Candidatus Liberibacter asiaticus", CLas, huanglongbing, HLB, Virus de la tristeza de los cítricos, CTV, scientific video journal" />

Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Automatización del procesamiento de yemas de cítricos para la detección de patógenos posteriores a través de la ingeniería de instrumentos

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65159
Automatic Translation
*1,6, *2, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5, *1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside, 2Technology Evolving Solutions (TES), 3Department of Bioengineering, University of California Riverside, 4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV, 5University of California Riverside, 6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Diseñamos, fabricamos y validamos un instrumento que procesa rápidamente tejidos de yemas cítricas de corteza ricos en floema. En comparación con los métodos actuales, el extractor de tejido de yemas (BTE) ha aumentado el rendimiento de las muestras y ha disminuido los costes de mano de obra y equipos necesarios.

Abstract

Los patógenos de los cítricos transmisibles y limitados por el floema, como los virus, los viroides y las bacterias, son responsables de epidemias devastadoras y graves pérdidas económicas en todo el mundo. Por ejemplo, el virus de la tristeza de los cítricos mató a más de 100 millones de árboles de cítricos en todo el mundo, mientras que el "Candidatus Liberibacter asiaticus" le ha costado a Florida $ 9 mil millones. El uso de yemas de cítricos sometidas a pruebas de patógenos para la propagación de árboles es clave para el manejo de dichos patógenos. El Programa de Protección Clonal de Cítricos (CCPP, por sus siglas en inglés) de la Universidad de California, Riverside, utiliza ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) para analizar miles de muestras de árboles fuente de yemas de cítricos cada año para proteger los cítricos de California y proporcionar unidades de propagación limpia a la Red Nacional de Plantas Limpias. Un grave cuello de botella en la detección molecular de alto rendimiento de virus y viroides cítricos es el paso de procesamiento de tejidos vegetales.

La preparación adecuada de los tejidos es fundamental para la extracción de ácidos nucleicos de calidad y su uso posterior en los ensayos de PCR. El picado, pesaje, liofilización, molienda y centrifugación de tejidos vegetales a bajas temperaturas para evitar la degradación de ácidos nucleicos requiere mucho tiempo y mano de obra y requiere equipos de laboratorio costosos y especializados. Este artículo presenta la validación de un instrumento especializado diseñado para procesar rápidamente tejidos de corteza ricos en floema a partir de yemas de cítricos, denominado extractor de tejido de yemas (BTE). El BTE aumenta el rendimiento de las muestras en un 100% en comparación con los métodos actuales. Además, disminuye la mano de obra y el costo del equipo. En este trabajo, las muestras de BTE tuvieron un rendimiento de ADN (80,25 ng/μL) que fue comparable con el protocolo de corte manual del CCPP (77,84 ng/μL). Este instrumento y el protocolo de procesamiento rápido de tejidos vegetales pueden beneficiar a varios laboratorios y programas de diagnóstico de cítricos en California y convertirse en un sistema modelo para el procesamiento de tejidos para otros cultivos leñosos perennes en todo el mundo.

Introduction

Los patógenos de los cítricos limitados por floema transmisibles por injerto, como los viroides, los virus y las bacterias, han causado epidemias devastadoras y graves pérdidas económicas en todas las zonas productoras de cítricos del mundo. Los viroides de los cítricos son factores limitantes de la producción debido a las enfermedades de exocortis y caquexia que causan en los tipos de cítricos económicamente importantes, como los trifoliados, los híbridos trifoliados, las mandarinas, las clementinas y las mandarinas 1,2,3. En California, estos tipos de cítricos sensibles a los viroides son la base del creciente y rentable mercado de los "peladores fáciles", siguiendo la tendencia cambiante en la preferencia de los consumidores por frutas fáciles de pelar, segmentadas y sin semillas 4,5,6. Por lo tanto, los viroides de los cítricos están regulados por el Departamento de Alimentos y Agricultura de California (CDFA, por sus siglas en inglés) "Programa de Limpieza de Plagas de Plantas de Vivero-Proyecto de Ley del Senado 140", y los laboratorios de la División de Diagnóstico de Plagas de Plantas del CDFA realizan miles de pruebas de viroides de cítricos anualmente 7,8,9,10 . El virus de la tristeza de los cítricos (CTV) ha sido responsable de la muerte de más de 100 millones de árboles de cítricos desde el comienzo de la epidemia mundial en la década de 1930 3,9,10,11. En California, los aislados del virus de la resistencia a la rotura del tallo y a la rotura trifoliada representan una seria amenaza para la industria de cítricos de California de $3.6 mil millones12,13,14. En consecuencia, el CDFA clasifica al CTV como una plaga vegetal de clase A regulada, y el laboratorio de la Agencia de Erradicación de la Tristeza de California Central (CCTEA, por sus siglas en inglés) realiza extensos estudios de campo y miles de pruebas de virus cada año15,16. Se estima que la bacteria "Candidatus Liberibacter asiaticus" (CLas) y la enfermedad huanglongbing (HLB) han causado cerca de $9 mil millones de daños económicos a Florida como resultado de una reducción del 40% de la superficie de cítricos, una disminución del 57% en las operaciones de cítricos y una pérdida de casi 8,000puestos de trabajo. En California, se predijo que una hipotética reducción del 20% en la superficie de cítricos debido al HLB resultaría en la pérdida de más de 8,200 empleos y una reducción de más de 500 millones de dólares en el producto interno bruto del estado. Por lo tanto, el Programa de Prevención de Plagas y Enfermedades de los Cítricos gasta más de $40 millones anuales en encuestas para analizar, detectar y erradicar las CLas de California14,17,19,20.

Un elemento clave del manejo de viroides, virus y bacterias de los cítricos es el uso de materiales propagativos probados contra patógenos (es decir, yemas) para la producción de árboles. Las yemas de los cítricos sometidas a pruebas de patógenos se producen y mantienen en el marco de programas de cuarentena integrales que emplean técnicas avanzadas de eliminación y detección de patógenos10,21. El Programa de Protección Clonal de Cítricos (CCPP, por sus siglas en inglés) de la Universidad de California, Riverside, analiza miles de muestras de yemas cada año de variedades de cítricos recién importadas al estado y a los EE. UU., así como árboles fuente de yemas de cítricos, para proteger los cítricos de California y apoyar las funciones de la Red Nacional de Plantas Limpias para Cítricos10,17,22. Para manejar el gran volumen de pruebas de cítricos, los ensayos de detección de patógenos de alto rendimiento, confiables y rentables son un componente fundamental para el éxito de programas como el CCPP 7,10,22.

Si bien los ensayos de detección de patógenos basados en moléculas, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), han permitido aumentos significativos en el rendimiento en los laboratorios de diagnóstico de plantas, en nuestra experiencia, uno de los cuellos de botella más críticos en la implementación de protocolos de alto rendimiento es el paso de procesamiento de muestras de tejido vegetal. Esto es particularmente cierto en el caso de los cítricos porque los protocolos disponibles actualmente para el procesamiento de tejidos ricos en floema, como los pecíolos de las hojas y la corteza de las yemas, requieren mucha mano de obra, mucho tiempo y equipos de laboratorio costosos y especializados. Estos protocolos requieren picado manual, pesaje, liofilización, molienda y centrifugación a bajas temperaturas para evitar la degradación de ácidos nucleicos 8,23,24. Por ejemplo, en el laboratorio de diagnóstico del CCPP, el procesamiento de muestras incluye (i) picado manual (6-9 muestras/h/operador), (ii) liofilización (16-24 h), (iii) pulverización (30-60 s) y (iv) centrifugación (1-2 h). El proceso también requiere suministros especializados (p. ej., tubos de seguridad de alta resistencia, bolas de molienda de acero inoxidable, adaptadores, cuchillas, guantes) y múltiples piezas de equipo de laboratorio costoso (p. ej., congelador ultrabajo, liofilizador, pulverizador de tejidos, crioestación de nitrógeno líquido, centrífuga refrigerada).

Como en cualquier industria, la ingeniería de equipos y la automatización de procesos son clave para reducir costos, aumentar el rendimiento y proporcionar productos y servicios uniformes y de alta calidad. La industria de los cítricos necesita instrumentos de procesamiento de tejidos de bajo costo que requieran una habilidad mínima para operar y, como tales, sean fáciles de transferir a los laboratorios de diagnóstico y a las operaciones de campo para permitir una alta capacidad de procesamiento de muestras para la rápida detección de patógenos aguas abajo. Technology Evolving Solutions (TES) y el CCPP desarrollaron (es decir, diseñaron y fabricaron) y validaron (es decir, probaron con muestras de cítricos y compararon con procedimientos de laboratorio estándar) un instrumento de bajo costo (es decir, eliminaron la necesidad de equipos de laboratorio especializados) para el procesamiento rápido de tejidos cítricos ricos en floema (es decir, yemas), llamado extractor de tejidos de yemas (BTE). Como se ve en la Figura 1, el BTE incluye un componente base para la potencia y los controles, además de una cámara extraíble para el procesamiento de las yemas de los cítricos. La cámara BTE está compuesta por una muela abrasiva diseñada específicamente para eliminar los tejidos de la corteza ricos en floema de las yemas de los cítricos. El tejido de la corteza triturada se expulsa rápidamente a través de un puerto deslizante a una jeringa que contiene tampón de extracción, se filtra y se prepara para la extracción y purificación de ácidos nucleicos sin ninguna manipulación o preparación adicional (Figura 1). El sistema BTE también incluye una aplicación de seguimiento de muestras sin papel y una aplicación de pesaje integrada, que registran la información de procesamiento de muestras en una base de datos en línea en tiempo real.

El sistema BTE ha aumentado la capacidad de diagnóstico de laboratorio del CCPP en más del 100% y ha producido sistemáticamente extractos de tejidos cítricos adecuados para la purificación de ácidos nucleicos de alta calidad y la detección posterior de patógenos de cítricos transmisibles por injerto mediante ensayos de PCR. Más específicamente, BTE ha reducido el tiempo de procesamiento de tejidos de más de 24 h a ~3 min por muestra, ha reemplazado instrumentos de laboratorio que cuestan más de $ 60,000 (Figura 2, pasos 2-4) y ha permitido el procesamiento de tamaños de muestra más grandes.

Este artículo presenta los datos de validación del procesamiento de tejidos de corteza de cítricos de alto rendimiento de BTE, la extracción de ácidos nucleicos y la detección de patógenos con muestras de yemas de cítricos de árboles fuente, incluidos todos los controles positivos y negativos apropiados de la Instalación de Cuarentena CCPP Rubidoux y la Instalación de la Fundación Lindcove, respectivamente. También presentamos los cambios en el rendimiento y el tiempo de procesamiento en comparación con el procedimiento de laboratorio actual (Figura 2). Además, este trabajo proporciona un protocolo detallado, paso a paso, para los laboratorios de pruebas de patógenos de cítricos y demuestra cómo el BTE puede apoyar las funciones de los programas de reproductores, encuestas y erradicación de plantas de cría de patógenos limpios.

Figure 1
Figura 1: Extractor de tejido de yemas. El BTE incluye un componente base para la potencia y los controles, además de una cámara extraíble para el procesamiento de las yemas de los cítricos. La cámara BTE está compuesta por una muela abrasiva diseñada específicamente para eliminar los tejidos de la corteza ricos en floema de las yemas de los cítricos. El tejido de la corteza triturada se expulsa rápidamente a través de un puerto deslizante a una jeringa, se filtra y se prepara para la extracción y purificación de ácidos nucleicos sin ninguna manipulación o preparación adicional. Abreviatura: BTE = extractor de tejidos de yemas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Comparación paso a paso entre el procedimiento convencional de laboratorio de corte manual y el procesamiento de BTE. El procesamiento de BTE implica el procesamiento de tejidos de corteza de cítricos de alto rendimiento, la extracción de ácidos nucleicos y la detección de patógenos. El tiempo de cada paso se indica entre paréntesis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Recolección de las muestras de yemas de cítricos para enviar

  1. Envíe a Technology Evolving Solutions una hoja de cálculo de información de árboles para que la carguen en su servidor web (eventualmente, el usuario creará nuevos árboles).
  2. Use el rastreador TES de la aplicación de teléfono para seleccionar un árbol y sostenga una etiqueta de collar de comunicación de campo cercano (NFC) en el teléfono para cargar la información del árbol en la etiqueta.
  3. Inserte de tres a cuatro muestras de yemas de cítricos en el portabolsas de plástico compatible con BTE y ciérrelas con la tapa.
    1. Asegúrese de que la longitud de la yema no exceda las 8 pulgadas y no sea inferior a 5 pulgadas.
      1. Si la longitud es superior a 8 pulgadas, use una hoja de afeitar desechable estéril o unas tijeras de podar descontaminadas con una solución de lejía al 10% (hipoclorito de sodio al 1%) para acortarla.
      2. Si la longitud es inferior a 5 pulgadas, recoja una muestra diferente de yemas para ponerla en la bolsa.
    2. Asegúrese de eliminar cualquier crecimiento axilar o espinas grandes a mano o con herramientas de corte desinfectadas con lejía al 10% (hipoclorito de sodio al 1%).
      NOTA: Este paso es importante para que la yema sea más fácil de maniobrar en la abertura de la cámara.
    3. Asegúrese de que no haya muestras de yemas que tengan características curvas. Si lo hacen, retírelos con herramientas de corte desinfectadas con lejía al 10% (hipoclorito de sodio al 1%) y coloque en las bolsas BTE solo las porciones rectas de la muestra.
      NOTA: Las yemas curvas son muy difíciles de maniobrar en el instrumento, lo que da como resultado rayas desiguales en la corteza.
  4. Utilice la aplicación de teléfono TES tracker para escanear la etiqueta de collar NFC del árbol y vincularla con la etiqueta de clip NFC en la bolsa de muestras.
  5. Preste atención al grosor de la yema, ya que eso determina cómo el operador quitará la corteza de la yema rica en floema dentro de la cámara BTE.
    1. Si la yema tiene un grosor inferior a 0,20 pulgadas, tenga cuidado al quitar la yema porque los hilos giratorios de alta velocidad en la cámara pulverizarán toda la yema hasta su núcleo, más allá de la capa de corteza y en los tejidos de madera y médula no ricos en floema.
    2. Seleccione yemas más gruesas porque es más fácil pelar los tejidos de la corteza y evitar los tejidos de yemas no ricos en floema.
  6. Coloque las muestras en un contenedor de envío aislado con algunas bolsas de hielo.

2. Configuración en la campana extractora

NOTA: Es preferible operar el BTE dentro de una campana extractora. Esto reducirá el riesgo de contaminación cruzada de tejidos vegetales y contaminación de laboratorio.

  1. Desinfecte con una botella rociadora al 10% (hipoclorito de sodio al 10%).
    1. Rocía la superficie de la capucha y deja reposar la lejía durante aproximadamente 1 minuto antes de limpiarla con una toalla de papel.
    2. Rocía una toalla de papel con la solución de lejía. Limpie la base TE, los componentes de la báscula de peso (báscula, escudo de aire y torre) y un rotulador.
  2. Desenvuelva un juego de jeringas para el número de muestras que se van a procesar y colóquelas dentro de una caja de cartón cubierta.
  3. Tenga un paquete de hisopos disponibles fuera de la capucha en caso de que sean necesarios.
  4. Prepara la báscula.
    1. Retire la torre de pesas de la báscula y mantenga presionado el botón de encendido para encenderla. Coloque la torre en el centro de la escala después de que la escala muestre 0.
    2. Deslice el protector de aire de la báscula de peso sobre la parte delantera de la báscula.
  5. Prepare la base del extractor de tejidos accionando el interruptor en la parte posterior. Asegúrese de que el interruptor en el lado izquierdo de la caja esté presionado hacia abajo en la parte superior. Espere a que un LED verde parpadee, que indica que la cámara está lista.

3. Configure las estaciones de limpieza (Figura complementaria S1).

  1. Coloque 1 L de agua en el limpiador ultrasónico.
  2. Envuelva dos bolsas de basura sobre la parte superior del limpiador ultrasónico.
  3. Vierta ~ 5 L de lejía al 10% (solución de hipoclorito de sodio al 1%) en el limpiador ultrasónico.
  4. Llene la tina de agua con suficiente agua para sumergir una cámara.
  5. Encienda el compresor de aire y abra la válvula.
  6. Coloque un telón de fondo para atrapar el líquido mientras la cámara se seca.

4. Procesamiento del material para el BTE para el pelado de la corteza de la yema de los cítricos

  1. Cargue la cámara en la base BTE.
    1. Prepare la cámara BTE.
      1. Coloque una bolsa de muestra vacía en la parte posterior de la cámara. Utilice dos juntas tóricas para asegurar la bolsa vacía a la boquilla trasera de la cámara BTE.
      2. Inspeccione la hoja en busca de signos de desgaste o daño, como cortes que se forman en la hoja donde continúa en el plástico o cortes que se forman en la punta. Asegúrese de que la flecha de la hoja esté alineada con el símbolo de candado único.
      3. Asegúrese de que la liberación de aire en la parte inferior de la cámara esté girada hacia el símbolo O . Coloque la tapa transparente sobre la abertura de la cámara y deslice el portaobjetos BTE transparente sobre la cámara usando el riel a la derecha de la cámara. Empuje la cerradura en la parte inferior de la cámara hasta donde pueda entrar en la corredera. Asegúrese de que la tapa del émbolo esté montada en la parte superior de la guía.
    2. Coloque la cámara en la base BTE con la boquilla de la base BTE sobresaliendo en la parte posterior de la cámara. Espere a que el LED azul parpadee, lo que indica que la colocación se ha realizado correctamente.
  2. Cargue la muestra en la base BTE moviendo la pegatina blanca de la etiqueta de clip NFC a una Z en el lado derecho de la caja. Mueva la etiqueta con un movimiento circular lento en Z hasta que la luz amarilla comience a parpadear. Fije la muestra a la base BTE y asegúrese de que la bolsa de muestra no tenga agujeros; Si hay un agujero, parchéalo con cinta adhesiva. Coloque la junta tórica sobre la bolsa de muestra para asegurarla a la parte delantera de la boquilla BTE.
  3. Cargue el juego de jeringas no utilizado.
    1. Tara el juego de jeringas. Coloque el juego de jeringas sin usar en la torre de la báscula. Retire el juego de jeringas cuando una luz roja comience a parpadear o la báscula muestre 0.
    2. Retire el émbolo de la jeringa con el filtro. Asegúrese de que el líquido esté en la jeringa inferior (sin filtro). Coloque el émbolo a un lado sobre una toalla de papel o en la torre donde el émbolo negro no toque ninguna superficie.
    3. Conecte la jeringa al puerto de salida de la corredera presionando el puerto de salida en la jeringa y girando 90°.
  4. Procesa la muestra de yema.
    PRECAUCIÓN: BTE tiene partes móviles de alta velocidad. Toda la operación debe realizarse dentro de una campana extractora. Todos los usuarios deben usar anteojos protectores, orejeras (tapones para los oídos) y todo el resto del equipo de protección personal (EPP), como guantes y batas de laboratorio.
    1. Presione el botón negro superior para encender la máquina. Presione una segunda vez para detener el motor en cualquier momento durante el procesamiento.
      NOTA: La caja tiene detección de velocidad y temperatura para garantizar que funcione correctamente.
    2. Toma un palo de yema a través de la bolsa y colócalo a través de la parte superior de la boquilla BTE.
    3. Agarra el palo de madera del otro lado de la cámara con la otra mano y baja lentamente hacia la hoja. Escuche un suave zumbido que indica que la yema está siendo despojada de su corteza. Mueva lentamente la yema hacia adelante y hacia atrás mientras la gira.
      1. Si se escucha un sonido de corte fuerte y agresivo, mueva rápidamente la rama hacia arriba y / o presione el botón superior para detener el motor. Para detener el motor, utilice el interruptor del lado derecho para finalizar el procesamiento (consulte el paso 4.4.3.2).
      2. Si no sale material de la salida al cortar, entonces la cámara tiene una obstrucción. Apague el motor, retire la tapa del émbolo deslizante y use el plástico del hisopo para empujar la obstrucción hacia afuera por la salida de la máquina. Utilice el interruptor del lado derecho para finalizar el procesamiento: Arriba = Corte hacia adelante; Medio = Motor apagado; Abajo = Corte inverso.
    4. Repita los pasos 4.4.2 y 4.4.3 para las ramas restantes.
      NOTA: Un indicador general de que se ha quitado suficiente corteza de yema es cuando el 25% de la jeringa se ha llenado con tejido vegetal. Los patógenos transmisibles de los cítricos podrían estar distribuidos de manera desigual en el árbol. Por lo tanto, se recolectan de tres a cuatro muestras de yemas alrededor del dosel de los árboles de cítricos. Es importante que cada muestra de yema en la bolsa portadora de BTE contribuya a la muestra final de tejido molido para garantizar que se analice una muestra representativa completa del árbol para detectar patógenos.
    5. Presione el botón negro superior para detener el procesamiento. Espere a que la luz comience a parpadear en amarillo nuevamente.
  5. Verifique el peso de la muestra.
    1. Gire la jeringa 90° y tire de ella hacia abajo para separarla. Vuelva a colocar el émbolo en la jeringa y coloque la jeringa en la torre.
    2. Espere a que la báscula detecte automáticamente la muestra y determine si está dentro del rango de peso adecuado (0,25 ± 0,05 g). Si el peso de la muestra es demasiado bajo (<0,20 g), repita el paso 4.4; el LED rojo comenzará a parpadear. Si el peso de la muestra es demasiado alto (>0,30 g), retire parte del material de la muestra; el LED amarillo comenzará a parpadear más lentamente. Si la muestra está dentro del rango, el LED verde comenzará a parpadear.
  6. Homogeneización de la muestra de yemas
    1. Retire el émbolo de la jeringa con la muestra, empuje el líquido en la jeringa con la muestra y vuelva a agregar el émbolo. El émbolo empuja el tampón y la savia de la planta a través del filtro de malla (reteniendo cualquier trozo grande de tejido de corteza) y a través del tubo de goma hacia la jeringa vacía.
    2. Mezcle la muestra empujando el tampón y la savia de la planta hacia adelante y hacia atrás de una jeringa a la otra. Repita ~ 3x-4x y hasta que la muestra se convierta en una mezcla líquida verde homogénea.
    3. Una vez bien homogeneizada, empuje la muestra de savia vegetal en la jeringa sin el filtro de malla, y separe el tubo de goma y la jeringa con el filtro de la jeringa con la muestra.
    4. Expulsar la muestra de savia vegetal de la jeringa en un tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml y almacenar a -20 °C hasta su nuevo uso. Utilice un marcador permanente para etiquetar la muestra con el número de bolsa.
      NOTA: La savia de la muestra vegetal del paso 4.6.5 ahora se puede procesar con cualquiera de los métodos de extracción de ácidos nucleicos, ARN o ADN disponibles basados en fenol-cloroformo, columna de sílice o perlas magnéticas 9,25,26,27 para la extracción y purificación de ácidos nucleicos (ver paso 7) y la detección posterior de patógenos transmisibles por injerto de cítricos (ver paso 8).

5. Desinfección de la cámara extraíble BTE

PRECAUCIÓN: Si el tampón del juego de jeringas entra en contacto con la cámara o el portaobjetos, enjuague y siga todas las normas de seguridad del laboratorio antes de limpiarlo. El juego de jeringas contiene tiocianato de guanidina. Si el tampón del juego de jeringas entra en contacto con la lejía, creará gas cianuro.

  1. Realice los siguientes pasos después de procesar la 10ª muestra en la cámara. Tenga en cuenta que el LED verde continuará parpadeando en lugar de pasar a parpadear en azul.
  2. Desmontar la cámara BTE para limpiar todos los posibles contaminantes; Retire la cubierta de plástico transparente, limpie el portaobjetos de la cámara y despeje el puerto de obstrucción del portaobjetos de la cámara.
  3. Gire la válvula de liberación de aire en la parte inferior de la cámara a la posición abierta (marca de candado abierto). Coloque los componentes de la cámara en el limpiador ultrasónico de configuración (consulte el paso 3.1). Coloque la tapa debajo de la cámara para evitar que flote. Haga funcionar el limpiador ultrasónico durante 15 minutos.
    NOTA: El baño de limpieza ultrasónico (5 L) puede contener hasta dos cámaras.
  4. Enjuague los componentes de la cámara en el baño de agua (paso 3.4) durante al menos 30 s. Mueva los componentes de la cámara a la estación de secado.
    PRECAUCIÓN: El secado provocará que las piezas se muevan rápidamente dentro de la cámara, ruidos fuertes (~85 decibelios [dB]) y posibles salpicaduras. Todos los usuarios deben usar anteojos protectores, orejeras (tapones para los oídos), batas de laboratorio y todos los demás EPP según lo exijan las reglas de seguridad del laboratorio operativo.
  5. Seque la cámara BTE.
    1. Coloque la pistola de aire comprimido en línea con la ranura de la abertura superior de la recámara (donde normalmente estaría la corredera). Presione el gatillo de la pistola para dispensar aire durante ~ 30 s.
      NOTA: Asegúrese de que la abertura esté alejada del usuario hacia el telón de fondo. Esto debería hacer girar el juego de cuchillas para eliminar el líquido atrapado debajo de él.
    2. Coloque la pistola de aire comprimido hacia las boquillas superiores de la cámara. Presione el gatillo de la pistola de aire comprimido y trace lentamente tres círculos completos de cada entrada de la boquilla.
    3. Coloque la pistola de aire comprimido en el centro del BTE. Comenzando desde el punto más interno, mantenga presionado el gatillo y muévase hasta que la pistola de aire apunte hacia donde estaría la corredera.
    4. Deje correr aire rápidamente por toda la cámara, por delante y por detrás, para sacar el agua de la superficie del exterior.
  6. Seque el portaobjetos BTE.
    1. Coloque la pistola de aire comprimido en la ranura del émbolo de la corredera y presione el gatillo para expulsar el agua por la salida de la corredera.
    2. Pasa una pistola de aire comprimido a lo largo de la superficie interior del portaobjetos para secarlo.
    3. Pase una pistola de aire a lo largo de la ranura de la corredera para expulsar el agua.
    4. Deje correr aire rápidamente sobre todo el exterior para eliminar el agua de la superficie.
  7. Seque los componentes.
    1. Sostenga la tapa del émbolo deslizante y las juntas tóricas en la mano y presione el gatillo.
    2. Pasa una pistola de aire comprimido sobre la superficie interior de la tapa.
    3. Coloque los componentes en la cámara y deslícelos para continuar secándolos o volver a montarlos.
      NOTA: Para un entorno de alto procesamiento de tejidos con múltiples BTE funcionales, se puede proporcionar un sistema de desinfección por lotes que sea capaz de descontaminar 10 cámaras simultáneamente.

6. Desechar y desinfectar

  1. Deseche las jeringas y los tubos de goma en el contenedor de desechos de guanidina designado.
  2. Deseche cualquier material vegetal en el contenedor de residuos biopeligrosos.
  3. Retire la cámara BTE de la base BTE.
  4. Desmontar la cámara BTE y proceder a su descontaminación, tal y como se describe en el paso 5.

7. Evaluación del procesamiento tisular y de la calidad del ARN purificado a partir de los extractos de yemas cítricas BTE

NOTA: En este protocolo, utilizamos muestras de yemas de 255 árboles de cítricos para comparar el tiempo requerido para el procesamiento del tejido de yemas de cítricos y la calidad del ARN purificado de extractos de tejido de corteza preparados por BTE (Figura 2, lado derecho, paso 1, paso 5 y paso 6) en comparación con el preparado siguiendo el método de procesamiento de tejido de yemas de cítricos aprobado por la normativa que utiliza pelado y picado a mano. liofilización, pulverización y centrifugación del tejido de la corteza, como lo describen Dang et al.23 (Figura 2, lado izquierdo, pasos 1-6).

  1. Procedimiento de laboratorio actual: Preparar muestras de yemas para el procesamiento de tejidos según el método aprobado reglamentariamente23.
    1. Llevar a cabo el pelado y picado manual del tejido de la corteza, la liofilización, la pulverización, la centrifugación y la transferencia de la savia de la planta al tubo de extracción de ARN, como lo describen Dang et al.23 (Figura 2, lado izquierdo, pasos 1-6).
    2. Después de pelar a mano las tres o cuatro muestras de yemas de cada árbol analizado, coloque todas las yemas dentro de un portabolsas de plástico compatible con BTE y guárdelas a 4 °C hasta el procesamiento de BTE (paso 7.2).
  2. Procedimiento BTE: Iniciar el procesamiento del tejido de las yemas de los cítricos BTE (sección 4, pasos 4.1-4.6; Figura 2, lado derecho, paso 1, paso 5 y paso 6).
    1. Utilice las muestras de yemas almacenadas dentro de las bolsas de transporte BTE del paso 7.1.2.
  3. Extraer y purificar el ARN de la savia vegetal obtenida del procedimiento de laboratorio actual (paso 7.1.1) y del procedimiento BTE (paso 7.2.2) utilizando el método basado en perlas magnéticas semiautomáticas aprobado por la normativa 8,23,28.
  4. Evaluar la calidad del ARN midiendo su concentración, pureza e integridad 8,23,24,29,3 3,31.
    1. Para calcular la concentración, utilice la espectrofotometría y la densidad óptica (OD) a una longitud de onda de 260 nm.
    2. Para evaluar la pureza, utilice una relación espectrofotométrica OD de 260/280.
    3. Para comprobar la integridad, utilice la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) con transcripción inversa (RT) dirigida al ARNm del gen de la NADH deshidrogenasa de los cítricos24,32.

8. Evaluación de la contaminación cruzada y detección de virus y viroides de cítricos mediante ARN purificado a partir de extractos de yemas de cítricos BTE

NOTA: En este protocolo, utilizamos muestras de yemas de 72 árboles de cítricos no infectados y un árbol infectado con virus y viroides para evaluar el potencial de contaminación cruzada entre muestras cuando se procesan mediante BTE (Figura 2, lado derecho, paso 1, paso 5 y paso 6) y la idoneidad del ARN purificado a partir de extractos de tejido de corteza preparados por BTE para ser utilizado como plantilla para la detección de RT-qPCR de virus y viroides de cítricos.

  1. Procesamiento de la primera muestra de EEB: Realice un experimento de referencia con 72 muestras no infectadas.
    1. Prepare tres cámaras BTE (A-C) (paso 4.1.1).
    2. Preparar todas las muestras de yemas de cítricos no infectadas (1-72) en bolsas portadoras de EEB y preparar un número igual (72) en el sistema de recogida de muestras de EEB de dos jeringas, con un sistema de jeringa para cada muestra (paso 2.4).
    3. Separe las bolsas de transporte de muestras y las jeringas de recolección de muestras en seis lotes (I-VI) de 12 muestras cada uno.
    4. Inicie el procesamiento del tejido de las yemas de los cítricos BTE (paso 4) siguiendo la secuencia que se indica a continuación (pasos 8.1.4.1-8.1.4.6) (consulte la Tabla 1, Procesamiento de la primera muestra de BTE).
      1. Para el lote I/muestras 1-12, procese 12 muestras con la cámara A. Desinfecte la cámara A después de la muestra 12 (paso 5).
      2. Para el lote II/muestras 13-24, procese 12 muestras con la cámara B. Desinfecte la cámara B después de la muestra 24 (paso 5).
      3. Para el lote III/muestras 25-36, procese 12 muestras con la cámara C. Desinfecte la cámara C después de la muestra 36 (paso 5).
      4. Para el lote IV/muestras 37-48, procese 12 muestras utilizando la cámara desinfectada A (paso 8.1.4.1).
      5. Para el lote V/muestras 49--60, procese 12 muestras utilizando la cámara desinfectada B (paso 8.1.4.2).
      6. Para el lote VI/muestras 60-72, procese 12 muestras utilizando la cámara desinfectada C (paso 8.1.4.3).
    5. Guarde las bolsas de transporte BTE con todas las muestras a 4 °C hasta su uso en el paso 8.2.
    6. Extraiga y purifique el ARN de las 72 muestras de savia vegetal generadas en los pasos 8.1.4.1-8.1.4.6 utilizando el método basado en perlas magnéticas semiautomáticas aprobado por la normativa 8,23,28.
    7. Realizar RT-qPCR para la detección de virus y viroides de cítricos, como se ha descrito anteriormente 8,33.
  2. Para el segundo procesamiento de muestras de EEB, realice un experimento de contaminación cruzada con 70 muestras no infectadas y dos muestras infectadas mixtas.
    1. Prepare tres cámaras BTE (A-C) (paso 4.1.1).
    2. Preparar la muestra de yemas de cítricos infectada con mezcla (73) en dos bolsas de transporte BTE (paso 1.3) para un número total de dos muestras infectadas.
    3. Reúna las bolsas portadoras de BTE con las muestras de yemas de cítricos no infectadas del paso 8.1.5, excepto la muestra 3 del lote I y la muestra 51 del lote V (véase la sustitución de la muestra en el paso 8.2.4), para un número total de 70 muestras no infectadas.
    4. Incluya la primera bolsa portadora de BTE con la muestra infectada por la mezcla 73 en lugar de la muestra 3 en el lote I y la segunda en lugar de la muestra 51 en el lote V para un número total de 72 muestras.
    5. Prepare un número igual (72) en el sistema de recogida de muestras BTE de dos jeringas, con un sistema de doble jeringa para cada muestra (paso 2.4).
    6. Separe las 72 bolsas de transporte de muestras y las jeringas de recolección de muestras en seis lotes (I-VI) de 12 muestras cada uno.
    7. Inicie el procesamiento del tejido de yemas cítricas BTE (paso 4), siguiendo la misma secuencia que en los pasos 8.1.4.1-8.1.4.6.
      NOTA: La única diferencia es la sustitución de la muestra 3 en el lote I y la muestra 51 en el lote V por la muestra infectada 73 (paso 8.2.4) (Tabla 1, Segundo procesamiento de muestras de BTE).
    8. Extraiga y purifique el ARN de las 72 muestras de savia vegetal generadas en el paso 8.2.7 como en el paso 8.1.6.
    9. Realice RT-qPCR para la detección de virus y viroides de cítricos, como en el paso 8.1.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Extracción, purificación y calidad del ARN utilizando tejido cítrico de yema procesado con BTE y evaluación del tiempo de procesamiento del tejido
Utilizamos muestras de yemas de 255 árboles de cítricos representativos para esta prueba con el fin de comparar la calidad del ARN del BTE con el procedimiento estándar. Las muestras se procesaron con el extractor de tejido de yemas (BTE) (pasos del protocolo 4.1-4.6 y Figura 2, lado derecho, paso 1, paso 5 y paso 6) o se prepararon siguiendo el método de procesamiento de tejido de yemas de cítricos aprobado por la normativa, que utiliza pelado y picado manual, liofilización, pulverización y centrifugación del tejido de la corteza, como lo describen Dang et al.23 (Figura 2, lado izquierdo, pasos 1-6).

La comparación lado a lado del BTE con el protocolo convencional de picado manual y equipo de laboratorio para el procesamiento de tejidos cítricos demostró que la calidad (es decir, la concentración, pureza e integridad) de los ácidos nucleicos extraídos (Figura 3A-C) y la idoneidad para su uso posterior para la detección por PCR de patógenos de cítricos (datos no mostrados) eran comparables. Al mismo tiempo, el tiempo dedicado al procesamiento de muestras se redujo significativamente utilizando el sistema TE/BTE. El BTE duplicó con creces el rendimiento de muestras del laboratorio CCPP, reduciendo los costos de mano de obra y equipos de laboratorio al eliminar la necesidad de decenas de miles de dólares en instrumentos, como batidores de perlas, centrífugas y crioestaciones.

Los ácidos nucleicos extraídos con BTE tuvieron una concentración promedio de 76,96 ng/μL ± 26,23 ng/μL (n = 181) y fueron de alta pureza, con baja contaminación proteica (A260/A280 2,27 ± 0,17, n = 181) (Figura 3B,C). Estos valores fueron comparables a los ácidos nucleicos producidos por el protocolo manual estándar del CCPP (concentración: 82,25 ng/μL ± 33,95 ng/μL, n = 181 y A260/A280 2,22 ± 0,10, n = 181) (Figura 3B,C). La integridad de los ácidos nucleicos (RT-qPCR para el gen de los cítricos nad5) fue muy similar para el BTE (Cq 20,97 ± 2,26, n = 181) y el protocolo CCPP manual estándar (Cq 19,25 ± 1,53, n = 181) (Figura 3A). Los resultados también demostraron que el instrumento BTE podía procesar un mayor volumen de muestra en el mismo período de tiempo en comparación con el método convencional. El procedimiento de laboratorio convencional requería ~7-10 minutos para picar a mano por muestra y un total de 12 minutos para el procesamiento de tejidos (liofilización, molienda y centrifugación), mientras que el BTE podía procesar tejido cítrico para la extracción de ácidos nucleicos en ~3 minutos por muestra.

Figure 3
Figura 3: Calidad de los extractos de ácidos nucleicos de las 181 muestras representativas de yemas de cítricos, definida por la concentración, pureza e integridad. Las muestras fueron procesadas por BTE y el protocolo convencional de picado manual y equipo de laboratorio. (A) La concentración de ácido nucleico se determinó utilizando absorbancia a 260 nm; (B) la pureza se determinó como la relación de las absorbancias a 260 nm y 280 nm (A260/280). (C) La integridad del ácido nucleico se analizó mediante RT-qPCR dirigida al ARNm del gen de los cítricos NADH deshidrogenasa (Nad5). Los rangos de valores óptimos se indican entre círculos discontinuos rojos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Detección de patógenos de cítricos transmisibles por injerto, evaluación de la contaminación cruzada y detección de virus y viroides de cítricos utilizando ARN purificado a partir de extractos de yemas de cítricos BTE
La validez del método de procesamiento de tejidos se evaluó mediante el procesamiento de 72 muestras sanas de yemas de cítricos junto con todas las muestras sanas y con la introducción de dos muestras de una mezcla de árboles infectada con virus y viroides (Tabla 1 y Figura 4A,B). Los ácidos nucleicos extraídos de ambos lotes se sometieron a q-PCR convencional de laboratorio como se describió anteriormente 8,33. Ninguna de las 72 muestras sanas del primer procesamiento de muestras de EEB dio curvas de amplificación para los patógenos de los cítricos analizados (es decir, falsos positivos) (Figura 4A). Los resultados sugieren que el BTE puede procesar el tejido cítrico igual de bien en comparación con el protocolo estándar de laboratorio con métodos de picado manual. En el segundo procesamiento de muestras de BTE, evaluamos el potencial de contaminación cruzada entre las cabezas de BTE y dentro de las muestras procesadas con la misma cabeza de BTE (pasos 1-6) y la idoneidad de los ácidos nucleicos para aplicaciones posteriores (es decir, para su uso como plantilla para la detección de RT-qPCR de virus y viroides cítricos). En el segundo procesamiento de muestras de BTE con dos muestras infectadas por mezcla introducidas, los ácidos nucleicos producidos por el protocolo BTE se utilizaron con éxito para detectar diferentes virus y viroides de los cítricos (p. ej., virus triplex, virus de la mancha de la hoja de los cítricos [CLBV], virus de la psorosis de los cítricos [CPsV], virus de la tristeza de los cítricos [CTV]), apscaviroides (viroide de hoja doblada de cítricos [CBLVd], viroide de enanismo de cítricos [CDVd], viroide de cítricos V [CVd-V], viroide cítrico VI [CVd-VI] y viroide cítrico VII [CVd-VII]), viroide no apscaviroides de atrofia del lúpulo (HSVd; hostuvioide), viroide de agrietamiento de corteza de cítricos (CBCVd; cocadviroide) y viroide de exocortis de cítricos (CEVd; pospiviroid) en el lote 1 y el lote 5. Dentro del lote 1 y el lote 5, las muestras que siguieron a la infectada fueron positivas para las enfermedades de las plantas mencionadas, pero tuvieron valores de Cq crecientes. Sin embargo, no se detectó contaminación cruzada entre cabezales ni resultados falsos positivos o negativos (Figura 4B).

Lote Muestra BTE Primer BTE Segunda BTE
Cámara Procesamiento de muestras Procesamiento de muestras
Yo 12-Ene Un 1-12 No infectados 1-2 y 4-12 No infectados
La muestra #3 se reemplaza con mezcla infectada
II 13-24 B 13-24 13-24
No infectado No infectado
III 25-36 C 25-36 25-36
No infectado No infectado
IV 37-48 A-Sanitized 37-48 37-48
No infectado No infectado
V 49-60 B-Sanitized 49-60 49-50 y 52-60 no infectados
No infectado
La muestra #51 se reemplaza con una mezcla infectada
VI 61-72 C-Sanitized 61-72 No infectados 61-72 No infectados

Tabla 1: Proceso seguido para la validación del método de procesamiento de tejidos BTE utilizando 72 muestras de yemas de cítricos. Cada procesamiento se repitió dos veces. Hubo 6 lotes con 12 muestras cada uno. En el primer procesamiento de muestras, las 72 muestras de yemas de cítricos estaban sanas. En el segundo procesamiento de la muestra de EEB, la muestra 3 y la muestra 51 se reemplazaron con dos muestras de una mezcla de árboles infectada con virus y viroides en el lote 1 y el lote 5.

Figure 4
Figura 4: Validación del método de procesamiento de tejidos BTE utilizando 72 muestras de yemas de cítricos. Cada procesamiento se repitió dos veces. Hubo 6 lotes con 12 muestras cada uno. (A) Las 72 muestras de yemas de cítricos estaban sanas. (B) Las mismas 72 muestras de yemas de cítricos con la introducción de dos muestras de una mezcla de árboles infectados con virus y viroides en el lote 1 (muestra 3) y el lote 5 (muestra 51). Los controles de NTC y agua tenían valores de Cq indeterminados (es decir, un objetivo de ADN no presente en la muestra). Los controles positivos para el tríplex (CLBV, CPsV, CTV) tuvieron valores de Cq de 23,9, 25,2 y 22,4 respectivamente. Los controles positivos para apscaviroides (CBLVd, CDVd y CBCVd) tuvieron valores de Cq de 23,39, 21,27 y 25,17 respectivamente. Los controles positivos para los no apscaviroides (CEVd, HSVd, IV) tuvieron valores de Cq de 26,9, 27,0 y 26,5 respectivamente. Abreviaturas: BTE = extractor de tejido de yemas de madera; NTC = control sin plantilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria S1: Configuración de la estación de limpieza. Después de procesar la 10ª muestra en la cámara, se deben seguir los pasos del protocolo 3.1-3.6 para preparar la estación de limpieza para desinfectar la cámara. Al igual que en el paso 3.1 del protocolo, se coloca 1 L de agua en el limpiador ultrasónico. Se envuelven dos bolsas de basura sobre la parte superior del limpiador ultrasónico (paso 3.2 del protocolo) y se vierten ~5 L de lejía al 10% (solución de hipoclorito de sodio al 1%) en el limpiador ultrasónico (paso 3.3 del protocolo). La tina de agua se llena con suficiente agua para sumergir una cámara (paso de protocolo 3.4), se apaga el compresor de aire y se abre la válvula (paso de protocolo 3.5). Se establece un telón de fondo para atrapar el líquido mientras la cámara se seca (paso de protocolo 3.6). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Con el advenimiento de la enfermedad de los cítricos HLB, para reducir las pérdidas, se ha instado a la industria de los cítricos, las agencias reguladoras y los laboratorios de diagnóstico a confiar en métodos de extracción de ácidos nucleicos de alto rendimiento combinados con el procesamiento manual de muestras de bajo rendimiento y ensayos de detección de patógenos como qPCR34 para el análisis de árboles individuales, en combinación con prácticas de manejo de enfermedades35. La tasa de positividad del HLB en California ha pasado del 0.01% en 2012 al 1.2% en 2020. A pesar de que la qPCR es una herramienta de detección de patógenos potente y fiable, las tecnologías disponibles actualmente no permiten muestrear y procesar un volumen adecuado de tejido vegetal, lo que da lugar a un claro submuestreo y a un subanálisis de CLas en los árboles de cítricos de California. El submuestreo y el subanálisis se producen tanto en relación con el número de árboles analizados como con la cantidad de material vegetal por árbol que se procesa (es decir, el número de hojas), y debido a la distribución esporádica de hojas infectadas dentro del dosel de los árboles, existe una alta probabilidad de que se pasen por alto infecciones tempranas o leves. Los métodos actuales para el muestreo y las pruebas CLas no pueden escalar con el aumento de la demanda debido a los costos (por ejemplo, mano de obra y equipo). Actualmente, el método de procesamiento de muestras utilizado por la mayoría de los laboratorios de diagnóstico de cítricos en California para adquirir ácidos nucleicos adecuados para pruebas de patógenos de cítricos requiere más de 17 horas para el manejo manual de muestras y suministros y equipos especializados que cuestan más de $ 100,000.

Aquí, presentamos la validación de un instrumento especializado diseñado para procesar rápidamente los tejidos de la corteza de la yema de los cítricos, llamado extractor de tejido de la yema (BTE), y un protocolo detallado, paso a paso, de manejo de muestras para laboratorios de diagnóstico de cítricos. La investigación se centró en el desarrollo de un método innovador de procesamiento de tejidos para reemplazar el actual corte manual de muestras de yemas y construir el instrumento de procesamiento de yemas de cítricos de mayor rendimiento y más rentable posible. Los resultados muestran que el BTE aumenta el rendimiento de las muestras y disminuye el costo de los equipos y suministros utilizados en el laboratorio de diagnóstico del CCPP. La tecnología y el método presentados también incluyen el uso de etiquetas NFC, una aplicación de teléfono y una base de datos en línea para el seguimiento de la información de la muestra en tiempo real. Una vez recolectadas las muestras de yemas, la aplicación del teléfono vincula el clip de la bolsa de muestras NFC con la etiqueta del árbol NFC. A continuación, las muestras se envían al laboratorio para su procesamiento con la máquina BTE. La información de cada muestra se registra con un rápido deslizamiento por el costado del cuerpo del BTE. A través de la etiqueta NFC de muestra, el tiempo de procesamiento de cada muestra y el peso de la muestra también se registran y se cargan en la base de datos en línea en tiempo real. Este método proporciona un sistema muy eficiente en el tiempo, mejora el control de calidad (es decir, evita errores de identificación de la muestra) y aumenta la eficiencia del laboratorio.

El procesamiento y la validación de alto rendimiento de BTE se llevaron a cabo con muestras de cítricos "de la vida real/de campo", lo que demuestra que otros laboratorios de diagnóstico pueden adoptar fácilmente la tecnología y la metodología. La adopción de esta tecnología permitirá disminuir los costos operativos y aumentar la capacidad de diagnóstico y la eficiencia del laboratorio, aumentando así las posibilidades de identificar árboles enfermos en una etapa más temprana después de que ocurra la infección y disminuyendo las posibilidades de propagación de la enfermedad. La comparación lado a lado de BTE versus métodos convencionales de procesamiento de tejidos demuestra que la calidad del ácido nucleico extraído (es decir, concentración, pureza e integridad) y los resultados de la detección de patógenos posteriores son comparables (Figura 3A-C). Sin embargo, el tiempo empleado en procesar las muestras se reduce significativamente utilizando el BTE en comparación con los protocolos de procesamiento manual (es decir, 3,3 min frente a 6,8 min). Las cámaras y la base BTE requieren un programa de limpieza regular. Aunque la limpieza lleva mucho tiempo y constituye una limitación del método, la tecnología permite procesar rápidamente múltiples muestras en el BTE antes de que sea necesario limpiar la cámara. Los métodos convencionales requieren menos limpieza, ya que cada muestra tiene su propio recipiente de procesamiento, que, en muchos casos, es desechable, pero necesitan más recipientes y espacio de almacenamiento (por ejemplo, refrigeradores de 4 °C y congeladores de -20 °C u -80 °C).

El proceso BTE fue concebido y construido para aumentar la probabilidad de identificar un área problemática a través del procesamiento y análisis de muestras a granel (es decir, encontrar un árbol enfermo dentro de un gran bloque de cimentación de germoplasma de cítricos, vivero o huerto) mediante la ejecución de solo un pequeño número de pruebas masivas que puedan identificar puntos calientes. Por lo tanto, solo se desvía cuando se encuentra un resultado positivo. Cuando esto sucede (Figura 4B, lote 1 y lote 5), se requiere el procesamiento posterior de muestras y el análisis de muestras individuales del mismo lote que contienen el material positivo (es decir, solo un subconjunto de muestras) para determinar qué muestras son positivas. Por lo tanto, es importante tener en cuenta que este procedimiento es principalmente adecuado para casos con bajas tasas de infección, donde permite analizar un alto volumen de material de muchos árboles, lo que, a su vez, aumenta la probabilidad de detección de la enfermedad sin tener que analizar un gran número de muestras individuales. Los métodos convencionales serán la opción óptima en casos con altas tasas de infección, ya que permiten analizar cada muestra de forma individual. Esto es especialmente importante en el caso de las encuestas de HLB en California20 (todavía con una baja tasa de positividad de HLB), donde los métodos utilizados basados en PCR para la detección de CLas están destinados principalmente a confirmar la presencia o ausencia de CLas en árboles asintomáticos (es decir, sin manchas típicas, amarillamiento del dosel o declive de los árboles) que han estado expuestos a psílidos asiáticos de cítricos (ACP) CLas positivos. Dado el hecho de que no sabemos en qué parte del árbol se ha alimentado un ACP infeccioso, las posibilidades de identificar un árbol infectado pero asintomático en el campo o en cualquier otra área u operación grande mediante el análisis de un pequeño número de muestras son muy bajas (por ejemplo, en California, actualmente se recolectan 20 hojas y se analizan 12 hojas por árbol20). Obviamente, cuanto más grande sea el dosel arbóreo, menores serán las posibilidades de detección de CLas. A pesar de que los costos de la PCR en sí (es decir, reactivos, equipo básico de laboratorio y termociclador), que sigue al procesamiento de la muestra, y la extracción y purificación de ácidos nucleicos continúan sin cambios en el proceso de BTE, la incertidumbre sobre dónde recolectar las muestras de árboles asintomáticos para determinar si están infectados o no aún persiste y, en nuestra opinión, es el talón de Aquiles de la encuesta de HLB en California. El instrumento, la tecnología, el método y las mejoras presentadas permitirán el procesamiento de muestras de mayor tamaño en un menor tiempo y a un menor costo. Por lo tanto, este método aumentará la probabilidad de identificar los árboles infectados de manera oportuna y mejorará los esfuerzos de erradicación del HLB u otros patógenos invasivos de los cítricos en California (p. ej., el virus de eliminación de la vena amarilla de los cítricos reportado en California en agosto de 2022).

En combinación con los métodos automatizados de procesamiento de tejidos, el muestreo y las pruebas a granel permitirían reducir los costos de procesamiento de tejidos vegetales. Esta reducción de costos permitiría a muchos laboratorios de diagnóstico examinar de manera más efectiva los huertos en muchos estados y rastrear mejor el movimiento del HLB y otras enfermedades. En última instancia, esto significa que los productores tendrían una herramienta más eficaz para frenar la propagación de enfermedades a través de pruebas a gran escala más eficientes. Si bien el instrumento BTE puede mejorar la capacidad de diagnóstico actual de los laboratorios de cítricos y beneficiar a toda la industria de los cítricos, al mismo tiempo, la tecnología también puede transferirse a otros cultivos arbóreos. Los datos preliminares de concentración y pureza de ácidos nucleicos, estimados por la DO, han indicado que el BTE puede procesar eficazmente tejidos de almendra (59,87 ng/μL ± 7,43 ng/μL y A260/A280 1,17 ± 0,05, n = 9), vid (135,74 ng/μL ± 50,74 ng/μL y A260/A280 1,17 ± 0,06, n = 9), y melocotón (66,50 ng/μL ± 6,07 ng/μL y A260/A280 1,29 ± 0,05, n = 9) (muestras amablemente proporcionadas por Foundation Plant Services en UC Davis).

La plataforma de procesamiento de tejidos de yemas que se presenta aquí ha inspirado el desarrollo de equipos adicionales de procesamiento de tejidos vegetales. Por ejemplo, actualmente se está desarrollando un extractor de tejido foliar (LTE). Los resultados preliminares de las pruebas con hojas de cítricos han demostrado que el instrumento LTE podría procesar aproximadamente siete veces más hojas con solo un aumento del 35% en el tiempo de procesamiento sobre el método estándar actual de 12 hojas utilizado en California20. Hemos estimado que un protocolo de muestreo y pruebas a granel compatible con LTE podría reducir el costo total por prueba de hojas de cítricos en una cuarta parte. La investigación para demostrar el valor de la aplicación práctica de esta tecnología se está llevando a cabo actualmente en el marco de una subvención en bloque para cultivos especiales del CDFA en nuestros laboratorios.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Los autores reconocen al pueblo Cahuilla como los Custodios Tradicionales de la Tierra en la que se realizó el trabajo experimental. Agradecemos al profesor Norman Ellstrand de la Universidad de California, Riverside, por proporcionar espacio de laboratorio para llevar a cabo actividades de investigación para este proyecto en el marco de la Iniciativa de Empresas de Agricultura y Alimentos de California (CAFÉ) de la UCR. Esta investigación fue apoyada por el CDFA - Programa de Subvenciones en Bloque para Cultivos Especiales (subvención no. 18-0001-055-SC). También se prestó apoyo adicional con el proyecto 6100 del CRB; Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura del USDA, proyecto Hatch 1020106; y el Servicio Nacional de Inspección de Sanidad Animal y Vegetal de la Red Nacional de Plantas Limpias-USDA (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148 & AP20PPQS&T00C049) otorgado a Georgios Vidalakis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.08" Hex Trimmer line PowerCare FPRO07065 Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor California Air Tools 8010 Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube Globe Scientific 111558B Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set Technology Evolving Solutions TE006-F1-10A-G1000-E1 Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach
12" Ruler Westcott ‎16012 To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite Hasa 1041 Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer Insignia NS-CZ70WH0 Store sample after processing
4" x 12" plastic bags Plymor FP20-4x12-10 Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab Puritan 806-PCL Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote HDX 206152 Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun JASTIND ‎JTABG103A Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie Sharpie  S-19421 Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor Brand Z627569 Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber Technology Evolving Solutions TE002BB-A05-E1 Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap Dawn 57445CT Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter Air Science P5-36XT-A Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container PolarTech 261/J50C Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat Red Kap KP14WH LN 46 Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop Microsoft Surface Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone Samsung Galaxy S9 Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag Technology Evolving Solutions TE005-Clip-E1 Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag Technology Evolving Solutions TE005-Collar-E1 Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves Usa Scientific 3915-4400 Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff 3M 90565-4DC-PS Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose FYPower ‎510019 Attaches air gun to compressor
Saftey glasses Solidwork SW8329-US Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle JohnBee B08QM81BJV Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base Technology Evolving Solutions TE001-A-E1 System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale Technology Evolving Solutions TE003-A05-200g-01-E1 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield 
Vermiculite EasyGoProducts B07WQDZGRP Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter Boenfu ‎BOWC-06002-US Wire cutters to cut trimmer line

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
  2. Vernière, C., et al. Citrus viroids: Symptom expression and effect on vegetative growth and yield of clementine trees grafted on trifoliate orange. Plant Disease. 88 (11), 1189-1197 (2004).
  3. Zhou, C., et al. Chapter 19 - Citrus viruses and viroids. The Genus Citrus. Talon, M., Caruso, M., Gmitter, F. G. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 391-410 (2020).
  4. Luckstead, J., Devadoss, S. Trends and issues facing the U.S. citrus industry. Choices Magazine Online. 36 (2), Available from: https://www.choicesmagazine.org/choices-magazine/theme-articles/trends-and-challenges-in-fruit-and-tree-nut-sectors/trends-and-issues-facing-the-us-citrus-industry (2021).
  5. Simnitt, S., Calvin, L. Fruit and Tree Nuts Outlook. United States Department of Agriculture-Economic Research Service. , Available from: https://www.ers.usda.gov/webdocs/outlooks/98171/fts-370.pdf?v=5697 (2020).
  6. Forsyth, J., Fruits Damiani, J. C. itrus Citrus Fruits. Types on the market. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. , Academic Press. Cambridge, MA. 1329-1335 (2003).
  7. Bostock, R. M., Thomas, C. S., Hoenisch, R. W., Golino, D. A., Vidalakis, G. Plant health: How diagnostic networks and interagency partnerships protect plant systems from pests and pathogens. California Agriculture. 68 (4), 117-124 (2014).
  8. Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).
  9. Wang, J., et al. Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale. Frontiers in Microbiology. 4, 366 (2013).
  10. Gergerich, R. C., et al. Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization. Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).
  11. Moreno, P., Ambrós, S., Albiach-Martí, M. R., Guerri, J., Peña, L. Citrus tristeza virus: A pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology. 9 (2), 251-268 (2008).
  12. Yokomi, R. K., et al. Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California. Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).
  13. Selvaraj, V., Maheshwari, Y., Hajeri, S., Yokomi, R. A rapid detection tool for VT isolates of Citrus tristeza virus by immunocapture-reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay. PLoS One. 14 (9), 0222170 (2019).
  14. Babcock, B. A. Economic impact of California's citrus industry in 2020. Journal of Citrus Pathology. 9, (2022).
  15. Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).
  16. Yokomi, R., et al. Molecular and biological characterization of a novel mild strain of citrus tristeza virus in California. Archives of Virology. 163 (7), 1795-1804 (2018).
  17. Fuchs, M., et al. Economic studies reinforce efforts to safeguard specialty crops in the United States. Plant Disease. 105 (1), 14-26 (2021).
  18. Singerman, A. The real cost of HLB in Florida. Citrus Industry Magazine. , Available from: https://citrusindustry.net/2019/07/30/the-real-cost-of-hib-in-florida/ (2019).
  19. McRoberts, N., et al. Using models to provide rapid programme support for California's efforts to suppress Huanglongbing disease of citrus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1776), 20180281 (2019).
  20. Albrecht, C., et al. Action plan for Asian citrus psyllid and huanglongbing (citrus greening) in California. Journal of Citrus Pathology. 7 (1), (2020).
  21. Navarro, L., et al. The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the period 1975-2001. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15 (15), (2002).
  22. Vidalakis, G., Gumpf, D. J., Polek, M. L., Bash, J. A. The California Citrus Clonal Protection Program. Citrus Production Manual. Ferguson, L., Grafton-Cardwell, E. E. , University of California, Agriculture and Natural Resources. Oakland, California. 117-130 (2014).
  23. Dang, T., et al. High-throughput RNA extraction from citrus tissues for the detection of viroids. In Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  24. Osman, F., Vidalakis, G. Real-time detection of viroids using singleplex and multiplex quantitative polymerase chain reaction. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  25. Li, R., et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Saponari, M., Manjunath, K., Yokomi, R. K. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 147 (1), 43-53 (2008).
  27. Damaj, M. B., et al. Reproducible RNA preparation from sugarcane and citrus for functional genomic applications. International Journal of Plant Genomics. 2009, 765367 (2009).
  28. Dang, T., et al. First report of citrus leaf blotch virus infecting Bearss lime tree in California. Plant Disease. 104 (11), 3088 (2020).
  29. Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques. 20 (6), 968-970 (1996).
  30. Teare, J. M., et al. Measurement of nucleic acid concentrations using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques. 22 (6), 1170-1174 (1997).
  31. Imbeaud, S. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 56-56 (2005).
  32. Menzel, W., Jelkmann, W., Maiss, E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods. 99 (1-2), 81-92 (2002).
  33. Vidalakis, G., et al. SYBR Green RT-qPCR for the universal detection of citrus viroids. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. , Humana. New York, NY. 211-217 (2022).
  34. Arredondo Valdés, R., et al. A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus. Canadian Journal of Microbiology. 62 (10), 803-811 (2016).
  35. Li, S., Wu, F., Duan, Y., Singerman, A., Guan, Z. Citrus greening: Management strategies and their economic impact. HortScience. 55 (5), 604-612 (2020).
  36. CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes. , Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019).

Tags

Bioingeniería Número 194 Extracción de tejido de yemas corte manual "Candidatus Liberibacter asiaticus" CLas huanglongbing HLB Virus de la tristeza de los cítricos CTV

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

to:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

Automatización del procesamiento de yemas de cítricos para la detección de patógenos posteriores a través de la ingeniería de instrumentos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E.,… More

Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E., Uribe, G., De Francesco, A., Milton, R., De La Torre, A., Mounkam, A., Dang, T., Bodaghi, S., Lavagi-Craddock, I., Syed, A., Grover, W., Okamba, A., Vidalakis, G. Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. J. Vis. Exp. (194), e65159, doi:10.3791/65159 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter