-Experiments mit 72 nicht infizierten Proben.
    1. Bereiten Sie drei (A-C) BTE-Kammern vor (Schritt 4.1.1).
    2. Bereiten Sie alle nicht infizierten Zitrusknospenholzproben (1-72) in HdO-Tragebeuteln vor und bereiten Sie eine gleiche Anzahl (72) in dem HdO-Probenentnahmesystem mit zwei Spritzen vor, wobei für jede Probe ein Spritzensystem vorhanden ist (Schritt 2.4).
    3. Trennen Sie die Probenträgerbeutel und Probenentnahmespritzen in sechs Chargen (I-VI) zu je 12 Proben.
    4. Starten Sie die HdO-Verarbeitung von Zitrusknospengewebe (Schritt 4) gemäß der folgenden Reihenfolge (Schritte 8.1.4.1-8.1.4.6) (siehe Tabelle 1, Erste Dieselprobenverarbeitung).
      1. Verarbeiten Sie für Charge I/Proben 1-12 12 Proben in Kammer A. Desinfizieren Sie Kammer A nach Probe 12 (Schritt 5).
      2. Für Charge II/Proben 13-24 werden 12 Proben in Kammer B verarbeitet. Desinfizieren Sie Kammer B nach Probe 24 (Schritt 5).
      3. Für Charge III/Proben 25-36 12 Proben in Kammer C verarbeiten. Kammer C nach Probe 36 desinfizieren (Schritt 5).
      4. Für Charge IV/Proben 37-48 werden 12 Proben in der desinfizierten Kammer A (Schritt 8.1.4.1) verarbeitet.
      5. Für Charge V/Proben 49--60 werden 12 Proben in der desinfizierten Kammer B (Schritt 8.1.4.2) verarbeitet.
      6. Für Charge VI/Proben 60-72 werden 12 Proben in der desinfizierten Kammer C (Schritt 8.1.4.3) verarbeitet.
    5. Lagern Sie die HdO-Tragetaschen mit allen Proben bei 4 °C bis zur Verwendung in Schritt 8.2.
    6. Extrahieren und reinigen Sie die RNA aus den 72 Pflanzensaftproben, die in den Schritten 8.1.4.1-8.1.4.6 erzeugt wurden, unter Verwendung der behördlich zugelassenen halbautomatischen Methodeauf Basis von magnetischen Kügelchen 8,23,28.
    7. Führen Sie RT-qPCR zum Nachweis von Zitrusviren und Viroiden durch, wie zuvor beschrieben 8,33.
  2. Für die zweite HdO-Probenverarbeitung wird ein Kreuzkontaminationsexperiment mit 70 nicht infizierten Proben und zwei gemischten infizierten Proben durchgeführt.
    1. Bereiten Sie drei (A-C) BTE-Kammern vor (Schritt 4.1.1).
    2. Die mit der Mischung infizierte Zitrusknospenholzprobe (73) wird in zwei HdO-Tragebeuteln (Schritt 1.3) für eine Gesamtzahl von zwei infizierten Proben vorbereitet.
    3. Entnehmen Sie die HdO-Tragetaschen mit den nicht infizierten Zitrusknospenholzproben aus Schritt 8.1.5, mit Ausnahme von Probe 3 - Charge I und Probe 51 - Charge V (siehe Probenaustausch in Schritt 8.2.4), so dass insgesamt 70 nicht infizierte Proben vorhanden sind.
    4. Fügen Sie den ersten HdO-Tragebeutel mit der mit der Mischung infizierten Probe 73 anstelle von Probe 3 in Charge I und den zweiten anstelle von Probe 51 in Charge V für eine Gesamtzahl von 72 Proben ein.
    5. Eine gleiche Anzahl (72) wird im HdO-Probenentnahmesystem mit zwei Spritzen mit einem Doppelspritzensystem für jede Probe vorbereitet (Schritt 2.4).
    6. Trennen Sie die 72 Probenträgerbeutel und Probenentnahmespritzen in sechs Chargen (I-VI) zu je 12 Proben.
    7. Starten Sie die HdO-Verarbeitung von Zitrusknospengewebe (Schritt 4) in der gleichen Reihenfolge wie in den Schritten 8.1.4.1-8.1.4.6.
      ANMERKUNG: Der einzige Unterschied besteht darin, dass Probe 3 in Charge I und Probe 51 in Charge V durch die infizierte Probe 73 ersetzt wird (Schritt 8.2.4) (Tabelle 1, Zweite HdO-Probenverarbeitung).
    8. Extrahieren und reinigen Sie die RNA aus den 72 Pflanzensaftproben, die in Schritt 8.2.7 wie in Schritt 8.1.6 erzeugt wurden.
    9. Führen Sie die RT-qPCR zum Nachweis von Zitrusviren und Viroiden durch, wie in Schritt 8.1.7 beschrieben.

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Representative Results

RNA-Extraktion, -Aufreinigung und -Qualität unter Verwendung von HdO-verarbeitetem Knospenholz-Zitrusgewebe und Bewertung der Zeit für die Gewebeverarbeitung
Für diesen Test haben wir Knospenholzproben von 255 repräsentativen Zitrusbäumen verwendet, um die RNA-Qualität des HdO mit dem Standardverfahren zu vergleichen. Die Proben wurden mit dem Knospenholz-Gewebeextraktor (HdO) verarbeitet (Protokollschritte 4.1-4.6 und Abbildung 2, rechte Seite, Schritt 1, Schritt 5 und Schritt 6) oder nach der behördlich zugelassenen Methode zur Verarbeitung von Zitrusknospengewebe vorbereitet, bei der das Rindengewebe von Hand geschält und zerkleinert, gefriergetrocknet, pulverisiert und zentrifugiert wird, wie von Dang et al.23 beschrieben (Abbildung 2, linke Seite, Schritte 1-6).

Der direkte Vergleich des HdO mit dem konventionellen Handhack- und Laborgeräteprotokoll für die Verarbeitung von Zitrusgewebe zeigte, dass die Qualität (d. h. Konzentration, Reinheit und Integrität) der extrahierten Nukleinsäuren (Abbildung 3A-C) und die Eignung für die nachgelagerte Verwendung für den PCR-Nachweis von Zitruspathogenen (Daten nicht gezeigt) vergleichbar waren. Gleichzeitig konnte der Zeitaufwand für die Bearbeitung von Proben durch den Einsatz des TE/HdO-Systems deutlich reduziert werden. Das HdO-System hat den Probendurchsatz des CCPP-Labors mehr als verdoppelt und die Arbeits- und Laborausrüstungskosten reduziert, da keine Instrumente wie Kügelchenschläger, Zentrifugen und Kryostationen im Wert von mehreren zehntausend Dollar erforderlich sind.

Die mit HdO extrahierten Nukleinsäuren hatten eine durchschnittliche Konzentration von 76,96 ng/μl ± 26,23 ng/μl (n = 181) und waren von hoher Reinheit mit geringer Proteinkontamination (A260/A280 2,27 ± 0,17, n = 181) (Abbildung 3B,C). Diese Werte waren vergleichbar mit den Nukleinsäuren, die mit dem manuellen Standardprotokoll von CCPP hergestellt wurden (Konzentration: 82,25 ng/μl ± 33,95 ng/μl, n = 181 und A260/A280 2,22 ± 0,10, n = 181) (Abbildung 3B,C). Die Nukleinsäureintegrität (RT-qPCR für das Zitrus-Gen nad5) war für HdO (Cq 20,97 ± 2,26, n = 181) und das Standard-CCPP-Protokoll (Cq 19,25 ± 1,53, n = 181) sehr ähnlich (Abbildung 3A). Die Ergebnisse zeigten auch, dass das HdO-Gerät im Vergleich zur herkömmlichen Methode ein höheres Probenvolumen im gleichen Zeitrahmen verarbeiten konnte. Das herkömmliche Laborverfahren erforderte ~7-10 Minuten für das manuelle Zerkleinern pro Probe und insgesamt 12 Minuten für die Gewebeverarbeitung (Gefriertrocknung, Mahlen und Zentrifugieren), während das HdO Zitrusgewebe für die Nukleinsäureextraktion in ~3 Minuten pro Probe verarbeiten konnte.

Figure 3
Abbildung 3: Qualität der Nukleinsäureextrakte der 181 repräsentativen Zitrusknospenholzproben, definiert durch Konzentration, Reinheit und Integrität. Die Proben wurden mit HdO und dem herkömmlichen Handhack- und Laborgeräteprotokoll verarbeitet. (A) Die Nukleinsäurekonzentration wurde unter Verwendung der Absorption bei 260 nm bestimmt; (B) die Reinheit wurde als Verhältnis der Absorptionen bei 260 nm und 280 nm bestimmt (A260/280). (C) Die Nukleinsäureintegrität wurde mittels RT-qPCR analysiert, die auf die mRNA des NADH-Dehydrogenase (Nad5)-Zitrusgens abzielte. Die Bereiche der optimalen Werte sind durch rot gestrichelte Kreise gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Nachweis von durch Transplantate übertragbaren Krankheitserregern von Zitrusfrüchten, Bewertung von Kreuzkontaminationen und Nachweis von Zitrusviren und -viroiden unter Verwendung von RNA, die aus HdO-Zitrusknospenholzextrakten gereinigt wurde
Die Validität der Gewebeverarbeitungsmethode wurde durch die Verarbeitung von 72 gesunden Zitrusknospenholzproben neben allen gesunden Proben und mit der Einführung von zwei Proben aus einer mit Viren und Viroiden infizierten Baummischung evaluiert (Tabelle 1 und Abbildung 4A,B). Nukleinsäuren, die aus beiden Chargen extrahiert wurden, wurden einer konventionellen laborbasierten q-PCR unterzogen, wie zuvor beschrieben 8,33. Keine der 72 gesunden Proben aus der ersten HdO-Probenverarbeitung ergab Amplifikationskurven für die getesteten Zitruspathogene (d. h. falsch positive) (Abbildung 4A). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das HdO Zitrusgewebe im Vergleich zum Standard-Laborprotokoll mit Handhackmethoden gleich gut verarbeiten kann. In der zweiten HdO-Probenverarbeitung bewerteten wir das Potenzial für Kreuzkontaminationen zwischen HdO-Köpfen und innerhalb von Proben, die mit demselben HdO-Kopf verarbeitet wurden (Schritte 1-6) und die Eignung der Nukleinsäuren für Downstream-Anwendungen (d. h. für die Verwendung als Vorlage für den RT-qPCR-Nachweis von Zitrusviren und Viroiden). In der zweiten HdO-Probenverarbeitung mit zwei eingeführten Mix-infizierten Proben wurden die durch das HdO-Protokoll erzeugten Nukleinsäuren erfolgreich zum Nachweis verschiedener Zitrusviren und Viroide (z. B. Triplex-Virus, Citrus-Leaf-Blotch-Virus [CLBV], Citrus-Psorose-Virus [CPsV], Citrus-Tristeza-Virus [CTV]), Apscaviroide (Citrus Bent Leaf Viroid [CBLVd], Citrus Dwerting Viroid [CDVd], Citrus Viroid V [CVd-V], Zitrusviroid VI [CVd-VI] und Zitrusviroid VII [CVd-VII]), Nicht-Apscaviroide Hopfen-Stunt-Viroid (HSVd; Hostuviroid), Zitrusrinden-Cracking-Viroid (CBCVd; Cocadviroid) und Citrus exocortis-Viroid (CEVd; Pospiviroid) in Charge 1 und Charge 5. Innerhalb von Charge 1 und Charge 5 waren die Proben, die auf die infizierte folgten, positiv für die oben genannten Pflanzenkrankheiten, wiesen aber steigende Cq-Werte auf. Es wurde jedoch weder eine Kreuzkontamination zwischen den Köpfen noch falsch positive oder negative Ergebnisse festgestellt (Abbildung 4B).

Stapel Probe HDO Erstes HdO Zweites HdO
Kammer Proben-Verarbeitung Proben-Verarbeitung
Ich 12-Jan Ein 1-12 Nicht infiziert 1-2 & 4-12 Nicht infiziert
Sample #3 wird durch eine infizierte Mischung ersetzt
II 13-24 B 13-24 13-24
Nicht infiziert Nicht infiziert
III 25-36 C 25-36 25-36
Nicht infiziert Nicht infiziert
IV 37-48 A-desinfiziert 37-48 37-48
Nicht infiziert Nicht infiziert
V 49-60 B-desinfiziert 49-60 49-50 & 52-60 nicht infiziert
Nicht infiziert
Sample #51 wird durch Mix infiziert ersetzt
VI 61-72 C-desinfiziert 61-72 Nicht infiziert 61-72 Nicht infiziert

Tabelle 1: Verfahren zur Validierung der HdO-Gewebeverarbeitungsmethode anhand von 72 Zitrusknospenholzproben. Jede Bearbeitung wurde zweimal wiederholt. Es gab 6 Chargen mit je 12 Proben. In der ersten Probenverarbeitung waren alle 72 Zitrusknospenholzproben gesund. In der zweiten HdO-Probenverarbeitung wurden Probe 3 und Probe 51 durch zwei Proben aus einer Baummischung ersetzt, die in Charge 1 und Charge 5 mit Viren und Viroiden infiziert war.

Figure 4
Abbildung 4: Validierung der HdO-Gewebeverarbeitungsmethode anhand von 72 Zitrusknospenholzproben. Jede Bearbeitung wurde zweimal wiederholt. Es gab 6 Chargen mit je 12 Proben. (A) Alle 72 Zitrusknospenholzproben waren gesund. (B) Dieselben 72 Zitrusknospenholzproben mit der Einführung von zwei Proben aus einer mit Viren und Viroiden infizierten Baummischung in Charge 1 (Probe 3) und Charge 5 (Probe 51). Die NTC- und Wasserkontrollen wiesen alle unbestimmte Cq-Werte auf (d. h. das DNA-Ziel war nicht in der Probe vorhanden). Die Positivkontrollen für den Triplex (CLBV, CPsV, CTV) wiesen Cq-Werte von 23,9, 25,2 bzw. 22,4 auf. Die Positivkontrollen für Apscaviroide (CBLVd, CDVd und CBCVd) wiesen Cq-Werte von 23,39, 21,27 bzw. 25,17 auf. Die Positivkontrollen für Nicht-Apscaviroide (CEVd, HSVd, IV) wiesen Cq-Werte von 26,9, 27,0 bzw. 26,5 auf. Abkürzungen: HdO = Knospenholz-Gewebeextraktor; NTC = No-Template-Steuerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung S1: Einrichtung der Reinigungsstation. Nachdem die 10. Probe in der Kammer verarbeitet wurde, müssen die Protokollschritte 3.1-3.6 befolgt werden, um die Reinigungsstation für die Desinfektion der Kammer vorzubereiten. Wie in Protokollschritt 3.1 wird 1 L Wasser in den Ultraschallreiniger gegeben. Zwei Müllbeutel werden über den Ultraschallreiniger gewickelt (Protokollschritt 3.2), und ~5 l 10%iges Bleichmittel (1%ige Natriumhypochloritlösung) werden in den Ultraschallreiniger gegossen (Protokollschritt 3.3). Die Wasserwanne wird mit so viel Wasser gefüllt, dass eine Kammer untergetaucht werden kann (Protokollschritt 3.4), der Luftkompressor ausgeschaltet und das Ventil geöffnet (Protokollschritt 3.5). Es wird eine Kulisse eingerichtet, um die Flüssigkeit aufzufangen, während die Kammer trocknet (Protokollschritt 3.6). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Mit dem Aufkommen der HLB-Zitruskrankheit wurden die Zitrusindustrie, die Zulassungsbehörden und die Diagnoselabore aufgefordert, sich auf Nukleinsäureextraktionsmethoden mit hohem Durchsatz in Kombination mit manueller Probenverarbeitung mit niedrigem Durchsatz und Assays zum Nachweis von Krankheitserregern wie qPCR34 für die Untersuchung einzelner Bäume in Kombination mit Krankheitsmanagementpraktikenzu verlassen 35. Die HLB-Positivitätsrate in Kalifornien ist von 0,01 % im Jahr 2012 auf 1,2 % im Jahr 2020 gestiegen. Obwohl die qPCR ein leistungsstarkes und zuverlässiges Instrument zum Nachweis von Krankheitserregern ist, ist es mit den derzeit verfügbaren Technologien nicht möglich, eine ausreichende Menge an Pflanzengewebe zu beproben und zu verarbeiten, was zu einer deutlichen Unter- und Unterbeprobung von CLas in Zitrusbäumen in Kalifornien führt. Unter- und Unterproben treten sowohl in Bezug auf die Anzahl der getesteten Bäume als auch auf die Menge des Pflanzenmaterials pro verarbeitetem Baum (d. h. die Anzahl der Blätter) auf, und aufgrund der sporadischen Verteilung infizierter Blätter innerhalb der Baumkronen besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass frühe oder milde Infektionen übersehen werden. Die derzeitigen Methoden für die Probenahme und CLas-Tests können aufgrund von Kosten (z. B. Arbeit und Ausrüstung) nicht mit einer erhöhten Nachfrage skaliert werden. Derzeit erfordert die Probenverarbeitungsmethode, die von den meisten Zitrus-Diagnoselabors in Kalifornien verwendet wird, um Nukleinsäuren zu gewinnen, die für die Untersuchung von Zitruspathogenen geeignet sind, über 17 Stunden für die manuelle Probenhandhabung und spezielle Verbrauchsmaterialien und Geräte, die über 100.000 US-Dollar kosten.

Hier präsentieren wir die Validierung eines speziellen Instruments zur schnellen Verarbeitung von Zitrusknospenrindengeweben, den sogenannten Knospengewebeextraktor (HdO), sowie ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Probenhandhabung für Zitrus-Diagnoselabore. Die Forschung konzentrierte sich auf die Entwicklung einer innovativen Gewebeverarbeitungsmethode, um das derzeitige arbeitsintensive Häckseln von Knospenholzproben von Hand zu ersetzen und das höchstmögliche Durchsatz- und kostengünstigste Instrument zur Verarbeitung von Zitrusblütenholz zu bauen. Die Ergebnisse zeigen, dass HdO den Probendurchsatz erhöht und die Kosten für Geräte und Verbrauchsmaterialien senkt, die im CCPP-Diagnoselabor verwendet werden. Die vorgestellte Technologie und Methode umfasst auch die Verwendung von NFC-Tags, einer Telefon-App und einer Online-Datenbank zur Verfolgung von Probeninformationen in Echtzeit. Nachdem die Knospenholzproben entnommen wurden, verknüpft die Telefon-App den NFC-Probenbeutelclip mit dem NFC-Baum-Tag. Die Proben werden dann zur Verarbeitung mit der HdO-Maschine an das Labor geschickt. Die Informationen zu jeder Probe werden mit einem schnellen Wisch über die Seite des HdO-Gehäuses aufgezeichnet. Über den NFC-Tag der Probe werden auch die Bearbeitungszeit für jede Probe und das Gewicht der Probe aufgezeichnet und in Echtzeit in die Online-Datenbank hochgeladen. Diese Methode bietet ein sehr zeiteffizientes System, verbessert die Qualitätskontrolle (d. h. durch die Vermeidung von Fehlern bei der Probenidentifikation) und erhöht die Effizienz des Labors.

Die HdO-Hochdurchsatzverarbeitung und -validierung wurde mit "realen/Feld"-Zitrusproben durchgeführt, was zeigt, dass andere diagnostische Labore die Technologie und Methodik problemlos übernehmen können. Die Einführung dieser Technologie wird es ermöglichen, die Betriebskosten zu senken und die diagnostische Kapazität und Laboreffizienz zu erhöhen, wodurch die Chancen erhöht werden, kranke Bäume in einem früheren Stadium nach der Infektion zu erkennen, und die Wahrscheinlichkeit einer Ausbreitung der Krankheit verringert wird. Der direkte Vergleich von HdO mit herkömmlichen Gewebeverarbeitungsmethoden zeigt, dass die Qualität der extrahierten Nukleinsäure (d. h. Konzentration, Reinheit und Integrität) und die Ergebnisse des nachgeschalteten Erregernachweises vergleichbar sind (Abbildung 3A-C). Der Zeitaufwand für die Verarbeitung der Proben wird jedoch mit dem HdO im Vergleich zu manuellen Verarbeitungsprotokollen erheblich reduziert (d. h. 3,3 min vs. 6,8 min). Die Kammern und die HdO-Basis erfordern einen regelmäßigen Reinigungsplan. Obwohl die Reinigung zeitaufwändig ist und eine Einschränkung der Methode darstellt, ermöglicht die Technologie die schnelle Verarbeitung mehrerer Proben im HdO, bevor die Kammer gereinigt werden muss. Herkömmliche Methoden erfordern weniger Reinigung, da jede Probe über einen eigenen Verarbeitungsbehälter verfügt, der in vielen Fällen Einwegbehälter ist, aber sie benötigen mehr Behälter und Lagerplatz (z. B. 4-Grad-Kühlschränke und -20 °C- oder -80-Grad-Gefrierschränke).

Das HdO-Verfahren wurde konzipiert und entwickelt, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, einen Problembereich durch die Verarbeitung und Prüfung von Massenproben zu identifizieren (d. h. einen kranken Baum in einem großen Fundamentblock für Zitruskeimplasma, eine Baumschule oder einen Obstgarten zu finden), indem nur eine kleine Anzahl von Massentests durchgeführt wird, die Hotspots identifizieren können. Daher weicht sie nur dann ab, wenn ein positives Ergebnis gefunden wird. In diesem Fall (Abbildung 4B, Charge 1 und Charge 5) sind die anschließende Probenverarbeitung und die Untersuchung einzelner Proben aus derselben Charge, die das positive Material enthalten (d. h. nur eine Teilmenge der Proben), erforderlich, um festzustellen, welche Proben positiv sind. Daher ist es wichtig zu beachten, dass sich dieses Verfahren vor allem für Fälle mit niedrigen Infektionsraten eignet, wo es die Untersuchung einer großen Menge an Material von vielen Bäumen ermöglicht, was wiederum die Wahrscheinlichkeit des Krankheitsnachweises erhöht, ohne eine große Anzahl von Einzelproben untersuchen zu müssen. Herkömmliche Methoden werden in Fällen mit hohen Infektionsraten die optimale Option sein, da sie es ermöglichen, jede Probe einzeln zu testen. Dies ist besonders wichtig im Fall von HLB-Erhebungen in Kalifornien20 (immer noch mit einer niedrigen HLB-Positivitätsrate), bei denen die verwendeten PCR-basierten Methoden zum Nachweis von CLas in erster Linie dazu dienen, das Vorhandensein oder Fehlen von CLas in asymptomatischen Bäumen zu bestätigen (d. h. keine typischen fleckigen Sprenkel, Vergilbung des Kronendachs oder Baumrückgang), die CLas-positiven asiatischen Zitruspsylliden (ACP) ausgesetzt waren. Angesichts der Tatsache, dass wir nicht wissen, wo im Baum ein infektiöses ACP gefressen hat, sind die Chancen, einen infizierten, aber asymptomatischen Baum auf dem Feld oder in einem anderen großen Gebiet oder Betrieb durch das Testen einer kleinen Anzahl von Proben zu identifizieren, sehr gering (z. B. werden in Kalifornien derzeit 20 Blätter gesammelt und 12 Blätter pro Baum getestet20). Je größer das Blätterdach ist, desto geringer ist natürlich die Wahrscheinlichkeit, dass CLas entdeckt wird. Auch wenn die Kosten für die PCR selbst (d. h. Reagenzien, grundlegende Laborausrüstung und Thermocycler), die auf die Probenverarbeitung folgt, sowie für die Nukleinsäureextraktion und -reinigung im HdO-Prozess unverändert bleiben, bleibt die Unsicherheit darüber, wo die Proben von asymptomatischen Bäumen entnommen werden sollen, um festzustellen, ob sie infiziert sind oder nicht, bestehen und unserer Meinung nach ist die Achillesferse der HLB-Umfrage in Kalifornien. Das vorgestellte Instrument, die Technologie, die Methode und die Verbesserungen ermöglichen die Verarbeitung größerer Probengrößen in kürzerer Zeit und zu geringeren Kosten. Daher wird diese Methode die Wahrscheinlichkeit erhöhen, infizierte Bäume rechtzeitig zu identifizieren, und die Tilgungsbemühungen für HLB oder andere invasive Krankheitserreger von Zitrusfrüchten in Kalifornien verbessern (z. B. das im August 2022 in Kalifornien gemeldete Citrus Yellow Vein Clearing Virus).

In Kombination mit automatisierten Gewebeverarbeitungsmethoden würden Massenproben und -tests die Kosten für die Verarbeitung von Pflanzengewebe senken. Diese Kostensenkung würde es vielen diagnostischen Laboren ermöglichen, Obstplantagen in vielen Bundesstaaten effektiver zu untersuchen und die Ausbreitung von HLB und anderen Krankheiten besser zu verfolgen. Letztendlich bedeutet dies, dass die Landwirte ein effektiveres Instrument hätten, um die Ausbreitung von Krankheiten durch effizientere Tests in großem Maßstab zu verlangsamen. Während das HdO-Gerät die derzeitige diagnostische Kapazität von Zitruslaboren verbessern und der gesamten Zitrusindustrie zugute kommen kann, kann die Technologie gleichzeitig auch auf andere Baumkulturen übertragen werden. Die vorläufigen Daten zur Nukleinsäurekonzentration und -reinheit, wie sie von der OD geschätzt wurden, haben gezeigt, dass HdO Gewebe aus Mandeln (59,87 ng/μl ± 7,43 ng/μl und A260/A280 1,17 ± 0,05, n = 9), Weinreben (135,74 ng/μl ± 50,74 ng/μl und A260/A280 1,17 ± 0,06, n = 9) und Pfirsich (66,50 ng/μl ± 6,07 ng/μl und A260/A280 1,29 ± 0,05) effektiv verarbeiten kann. n = 9) (Proben wurden freundlicherweise von Foundation Plant Services an der UC Davis zur Verfügung gestellt).

Die hier vorgestellte Plattform für die Verarbeitung von Knospengewebe hat die Entwicklung weiterer Anlagen zur Verarbeitung von Pflanzengewebe angeregt. So befindet sich beispielsweise ein Blattgewebeextraktor (LTE) derzeit in der Entwicklung. Vorläufige Testergebnisse mit Zitrusblättern haben gezeigt, dass das LTE-Gerät etwa siebenmal mehr Blätter verarbeiten kann, wobei die Verarbeitungszeit im Vergleich zur aktuellen Standardmethode mit 12 Blättern, die in Kalifornien verwendet wird, um nur35 % verlängert werden kann. Wir schätzen, dass ein LTE-gestütztes Massenprobenahme- und Testprotokoll die Gesamtkosten pro Zitrusblatttest um ein Viertel senken könnte. Die Forschung, um den Wert der praktischen Anwendung dieser Technologie zu beweisen, wird derzeit im Rahmen eines CDFA Specialty Crop Block Grant in unseren Labors durchgeführt.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden finanziellen Interessen gibt.

Acknowledgments

Die Autoren erkennen das Volk der Cahuilla als die traditionellen Hüter des Landes an, auf dem die experimentelle Arbeit durchgeführt wurde. Wir danken Professor Norman Ellstrand von der University of California, Riverside, für die Bereitstellung von Laborräumen für die Durchführung von Forschungsaktivitäten für dieses Projekt im Rahmen der UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ) Initiative. Diese Forschung wurde durch das CDFA - Specialty Crop Block Grant Program (Grant Nr. 18-0001-055-SC) unterstützt. Zusätzliche Unterstützung kam auch durch das CRB-Projekt 6100; USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch-Projekt 1020106; und der National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Health Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, & AP20PPQS&T00C049) an Georgios Vidalakis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.08" Hex Trimmer line PowerCare FPRO07065 Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor California Air Tools 8010 Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube Globe Scientific 111558B Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set Technology Evolving Solutions TE006-F1-10A-G1000-E1 Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach
12" Ruler Westcott ‎16012 To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite Hasa 1041 Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer Insignia NS-CZ70WH0 Store sample after processing
4" x 12" plastic bags Plymor FP20-4x12-10 Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab Puritan 806-PCL Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote HDX 206152 Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun JASTIND ‎JTABG103A Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie Sharpie  S-19421 Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor Brand Z627569 Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber Technology Evolving Solutions TE002BB-A05-E1 Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap Dawn 57445CT Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter Air Science P5-36XT-A Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container PolarTech 261/J50C Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat Red Kap KP14WH LN 46 Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop Microsoft Surface Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone Samsung Galaxy S9 Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag Technology Evolving Solutions TE005-Clip-E1 Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag Technology Evolving Solutions TE005-Collar-E1 Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves Usa Scientific 3915-4400 Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff 3M 90565-4DC-PS Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose FYPower ‎510019 Attaches air gun to compressor
Saftey glasses Solidwork SW8329-US Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle JohnBee B08QM81BJV Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base Technology Evolving Solutions TE001-A-E1 System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale Technology Evolving Solutions TE003-A05-200g-01-E1 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield 
Vermiculite EasyGoProducts B07WQDZGRP Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter Boenfu ‎BOWC-06002-US Wire cutters to cut trimmer line

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioengineering Ausgabe 194 Knospengewebeextraktion Handhacken "Candidatus Liberibacter asiaticus" CLas huanglongbing HLB Citrus tristeza virus CTV

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

to:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

Automatisierung der Verarbeitung von Zitrusblütenholz für den nachgelagerten Nachweis von Krankheitserregern durch Gerätetechnik
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Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E., Uribe, G., De Francesco, A., Milton, R., De La Torre, A., Mounkam, A., Dang, T., Bodaghi, S., Lavagi-Craddock, I., Syed, A., Grover, W., Okamba, A., Vidalakis, G. Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. J. Vis. Exp. (194), e65159, doi:10.3791/65159 (2023).

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