ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
我们设计、制造并验证了一种快速处理富含韧皮部的树皮柑橘接穗组织的仪器。与现有方法相比，接穗组织提取器（BTE）提高了样品通量，并降低了所需的劳动力和设备成本。
Abstract
移植传播、韧皮部限制的柑橘病原体，如病毒、类病毒和细菌，是造成全球毁灭性流行病和严重经济损失的原因。例如，柑橘tristeza病毒杀死了全球超过1亿棵柑橘树，而“念珠菌亚洲自由杆菌”使佛罗里达州损失了90亿美元。使用经过病原体测试的柑橘接穗进行树木繁殖是管理此类病原体的关键。加州大学河滨分校的柑橘克隆保护计划 （CCPP） 使用聚合酶链反应 （PCR） 测定每年测试来自柑橘接穗树的数千个样品，以保护加州的柑橘并为国家清洁植物网络提供清洁繁殖装置。柑橘病毒和类病毒的高通量分子检测的一个严重瓶颈是植物组织处理步骤。
正确的组织制备对于提取优质核酸和PCR测定的下游使用至关重要。植物组织在低温下切碎、称重、冷冻干燥、研磨和离心以避免核酸降解是时间和劳动密集型的，需要昂贵且专业的实验室设备。本文介绍了一种专门用于快速处理柑橘接穗木富含韧皮部的树皮组织的仪器的验证，称为接穗组织提取器 （BTE）。与现有方法相比，BTE 可将样品通量提高 100%。此外，它还减少了劳动力和设备成本。在这项工作中，BTE样品的DNA产量（80.25 ng / μL）与CCPP的手工切碎方案（77.84 ng / μL）相当。该仪器和快速植物组织处理方案可以使加利福尼亚州的几个柑橘诊断实验室和项目受益，并成为全球其他木本多年生作物组织处理的模型系统。
Introduction
柑橘的嫁接传播限制韧皮部病原体，如类病毒、病毒和细菌，在世界每个柑橘产区都造成了毁灭性的流行病和严重的经济损失。柑橘类病毒限制了生产因素，因为它们在经济上重要的柑橘类型中引起外皮质炎和恶病质疾病，例如三叶、三叶杂交种、柑橘、柑橘和橘子 1,2,3。在加利福尼亚州，这些对类病毒敏感的柑橘类型是“易去皮者”市场增长和盈利的基础，跟随消费者对易于去皮、分段和无籽水果的偏好变化趋势4,5,6。因此，柑橘类病毒受到加州食品和农业部（CDFA）“柑橘苗圃害虫清洁计划-参议院法案140”的监管，CDFA植物害虫诊断处的实验室每年进行数千次柑橘类病毒测试7,8,9,10.自 1930 年代全球流行病开始以来，柑橘 tristeza 病毒 （CTV） 已造成超过 1 亿棵柑橘树死亡 3,9,10,11。在加利福尼亚州，病毒的茎点蚀和三叶断裂抗性对价值 36 亿美元的加州柑橘产业构成严重威胁12,13,14。因此，CDFA将CTV归类为受管制的A类植物害虫，中加州Tristeza根除局（CCTEA）的实验室每年进行广泛的实地调查和数千次病毒测试15,16。据估计，细菌“亚洲念珠菌”（CLas）和黄龙冰病（HLB）对佛罗里达州造成了近90亿美元的经济损失，原因是柑橘种植面积减少了40%，柑橘业务减少了57%，并损失了近8,000个工作岗位17,18。在加利福尼亚州，假设HLB导致的柑橘种植面积减少20%，预计将导致8,200多个工作岗位流失，该州国内生产总值减少超过五亿美元。因此，柑橘病虫害预防计划每年花费超过 4000 万美元进行调查，以测试、检测和根除来自加利福尼亚州14、17、19、20 的 CLas。
管理柑橘类病毒、病毒和细菌的一个关键要素是使用经过病原体测试的繁殖材料（即接穗）进行树木生产。经过病原体测试的柑橘接穗是在采用先进病原体消除和检测技术的综合检疫计划中生产和维护的10,21。加州大学河滨分校的柑橘克隆保护计划 （CCPP） 每年测试来自新进口到该州和美国的柑橘品种以及柑橘接穗树的数千个接穗样品，以保护加州的柑橘并支持国家柑橘清洁植物网络的功能10,17,22.为了处理大量的柑橘检测，高通量、可靠且具有成本效益的病原体检测检测是CCPP 7,10,22等项目成功的基本组成部分。
虽然聚合酶链反应（PCR）等基于分子的病原体检测分析已显著提高植物诊断实验室的通量，但根据我们的经验，实施高通量方案的最关键瓶颈之一是植物组织样品处理步骤。对于柑橘来说尤其如此，因为目前可用于处理富含韧皮部的组织（如叶柄和接穗树皮）的方案是劳动密集型的，耗时的，并且需要昂贵且专业的实验室设备。这些方案需要在低温下手工切碎、称重、冷冻干燥、研磨和离心，以避免核酸降解8,23,24。例如，在CCPP诊断实验室，样品处理包括（i）手工切碎（6-9个样品/小时/操作员），（ii）冷冻干燥（16-24小时），（iii）粉碎（30-60秒）和（iv）离心（1-2小时）。该过程还需要专门的用品（例如，重型安全锁定管，不锈钢研磨球，适配器，刀片，手套）和多件昂贵的实验室设备（例如，超低温冰箱，冷冻干燥机，组织粉碎机，液氮低温，冷冻离心机）。
与任何行业一样，设备工程和流程自动化是降低成本、提高产量以及提供高质量、统一的产品和服务的关键。柑橘行业需要低成本的组织处理仪器，这些仪器需要最少的操作技能，因此易于转移到诊断实验室和现场操作，以实现快速下游病原体检测的高样品处理能力。技术演进解决方案（TES）和CCPP开发（即设计和制造）并验证（即用柑橘样品进行测试并与标准实验室程序进行比较）一种低成本（即消除了对专业实验室设备的需求）仪器，用于快速处理富含韧皮部的柑橘组织（即接穗），称为接穗组织提取器（BTE）。 如图1所示，BTE包括一个用于电源和控制的基本组件，以及一个用于处理柑橘接穗木的可拆卸腔室。BTE腔室由一个砂轮组成，专门设计用于从柑橘接穗中剥离富含韧皮部的树皮组织。切碎的树皮组织通过滑动端口快速喷射到含有提取缓冲液的注射器中，过滤，并准备好进行核酸提取和纯化，无需任何额外的处理或制备（图1）。BTE系统还包括无纸化样品跟踪应用程序和集成称重应用程序，可将样品处理信息实时记录在在线数据库中。
BTE系统将CCPP的实验室诊断能力提高了100%以上，并始终如一地生产出适合纯化高质量核酸和使用PCR测定法检测柑橘移植传播病原体的柑橘组织提取物。更具体地说，BTE将组织处理时间从每个样品的24小时减少到~3分钟，取代了成本超过60,000美元的实验室仪器（图2，步骤2-4），并允许处理更大的样品量。
本文介绍了BTE高通量柑橘树皮组织处理、核酸提取和病原体检测验证数据，包括分别来自CCPP Rubidoux检疫设施和Lindcove基金会设施的所有适当的阳性和阴性对照。我们还介绍了与当前实验室程序相比的吞吐量和处理时间变化（图2）。此外，这项工作为柑橘病原体检测实验室提供了详细的分步协议，并展示了BTE如何支持病原体清洁苗圃，调查和根除计划的功能。
图 1：接穗组织提取器。 BTE包括一个用于电源和控制的基本组件，以及一个用于加工柑橘接穗木的可拆卸室。BTE腔室由一个砂轮组成，专门设计用于从柑橘接穗中剥离富含韧皮部的树皮组织。切碎的树皮组织通过滑口快速喷射到注射器中，过滤，并准备好进行核酸提取和纯化，无需任何额外的处理或准备。缩写：BTE = 接穗组织提取器。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：传统手工切碎实验室程序与 BTE 处理之间的分步比较。 BTE 处理涉及高通量柑橘树皮组织处理、核酸提取和病原体检测。每个步骤的时间在括号中表示。 请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 收集柑橘接穗样品进行运输
- 向技术演进解决方案发送树信息电子表格，以便他们加载到他们的 Web 服务器中（最终，用户将创建新树）。
- 使用手机应用程序 TES 跟踪器 选择一棵树，并将近场通信 （NFC） 项圈标签握在手机上，以将树信息加载到标签中。
- 将三到四个柑橘接穗样品插入兼容 BTE 的塑料袋托架中，并盖上盖子。
- 确保接穗的长度不超过 8 英寸且不小于 5 英寸。
- 如果长度大于 8 英寸，请使用无菌一次性剃须刀片或用 10% 漂白剂溶液（1% 次氯酸钠）净化的修剪剪使其更短。
- 如果长度小于 5 英寸，请收集不同的接穗样品放入袋中。
- 确保用手或使用 10% 漂白消毒的切割工具（1% 次氯酸钠）去除任何腋窝生长或大刺。
注意：此步骤很重要，以便接穗在腔室开口时更容易操纵。 - 确保没有具有弯曲特征的接穗样品。如果是这样，请使用 10% 漂白消毒的切割工具（1% 次氯酸钠）将其去除，并仅将样品的直部分放入 BTE 袋中。
注意：弯曲的接穗很难操纵到仪器中，导致树皮条纹不均匀。
- 确保接穗的长度不超过 8 英寸且不小于 5 英寸。
- 使用手机应用程序 TES跟踪器 扫描树的NFC项圈标签，并将其与样品袋上的NFC夹标签链接。
- 注意接穗的厚度，因为这决定了操作员如何在 BTE 腔内剥离富含韧皮部的接穗树皮。
- 如果接穗的厚度低于 0.20 英寸，则剥离接穗时要小心，因为腔室中的高速纺线会将整个接穗粉碎到其核心，超出树皮层并进入富含韧皮部的木材和髓组织。
- 选择较厚的接穗，因为更容易剥离树皮组织，同时避免富含韧皮部的接穗组织。
- 将样品放入带有几个冰袋的绝缘运输容器中。
2. 设置在通风橱中
注意：最好在通风橱内操作BTE。这将降低植物组织交叉污染和实验室污染的风险。
- 使用10%（1%次氯酸钠）喷雾瓶消毒。
- 喷洒罩子表面，让漂白剂静置约 1 分钟，然后用纸巾擦拭。
- 用漂白剂溶液喷洒纸巾。擦拭 TE 底座、体重秤组件（秤、空气防护罩和塔）和记号笔。
- 打开用于处理样品数量的注射器组，并将它们放在有盖的纸板箱中。
- 在引擎盖外准备一包拭子，以备不时之需。
- 准备体重秤。
- 从秤上取下配重塔，然后按住电源按钮将其打开。在刻度显示 0 后，将塔放在刻度的中心。
- 将体重秤空气防护罩滑过秤的前部。
- 通过翻转背面的开关来准备组织提取器底座。确保按下盒子左侧的开关顶部。等待闪烁的绿色 LED，表示腔室已准备就绪。
3. 设置清洁站（补充图S1）。
- 将1升水放入超声波清洗机中。
- 将两个垃圾袋包裹在超声波清洗机的顶部。
- 将~5升10%漂白剂（1%次氯酸钠溶液）倒入超声波清洗机中。
- 在水桶中装满足够的水以淹没房间。
- 打开空压机，打开阀门。
- 设置一个背景，以便在腔室干燥时捕获液体。
4. 柑橘接穗树皮剥离用BTE材料加工
- 将腔室装载到BTE底座上。
- 准备BTE室。
- 将一个空样品袋连接到腔室的背面。使用两个 O 形圈将空袋固定到 BTE 室的后喷嘴上。
- 检查刀片是否有磨损或损坏的迹象，例如刀片上形成的切口，然后继续进入塑料或尖端形成切口。确保刀片上的箭头与单个锁定符号对齐。
- 确保腔室底部的空气释放转向 O 符号。将透明盖子放在腔室开口上，然后使用腔室右侧的轨道将透明BTE滑轨滑到腔室上。将腔室底部的锁推入滑块。确保柱塞盖安装在滑块顶部。
- 将腔室放在 BTE 底座上，BTE 底座的喷嘴突出到腔室的背面。等待蓝色 LED 闪烁，表示放置成功。
- 准备BTE室。
- 通过将 NFC 剪辑标签上的白色贴纸移动到盒子右侧的 Z 轴上，将样品加载到 BTE 底座上。在 Z 轴上以缓慢的圆周运动移动标签，直到黄灯开始闪烁。将样品连接到BTE底座上，并确保样品袋上没有孔;如果有孔，请用胶带修补。将 O 形圈放在样品袋上，将其固定在 BTE 喷嘴的前面。
- 装入未使用的注射器组。
- 去皮注射器组。将未使用的注射器装置放在秤塔上。当红灯开始闪烁或刻度显示0时，取出注射器组。
- 用过滤器从注射器中取出柱塞。确保液体在底部（非过滤器）注射器中。将柱塞放在纸巾上或黑色柱塞不接触任何表面的塔上。
- 通过将出口口按入注射器并旋转 90°，将注射器连接到滑动出口端口。
- 处理接穗样品。
注意：BTE具有高速运动部件。所有操作都需要在通风橱内进行。所有用户都应使用防护眼镜、耳罩（耳塞）和所有其他个人防护设备 （PPE），例如手套和实验室外套。- 按顶部的黑色按钮启动机器。在处理过程中随时按第二次以停止电机。
注意：盒子具有速度和温度感应功能，以确保其正常工作。 - 从袋子里拿一根接穗棒，然后把它穿过BTE喷嘴的 顶部 。
- 用另一只手抓住腔室另一侧的接穗棒，慢慢地向下插入刀片。聆听轻微的嗡嗡声，表明接穗正在剥去树皮。在旋转接穗的同时慢慢来回移动接穗。
- 如果听到响亮的剧烈切碎声，请快速将树枝移动到顶部和/或按顶部按钮停止电机。要停止电机，请使用右侧开关完成处理（见步骤4.4.3.2）。
- 如果在切割时没有材料从出口出来，则腔室有堵塞。关闭电机，取下滑动柱塞盖，然后使用棉签的塑料将堵塞物推出机器出口。使用右侧开关完成加工：向上 = 正向切割;中间 = 电机关闭;向下 = 反向切割。
- 对其余分支重复步骤 4.4.2 和步骤 4.4.3。
注意：当注射器的25%已充满植物组织时，已剥离足够接穗树皮的一般指标。柑橘的嫁接传播病原体可能在树中分布不均匀。因此，从柑橘树冠周围收集了三到四个接穗样品。BTE手提袋中的每个接穗样品都必须有助于最终的研磨组织样品，以确保对具有代表性的完整树木样品进行病原体检测。 - 按顶部的黑色按钮停止处理。等待指示灯再次开始闪烁黄色。
- 按顶部的黑色按钮启动机器。在处理过程中随时按第二次以停止电机。
- 验证样品重量。
- 将注射器旋转90°，然后将其向下拉以分离。将柱塞放回注射器上，然后将注射器放在塔上。
- 等待秤自动检测样品，并确定其是否在适当的重量范围内（0.25 ± 0.05 g）。如果样品重量太低（<0.20 g），重复步骤4.4;红色 LED 将开始闪烁。如果样品重量过高（>0.30 g），请去除一些样品材料;黄色 LED 将开始更慢地闪烁。如果样品在该范围内，绿色 LED 将开始闪烁。
- 均质化接穗样品
- 从装有样品的注射器中取出柱塞，将液体与样品一起推入注射器中，然后重新添加柱塞。柱塞将缓冲液和植物汁液推过网状过滤器（保留任何大的树皮组织碎片），并通过橡胶管 进入 空注射器。
- 通过将缓冲液和植物汁液从一个注射器来回推到另一个注射器来混合样品。重复~3x-4x，直到样品变成均匀的绿色液体混合物。
- 一旦充分均质化，将植物汁液样品推入没有网状过滤器的注射器中，并将橡胶管和带有过滤器的注射器与带有样品的注射器分离。
- 将植物汁液样品从注射器中排出到2mL无菌微量离心管中，并储存在-20°C直至进一步使用。使用永久性记号笔在样品上贴上袋号标签。
注意：步骤4.6.5中的植物样品汁液现在可以使用任何可用的核酸，RNA或DNA，基于苯酚 - 氯仿，硅胶柱或磁珠9,25,26,27的提取方法进行处理，用于核酸提取和纯化（见步骤7）和下游检测柑橘的移植传播病原体（见步骤8）。
5. 对 BTE 可拆卸腔室进行消毒
注意：如果注射器组中的缓冲液进入腔室或载玻片，请在清洁前冲洗并遵循实验室的所有安全规则。注射器组含有硫氰酸胍。如果注射器组中的缓冲液与漂白剂接触，则会产生氰化物气体。
- 在腔室中处理第 10 个样品后，执行以下步骤。请注意，绿色 LED 将继续闪烁，而不是变为蓝色闪烁。
- 拆卸BTE室以清洁所有可能的污染物;取下透明塑料盖，清除腔室滑块，并清除腔室载玻片上的堵塞端口。
- 将腔室底部的空气释放阀转到打开位置（打开挂锁标记）。将腔室组件放入设置的超声波清洗器中（参见步骤3.1）。将盖子放在腔室下方以防止其漂浮。运行超声波清洗机15分钟。
注意：超声波清洗槽（5 L）最多可容纳两个腔室。 - 在水浴（步骤3.4）中冲洗腔室组件至少30秒。将腔室组件移至干燥站。
注意：干燥会导致腔室内部件快速移动、噪音大（~85 分贝 [dB]）和可能的飞溅。所有用户都应使用防护眼镜、耳罩（耳塞）、实验室外套和操作实验室安全规则要求的所有其他个人防护装备。 - 干燥BTE室。
- 将气枪与腔室上部开口的凹槽（滑块通常位于的位置）对齐。按下喷枪的扳机分配空气~30秒。
注：确保开口远离用户朝向背景。这应该旋转刀片组以去除捕获在其下方的液体。 - 将气枪朝向腔室的顶部喷嘴。按下气枪的扳机，慢慢地描摹每个喷嘴入口的三个完整圆圈。
- 将气枪放置在BTE的中心。从最内侧开始，按住扳机，然后移动直到气枪指向滑块的位置。
- 快速将空气流过整个腔室，前后，以去除外部的地表水。
- 将气枪与腔室上部开口的凹槽（滑块通常位于的位置）对齐。按下喷枪的扳机分配空气~30秒。
- 干燥BTE载玻片。
- 将气枪放入滑块的柱塞槽中，然后按下扳机将水从滑块出口中排出。
- 沿着载玻片的内表面运行气枪以使其干燥。
- 沿着滑动槽运行气枪以推出水。
- 快速将空气流过整个外部，以去除地表水。
- 干燥组件。
- 握住滑动柱塞盖和 O 形圈，然后按下扳机。
- 将气枪放在盖子的内表面上。
- 将组件放入腔室并滑动以继续干燥或重新组装它们。
注意：对于具有多个功能性BTE的高组织处理环境，可以提供能够同时对10个腔室进行净化的批量消毒系统。
6. 处理和消毒
- 将注射器和橡胶管丢弃在指定的胍废物容器中。
- 将任何植物材料丢弃在生物危害废物容器中。
- 从 BTE 底座上拆下 BTE 室。
- 拆卸BTE室并进行净化，如步骤5中所述。
7. 评估从BTE柑橘接穗提取物中纯化的RNA的组织处理和质量
注意：在该协议中，我们使用来自255棵柑橘树的接穗木样品来比较柑橘接穗组织加工所需的时间以及从BTE制备的树皮组织提取物中纯化的RNA的质量（图2，右侧，步骤1，步骤5和步骤6）与在法规批准的柑橘接穗组织处理方法之后制备的RNA，使用手工去皮和切碎， 树皮组织的冷冻干燥，粉碎和离心，如Dang等人23 所述（图2，左侧，步骤1-6）。
- 目前的实验室程序：根据法规批准的方法23制备用于组织处理的接穗样品。
- 如Dang等人23 所述，对树皮组织进行手工剥皮和切碎，冷冻干燥，粉碎，离心并将植物汁液转移到RNA提取管中（图2，左侧，步骤1-6）。
- 从每棵被测树上手工剥出三到四个接穗样品后，将所有接穗放入与BTE兼容的塑料袋载体中，并储存在4°C直至BTE处理（步骤7.2）。
- BTE程序：启动BTE柑橘接穗组织加工（第4节，步骤4.1-4.6; 图 2，右侧，步骤 1、步骤 5 和步骤 6）。
- 使用步骤7.1.2中储存在BTE手提袋内的接穗样品。
- 使用监管批准的基于磁珠的半自动磁珠方法8,23,28从当前实验室程序（步骤7.1.1）和BTE程序（步骤7.2.2）获得的植物汁液中提取和纯化RNA。
- 通过测量其浓度、纯度和完整性来评估 RNA 质量 8,23,24,29,3 3,31。
- 要计算浓度，请使用分光光度法和波长为260nm的光密度（OD）。
- 要评估纯度，请使用260/280的分光光度OD比。
- 要检查完整性，请使用靶向 NADH 脱氢酶柑橘基因24,32 的 mRNA 的逆转录 （RT） 定量聚合酶链反应 （qPCR） 反应。
8. 使用从BTE柑橘接穗提取物中纯化的RNA评估柑橘病毒和类病毒的交叉污染和检测
注意：在该协议中，我们使用来自72棵未感染的柑橘树和一棵混合感染病毒和类病毒的树的接穗样品来评估BTE处理时样品之间交叉污染的可能性（图2，右侧，步骤1，步骤5和步骤6）以及从BTE制备的树皮组织提取物中纯化的RNA的适用性，可用作柑橘病毒和类病毒RT-qPCR检测的模板。
- 第一次BTE样本处理：对72个未感染的样本进行基线实验。
- 准备三个 （A-C） BTE 室（步骤 4.1.1）。
- 在BTE手提袋中制备所有未感染的柑橘接穗样品（1-72），并在双注射器BTE样品收集系统中制备相同数量的（72），每个样品有一个注射器系统（步骤2.4）。
- 将样品袋和样品收集注射器分成六批 （I-VI），每批 12 个样品。
- 按照下面的顺序（步骤8.1.4.1-8.1.4.6）开始BTE柑橘接穗组织处理（步骤4）（见 表1，第一次BTE样品处理）。
- 对于批次 I/样品 1-12，使用腔室 A 处理 12 个样品.在样品 12 之后对腔室 A 进行消毒（步骤 5）。
- 对于批次II/样品13-24，使用腔室B处理12个样品，在样品24（步骤5）后对腔室B进行消毒。
- 对于批次 III/样品 25-36，使用腔室 C 处理 12 个样品，在样品 36 后对腔室 C 进行消毒（步骤 5）。
- 对于批次IV/样品37-48，使用消毒室A处理12个样品（步骤8.1.4.1）。
- 对于批次 V/样品 49--60，使用消毒室 B 处理 12 个样品（步骤 8.1.4.2）。
- 对于批次VI/样品60-72，使用消毒室C处理12个样品（步骤8.1.4.3）。
- 将装有所有样品的BTE手提袋储存在4°C，直到在步骤8.2中使用。
- 使用监管批准的基于磁珠的半自动方法8,23,28从步骤8.1.4.1-8.1.4.6中生成的72个植物汁液样品中提取和纯化RNA。
- 执行RT-qPCR以检测柑橘病毒和类病毒，如前所述8,33。
- 对于第二次BTE样品处理，对70个未感染样品和两个混合感染样品进行交叉污染实验。
- 准备三个 （A-C） BTE 室（步骤 4.1.1）。
- 将混合感染的柑橘接穗样品（73）准备在两个BTE手提袋（步骤1.3）中，总共有两个感染的样品。
- 收集装有步骤8.1.5中未感染的柑橘接穗样品的BTE手提袋，除了样品3-批次I和样品51-批次V（见步骤8.2.4中的样品更换），总共有70个未感染的样品。
- 包括第一个BTE手提袋，其中混合感染的样品73代替批次I中的样品3，第二个载体袋代替批次V中的样品51，总共72个样品。
- 在双注射器BTE样品收集系统中制备相同数量（72），每个样品有一个双注射器系统（步骤2.4）。
- 将 72 个样品载体袋和样品收集注射器分成六批 （I-VI），每批 12 个样品。
- 按照与步骤8.1.4.1-8.1.4.6相同的顺序启动BTE柑橘接穗组织加工（步骤4）。
注意：唯一的区别是用受感染的样品73替换批次I中的样品3和批次V中的样品51（步骤8.2.4）（表1，第二次BTE样品处理）。 - 如步骤8.1.6所示，从步骤8.2.7中生成的72种植物汁液样品中提取并纯化RNA。
- 执行RT-qPCR以检测柑橘病毒和类病毒，如步骤8.1.7所示。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
使用 BTE 加工的接穗柑橘组织进行 RNA 提取、纯化和质量，并评估组织处理时间
我们使用来自255棵代表性柑橘树的接穗样品进行此测试，以比较BTE与标准程序的RNA质量。样品由接穗组织提取器（BTE）（方案步骤4.1-4.6和图2，右侧，步骤1，步骤5和步骤6）处理或按照法规批准的柑橘接穗组织处理方法制备，该方法利用手工去皮和切碎，冷冻干燥，粉碎和树皮组织的离心，如Dang等人所述23（图2， 左侧，步骤 1-6）。
BTE与传统的柑橘组织处理手工切碎和实验室设备方案的并排比较表明，提取的核酸的质量（即浓度，纯度和完整性）（图3A-C）和下游用于柑橘病原体PCR检测的适用性（数据未显示）具有可比性。同时，使用 TE/BTE 系统显著缩短了处理样品所花费的时间。BTE 将 CCPP 实验室的样品通量提高了一倍以上，消除了对数万美元仪器（如珠打浆机、离心机和低温设备）的需求，从而降低了劳动力和实验室设备成本。
用BTE提取的核酸平均浓度为76.96 ng/μL±26.23 ng/μL（n = 181），纯度高，蛋白质污染低（A260/A280 2.27 ± 0.17，n = 181）（图3B，C）。这些值与CCPP标准手动实验方案产生的核酸相当（浓度：82.25 ng/μL ± 33.95 ng/μL，n = 181和A260/A280 2.22 ± 0.10，n = 181）（图3B，C）。BTE（Cq 20.97 ± 2.26，n = 181）和标准手动CCPP方案（Cq 19.25±1.53，n = 181）的核酸完整性（柑橘基因nad5的RT-qPCR）非常相似（图3A）。结果还表明，与传统方法相比，BTE仪器可以在同一时间范围内处理更大的样品量。传统的实验室程序需要~7-10分钟用于每个样品的手工切碎，总共需要12分钟的组织处理（冷冻干燥，研磨和离心），而BTE可以在~3分钟内处理柑橘组织以进行核酸提取每个样品。
图 3：181 种代表性柑橘接穗样品的核酸提取物质量，由浓度、纯度和完整性定义。 样品通过BTE和传统的手工切碎和实验室设备协议进行处理。（A）使用260nm处的吸光度测定核酸浓度;（B）纯度测定为260nm和280nm处的吸光度之比（A260/280）。（C）通过靶向NADH脱氢酶（Nad5）柑橘基因mRNA的RT-qPCR分析核酸完整性。最佳值的范围在红色虚线圆圈之间表示。 请点击此处查看此图的大图。
检测柑橘的移植传播病原体，评估交叉污染，并使用从BTE柑橘接穗提取物中纯化的RNA检测柑橘病毒和类病毒
通过与所有健康样品并排处理72个健康柑橘接穗样品，并引入来自感染病毒和类病毒的树木混合物中的两个样品来评估组织处理方法的有效性（表1和图4A，B）。从两个批次中提取的核酸均采用常规的基于实验室的q-PCR，如前所述8,33。来自第一次BTE样品处理的72个健康样品中没有一个给出测试的柑橘病原体（即假阳性）的扩增曲线（图4A）。结果表明，与使用手工切碎方法的标准实验室方案相比，BTE可以同样很好地处理柑橘组织。在第二次 BTE 样品处理中，我们评估了 BTE 头之间和用相同 BTE 头处理的样品内交叉污染的可能性（步骤 1-6）以及核酸对下游应用的适用性（即，用作柑橘病毒和类病毒的 RT-qPCR 检测模板）。在用两个引入的混合感染样品进行的第二次BTE样品处理中，成功使用BTE方案产生的核酸检测不同的柑橘病毒和类病毒（例如，三重病毒，柑橘叶斑病毒[CLBV]，柑橘银屑病病毒[CPsV]，柑橘Tristeza病毒[CTV]），apscaviroids（柑橘弯曲叶类病毒[CBLVd]，柑橘矮化类病毒[CDVd]，柑橘类病毒V [CVd-V]， 第1批和第5批中的柑橘类病毒VI [CVd-VI]和柑橘类病毒VII [CVd-VII]），非类顶点类病毒跳特技类病毒（HSVd;hostuviroid），柑橘树皮裂解类病毒（CBCVd;cocadviroid）和柑橘外皮质皮质类病毒（CEVd;负质类）。在第1批和第5批中，继感染者之后的样本对上述植物病害呈阳性，但Cq值增加。然而，没有检测到头部之间的交叉污染，也没有任何假阳性或假阴性结果（图4B）。
| 批 | 样本 | 贝特 | 第一个 BTE | 第二届 BTE |
| 室 | 来样加工 | 来样加工 | ||
| 我 | 12-1月 | 一个 | 1-12 未感染 | 1-2 & 4-12 未感染 |
| 样品 #3 替换为感染的混合物 | ||||
| 第二 | 13-24 | B | 13-24 | 13-24 |
| 未感染 | 未感染 | |||
| 第三 | 25-36 | C | 25-36 | 25-36 |
| 未感染 | 未感染 | |||
| 四 | 37-48 | A-消毒 | 37-48 | 37-48 |
| 未感染 | 未感染 | |||
| V | 49-60 | B-消毒 | 49-60 | 49-50 和 52-60 未感染 |
| 未感染 | ||||
| 样品 #51 替换为感染的混合物 | ||||
| 六 | 61-72 | C-消毒 | 61-72 未感染 | 61-72 未感染 |
表 1：使用 72 个柑橘接穗样品验证 BTE 组织处理方法所遵循的流程。 每个处理重复两次。有6批，每批12个样品。在第一次样品处理中，所有72个柑橘接穗样品均健康。在第二次BTE样品处理中，样品3和样品51被来自第1批和第5批中感染病毒和类病毒的树混合物中的两个样品替换。
图 4：使用 72 个柑橘接穗样品验证 BTE 组织处理方法。 每个处理重复两次。有6批，每批12个样品。（A）所有72个柑橘接穗样本均健康。（B）相同的72个柑橘接穗样品，在第1批（样品3）和第5批（样品51）中引入感染病毒和类病毒的树木混合物中的两个样品。NTC和水对照的Cq值均未确定（即样品中不存在DNA靶标）。三重组（CLBV、CPsV、CTV）的阳性对照的Cq值分别为23.9、25.2和22.4。类腹膜病毒（CBLVd、CDVd和CBCVd）的阳性对照组的Cq值分别为23.39、21.27和25.17。非顶点病毒类药物（CEVd、HSVd、IV）的阳性对照组的Cq值分别为26.9、27.0和26.5。缩写：BTE = 接穗组织提取器;NTC = 无模板控件。 请点击此处查看此图的大图。
补充图S1：清洁站设置。 在腔室中处理第 10 个样品后，应遵循协议步骤 3.1-3.6 来准备清洁站以对腔室进行消毒。如协议步骤3.1所示，将1升水放入超声波清洗机中。将两个垃圾袋包裹在超声波清洗机的顶部（方案步骤3.2），并将~5升10%漂白剂（1%次氯酸钠溶液）倒入超声波清洗机（方案步骤3.3）。水桶装满足够的水来淹没腔室（协议步骤3.4），关闭空气压缩机，打开阀门（协议步骤3.5）。设置一个背景以在腔室干燥时捕获液体（协议步骤3.6）。 请点击此处下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
随着HLB柑橘病的出现，为了减少损失，柑橘行业、监管机构和诊断实验室被敦促依靠高通量核酸提取方法与低通量手动样品处理和病原体检测分析相结合，如qPCR34 ，结合疾病管理实践35对单个树木进行测试35.加州的HLB阳性率从2012年的0.01%上升到2020年的1.2%。尽管qPCR是一种强大而可靠的病原体检测工具，但目前可用的技术不允许对足够数量的植物组织进行采样和处理，导致加利福尼亚州柑橘树中CLas的明显欠采样和测试不足。采样不足和测试不足与测试树木数量和每棵正在处理的树木的植物材料数量（即叶子数量）有关，并且由于受感染的叶子在树冠内的零星分布，因此很有可能错过早期或轻度感染。由于成本（例如劳动力和设备），目前的采样和CLas测试方法无法随着需求的增加而扩展。目前，加利福尼亚州大多数柑橘诊断实验室用于获取适合柑橘病原体检测的核酸的样品处理方法需要17小时以上的手动样品处理和成本超过10万美元的专用用品和设备。
在这里，我们介绍了一种专门用于快速处理柑橘接穗树皮组织的仪器的验证，称为接穗木组织提取器（BTE），以及柑橘诊断实验室样品处理的详细分步方案。该研究的重点是开发一种创新的组织处理方法，以取代目前劳动密集型的手工切穗接穗样品，并构建最高通量和最具成本效益的柑橘接穗加工仪器。结果表明，BTE提高了样品通量，降低了CCPP诊断实验室使用的设备和耗材的成本。所提出的技术和方法还包括使用NFC标签，手机应用程序和在线数据库进行实时样品信息跟踪。收集接穗样品后，手机应用程序会将 NFC 样品袋夹与 NFC 树标签链接起来。然后将样品运送到实验室，用BTE机器进行处理。每个样品的信息都通过快速滑动BTE主体的侧面来记录。通过样品NFC标签，每个样品的处理时间和样品的重量也被实时记录并上传到在线数据库。该方法提供了一个非常省时的系统，改善了质量控制（即，通过避免样品ID错误），并提高了实验室效率。
BTE高通量处理和验证是用“真实/现场”柑橘样品进行的，表明其他诊断实验室可以很容易地采用该技术和方法。采用这项技术将降低运营成本，提高诊断能力和实验室效率，从而增加在感染发生后早期识别病树的机会，并降低疾病传播的机会。BTE与传统组织处理方法的并排比较表明，提取的核酸的质量（即浓度、纯度和完整性）与下游病原体检测结果相当（图3A-C）。然而，与手动处理方案相比，使用BTE处理样品所花费的时间显着减少（即3.3分钟对6.8分钟）。腔室和BTE底座确实需要定期清洁。尽管清洁非常耗时并且构成了该方法的限制，但该技术允许在需要清洁腔室之前在BTE中快速处理多个样品。传统方法需要较少的清洁，因为每个样品都有自己的处理容器，在许多情况下，这是一次性的，但它们需要更多的容器和存储空间（例如，4°C冰箱和-20°C或-80°C冰箱）。
BTE过程的构思和构建旨在通过批量样品处理和测试（即，在大型柑橘种质基础块，苗圃或果园中发现患病树）来提高识别问题区域的可能性，只需运行少量可以 识别 热点的批量测试。因此，它仅在发现阳性结果时才会偏离。发生这种情况时（图4B，批次1和批次5），需要后续样品处理和测试包含阳性材料的同一批次的单个样品（即，仅样品的子集）以确定哪些样品是阳性的。因此，重要的是要注意，该程序主要适用于感染率低的情况，它允许测试来自许多树木的大量材料，这反过来增加了疾病检测的可能性，而无需测试大量单个样本。在感染率高的情况下，传统方法将是最佳选择，因为它们允许单独测试每个样本。这在加利福尼亚州20 的HLB调查（HLB阳性率仍然很低）的情况下尤其重要，其中利用基于PCR的CLas检测方法主要用于确认暴露于CLas阳性亚洲木虱（ACP）的无症状树木中是否存在CLas（即，没有典型的斑点斑驳，冠层变黄或树木衰退）。鉴于我们不知道感染性ACP在树中的哪个位置进食，通过测试少量样本，在田间或任何其他大区域或操作中识别受感染但无症状的树木的机会非常低（例如，在加利福尼亚州，目前收集20片叶子，每棵树20测试12片叶子）。显然，树冠越大，CLas检测的几率就越低。尽管在样品处理之后的PCR本身（即试剂，基本实验室设备和热循环仪）以及核酸提取和纯化的成本在BTE过程中继续保持不变，但从无症状树上收集样本以确定它们是否被感染的不确定性仍然存在，我们认为， 是加州HLB调查的致命弱点。所展示的仪器、技术、方法和改进将允许在更短的时间内以更低的成本处理更大的样本量。因此，该方法将增加及时识别受感染树木的概率，并改善加州对HLB或其他柑橘侵袭性病原体的根除工作（例如，2022年8月在加州报告的柑橘黄脉清除病毒）。
结合自动化组织处理方法，批量取样和测试将降低植物组织处理成本。这种成本降低将使许多诊断实验室能够更有效地筛查许多州的果园，并更好地跟踪HLB和其他疾病的移动。最终，这意味着种植者将拥有更有效的工具，通过更有效的大规模测试来减缓疾病的传播。虽然BTE仪器可以提高柑橘实验室目前的诊断能力并使整个柑橘产业受益，但同时，该技术也可以转移到其他树木作物上。根据OD估计的核酸浓度和纯度的初步数据，BTE可以有效处理杏仁（59.87 ng/μL±7.43 ng/μL和A260/A280 1.17 ± 0.05，n = 9）、葡萄（135.74 ng/μL ± 50.74 ng/μL和A260/A280 1.17 ± 0.06，n = 9）和桃子（66.50 ng/μL ± 6.07 ng/μL和A260/A280 1.29 ± 0.05）的组织。 n = 9）（样品由加州大学戴维斯分校的基础植物服务公司提供）。
这里介绍的接穗纸巾加工平台激发了其他植物用纸加工设备的开发。例如，目前正在开发叶组织提取器（LTE）。使用柑橘叶的初步测试结果显示，LTE仪器可以处理大约7倍的叶子，而处理时间仅比加利福尼亚20使用的当前标准12叶方法增加35%。我们估计，LTE支持的批量采样和测试协议可以将每次柑橘叶测试的总体成本降低四分之一。目前正在我们的实验室进行CDFA特种作物块拨款，以证明该技术实际应用价值的研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者承认Cahuilla人是完成实验工作的土地的传统监护人。我们感谢加州大学河滨分校的Norman Ellstrand教授提供实验室空间，以便在UCR加州农业和食品企业（CAFÉ）倡议下为该项目开展研究活动。这项研究得到了CDFA-特种作物整笔拨款计划（拨款号18-0001-055-SC）的支持。CRB项目6100也提供了额外的支持;美国农业部国家食品和农业研究所，哈奇项目1020106;以及国家清洁植物网络-美国农业部动植物卫生检验局（AP17PPQS&T00C118，AP18PPQS&T00C107，AP19PPQS&T00C148和AP20PPQS&T00C049授予乔治斯·维达拉基斯。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.08" Hex Trimmer line | PowerCare | FPRO07065 | Needed to replace blades. |
| 1 Hp, 8 gal air compressor | California Air Tools | 8010 | Quickly dry chambers after rinsed |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Globe Scientific | 111558B | Store sample in after swishing with syinges |
| 10 mL Syringe Set | Technology Evolving Solutions | TE006-F1-10A-G1000-E1 | Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach |
| 12" Ruler | Westcott | 16012 | To measure trimmer line before cutting |
| 12% Sodium Hypochlorite | Hasa | 1041 | Disinfects chambers after processing |
| -20 C Freezer | Insignia | NS-CZ70WH0 | Store sample after processing |
| 4" x 12" plastic bags | Plymor | FP20-4x12-10 | Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal |
| 6" Cotton Swab | Puritan | 806-PCL | Swab to remove clogs |
| 7 Gallon Storage Tote | HDX | 206152 | Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers |
| Air blow gun | JASTIND | JTABG103A | Directs air into the chambers at high pressure |
| Black Sharpie | Sharpie | S-19421 | Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later |
| Bottle Top Dispensor | Brand | Z627569 | Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe |
| BTE Chamber | Technology Evolving Solutions | TE002BB-A05-E1 | Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool |
| Dish Soap | Dawn | 57445CT | Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber |
| Fume hood with hepa filter | Air Science | P5-36XT-A | Fume hood with hepa filter (ASTS-030) to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Insulated foam shipping container | PolarTech | 261/J50C | Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected |
| Lab coat | Red Kap | KP14WH LN 46 | Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Laptop | Microsoft | Surface | Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base |
| NFC Capable Phone | Samsung | Galaxy S9 | Phone to download and use TES phone app |
| NFC clip tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Clip-E1 | Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app |
| NFC Collar Tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Collar-E1 | Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app |
| Nitrile Gloves | Usa Scientific | 3915-4400 | Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Noise-Reducing Earmuff | 3M | 90565-4DC-PS | Protect ears while operating air compressor and tissue processing base |
| Polyurethane Recoil Air Hose | FYPower | 510019 | Attaches air gun to compressor |
| Saftey glasses | Solidwork | SW8329-US | Protect eyes for chemical and physical hazards |
| Spray bottle | JohnBee | B08QM81BJV | Spray bleach to deconatinate surfaces |
| Tissue Extractor Base | Technology Evolving Solutions | TE001-A-E1 | System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench |
| Tissue Processing Base Weight Scale | Technology Evolving Solutions | TE003-A05-200g-01-E1 | 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield |
| Vermiculite | EasyGoProducts | B07WQDZGRP | Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service |
| Wire Cutter | Boenfu | BOWC-06002-US | Wire cutters to cut trimmer line |
References
- Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
- Vernière, C., et al. Citrus viroids: Symptom expression and effect on vegetative growth and yield of clementine trees grafted on trifoliate orange. Plant Disease. 88 (11), 1189-1197 (2004).
- Zhou, C., et al. Chapter 19 - Citrus viruses and viroids. The Genus Citrus. Talon, M., Caruso, M., Gmitter, F. G. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 391-410 (2020).
- Luckstead, J., Devadoss, S. Trends and issues facing the U.S. citrus industry. Choices Magazine Online. 36 (2), Available from: https://www.choicesmagazine.org/choices-magazine/theme-articles/trends-and-challenges-in-fruit-and-tree-nut-sectors/trends-and-issues-facing-the-us-citrus-industry (2021).
- Simnitt, S., Calvin, L. Fruit and Tree Nuts Outlook. United States Department of Agriculture-Economic Research Service. , Available from: https://www.ers.usda.gov/webdocs/outlooks/98171/fts-370.pdf?v=5697 (2020).
- Forsyth, J., Fruits Damiani, J. C. itrus Citrus Fruits. Types on the market. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. , Academic Press. Cambridge, MA. 1329-1335 (2003).
- Bostock, R. M., Thomas, C. S., Hoenisch, R. W., Golino, D. A., Vidalakis, G. Plant health: How diagnostic networks and interagency partnerships protect plant systems from pests and pathogens. California Agriculture. 68 (4), 117-124 (2014).
- Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).
- Wang, J., et al. Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale. Frontiers in Microbiology. 4, 366 (2013).
- Gergerich, R. C., et al. Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization. Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).
- Moreno, P., Ambrós, S., Albiach-Martí, M. R., Guerri, J., Peña, L. Citrus tristeza virus: A pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology. 9 (2), 251-268 (2008).
- Yokomi, R. K., et al. Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California. Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).
- Selvaraj, V., Maheshwari, Y., Hajeri, S., Yokomi, R. A rapid detection tool for VT isolates of Citrus tristeza virus by immunocapture-reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay. PLoS One. 14 (9), 0222170 (2019).
- Babcock, B. A. Economic impact of California's citrus industry in 2020. Journal of Citrus Pathology. 9, (2022).
- Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).
- Yokomi, R., et al. Molecular and biological characterization of a novel mild strain of citrus tristeza virus in California. Archives of Virology. 163 (7), 1795-1804 (2018).
- Fuchs, M., et al. Economic studies reinforce efforts to safeguard specialty crops in the United States. Plant Disease. 105 (1), 14-26 (2021).
- Singerman, A. The real cost of HLB in Florida. Citrus Industry Magazine. , Available from: https://citrusindustry.net/2019/07/30/the-real-cost-of-hib-in-florida/ (2019).
- McRoberts, N., et al. Using models to provide rapid programme support for California's efforts to suppress Huanglongbing disease of citrus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1776), 20180281 (2019).
- Albrecht, C., et al. Action plan for Asian citrus psyllid and huanglongbing (citrus greening) in California. Journal of Citrus Pathology. 7 (1), (2020).
- Navarro, L., et al. The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the period 1975-2001. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15 (15), (2002).
- Vidalakis, G., Gumpf, D. J., Polek, M. L., Bash, J. A. The California Citrus Clonal Protection Program. Citrus Production Manual. Ferguson, L., Grafton-Cardwell, E. E. , University of California, Agriculture and Natural Resources. Oakland, California. 117-130 (2014).
- Dang, T., et al. High-throughput RNA extraction from citrus tissues for the detection of viroids. In Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
- Osman, F., Vidalakis, G. Real-time detection of viroids using singleplex and multiplex quantitative polymerase chain reaction. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
- Li, R., et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2), 48-55 (2008).
- Saponari, M., Manjunath, K., Yokomi, R. K. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 147 (1), 43-53 (2008).
- Damaj, M. B., et al. Reproducible RNA preparation from sugarcane and citrus for functional genomic applications. International Journal of Plant Genomics. 2009, 765367 (2009).
- Dang, T., et al. First report of citrus leaf blotch virus infecting Bearss lime tree in California. Plant Disease. 104 (11), 3088 (2020).
- Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques. 20 (6), 968-970 (1996).
- Teare, J. M., et al. Measurement of nucleic acid concentrations using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques. 22 (6), 1170-1174 (1997).
- Imbeaud, S. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 56-56 (2005).
- Menzel, W., Jelkmann, W., Maiss, E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods. 99 (1-2), 81-92 (2002).
- Vidalakis, G., et al. SYBR Green RT-qPCR for the universal detection of citrus viroids. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. , Humana. New York, NY. 211-217 (2022).
- Arredondo Valdés, R., et al. A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus. Canadian Journal of Microbiology. 62 (10), 803-811 (2016).
- Li, S., Wu, F., Duan, Y., Singerman, A., Guan, Z. Citrus greening: Management strategies and their economic impact. HortScience. 55 (5), 604-612 (2020).
- CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes. , Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019).
Tags
生物工程，第194期，接穗组织提取，手切，“亚洲自由念珠菌”，CLas，黄龙兵，HLB， 柑橘特里斯特扎 病毒，CTVErratum
Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:
Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside
to:
Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside
