Candidatus Liberibacter asiaticus", CLas, huanglongbing, HLB, Citrus tristeza-virus, CTV, scientific video journal" />

Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Automatisering av bearbetning av citrusknoppved för nedströms patogendetektering genom instrumentteknik

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65159
Automatic Translation
*1,6, *2, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5, *1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside, 2Technology Evolving Solutions (TES), 3Department of Bioengineering, University of California Riverside, 4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV, 5University of California Riverside, 6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Vi konstruerade, tillverkade och validerade ett instrument som snabbt bearbetar floemrika barkvävnader från citrusknoppar. Jämfört med nuvarande metoder har budwood tissue extractor (BTE) ökat provgenomströmningen och minskat de nödvändiga arbets- och utrustningskostnaderna.

Abstract

Transplantatöverförbara, floembegränsade patogener av citrusfrukter som virus, viroider och bakterier är ansvariga för förödande epidemier och allvarliga ekonomiska förluster över hela världen. Till exempel dödade citrus tristeza-viruset över 100 miljoner citrusträd globalt, medan "Candidatus Liberibacter asiaticus" har kostat Florida 9 miljarder dollar. Användningen av patogentestad citrusknoppved för trädförökning är avgörande för hanteringen av sådana patogener. Citrus Clonal Protection Program (CCPP) vid University of California, Riverside, använder PCR-analyser (polymeraskedjereaktion) för att testa tusentals prover från citrusknoppar varje år för att skydda Kaliforniens citrusfrukter och för att tillhandahålla rena förökningsenheter till National Clean Plant Network. En allvarlig flaskhals i den storskaliga molekylära detektionen av citrusvirus och viroider är bearbetningssteget för växtvävnad.

Korrekt vävnadsberedning är avgörande för extraktion av nukleinsyror av hög kvalitet och nedströms användning i PCR-analyser. Att hacka, väga, frystorka, mala och centrifugera växtvävnad vid låga temperaturer för att undvika nukleinsyranedbrytning är tids- och arbetskrävande och kräver dyr och specialiserad laboratorieutrustning. Denna artikel presenterar valideringen av ett specialiserat instrument konstruerat för att snabbt bearbeta floemrika barkvävnader från citrusknoppved, kallat budwood tissue extractor (BTE). BTE ökar provgenomströmningen med 100 % jämfört med nuvarande metoder. Dessutom minskar det arbetskraften och kostnaden för utrustning. I detta arbete hade BTE-proverna ett DNA-utbyte (80,25 ng/μL) som var jämförbart med CCPP:s handhackningsprotokoll (77,84 ng/μL). Detta instrument och det snabba bearbetningsprotokollet för växtvävnad kan gynna flera citrusdiagnostiska laboratorier och program i Kalifornien och bli ett modellsystem för vävnadsbearbetning för andra vedartade perenna grödor över hela världen.

Introduction

Transplantatöverförbara floembegränsade patogener av citrusfrukter, såsom viroider, virus och bakterier, har orsakat förödande epidemier och allvarliga ekonomiska förluster i alla citrusproducerande områden i världen. Citrusviroider begränsar produktionsfaktorer på grund av de exokortis- och kakexisjukdomar som de orsakar i ekonomiskt viktiga citrustyper, såsom trifoliat, trifoliathybrider, mandariner, klementiner och mandariner 1,2,3. I Kalifornien är dessa viroidkänsliga citrustyper grunden för den växande och lönsamma marknaden för "lättskalade", vilket följer den skiftande trenden i konsumenternas preferens för frukter som är lätta att skala, segmenterade och kärnfria 4,5,6. Således regleras citrusviroider enligt California Department of Food and Agriculture (CDFA) "Citrus Nursery Stock Pest Cleanliness Program-Senate Bill 140", och laboratorierna i CDFA:s Plant Pest Diagnostics Branch utför tusentals citrusviroidtester årligen 7,8,9,10 . Citrus tristeza-virus (CTV) har orsakat döden av över 100 miljoner citrusträd sedan början av den globala epidemin på 1930-talet 3,9,10,11. I Kalifornien utgör stamgropar och trifoliatbrytande resistensisolat av viruset ett allvarligt hot mot Kaliforniens citrusindustri som omsätter 3,6 miljarder dollar12,13,14. Följaktligen klassificerar CDFA CTV som en reglerad klass A-växtskadegörare, och laboratoriet vid Central California Tristeza Eradication Agency (CCTEA) utför omfattande fältundersökningar och tusentals virustester varje år15,16. Bakterien "Candidatus Liberibacter asiaticus" (CLas) och huanglongbing-sjukdomen (HLB) beräknas ha orsakat nära 9 miljarder dollar i ekonomisk skada för Florida som ett resultat av en 40-procentig minskning av citrusarealen, en 57-procentig minskning av citrusodlingen och en förlust av nästan 8 000 arbetstillfällen17,18. I Kalifornien förutspåddes en hypotetisk 20-procentig minskning av citrusarealen på grund av HLB leda till mer än 8 200 förlorade arbetstillfällen och en minskning av delstatens bruttonationalprodukt med över en halv miljard dollar. Därför spenderar Citrus Pest and Disease Prevention Program över 40 miljoner dollar årligen på undersökningar för att testa, upptäcka och utrota CLas från Kalifornien14,17,19,20.

En viktig del av hanteringen av citrusviroider, virus och bakterier är användningen av patogentestade förökningsmaterial (t.ex. knoppved) för trädproduktion. Patogentestad citrusknoppved produceras och underhålls inom omfattande karantänprogram som använder avancerade tekniker för eliminering och detektion av patogener10,21. Citrus Clonal Protection Program (CCPP) vid University of California, Riverside, testar tusentals knoppträprover varje år från citrussorter som nyligen importerats till delstaten och USA, samt träd från citrusknoppar, för att skydda Kaliforniens citrus och stödja funktionerna hos National Clean Plant Network for Citrus10,17,22. För att hantera den stora volymen citrustester är tillförlitliga och kostnadseffektiva patogendetektionsanalyser med hög genomströmning en grundläggande komponent för framgång för program som CCPP 7,10,22.

Även om molekylbaserade patogendetektionsanalyser som polymeraskedjereaktion (PCR) har möjliggjort betydande ökningar av genomströmningen i växtdiagnostiska laboratorier, är enligt vår erfarenhet en av de mest kritiska flaskhalsarna i implementeringen av protokoll med hög genomströmning bearbetningssteget för växtvävnadsprover. Detta gäller särskilt för citrusfrukter eftersom de för närvarande tillgängliga protokollen för bearbetning av floemrika vävnader som bladskaft och knoppvedsbark är arbetskrävande, tidskrävande och kräver dyr och specialiserad laboratorieutrustning. Dessa protokoll kräver handhackning, vägning, frystorkning, malning och centrifugering vid låga temperaturer för att undvika nukleinsyranedbrytning 8,23,24. Vid diagnoslaboratoriet CCPP omfattar provbearbetningen till exempel i) handhackning (6–9 prover/h/operatör), ii) frystorkning (16–24 timmar), iii) pulverisering (30–60 s) och iv) centrifugering (1–2 timmar). Processen kräver också specialutrustning (t.ex. kraftiga safe-lock-rör, slipkulor i rostfritt stål, adaptrar, blad, handskar) och flera delar av dyr laboratorieutrustning (t.ex. ultralåg frys, frystork, vävnadspulveriserare, kryostation med flytande kväve, kylcentrifug).

Som i alla branscher är utrustningsteknik och automatisering av processer nyckeln till att sänka kostnaderna, öka genomströmningen och tillhandahålla högkvalitativa, enhetliga produkter och tjänster. Citrusindustrin behöver billiga instrument för bearbetning av vävnader som kräver minimal skicklighet för att fungera och som därför är lätta att överföra till diagnostiska laboratorier och fältverksamhet för att möjliggöra hög provbearbetningskapacitet för snabb upptäckt av patogener nedströms. Technology Evolving Solutions (TES) och CCPP utvecklade (dvs. designar och tillverkar) och validerade (dvs. testade med citrusprover och jämförde med standardlaboratorieprocedurer) ett billigt (dvs. eliminerade behovet av specialiserad laboratorieutrustning) instrument för snabb bearbetning av floemrika citrusvävnader (dvs. knoppved), kallat budwood tissue extractor (BTE). Som framgår av figur 1 innehåller BTE en baskomponent för ström och kontroller, plus en avtagbar kammare för bearbetning av citrusknoppved. BTE-kammaren består av en slipskiva som är speciellt utformad för att ta bort de floemrika barkvävnaderna från citrusknoppen. Den strimlade barkvävnaden matas snabbt ut genom en glidport till en spruta som innehåller extraktionsbuffert, filtreras och görs redo för nukleinsyraextraktion och rening utan ytterligare hantering eller beredning (figur 1). BTE-systemet innehåller också en papperslös provspårningsapplikation och en integrerad vägningsapplikation, som registrerar provbehandlingsinformationen i en onlinedatabas i realtid.

BTE-systemet har ökat CCPP:s laboratoriediagnostiska kapacitet med över 100 % och har konsekvent producerat extrakt av citrusvävnad som är lämpliga för rening av nukleinsyror av hög kvalitet och nedströms detektion av transplantatöverförbara patogener av citrusfrukter med hjälp av PCR-analyser. Mer specifikt har BTE minskat tiden för vävnadsbearbetning från över 24 timmar till ~3 minuter per prov, ersatt laboratorieinstrument som kostar över 60 000 USD (figur 2, steg 2-4) och möjliggjort bearbetning av större provstorlekar.

Detta dokument presenterar BTE-högkapacitetsbearbetning av citrusbarkvävnadsbearbetning, nukleinsyraextraktion och valideringsdata för patogendetektion med citrusknoppsprover från källträd, inklusive alla lämpliga positiva och negativa kontroller från CCPP Rubidoux Quarantine Facility respektive Lindcove Foundation Facility. Vi presenterar också genomströmnings- och bearbetningstidsförändringarna jämfört med den nuvarande laboratorieproceduren (Figur 2). Dessutom ger detta arbete ett detaljerat, steg-för-steg-protokoll för testlaboratorier för citruspatogener och visar hur BTE kan stödja funktionerna hos patogenrena plantskole-, undersöknings- och utrotningsprogram.

Figure 1
Figur 1: Vävnadsextraktor av knoppträ. BTE innehåller en baskomponent för kraft och kontroller, plus en avtagbar kammare för bearbetning av citrusknoppved. BTE-kammaren består av en slipskiva som är speciellt utformad för att ta bort de floemrika barkvävnaderna från citrusknoppved. Den strimlade barkvävnaden matas snabbt ut genom en glidport i en spruta, filtreras och görs redo för nukleinsyraextraktion och rening utan ytterligare hantering eller förberedelse. Förkortning: BTE = budwood tissue extractor. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Steg-för-steg-jämförelse mellan den konventionella handhackningsproceduren i labbet och BTE-bearbetning. BTE-bearbetning involverar bearbetning av citrusbarkvävnad med hög kapacitet, nukleinsyraextraktion och patogendetektering. Tiden för varje steg anges inom parentes. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Samla in proverna av citrusknoppträ som ska skickas

  1. Skicka Technology Evolving Solutions ett kalkylblad med trädinformation som de kan läsa in på sin webbserver (så småningom kommer användaren att skapa nya träd).
  2. Använd telefonappen TES-spåraren för att välja ett träd och håll en NFC-halsbandstagg mot telefonen för att läsa in trädinformationen till taggen.
  3. Sätt in tre till fyra citrusknoppsprover i den BTE-kompatibla plastpåshållaren och stäng med locket.
    1. Se till att knoppvedens längd inte överstiger 8 tum och inte är mindre än 5 tum.
      1. Om längden är större än 8 tum, använd ett sterilt engångsrakblad eller beskärningssax dekontaminerad med 10 % blekmedelslösning (1 % natriumhypoklorit) för att göra den kortare.
      2. Om längden är mindre än 5 tum, samla in ett annat knoppvedsprov för att lägga i påsen.
    2. Se till att eventuell axillär tillväxt eller stora taggar tas bort för hand eller med 10 % blekmedelsdesinficerade skärverktyg (1 % natriumhypoklorit).
      OBS: Detta steg är viktigt så att knoppveden är lättare att manövrera i kammarens öppning.
    3. Se till att det inte finns några knoppträprover som har böjda funktioner. Om de gör det, ta bort dem med 10 % blekmedelsdesinficerade skärverktyg (1 % natriumhypoklorit) och placera endast de raka delarna av provet i BTE-påsarna.
      OBS: Böjd knoppved är mycket svår att manövrera in i instrumentet, vilket resulterar i ojämna barkränder.
  4. Använd telefonappen TES tracker för att skanna trädets NFC-halsbandstagg och länka den till NFC-klämman på provpåsen.
  5. Var uppmärksam på tjockleken på knoppveden, eftersom det avgör hur operatören kommer att ta bort den floemrika knoppvedsbarken inuti BTE-kammaren.
    1. Om knoppträet har en tjocklek under 0,20 tum, var försiktig när du tar bort knoppved eftersom de höghastighetssnurrande trådarna i kammaren kommer att pulverisera hela knoppträet till dess kärna, bortom barkskiktet och in i de icke-floemrika vävnaderna av trä och märg.
    2. Välj tjockare knoppved eftersom det är lättare att ta bort barkvävnaderna samtidigt som man undviker de icke-floemrika knoppvedsvävnaderna.
  6. Placera proverna i en isolerad transportbehållare med några kylklampar.

2. Installation i dragskåpet

OBS: Det är att föredra att använda BTE inuti ett dragskåp. Detta kommer att minska risken för korskontaminering av växtvävnad och laboratoriekontaminering.

  1. Desinficera med en 10 % (1 % natriumhypoklorit) sprayflaska.
    1. Spraya huvens yta och låt blekmedlet sitta i cirka 1 minut innan du torkar av det med en pappershandduk.
    2. Spraya en pappershandduk med blekmedelslösningen. Torka av TE-basen, viktskalans komponenter (våg, luftsköld och torn) och en markeringspenna.
  2. Packa upp ett sprutset för antalet prover som ska bearbetas och placera dem i en täckt kartong.
  3. Ha ett paket med svabbar tillgängliga utanför huven om de skulle behövas.
  4. Förbered vågen.
    1. Ta bort vikttornet från vågen och håll in strömknappen för att slå på den. Placera tornet i mitten av skalan efter att skalan visar 0.
    2. Skjut viktvågens luftsköld över vågens framsida.
  5. Förbered vävnadsextraktorns bas genom att vrida på strömbrytaren på baksidan. Se till att strömbrytaren på vänster sida av lådan trycks ner på toppen. Vänta på en blinkande grön lysdiod, vilket indikerar att kammaren är klar.

3. Ställ in rengöringsstationerna (kompletterande figur S1).

  1. Häll 1 L vatten i ultraljudsrengöraren.
  2. Linda in två soppåsar ovanpå ultraljudsrengöraren.
  3. Häll ~5 L 10 % blekmedel (1 % natriumhypokloritlösning) i ultraljudsrengöraren.
  4. Fyll vattenkaret med tillräckligt med vatten för att sänka ner en kammare.
  5. Slå på luftkompressorn och öppna ventilen.
  6. Sätt upp en bakgrund för att fånga upp vätskan medan kammaren torkar.

4. Bearbetning av BTE-materialet för strippning av citrusknoppsbark

  1. Ladda kammaren på BTE-basen.
    1. Förbered BTE-kammaren.
      1. Fäst en tom provpåse på baksidan av kammaren. Använd två O-ringar för att fästa den tomma påsen på bakmunstycket på BTE-kammaren.
      2. Inspektera bladet för tecken på slitage eller skador, såsom skärsår som bildas på bladet där det fortsätter in i plasten eller skärsår som bildas på spetsen. Se till att pilen på bladet är i linje med den enkla låssymbolen.
      3. Se till att luftutsläppet på botten av kammaren är vänt mot O-symbolen . Placera det genomskinliga locket över kammaröppningen och skjut den genomskinliga BTE-sliden på kammaren med hjälp av spåret till höger om kammaren. Skjut låset på botten av kammaren så långt det går in i sliden. Se till att kolvlocket är monterat på toppen av sliden.
    2. Placera kammaren på BTE-basen med BTE-basens munstycke utskjutande på baksidan av kammaren. Vänta tills den blå lysdioden blinkar, vilket indikerar att placeringen har lyckats.
  2. Ladda sample på BTE-basen genom att flytta den vita dekalen på NFC-klämman tag till ett Z på höger sida av lådan. Flytta tag i en långsam cirkelrörelse på Z tills den gula lampan börjar blinka. Fäst sample på BTE-basen och se till att sample påsen har inga hål i sig; Om det finns ett hål, lappa det med tejp. Placera O-ringen över sample påsen för att fästa den på framsidan av BTE-munstycket.
  3. Ladda det oanvända sprutsetet.
    1. Tarera sprutsetet. Placera det oanvända sprutsetet på vågtornet. Ta bort sprutsatsen när en röd lampa börjar blinka eller vågen visar 0.
    2. Ta bort kolven från sprutan med filtret. Se till att vätskan finns i den nedre sprutan (utan filter). Placera kolven åt sidan på en pappershandduk eller på tornet där den svarta kolven inte vidrör några ytor.
    3. Fäst sprutan i skjutporten genom att trycka in utloppsporten i sprutan och vrida 90°.
  4. Bearbeta knoppvedsprovet.
    VARNING: BTE har rörliga delar med hög hastighet. All drift måste ske inuti ett dragskåp. Alla användare bör använda skyddsglasögon, hörselkåpor (öronproppar) och all annan personlig skyddsutrustning (PPE), såsom handskar och labbrockar.
    1. Tryck på den övre svarta knappen för att starta maskinen. Tryck en andra gång för att stoppa motorn när som helst under bearbetningen.
      OBS: Lådan har hastighets- och temperaturavkänning för att säkerställa att den fungerar korrekt.
    2. Ta en knoppträpinne genom påsen och sätt den genom toppen av BTE-munstycket.
    3. Ta tag i knopppinnen på andra sidan av kammaren med den andra handen och gå långsamt ner i bladet. Lyssna efter ett mjukt surrande ljud som indikerar att knoppveden håller på att bli av med sin bark. Flytta långsamt knoppträet fram och tillbaka medan du roterar det.
      1. Om ett högt, aggressivt huggande ljud hörs, flytta snabbt grenen till toppen och/eller tryck på den övre knappen för att stoppa motorn. För att stoppa motorn, använd omkopplaren på höger sida för att avsluta bearbetningen (se steg 4.4.3.2).
      2. Om inget material kommer ut ur utgången vid skärning, har kammaren en tilltäppning. Stäng av motorn, ta bort skjutkolvlocket och använd pinnens plast för att trycka ut tilltäppningen genom maskinens utgång. Använd omkopplaren på höger sida för att avsluta bearbetningen: Upp = Framåtskärning; Mitten = Motorn avstängd; Ner = Omvänd kapning.
    4. Upprepa steg 4.4.2 och steg 4.4.3 för de återstående grenarna.
      OBS: En allmän indikator på att tillräckligt med knoppbark har tagits bort är när 25 % av sprutan har fyllts med växtvävnad. Transplantatöverförbara patogener av citrusfrukter kan vara ojämnt fördelade i trädet. Därför samlas tre till fyra knoppvedsprover in runt citrusträdets krontak. Det är viktigt att varje knoppvedsprov i BTE-bärkassen bidrar till det slutliga markvävnadsprovet för att säkerställa att ett fullständigt trädrepresentativt prov kommer att testas för patogener.
    5. Tryck på den övre svarta knappen för att stoppa bearbetningen. Vänta tills lampan börjar blinka gult igen.
  5. Kontrollera provvikten.
    1. Vrid sprutan 90° och dra den nedåt för att lossa den. Sätt tillbaka kolven på sprutan och placera sprutan på tornet.
    2. Vänta tills vågen automatiskt detekterar sample och avgör om den är inom rätt viktintervall (0.25 ± 0.05 g). Om sample vikt är för låg (<0.20 g), upprepa steg 4.4; den röda lysdioden börjar blinka. Om provvikten är för hög (>0.30 g), ta bort en del av provmaterialet; den gula lysdioden börjar blinka långsammare. Om sample är inom intervallet, den gröna lysdioden börjar blinka.
  6. Homogenisering av knoppträprovet
    1. Ta bort kolven från sprutan med provet, tryck in vätskan i sprutan med provet och tillsätt kolven igen. Kolven trycker bufferten och växtsaften genom nätfiltret (och håller kvar eventuella stora barkvävnadsbitar) och via gummislangen in i den tomma sprutan.
    2. Blanda provet genom att trycka bufferten och växtsaften fram och tillbaka från den ena sprutan till den andra. Upprepa ~3x-4x och tills provet blir en homogen grön vätskeblandning.
    3. När växtsaften är väl homogeniserad, tryck in växtsaftprovet i sprutan utan nätfiltret och lossa gummislangen och sprutan med filtret från sprutan med provet.
    4. Spruta ut växtsaftsprovet från sprutan i ett 2 ml sterilt mikrocentrifugrör och förvara vid −20 °C tills vidare användning. Använd en permanent märkpenna för att märka provet med påsens nummer.
      OBS: Växtprovsaften från steg 4.6.5 kan nu bearbetas med någon av de tillgängliga nukleinsyra-, RNA- eller DNA-extraktionsmetoderna baserade på fenol-kloroform, kiseldioxidkolonn eller magnetiska pärlor 9,25,26,27 för nukleinsyraextraktion och rening (se steg 7) och nedströms detektion av transplantatöverförbara patogener av citrus (se steg 8).

5. Desinficering av BTE:s avtagbara kammare

VARNING: Om bufferten från sprutsetet hamnar på kammaren eller glider, skölj och följ alla laboratoriets säkerhetsregler före rengöring. Sprutsetet innehåller guanidintiocyanat. Om bufferten från sprutsetet kommer i kontakt med blekmedel kommer den att skapa cyanidgas.

  1. Utför följande steg efter att det 10:e provet har bearbetats i kammaren. Observera att den gröna lysdioden fortsätter att blinka istället för att övergå till att blinka blått.
  2. Demontera BTE-kammaren för att rengöra alla möjliga föroreningar; Ta bort det genomskinliga plastlocket, rensa kammarsliden och rensa igensättningsporten på kammarsliden.
  3. Vrid luftfrigöringsventilen på botten av kammaren till öppet läge (öppet hänglåsmärke). Placera kammarkomponenterna i den inställda ultraljudsrengöraren (se steg 3.1). Placera locket under kammaren för att förhindra att det flyter. Kör ultraljudsrengöraren i 15 minuter.
    OBS: Ultraljudsrengöringsbadet (5 L) rymmer upp till två kammare.
  4. Skölj kammarens komponenter i vattenbadet (steg 3.4) i minst 30 s. Flytta kammarkomponenterna till torkstationen.
    VARNING: Torkning kommer att orsaka snabbrörliga delar i kammaren, höga ljud (~85 decibel [dB]) och eventuellt stänk. Alla användare bör använda skyddsglasögon, hörselkåpor (öronproppar), labbrockar och all annan personlig skyddsutrustning som krävs enligt säkerhetsreglerna för det operativa laboratoriet.
  5. Torka BTE-kammaren.
    1. Placera luftpistolen i linje med spåret på kammarens övre öppning (där sliden vanligtvis skulle vara). Tryck på pistolens avtryckare för att mata ut luft i ~30 s.
      OBS: Se till att öppningen är borta från användaren mot bakgrunden. Detta bör snurra bladsatsen för att ta bort vätskan som fastnat under den.
    2. Placera luftpistolen mot kammarens övre munstycken. Tryck på avtryckaren på luftpistolen och spåra långsamt tre hela cirklar av varje munstycksingång.
    3. Placera luftpistolen i mitten av BTE. Börja från den innersta punkten, håll avtryckaren intryckt och flytta tills luftpistolen pekar mot där rutschkanan skulle vara.
    4. Kör snabbt luft över hela kammaren, fram och bak, för att få bort ytvattnet från utsidan.
  6. Torka BTE-sliden.
    1. Placera luftpistolen i kolvöppningen på sliden och tryck på avtryckaren för att mata ut vatten ur slidens utgång.
    2. Kör en luftpistol längs den inre ytan av rutschkanan för att torka den.
    3. Kör en luftpistol längs glidspåret för att trycka ut vatten.
    4. Kör snabbt luft över hela utsidan för att få bort ytvatten från den.
  7. Torka komponenterna.
    1. Håll skjutkolvlocket och O-ringarna i handen och tryck på avtryckaren.
    2. Kör en luftpistol över lockets insida.
    3. Placera komponenterna i kammaren och skjut för att fortsätta torka eller sätt ihop dem igen.
      OBS: För en miljö med hög vävnadsbearbetning med flera funktionella BTE:er kan ett satsdesinficeringssystem tillhandahållas som kan dekontaminera 10 kammare samtidigt.

6. Kassera och desinficera

  1. Kassera sprutorna och gummislangen i den avsedda behållaren för guanidinavfall.
  2. Släng eventuellt växtmaterial i behållaren för biologiskt farligt avfall.
  3. Ta bort bakom-facket från sned-regera-sockeln.
  4. Demontera BTE-kammaren och fortsätt med dekontamineringen enligt beskrivningen i steg 5.

7. Bedömning av vävnadsbearbetningen och kvaliteten på RNA som renats från extrakt av BTE-citrusknoppar

OBS: I detta protokoll använde vi knoppvedsprover från 255 citrusträd för att jämföra den tid som krävs för bearbetning av citrusknoppvedsvävnad och kvaliteten på RNA renat från barkvävnadsextrakt framställt av BTE (figur 2, höger sida, steg 1, steg 5 och steg 6) jämfört med den som framställts enligt den regulatoriskt godkända metoden för bearbetning av citrusknoppsvävnad med handskalning och hackning, frystorkning, pulverisering och centrifugering av barkvävnaden, enligt beskrivningen av Dang et al.23 (Figur 2, vänster sida, steg 1-6).

  1. Nuvarande laboratorieförfarande: Förbered knoppvedsprover för vävnadsbearbetning enligt den lagstadgade metoden23.
    1. Utför handskalning och hackning av barkvävnaden, frystorkning, pulverisering, centrifugering och överföring av växtsaften till RNA-extraktionsröret, enligt beskrivningen av Dang et al.23 (Figur 2, vänster sida, steg 1-6).
    2. Efter att ha skalat de tre till fyra knoppvedsproverna för hand från varje testat träd, placera all knoppved i en BTE-kompatibel plastpåsehållare och förvara vid 4 °C fram till BTE-bearbetningen (steg 7.2).
  2. BTE-procedur: Påbörja BTE-bearbetningen av citrusknoppsvävnad (avsnitt 4, steg 4.1-4.6; Figur 2, höger sida, steg 1, steg 5 och steg 6).
    1. Använd knoppvedsproverna som förvaras i BTE-bärsäckarna från punkt 7.1.2.
  3. Extrahera och rena RNA från växtsaften från det aktuella laboratorieförfarandet (steg 7.1.1) och BTE-förfarandet (steg 7.2.2) med hjälp av den lagstadgat godkända halvautomatiska metoden 8,23,28 baserad på magnetiska pärlor.
  4. Bedöm RNA-kvaliteten genom att mäta dess koncentration, renhet och integritet 8,23,24,29,3 3,31.
    1. För att beräkna koncentrationen, använd spektrofotometri och optisk densitet (OD) vid en våglängd på 260 nm.
    2. För att bedöma renheten, använd ett spektrofotometriskt OD-förhållande på 260/280.
    3. För att kontrollera integriteten, använd omvänd transkription (RT) kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) riktad mot mRNA för NADH-dehydrogenas-citrusgenen24,32.

8. Bedömning av korskontaminering och påvisande av citrusvirus och viroider med hjälp av RNA som renats från extrakt av BTE-citrusknoppar

OBS: I detta protokoll använde vi knoppvedsprover från 72 icke-infekterade citrusträd och ett träd som var blandinfekterat med virus och viroider för att bedöma risken för korskontaminering mellan prover när de bearbetades med BTE (figur 2, höger sida, steg 1, steg 5 och steg 6) och lämpligheten av RNA renat från barkvävnadsextrakt framställt av BTE för att användas som mall för RT-qPCR-detektion av citrusvirus och viroider.

  1. Första BTE-provbearbetningen: Genomför ett baslinjeexperiment med 72 icke-infekterade prover.
    1. Förbered tre (A-C) BTE-kammare (steg 4.1.1).
    2. Bered alla icke-infekterade citrusknoppsprover (1–72) i BTE-bärkassar och förbered lika många (72) i BTE-provuppsamlingssystemet med två sprutor, med ett sprutsystem för varje prov (steg 2.4).
    3. Separera provbärarna och provtagningssprutorna i sex satser (I-VI) med 12 prover vardera.
    4. Påbörja bearbetningen av BTE-citrusknoppsvävnad (steg 4) enligt sekvensen nedan (steg 8.1.4.1-8.1.4.6) (se tabell 1, Första BTE-provbearbetningen).
      1. För batch I/Samples 1-12, bearbeta 12 samples med hjälp av kammare A. Desinficera kammare A efter sample 12 (steg 5).
      2. För batch II/prover 13-24, bearbeta 12 samples med kammare B. Desinficera kammare B efter sample 24 (steg 5).
      3. För batch III/prover 25-36, bearbeta 12 samples med kammare C. Desinficera kammare C efter sample 36 (steg 5).
      4. För batch IV/prover 37-48, bearbeta 12 samples med den desinficerade kammaren A (steg 8.1.4.1).
      5. För sats V/prover 49--60, bearbeta 12 prover med den sanerade kammaren B (steg 8.1.4.2).
      6. För parti VI/prov 60-72, bearbeta 12 prover med hjälp av den desinficerade kammaren C (steg 8.1.4.3).
    5. Förvara bakom-örat-bärkassen med alla prover vid 4 °C fram till användning enligt steg 8.2.
    6. Extrahera och rena RNA från de 72 växtsaftsprover som genererades i steg 8.1.4.1–8.1.4.6 med hjälp av den lagstadgat godkända halvautomatiska metoden 8,23,28 baserad på magnetiska pärlor.
    7. Utför RT-qPCR för detektion av citrusvirus och viroider, som tidigare beskrivits 8,33.
  2. För den andra bearbetningen av BTE-prover, utför ett korskontamineringsexperiment med 70 icke-infekterade prover och två blandade infekterade prover.
    1. Förbered tre (A-C) BTE-kammare (steg 4.1.1).
    2. Bered det blandade provet av citrusknoppved (73) i två BTE-bärkassar (steg 1.3) för totalt två infekterade prover.
    3. Samla ihop BTE-bärsäckarna med de icke-infekterade citrusknoppsproverna från steg 8.1.5, utom prov 3-sats I och prov 51-parti V (se provbyte i steg 8.2.4), för totalt 70 icke-infekterade prover.
    4. Bifoga den första BTE-bärkassen med det blandningsinfekterade provet 73 i stället för prov 3 i parti I och det andra i stället för prov 51 i parti V för totalt 72 prover.
    5. Bered lika många (72) i BTE-provtagningssystemet med två sprutor, med ett system med dubbla sprutor för varje prov (steg 2.4).
    6. Separera de 72 provbärarna och provtagningssprutorna i sex satser (I-VI) med 12 prover vardera.
    7. Påbörja bearbetningen av BTE-citrusknoppsvävnad (steg 4) enligt samma sekvens som i steg 8.1.4.1–8.1.4.6.
      OBS: Den enda skillnaden är att sample 3 i batch I och sample 51 i batch V ersätts med den infekterade sample 73 (steg 8.2.4) (tabell 1, andra BTE sample bearbetning).
    8. Extrahera och rena RNA från de 72 växtsaftsproverna som genererades i steg 8.2.7 som i steg 8.1.6.
    9. Utför RT-qPCR för detektion av citrusvirus och viroider, som i steg 8.1.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

RNA-extraktion, rening och kvalitet med hjälp av BTE-bearbetad citrusvävnad från knoppved och bedömning av tid för vävnadsbearbetning
Vi använde knoppvedsprover från 255 representativa citrusträd för detta test för att jämföra RNA-kvaliteten från BTE jämfört med standardproceduren. Proverna bearbetades med budwood tissue extractor (BTE) (protokollsteg 4.1-4.6 och figur 2, höger sida, steg 1, steg 5 och steg 6) eller framställdes enligt den regulatoriskt godkända bearbetningsmetoden för citrusknoppsvävnad, som använder handskalning och hackning, frystorkning, pulverisering och centrifugering av barkvävnaden, som beskrivs av Dang et al.23 (Figur 2, vänster sida, steg 1-6).

Jämförelsen sida vid sida av BTE med det konventionella protokollet för handhackning och laboratorieutrustning för bearbetning av citrusvävnad visade att kvaliteten (dvs. koncentrationen, renheten och integriteten) hos de extraherade nukleinsyrorna (figur 3A–C) och lämpligheten för användning i senare led för PCR-detektion av citruspatogener (data visas inte) var jämförbara. Samtidigt minskade tiden för bearbetning av prover avsevärt med hjälp av TE/BTE-systemet. BTE mer än fördubblade provgenomströmningen i CCPP-laboratoriet, vilket minskade kostnaderna för arbetskraft och laboratorieutrustning genom att eliminera behovet av instrument för tiotusentals dollar, såsom pärlvispare, centrifuger och kryostationer.

Nukleinsyrorna extraherade med BTE hade en genomsnittlig koncentration på 76,96 ng/μL ± 26,23 ng/μL (n = 181) och var av hög renhet, med låg proteinkontaminering (A260/A280 2,27 ± 0,17, n = 181) (figur 3B,C). Dessa värden var jämförbara med de nukleinsyror som producerades enligt CCPP:s manuella standardprotokoll (koncentration: 82,25 ng/μL ± 33,95 ng/μL, n = 181 och A260/A280 2,22 ± 0,10, n = 181) (figur 3B,C). Nukleinsyraintegriteten (RT-qPCR för citrusgenen nad5) var mycket likartad för BTE (Cq 20,97 ± 2,26, n = 181) och standardmanualens CCPP-protokoll (Cq 19,25 ± 1,53, n = 181) (figur 3A). Resultaten visade också att BTE-instrumentet kunde bearbeta en högre provvolym inom samma tidsram jämfört med den konventionella metoden. Den konventionella laboratorieproceduren krävde ~7-10 minuter för handhackning per prov och totalt 12 minuter för vävnadsbearbetning (frystorkning, malning och centrifugering), medan BTE kunde bearbeta citrusvävnad för nukleinsyraextraktion på ~3 minuter per prov.

Figure 3
Figur 3: Kvaliteten på nukleinsyraextrakten i de 181 representativa proverna av citrusknoppved, definierad genom koncentration, renhet och integritet. Proverna bearbetades med BTE och det konventionella handhacknings- och laboratorieutrustningsprotokollet. A) Nukleinsyrakoncentrationen bestämdes med hjälp av absorbans vid 260 nm. B) Renheten bestämdes som förhållandet mellan absorbanserna vid 260 nm och 280 nm (A260/280). (C) Nukleinsyraintegriteten analyserades med RT-qPCR riktad mot mRNA av NADH-dehydrogenas (Nad5) citrusgenen. Intervallen med optimala värden anges mellan röda streckade cirklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Påvisande av transplantatöverförbara patogener av citrusfrukter, bedömning av korskontaminering och påvisande av citrusvirus och vioider med hjälp av RNA som renats från BTE-extrakt av citrusknoppar
Validiteten hos vävnadsbearbetningsmetoden utvärderades genom att behandla 72 friska prover av citrusknoppved sida vid sida med alla friska prover och genom att införa två prover från en trädblandning infekterad med virus och viroider (tabell 1 och figur 4A,B). Nukleinsyror extraherade från båda satserna utsattes för konventionell laboratoriebaserad q-PCR som tidigare beskrivits 8,33. Inget av de 72 friska proverna från den första BTE-provbehandlingen gav amplifieringskurvor för de testade citruspatogenerna (dvs. falskt positiva) (figur 4A). Resultaten tyder på att BTE kan bearbeta citrusvävnad lika bra jämfört med standardlaboratorieprotokollet med handhackningsmetoder. I den andra behandlingen av BTE-prover bedömde vi risken för korskontaminering mellan BTE-huvuden och inom prover som bearbetats med samma BTE-huvud (steg 1–6) och nukleinsyrornas lämplighet för nedströmstillämpningar (dvs. för användning som mall för RT-qPCR-detektion av citrusvirus och vioider). I den andra BTE-provbearbetningen med två introducerade blandinfekterade prover användes nukleinsyrorna som producerades av BTE-protokollet framgångsrikt för att detektera olika citrusvirus och viroider (t.ex. triplexvirus, citrusbladfläcksvirus [CLBV], citruspsorosvirus [CPsV], citrus tristeza-virus [CTV]), apscaviroider (citrusböjbladsviroid [CBLVd], citrusdvärgviroid [CDVd], citrusviroid V [CVd-V], citrusviroid VI [CVd-VI] och citrusviroid VII [CVd-VII]), icke-apscaviroider humlestuntviroid (HSVd; hostuviroid), citrusbarkknäckningsviroid (CBCVd; cocadviroid) och citrus exocortis viroid (CEVd; pospiviroid) i batch 1 och batch 5. Inom batch 1 och batch 5 var prover som följde den infekterade positiva för ovanstående växtsjukdomar men hade ökande Cq-värden. Ingen korskontaminering mellan huvuden upptäcktes dock och inte heller några falskt positiva eller negativa resultat (figur 4B).

Batch Prov BTE Första BTE Andra bakom-örat
Kammare Bearbetning av prover Bearbetning av prover
Jag 12-januari A 1-12 Icke-smittade 1-2 & 4-12 Icke-infekterade
Prov #3 ersätts med blandningsinfekterad
II 13-24 B 13-24 13-24
Icke-infekterade Icke-infekterade
III 25-36 C 25-36 25-36
Icke-infekterade Icke-infekterade
DROPP 37-48 A-sanerad 37-48 37-48
Icke-infekterade Icke-infekterade
V 49-60 B-sanerad 49-60 49-50 & 52-60 Icke-smittade
Icke-infekterade
Prov #51 ersätts med blandningsinfekterad
VI 61-72 C-sanerad 61-72 Icke-smittade 61-72 Icke-smittade

Tabell 1: Metod för validering av metoden för bearbetning av BTE-vävnad med 72 prover av citrusknoppved. Varje bearbetning upprepades två gånger. Det fanns 6 satser med 12 prover vardera. I den första provbearbetningen var alla 72 citrusknoppsprover friska. I den andra BTE-provbearbetningen ersattes prov 3 och prov 51 med två prover från en trädblandning infekterad med virus och viroider i batch 1 och batch 5.

Figure 4
Figur 4: Validering av metoden för bearbetning av BTE-vävnad med 72 prover av citrusknoppved. Varje bearbetning upprepades två gånger. Det fanns 6 satser med 12 prover vardera. (A) Alla 72 prover av citrusknoppved var friska. B) Samma 72 prover av citrusknoppved med införande av två prover från en trädblandning som är infekterad med virus och viroider i parti 1 (prov 3) och parti 5 (prov 51). NTC- och vattenkontrollerna hade alla obestämda Cq-värden (dvs. DNA-målet fanns inte i provet). De positiva kontrollerna för triplexen (CLBV, CPsV, CTV) hade Cq-värden på 23,9, 25,2 respektive 22,4. De positiva kontrollerna för apscaviroider (CBLVd, CDVd och CBCVd) hade Cq-värden på 23,39, 21,27 respektive 25,17. De positiva kontrollerna för icke-apscaviroider (CEVd, HSVd, IV) hade Cq-värden på 26,9, 27,0 respektive 26,5. Förkortningar: BTE = knoppvedsextraktor; NTC = ingen mallkontroll. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande bild S1: Inställning av rengöringsstation. Efter att det 10:e provet har bearbetats i kammaren ska protokollsteg 3.1-3.6 följas för att förbereda rengöringsstationen för att desinficera kammaren. Som i protokollsteg 3.1 placeras 1 L vatten i ultraljudsrengöraren. Två soppåsar lindas över toppen av ultraljudsrengöraren (protokollsteg 3.2), och ~5 L 10 % blekmedel (1 % natriumhypokloritlösning) hälls i ultraljudsrengöraren (protokollsteg 3.3). Vattenkaret fylls med tillräckligt med vatten för att sänka ner en kammare (protokollsteg 3.4), luftkompressorn stängs av och ventilen öppnas (protokollsteg 3.5). En bakgrund är uppsatt för att fånga upp vätskan medan kammaren torkar (protokollsteg 3.6). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I och med tillkomsten av HLB-citrussjukdomen har citrusindustrin, tillsynsmyndigheter och diagnostiska laboratorier uppmanats att förlita sig på nukleinsyraextraktionsmetoder med hög genomströmning i kombination med manuell provbearbetning med låg genomströmning och patogendetektionsanalyser som qPCR34 för testning av enskilda träd, i kombination med metoder för sjukdomshantering35. Kaliforniens HLB-positivitetsgrad har gått från 0,01 % 2012 till 1,2 % 2020. Även om qPCR är ett kraftfullt och tillförlitligt verktyg för detektion av patogener, tillåter den för närvarande tillgängliga tekniken inte att en tillräcklig volym växtvävnad provtas och bearbetas, vilket resulterar i tydlig under- och undertestning för CLas i citrusträd i Kalifornien. Under- och undertestning förekommer i förhållande till både antalet testade träd och mängden växtmaterial per träd som bearbetas (dvs. antalet löv), och på grund av den sporadiska fördelningen av infekterade löv i trädkronorna finns det en stor sannolikhet för att missa tidiga eller milda infektioner. De nuvarande metoderna för provtagning och CLas-testning kan inte skalas upp med ökad efterfrågan på grund av kostnader (t.ex. arbetskraft och utrustning). För närvarande kräver provbearbetningsmetoden som används av de flesta citrusdiagnostiska laboratorier i Kalifornien för att förvärva nukleinsyror som är lämpliga för testning av citruspatogener över 17 timmar för manuell provhantering och specialiserade förnödenheter och utrustning som kostar över 100 000 USD.

Här presenterar vi valideringen av ett specialiserat instrument som är konstruerat för att snabbt bearbeta citrusknoppsbarkvävnader, kallat budwood tissue extractor (BTE), och ett detaljerat, steg-för-steg-protokoll för provhantering för citrusdiagnostiska laboratorier. Forskningen fokuserade på att utveckla en innovativ vävnadsbearbetningsmetod för att ersätta den nuvarande arbetsintensiva handhuggningen av knoppvedsprover och bygga det mest genomströmnings- och kostnadseffektiva bearbetningsinstrumentet för citrusknoppved som möjligt. Resultaten visar att BTE ökar provgenomströmningen och minskar kostnaderna för utrustning och förnödenheter som används vid CCPP:s diagnostiska laboratorium. Den presenterade tekniken och metoden inkluderar också användning av NFC-taggar, en telefonapp och en onlinedatabas för spårning av provinformation i realtid. Efter att knoppvedsprover har samlats in länkar telefonappen NFC-provpåsklämman till NFC-trädtaggen. Proverna skickas sedan till laboratoriet för bearbetning med BTE-maskinen. Information för varje sample registreras med ett snabbt svep över sidan av BTE-kroppen. Genom NFC-taggen registreras också bearbetningstiden för varje prov och provets vikt och laddas upp till onlinedatabasen i realtid. Denna metod ger ett mycket tidseffektivt system, förbättrar kvalitetskontrollen (dvs. genom att undvika prov-ID-fel) och ökar laboratoriets effektivitet.

Bearbetningen och valideringen av BTE med hög genomströmning utfördes med citrusprover från "verkliga livet/fältet", vilket visar att andra diagnostiska laboratorier lätt kan ta till sig tekniken och metodiken. Att använda denna teknik kommer att göra det möjligt att minska driftskostnaderna och öka den diagnostiska kapaciteten och laboratorieeffektiviteten, vilket ökar chanserna att identifiera sjuka träd i ett tidigare skede efter att infektionen har inträffat och minska risken för sjukdomsspridning. Jämförelsen sida vid sida av BTE jämfört med konventionella vävnadsbearbetningsmetoder visar att kvaliteten på extraherad nukleinsyra (dvs. koncentration, renhet och integritet) och resultaten av nedströms patogendetektion är jämförbara (figur 3A–C). Tiden som går åt till att bearbeta proverna minskar dock avsevärt med BTE jämfört med manuella bearbetningsprotokoll (dvs. 3,3 min jämfört med 6,8 min). Kamrarna och BTE-basen kräver ett regelbundet rengöringsschema. Även om rengöringen är tidskrävande och utgör en begränsning av metoden, gör tekniken det möjligt att snabbt bearbeta flera prover i BTE innan kammaren behöver rengöras. Konventionella metoder kräver mindre rengöring eftersom varje prov har sin egen processbehållare, som i många fall är engångsbehållare, men de behöver fler behållare och lagringsutrymme (t.ex. kylskåp med 4 °C och frysar med −20 °C eller −80 °C).

BTE-processen utformades och byggdes för att öka sannolikheten för att identifiera ett problemområde via bulkprovbearbetning och testning (dvs. att hitta ett sjukt träd i ett stort grundblock för citrusgroddar, plantskola eller fruktträdgård) genom att endast köra ett litet antal bulktester som kan identifiera hot spots. Därför avviker den bara när ett positivt resultat hittas. När detta sker (figur 4B, sats 1 och sats 5) krävs efterföljande provbearbetning och testning av enskilda prover från samma sats som innehåller det positiva materialet (dvs. endast en delmängd av proverna) för att avgöra vilka prover som är positiva. Det är därför viktigt att notera att detta förfarande i första hand är lämpligt för fall med låga infektionsfrekvenser, där det möjliggör testning av en stor mängd material från många träd, vilket i gengäld ökar sannolikheten för sjukdomsupptäckt utan att behöva testa ett stort antal enskilda prover. Konventionella metoder kommer att vara det optimala alternativet i fall med hög infektionsfrekvens, eftersom de gör det möjligt att testa varje prov individuellt. Detta är särskilt viktigt när det gäller HLB-undersökningar i Kalifornien20 (fortfarande med en låg HLB-positivitetsgrad), där de använda PCR-baserade metoderna för CLas-detektion främst är avsedda att bekräfta närvaron eller frånvaron av CLas i asymtomatiska träd (dvs. inga typiska fläckiga fläckar, gulnande krontak eller trädnedgång) som har exponerats för CLas-positiva asiatiska citruspsyllider (ACP). Med tanke på det faktum att vi inte vet var i trädet en infektiös ACP har ätit, är chanserna att identifiera ett infekterat men asymtomatiskt träd på fältet eller i något annat stort område eller verksamhet genom att testa ett litet antal prover mycket låga (t.ex. i Kalifornien samlas för närvarande 20 löv in och 12 löv testas per träd20). Ju större trädkronorna är, desto lägre är risken för CLas-upptäckt. Även om kostnaderna för själva PCR (dvs. reagenser, grundläggande laboratorieutrustning och termocykler), som följer på provbearbetningen, och nukleinsyraextraktionen och reningen fortsätter oförändrade i BTE-processen, kvarstår osäkerheten om var proverna ska samlas in från asymtomatiska träd för att avgöra om de är infekterade eller inte och, enligt vår mening, är HLB-undersökningens akilleshäl i Kalifornien. Det presenterade instrumentet, tekniken, metoden och förbättringarna kommer att möjliggöra bearbetning av större provstorlekar på kortare tid och till en lägre kostnad. Därför kommer denna metod att öka sannolikheten för att identifiera infekterade träd i tid och förbättra utrotningsinsatserna för HLB eller andra invasiva patogener av citrusfrukter i Kalifornien (t.ex. citrus yellow vein clearing virus som rapporterades i Kalifornien i augusti 2022).

I kombination med automatiserade metoder för bearbetning av vävnader skulle bulkprovtagning och testning göra det möjligt att minska kostnaderna för bearbetning av växtvävnad. Denna kostnadsminskning skulle göra det möjligt för många diagnostiska laboratorier att mer effektivt undersöka fruktträdgårdar i många stater och att bättre spåra förflyttningen av HLB och andra sjukdomar. I slutändan innebär detta att odlare skulle ha ett mer effektivt verktyg för att bromsa spridningen av sjukdomar genom effektivare storskaliga tester. Även om BTE-instrumentet kan förbättra citruslaboratoriernas nuvarande diagnostiska kapacitet och gynna hela citrusindustrin, kan tekniken samtidigt också överföras till andra trädgrödor. De preliminära uppgifterna om nukleinsyrakoncentration och renhet, som uppskattats av OD, har visat att BTE effektivt kan bearbeta vävnader från mandel (59,87 ng/μL ± 7,43 ng/μL och A260/A280 1,17 ± 0,05, n = 9), vinrankor (135,74 ng/μL ± 50,74 ng/μL och A260/A280 1,17 ± 0,06, n = 9) och persika (66,50 ng/μL ± 6,07 ng/μL och A260/A280 1,29 ± 0,05, n = 9) (prover vänligen tillhandahållna av Foundation Plant Services vid UC Davis).

Plattformen för bearbetning av mjukpapper från knoppved som presenteras här har inspirerat till utvecklingen av ytterligare utrustning för bearbetning av växtvävnad. Till exempel är en bladvävnadsextraktor (LTE) för närvarande under utveckling. Preliminära testresultat med citrusblad har visat att LTE-instrumentet kan bearbeta cirka sju gånger fler blad med endast en 35-procentig ökning av bearbetningstiden jämfört med den nuvarande standardmetoden med 12 blad som används i Kalifornien20. Vi har uppskattat att ett LTE-stött bulkprovtagnings- och testprotokoll skulle kunna minska den totala kostnaden per citrusbladstest med en fjärdedel. Forskning för att bevisa värdet av den praktiska tillämpningen av denna teknik pågår för närvarande inom ramen för ett CDFA Specialty Crop Block Grant i våra laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna redovisar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna erkänner Cahuilla-folket som de traditionella väktarna av det land där det experimentella arbetet slutfördes. Vi är tacksamma mot professor Norman Ellstrand vid University of California, Riverside, för att ha tillhandahållit labbutrymme för att genomföra forskningsaktiviteter för detta projekt inom ramen för UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ) Initiative. Denna forskning stöddes av CDFA - Specialty Crop Block Grant Program (anslag nr 18-0001-055-SC). Ytterligare stöd tillhandahölls också av CRB-projektet 6100; USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch-projektet 1020106; och National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Health Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, & AP20PPQS&T00C049) tilldelas Georgios Vidalakis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.08" Hex Trimmer line PowerCare FPRO07065 Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor California Air Tools 8010 Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube Globe Scientific 111558B Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set Technology Evolving Solutions TE006-F1-10A-G1000-E1 Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach
12" Ruler Westcott ‎16012 To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite Hasa 1041 Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer Insignia NS-CZ70WH0 Store sample after processing
4" x 12" plastic bags Plymor FP20-4x12-10 Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab Puritan 806-PCL Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote HDX 206152 Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun JASTIND ‎JTABG103A Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie Sharpie  S-19421 Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor Brand Z627569 Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber Technology Evolving Solutions TE002BB-A05-E1 Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap Dawn 57445CT Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter Air Science P5-36XT-A Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container PolarTech 261/J50C Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat Red Kap KP14WH LN 46 Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop Microsoft Surface Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone Samsung Galaxy S9 Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag Technology Evolving Solutions TE005-Clip-E1 Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag Technology Evolving Solutions TE005-Collar-E1 Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves Usa Scientific 3915-4400 Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff 3M 90565-4DC-PS Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose FYPower ‎510019 Attaches air gun to compressor
Saftey glasses Solidwork SW8329-US Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle JohnBee B08QM81BJV Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base Technology Evolving Solutions TE001-A-E1 System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale Technology Evolving Solutions TE003-A05-200g-01-E1 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield 
Vermiculite EasyGoProducts B07WQDZGRP Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter Boenfu ‎BOWC-06002-US Wire cutters to cut trimmer line

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
  2. Vernière, C., et al. Citrus viroids: Symptom expression and effect on vegetative growth and yield of clementine trees grafted on trifoliate orange. Plant Disease. 88 (11), 1189-1197 (2004).
  3. Zhou, C., et al. Chapter 19 - Citrus viruses and viroids. The Genus Citrus. Talon, M., Caruso, M., Gmitter, F. G. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 391-410 (2020).
  4. Luckstead, J., Devadoss, S. Trends and issues facing the U.S. citrus industry. Choices Magazine Online. 36 (2), Available from: https://www.choicesmagazine.org/choices-magazine/theme-articles/trends-and-challenges-in-fruit-and-tree-nut-sectors/trends-and-issues-facing-the-us-citrus-industry (2021).
  5. Simnitt, S., Calvin, L. Fruit and Tree Nuts Outlook. United States Department of Agriculture-Economic Research Service. , Available from: https://www.ers.usda.gov/webdocs/outlooks/98171/fts-370.pdf?v=5697 (2020).
  6. Forsyth, J., Fruits Damiani, J. C. itrus Citrus Fruits. Types on the market. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. , Academic Press. Cambridge, MA. 1329-1335 (2003).
  7. Bostock, R. M., Thomas, C. S., Hoenisch, R. W., Golino, D. A., Vidalakis, G. Plant health: How diagnostic networks and interagency partnerships protect plant systems from pests and pathogens. California Agriculture. 68 (4), 117-124 (2014).
  8. Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).
  9. Wang, J., et al. Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale. Frontiers in Microbiology. 4, 366 (2013).
  10. Gergerich, R. C., et al. Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization. Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).
  11. Moreno, P., Ambrós, S., Albiach-Martí, M. R., Guerri, J., Peña, L. Citrus tristeza virus: A pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology. 9 (2), 251-268 (2008).
  12. Yokomi, R. K., et al. Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California. Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).
  13. Selvaraj, V., Maheshwari, Y., Hajeri, S., Yokomi, R. A rapid detection tool for VT isolates of Citrus tristeza virus by immunocapture-reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay. PLoS One. 14 (9), 0222170 (2019).
  14. Babcock, B. A. Economic impact of California's citrus industry in 2020. Journal of Citrus Pathology. 9, (2022).
  15. Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).
  16. Yokomi, R., et al. Molecular and biological characterization of a novel mild strain of citrus tristeza virus in California. Archives of Virology. 163 (7), 1795-1804 (2018).
  17. Fuchs, M., et al. Economic studies reinforce efforts to safeguard specialty crops in the United States. Plant Disease. 105 (1), 14-26 (2021).
  18. Singerman, A. The real cost of HLB in Florida. Citrus Industry Magazine. , Available from: https://citrusindustry.net/2019/07/30/the-real-cost-of-hib-in-florida/ (2019).
  19. McRoberts, N., et al. Using models to provide rapid programme support for California's efforts to suppress Huanglongbing disease of citrus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1776), 20180281 (2019).
  20. Albrecht, C., et al. Action plan for Asian citrus psyllid and huanglongbing (citrus greening) in California. Journal of Citrus Pathology. 7 (1), (2020).
  21. Navarro, L., et al. The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the period 1975-2001. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15 (15), (2002).
  22. Vidalakis, G., Gumpf, D. J., Polek, M. L., Bash, J. A. The California Citrus Clonal Protection Program. Citrus Production Manual. Ferguson, L., Grafton-Cardwell, E. E. , University of California, Agriculture and Natural Resources. Oakland, California. 117-130 (2014).
  23. Dang, T., et al. High-throughput RNA extraction from citrus tissues for the detection of viroids. In Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  24. Osman, F., Vidalakis, G. Real-time detection of viroids using singleplex and multiplex quantitative polymerase chain reaction. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  25. Li, R., et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Saponari, M., Manjunath, K., Yokomi, R. K. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 147 (1), 43-53 (2008).
  27. Damaj, M. B., et al. Reproducible RNA preparation from sugarcane and citrus for functional genomic applications. International Journal of Plant Genomics. 2009, 765367 (2009).
  28. Dang, T., et al. First report of citrus leaf blotch virus infecting Bearss lime tree in California. Plant Disease. 104 (11), 3088 (2020).
  29. Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques. 20 (6), 968-970 (1996).
  30. Teare, J. M., et al. Measurement of nucleic acid concentrations using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques. 22 (6), 1170-1174 (1997).
  31. Imbeaud, S. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 56-56 (2005).
  32. Menzel, W., Jelkmann, W., Maiss, E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods. 99 (1-2), 81-92 (2002).
  33. Vidalakis, G., et al. SYBR Green RT-qPCR for the universal detection of citrus viroids. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. , Humana. New York, NY. 211-217 (2022).
  34. Arredondo Valdés, R., et al. A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus. Canadian Journal of Microbiology. 62 (10), 803-811 (2016).
  35. Li, S., Wu, F., Duan, Y., Singerman, A., Guan, Z. Citrus greening: Management strategies and their economic impact. HortScience. 55 (5), 604-612 (2020).
  36. CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes. , Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019).

Tags

Bioteknik utgåva 194 Extraktion av Budwoodvävnad handhackning "Candidatus Liberibacter asiaticus" CLas huanglongbing HLB Citrus tristeza-virus CTV

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

to:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

Automatisering av bearbetning av citrusknoppved för nedströms patogendetektering genom instrumentteknik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E.,… More

Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E., Uribe, G., De Francesco, A., Milton, R., De La Torre, A., Mounkam, A., Dang, T., Bodaghi, S., Lavagi-Craddock, I., Syed, A., Grover, W., Okamba, A., Vidalakis, G. Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. J. Vis. Exp. (194), e65159, doi:10.3791/65159 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter