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Summary
Nous avons conçu, fabriqué et validé un instrument qui traite rapidement les tissus de bourgeons d’agrumes riches en phloème. Par rapport aux méthodes actuelles, l’extracteur de tissus de bourgeons (BTE) a permis d’augmenter le débit d’échantillons et de réduire les coûts de main-d’œuvre et d’équipement requis.
Abstract
Les agents pathogènes des agrumes transmissibles par les greffons et limités par le phloème, tels que les virus, les viroïdes et les bactéries, sont responsables d’épidémies dévastatrices et de graves pertes économiques dans le monde entier. Par exemple, le virus de la tristeza des agrumes a tué plus de 100 millions d’agrumes dans le monde, tandis que « Candidatus Liberibacter asiaticus » a coûté 9 milliards de dollars à la Floride. L’utilisation de bourgeons d’agrumes testés pour la propagation des arbres est essentielle pour la gestion de ces agents pathogènes. Le programme de protection clonale des agrumes (CCPP) de l’Université de Californie à Riverside utilise des tests de réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour tester des milliers d’échantillons d’arbres sources de bourgeons d’agrumes chaque année afin de protéger les agrumes de Californie et de fournir des unités de propagation propres au National Clean Plant Network. Un goulot d’étranglement important dans la détection moléculaire à haut débit des virus et des viroïdes des agrumes est l’étape de traitement des tissus végétaux.
Une bonne préparation des tissus est essentielle pour l’extraction d’acides nucléiques de qualité et l’utilisation en aval dans les tests PCR. Le hachage, le pesage, la lyophilisation, le broyage et la centrifugation des tissus végétaux à basse température pour éviter la dégradation des acides nucléiques prennent beaucoup de temps et de main-d’œuvre et nécessitent des équipements de laboratoire coûteux et spécialisés. Cet article présente la validation d’un instrument spécialisé conçu pour traiter rapidement les tissus d’écorce riches en phloème du bois de bourgeon d’agrumes, appelé extracteur de tissu de bourgeon (BTE). Le contour d’oreille augmente le débit d’échantillons de 100 % par rapport aux méthodes actuelles. De plus, cela diminue la main-d’œuvre et le coût de l’équipement. Dans ce travail, les échantillons de contours d’oreille avaient un rendement en ADN (80,25 ng/μL) comparable au protocole de hachage manuel du CCPP (77,84 ng/μL). Cet instrument et le protocole de traitement rapide des tissus végétaux peuvent bénéficier à plusieurs laboratoires et programmes de diagnostic des agrumes en Californie et devenir un système modèle pour le traitement des tissus pour d’autres cultures ligneuses vivaces dans le monde entier.
Introduction
Les agents pathogènes des agrumes limités par le phloème transmissibles par les greffons, tels que les viroïdes, les virus et les bactéries, ont provoqué des épidémies dévastatrices et de graves pertes économiques dans toutes les régions productrices d’agrumes du monde. Les viroïdes d’agrumes sont des facteurs de production limitants en raison des maladies exocortis et de cachexie qu’ils causent dans les types d’agrumes économiquement importants, tels que les hybrides trifoliés, les mandarines, les clémentines et les mandarines 1,2,3. En Californie, ces types d’agrumes sensibles aux viroïdes sont à la base du marché croissant et rentable des « éplucheurs faciles », suivant la tendance changeante de la préférence des consommateurs pour les fruits faciles à peler, segmentés et sans pépins 4,5,6. Ainsi, les viroïdes d’agrumes sont réglementés par le Département de l’alimentation et de l’agriculture de Californie (CDFA) « Programme de propreté des ravageurs du matériel de pépinière d’agrumes – Projet de loi 140 du Sénat », et les laboratoires de la Direction du diagnostic des ravageurs des plantes du CDFA effectuent des milliers de tests de viroïdes d’agrumes chaque année 7,8,9,10 . Le virus de la tristeza des agrumes (CTV) a été responsable de la mort de plus de 100 millions d’agrumes depuis le début de l’épidémie mondiale dans les années 1930 3,9,10,11. En Californie, les isolats du virus résistants à la piqûre de la tige et à la rupture trifoliée constituent une menace sérieuse pour l’industrie californienne des agrumes, dont le chiffre d’affaires s’élève à 3,6 milliards de dollars. Par conséquent, le CDFA classe le CTV comme un phytoravageur réglementé de classe A, et le laboratoire de l’Agence d’éradication de la tristeza de Californie centrale (CCTEA) effectue des enquêtes approfondies sur le terrain et des milliers de tests de dépistage du virus chaque année15,16. On estime que la bactérie « Candidatus Liberibacter asiaticus » (CLas) et la maladie du huanglongbing (HLB) ont causé près de 9 milliards de dollars de dommages économiques à la Floride en raison d’une réduction de 40 % de la superficie d’agrumes, d’une diminution de 57 % des opérations d’agrumes et d’une perte de près de 8 000 emplois17,18. En Californie, une hypothétique réduction de 20 % de la superficie d’agrumes due au HLB devrait entraîner plus de 8 200 pertes d’emplois et une réduction de plus d’un demi-milliard de dollars du produit intérieur brut de l’État. Par conséquent, le programme de prévention des ravageurs et des maladies des agrumes dépense plus de 40 millions de dollars par an pour des enquêtes visant à tester, détecter et éradiquer les CLas de Californie14,17,19,20.
Un élément clé de la lutte contre les viroïdes, les virus et les bactéries des agrumes est l’utilisation de matériaux de multiplication testés par des agents pathogènes (c.-à-d. le bois de bourgeon) pour la production d’arbres. Le bois de bourgeon d’agrumes testé contre les agents pathogènes est produit et maintenu dans le cadre de programmes de quarantaine complets qui utilisent des techniques avancées d’élimination et de détection des agents pathogènes10,21. Le programme de protection clonale des agrumes (CCPP) de l’Université de Californie à Riverside teste chaque année des milliers d’échantillons de bourgeons provenant de variétés d’agrumes nouvellement importées dans l’État et aux États-Unis, ainsi que d’arbres sources de bourgeons d’agrumes, afin de protéger les agrumes de Californie et de soutenir les fonctions du National Clean Plant Network for Citrus10,17,22. Pour gérer le grand volume d’analyses d’agrumes, des tests de détection d’agents pathogènes à haut débit, fiables et rentables sont un élément fondamental pour le succès de programmes tels que le CCPP 7,10,22.
Bien que les tests de détection d’agents pathogènes moléculaires tels que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) aient permis d’augmenter considérablement le débit dans les laboratoires de diagnostic des plantes, d’après notre expérience, l’un des goulots d’étranglement les plus critiques dans la mise en œuvre de protocoles à haut débit est l’étape de traitement des échantillons de tissus végétaux. Cela est particulièrement vrai pour les agrumes, car les protocoles actuellement disponibles pour le traitement des tissus riches en phloèmes tels que les pétioles des feuilles et l’écorce des bourgeons demandent beaucoup de main-d’œuvre, prennent du temps et nécessitent des équipements de laboratoire coûteux et spécialisés. Ces protocoles nécessitent le hachage, le pesage, la lyophilisation, le broyage et la centrifugation à basse température pour éviter la dégradation des acides nucléiques 8,23,24. Par exemple, au laboratoire de diagnostic du CCPP, le traitement des échantillons comprend (i) le hachage manuel (6 à 9 échantillons/h/opérateur), (ii) la lyophilisation (16 à 24 h), (iii) la pulvérisation (30 à 60 s) et (iv) la centrifugation (1 à 2 h). Le processus nécessite également des fournitures spécialisées (p. ex., des tubes robustes à verrouillage de sécurité, des billes de broyage en acier inoxydable, des adaptateurs, des lames, des gants) et de multiples pièces d’équipement de laboratoire coûteuses (p. ex., congélateur à ultra-basse température, lyophilisateur, pulvérisateur de tissus, station de cryostation d’azote liquide, centrifugeuse réfrigérée).
Comme dans toute industrie, l’ingénierie des équipements et l’automatisation des processus sont essentielles pour réduire les coûts, augmenter le rendement et fournir des produits et des services uniformes et de haute qualité. L’industrie des agrumes a besoin d’instruments de traitement des tissus à faible coût qui nécessitent un minimum de compétences pour fonctionner et, en tant que tels, sont faciles à transférer aux laboratoires de diagnostic et aux opérations sur le terrain pour permettre une grande capacité de traitement des échantillons pour une détection rapide des agents pathogènes en aval. Technology Evolving Solutions (TES) et le CCPP ont mis au point (c.-à-d. conçu et fabriqué) et validé (c.-à-d. testé avec des échantillons d’agrumes et comparé aux procédures de laboratoire standard) un instrument peu coûteux (c.-à-d. éliminé le besoin d’équipement de laboratoire spécialisé) pour le traitement rapide des tissus d’agrumes riches en phloème (c.-à-d. le bois de bourgeon), appelé extracteur de tissus de bourgeon (BTE). Comme le montre la figure 1, le contour d’oreille comprend un composant de base pour l’alimentation et les commandes, ainsi qu’une chambre amovible pour le traitement du bois de bourgeon d’agrumes. La chambre BTE est composée d’une meule spécialement conçue pour dépouiller les tissus d’écorce riches en phloème du bourgeon d’agrumes. Le tissu d’écorce déchiqueté est éjecté rapidement par un orifice coulissant dans une seringue contenant un tampon d’extraction, filtré et préparé pour l’extraction et la purification des acides nucléiques sans aucune manipulation ou préparation supplémentaire (figure 1). Le système contour d’oreille comprend également une application de suivi des échantillons sans papier et une application de pesage intégrée, qui enregistrent les informations de traitement des échantillons dans une base de données en ligne en temps réel.
Le système BTE a augmenté la capacité de diagnostic de laboratoire du CCPP de plus de 100 % et a toujours produit des extraits de tissus d’agrumes adaptés à la purification d’acides nucléiques de haute qualité et à la détection en aval d’agents pathogènes d’agrumes transmissibles par greffe à l’aide de tests PCR. Plus précisément, le contour d’oreille a réduit le temps de traitement des tissus de plus de 24 h à ~3 minutes par échantillon, a remplacé les instruments de laboratoire coûtant plus de 60 000 $ (figure 2, étapes 2 à 4) et a permis le traitement d’échantillons de plus grande taille.
Cet article présente les données de validation du traitement des tissus d’écorce d’agrumes à haut débit du contour d’oreille, de l’extraction des acides nucléiques et de la détection des agents pathogènes avec des échantillons de bourgeons d’agrumes provenant d’arbres sources, y compris tous les contrôles positifs et négatifs appropriés de l’installation de quarantaine de Rubidoux et de l’installation de la Fondation Lindcove, respectivement. Nous présentons également les changements de débit et de temps de traitement par rapport à la procédure de laboratoire actuelle (Figure 2). De plus, ce travail fournit un protocole détaillé, étape par étape, pour les laboratoires d’analyse des agents pathogènes des agrumes et démontre comment le contour d’oreille peut soutenir les fonctions du matériel de pépinière, de l’enquête et des programmes d’éradication des agents pathogènes.
Figure 1 : Extracteur de tissus de bourgeons. Le contour d’oreille comprend un composant de base pour l’alimentation et les commandes, ainsi qu’une chambre amovible pour le traitement du bois de bourgeon d’agrumes. La chambre BTE est composée d’une meule spécialement conçue pour décaper les tissus d’écorce riches en phloème du bois de bourgeons d’agrumes. Le tissu d’écorce déchiqueté est éjecté rapidement par un orifice coulissant dans une seringue, filtré et préparé pour l’extraction et la purification des acides nucléiques sans aucune manipulation ou préparation supplémentaire. Abréviation : BTE = extracteur de tissus de bourgeons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Comparaison étape par étape entre la procédure conventionnelle de hachage manuel en laboratoire et le traitement des contours d’oreille. Le traitement des contours d’oreille implique le traitement des tissus d’écorce d’agrumes à haut débit, l’extraction des acides nucléiques et la détection des agents pathogènes. Le temps de chaque étape est indiqué entre parenthèses. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Protocol
1. Collecte des échantillons de bourgeons d’agrumes à expédier
- Envoyez à Technology Evolving Solutions une feuille de calcul contenant des informations sur les arbres pour qu’ils puissent les charger sur leur serveur Web (éventuellement, l’utilisateur créera de nouveaux arbres).
- Utilisez le tracker TES de l’application téléphonique pour sélectionner un arbre et tenez une étiquette de collier de communication en champ proche (NFC) sur le téléphone pour charger les informations de l’arbre sur l’étiquette.
- Insérez trois à quatre échantillons de bourgeons d’agrumes dans le porte-sac en plastique compatible avec le contour d’oreille et fermez avec le couvercle.
- Assurez-vous que la longueur du bourgeon ne dépasse pas 8 po et n’est pas inférieure à 5 po.
- Si la longueur est supérieure à 8 po, utilisez une lame de rasoir jetable stérile ou un sécateur décontaminé avec une solution d’eau de Javel à 10 % (hypochlorite de sodium à 1 %) pour le raccourcir.
- Si la longueur est inférieure à 5 po, prélevez un autre échantillon de bois de bourgeon pour le mettre dans le sac.
- Assurez-vous que toute excroissance axillaire ou grosse épine est enlevée à la main ou à l’aide d’outils de coupe désinfectés à 10 % d’eau de Javel (hypochlorite de sodium à 1 %).
REMARQUE: Cette étape est importante pour que le bourgeon soit plus facile à manœuvrer dans l’ouverture de la chambre. - Assurez-vous qu’il n’y a pas d’échantillons de bourgeons qui ont des caractéristiques incurvées. Si c’est le cas, retirez-les à l’aide d’outils de coupe désinfectés à 10 % d’eau de Javel (hypochlorite de sodium à 1 %) et placez dans les sacs contour d’oreille uniquement les parties droites de l’échantillon.
REMARQUE: Le bois de bourgeon incurvé est très difficile à manœuvrer dans l’instrument, ce qui entraîne des rayures d’écorce inégales.
- Assurez-vous que la longueur du bourgeon ne dépasse pas 8 po et n’est pas inférieure à 5 po.
- Utilisez le tracker TES de l’application téléphonique pour scanner l’étiquette du collier NFC de l’arbre et la lier à l’étiquette de clip NFC sur le sac d’échantillons.
- Faites attention à l’épaisseur du bourgeon car cela détermine la façon dont l’opérateur décapera l’écorce de bourgeon riche en phloème à l’intérieur de la chambre du contour d’oreille.
- Si le bourgeon a une épaisseur inférieure à 0,20 po, soyez prudent lorsque vous décapage le bourgeon car les fils de rotation à grande vitesse dans la chambre pulvériseront le bourgeon entier jusqu’à son noyau, au-delà de la couche d’écorce et dans les tissus non riches en phloème du bois et de la moelle.
- Choisissez des bourgeons plus épais car il est plus facile de décaper les tissus de l’écorce tout en évitant les tissus de bourgeons non riches en phloème.
- Placez les échantillons dans un conteneur d’expédition isotherme avec quelques blocs réfrigérants.
2. Installation dans la hotte
REMARQUE: Il est préférable de faire fonctionner le contour d’oreille à l’intérieur d’une hotte. Cela réduira le risque de contamination croisée des tissus végétaux et de contamination des laboratoires.
- Désinfecter à l’aide d’un vaporisateur à 10 % (hypochlorite de sodium à 1 %).
- Vaporisez la surface de la hotte et laissez l’eau de Javel reposer pendant environ 1 minute avant de l’essuyer avec une serviette en papier.
- Vaporisez une serviette en papier avec la solution d’eau de Javel. Essuyez la base TE, les composants de la balance (balance, bouclier d’air et tour) et un marqueur.
- Déballez un ensemble de seringues pour le nombre d’échantillons à traiter et placez-les dans une boîte en carton couverte.
- Ayez un paquet d’écouvillons à portée de main à l’extérieur de la hotte au cas où vous en auriez besoin.
- Préparez la balance.
- Retirez la tour de musculation de la balance et maintenez le bouton d’alimentation enfoncé pour l’allumer. Placez la tour au centre de l’échelle une fois que l’échelle affiche 0.
- Faites glisser le bouclier d’air de la balance sur l’avant de la balance.
- Préparez la base de l’extracteur de tissus en actionnant l’interrupteur situé à l’arrière. Assurez-vous que l’interrupteur sur le côté gauche de la boîte est enfoncé sur le dessus. Attendez qu’une LED verte clignote, qui indique que la chambre est prête.
3. Installez les stations de nettoyage (figure supplémentaire S1).
- Placez 1 L d’eau dans le nettoyeur à ultrasons.
- Enroulez deux sacs poubelle sur le dessus du nettoyeur à ultrasons.
- Versez ~5 L d’eau de Javel à 10 % (solution d’hypochlorite de sodium à 1 %) dans le nettoyeur à ultrasons.
- Remplissez le réservoir d’eau avec suffisamment d’eau pour immerger une chambre.
- Allumez le compresseur d’air et ouvrez la vanne.
- Installez une toile de fond pour récupérer le liquide pendant que la chambre sèche.
4. Traitement du matériau pour le contour d’oreille pour le décapage de l’écorce de bourgeon d’agrumes
- Chargez la chambre sur la base du contour d’oreille.
- Préparez la chambre du contour d’oreille.
- Fixez un sac d’échantillon vide à l’arrière de la chambre. Utilisez deux joints toriques pour fixer le sac vide à la buse arrière de la chambre du contour d’oreille.
- Inspectez la lame pour détecter des signes d’usure ou de dommages, tels que des coupures qui se forment sur la lame à l’endroit où elle continue dans le plastique ou des coupures qui se forment sur la pointe. Assurez-vous que la flèche sur la lame est alignée avec le symbole de verrouillage unique.
- Assurez-vous que le dégagement d’air au fond de la chambre est tourné vers le symbole O . Placez le couvercle transparent sur l’ouverture de la chambre et faites glisser la glissière BTE transparente sur la chambre à l’aide du rail situé à droite de la chambre. Poussez le verrou au fond de la chambre aussi loin que possible dans la glissière. Assurez-vous que le capuchon du piston est monté sur le dessus de la glissière.
- Placez la chambre sur la base du contour d’oreille avec la buse de la base du contour d’oreille dépassant à l’arrière de la chambre. Attendez que la LED bleue clignote, indiquant que le placement est réussi.
- Préparez la chambre du contour d’oreille.
- Chargez l’échantillon sur la base du contour d’oreille en déplaçant l’autocollant blanc sur l’étiquette de clip NFC vers un Z sur le côté droit de la boîte. Déplacez la balise dans un lent mouvement circulaire sur Z jusqu’à ce que le voyant jaune commence à clignoter. Fixez l’échantillon à la base du contour d’oreille et assurez-vous que le sac d’échantillon n’est pas troué. S’il y a un trou, réparez-le avec du ruban adhésif. Placez le joint torique sur le sac d’échantillon pour le fixer à l’avant de la buse BTE.
- Chargez le jeu de seringues inutilisé.
- Tarer le jeu de seringues. Placez la seringue inutilisée sur la tour de la balance. Retirez le jeu de seringues lorsqu’un voyant rouge commence à clignoter ou que la balance affiche 0.
- Retirez le piston de la seringue avec le filtre. Assurez-vous que le liquide se trouve dans la seringue inférieure (sans filtre). Placez le piston de côté sur une serviette en papier ou sur la tour où le piston noir ne touche aucune surface.
- Fixez la seringue à l’orifice de sortie coulissant en appuyant sur l’orifice de sortie dans la seringue et en le tournant à 90°.
- Traitez l’échantillon de bois de bourgeon.
ATTENTION : Le contour d’oreille a des pièces mobiles à grande vitesse. Toutes les opérations doivent se dérouler à l’intérieur d’une hotte. Tous les utilisateurs doivent utiliser des lunettes de protection, des cache-oreilles (bouchons d’oreille) et tout autre équipement de protection individuelle (EPI), tel que des gants et des blouses de laboratoire.- Appuyez sur le bouton noir supérieur pour démarrer la machine. Appuyez une deuxième fois pour arrêter le moteur à tout moment pendant le traitement.
REMARQUE: La boîte est dotée d’une détection de vitesse et de température pour garantir son bon fonctionnement. - Saisissez un bâton de budwood dans le sac et passez-le dans le haut de la buse BTE.
- Saisissez le bâton de bourgeon de l’autre côté de la chambre avec l’autre main et descendez lentement dans la lame. Écoutez un léger bourdonnement indiquant que le bourgeon est dépouillé de son écorce. Déplacez lentement le bois de bourgeon d’avant en arrière tout en le faisant tourner.
- Si vous entendez un bruit de hachage fort et agressif, déplacez rapidement la branche vers le haut et/ou appuyez sur le bouton supérieur pour arrêter le moteur. Pour arrêter le moteur, utilisez l’interrupteur de droite pour terminer le traitement (voir étape 4.4.3.2).
- Si aucun matériau ne sort de la sortie lors de la coupe, la chambre est obstruée. Éteignez le moteur, retirez le capuchon du piston coulissant et utilisez le plastique de l’écouvillon pour pousser le bouchon vers la sortie de la machine. Utilisez l’interrupteur de droite pour terminer le traitement : Haut = Coupe vers l’avant ; Milieu = Moteur éteint ; Vers le bas = Coupe inversée.
- Répétez les étapes 4.4.2 et 4.4.3 pour les branches restantes.
REMARQUE: Un indicateur général qu’une quantité suffisante d’écorce de bourgeon a été enlevée est lorsque 25% de la seringue a été remplie de tissu végétal. Les agents pathogènes des agrumes transmissibles par les greffons pourraient être répartis de manière inégale dans l’arbre. Par conséquent, trois à quatre échantillons de bourgeons sont prélevés autour de la canopée des agrumes. Il est important que chaque échantillon de bourgeon dans le sac de transport du contour d’oreille contribue à l’échantillon final de tissu broyé afin de s’assurer qu’un échantillon complet représentatif de l’arbre sera analysé pour détecter les agents pathogènes. - Appuyez sur le bouton noir supérieur pour arrêter le traitement. Attendez que le voyant recommence à clignoter en jaune.
- Appuyez sur le bouton noir supérieur pour démarrer la machine. Appuyez une deuxième fois pour arrêter le moteur à tout moment pendant le traitement.
- Vérifiez le poids de l’échantillon.
- Faites pivoter la seringue de 90° et tirez-la vers le bas pour la détacher. Replacez le piston sur la seringue et placez la seringue sur la tour.
- Attendez que la balance détecte automatiquement l’échantillon et déterminez s’il se situe dans la plage de poids appropriée (0,25 ± 0,05 g). Si le poids de l’échantillon est trop faible (<0,20 g), répétez l’étape 4.4 ; la LED rouge commencera à clignoter. Si le poids de l’échantillon est trop élevé (>0,30 g), retirez une partie de l’échantillon ; la LED jaune commencera à clignoter plus lentement. Si l’échantillon se trouve dans la plage, la LED verte commencera à clignoter.
- Homogénéisation de l’échantillon de bourgeon
- Retirez le piston de la seringue contenant l’échantillon, poussez le liquide dans la seringue contenant l’échantillon et rajoutez le piston. Le piston pousse le tampon et la sève de la plante à travers le filtre à mailles (en retenant les gros morceaux de tissu d’écorce) et via le tube en caoutchouc dans la seringue vide.
- Mélangez l’échantillon en poussant le tampon et la sève de la plante d’avant en arrière d’une seringue à l’autre. Répétez ~3x-4x et jusqu’à ce que l’échantillon devienne un mélange liquide vert homogène.
- Une fois bien homogénéisé, poussez l’échantillon de sève végétale dans la seringue sans le filtre à mailles, et détachez le tube en caoutchouc et la seringue avec le filtre de la seringue avec l’échantillon.
- Expulser l’échantillon de sève végétale de la seringue dans un tube de microcentrifugation stérile de 2 ml et conserver à −20 °C jusqu’à nouvel usage. Utilisez un marqueur permanent pour étiqueter l’échantillon avec le numéro du sac.
REMARQUE : La sève de l’échantillon végétal de l’étape 4.6.5 peut maintenant être traitée avec n’importe laquelle des méthodes d’extraction d’acides nucléiques, d’ARN ou d’ADN disponibles, à base de phénol-chloroforme, de colonne de silice ou de billes magnétiques 9,25,26,27 pour l’extraction et la purification des acides nucléiques (voir l’étape 7) et la détection en aval des agents pathogènes des agrumes transmissibles par le greffon (voir l’étape 8).
5. Assainissement de la chambre amovible du contour d’oreille
ATTENTION: Si le tampon de l’ensemble de seringues entre en contact avec la chambre ou la glissière, rincez et suivez toutes les règles de sécurité du laboratoire avant de nettoyer. Le set de seringues contient du thiocyanate de guanidine. Si le tampon de la seringue entre en contact avec de l’eau de Javel, il créera du cyanure gazeux.
- Effectuez les étapes suivantes après le traitement du 10e échantillon dans la chambre. Notez que la LED verte continuera à clignoter au lieu de passer au bleu clignotant.
- Démontez la chambre du contour d’oreille pour nettoyer tous les contaminants possibles; Retirez le couvercle en plastique transparent, dégagez la glissière de la chambre et dégagez l’orifice d’obstruction de la glissière de la chambre.
- Tournez la soupape de décharge d’air au fond de la chambre en position ouverte (marque de cadenas ouverte). Placez les composants de la chambre dans le nettoyeur à ultrasons configuré (voir étape 3.1). Placez le couvercle sous la chambre pour l’empêcher de flotter. Faites fonctionner le nettoyeur à ultrasons pendant 15 min.
REMARQUE: Le bain de nettoyage par ultrasons (5 L) peut contenir jusqu’à deux chambres. - Rincez les composants de la chambre au bain-marie (étape 3.4) pendant au moins 30 s. Déplacez les composants de la chambre vers la station de séchage.
ATTENTION: Le séchage provoquera des pièces en mouvement rapide dans la chambre, des bruits forts (~85 décibels [dB]) et des éclaboussures possibles. Tous les utilisateurs doivent utiliser des lunettes de protection, des cache-oreilles (bouchons d’oreilles), des blouses de laboratoire et tout autre EPI comme l’exigent les règles de sécurité du laboratoire d’opération. - Séchez la chambre du contour d’oreille.
- Positionnez le pistolet à air comprimé dans l’axe de la rainure de l’ouverture supérieure de la chambre (là où se trouve généralement la glissière). Appuyez sur la gâchette du pistolet pour distribuer de l’air pendant ~30 s.
REMARQUE: Assurez-vous que l’ouverture est éloignée de l’utilisateur vers la toile de fond. Cela devrait faire tourner le jeu de lames pour éliminer le liquide emprisonné en dessous. - Positionnez le pistolet à air comprimé vers les buses supérieures de la chambre. Appuyez sur la gâchette du pistolet à air comprimé et tracez lentement trois cercles complets de chaque entrée de buse.
- Positionnez le pistolet à air comprimé au centre du contour d’oreille. En partant du point le plus intérieur, maintenez la gâchette enfoncée et déplacez-vous jusqu’à ce que le pistolet à air comprimé pointe vers l’endroit où se trouverait la glissière.
- Faites passer rapidement de l’air sur toute la chambre, à l’avant et à l’arrière, pour évacuer l’eau de surface de l’extérieur.
- Positionnez le pistolet à air comprimé dans l’axe de la rainure de l’ouverture supérieure de la chambre (là où se trouve généralement la glissière). Appuyez sur la gâchette du pistolet pour distribuer de l’air pendant ~30 s.
- Séchez la lame BTE.
- Positionnez le pistolet à air comprimé dans la fente du piston de la glissière et appuyez sur la gâchette pour éjecter l’eau de la sortie de la glissière.
- Passez un pistolet à air comprimé le long de la surface intérieure de la glissière pour la sécher.
- Passez un pistolet à air comprimé le long de la rainure de la glissière pour faire sortir l’eau.
- Faites rapidement couler de l’air sur tout l’extérieur pour en évacuer l’eau de surface.
- Séchez les composants.
- Tenez le capuchon du piston coulissant et les joints toriques dans la main, puis appuyez sur la gâchette.
- Passez un pistolet à air comprimé sur la surface intérieure du couvercle.
- Placez les composants dans la chambre et faites-les glisser pour continuer à les sécher ou les remonter.
REMARQUE: Pour un environnement de traitement des tissus élevé avec plusieurs contours d’oreille fonctionnels, un système d’assainissement par lots capable de décontaminer 10 chambres simultanément peut être fourni.
6. Mise au rebut et désinfection
- Jetez les seringues et les tubes en caoutchouc dans le conteneur à déchets de guanidine prévu à cet effet.
- Jetez toute matière végétale dans le conteneur de déchets biologiques dangereux.
- Retirez la chambre du contour d’oreille de la base du contour d’oreille.
- Démontez la chambre contour d’oreille et procédez à leur décontamination, comme décrit à l’étape 5.
7. Évaluation du traitement tissulaire et de la qualité de l’ARN purifié à partir des extraits de bourgeons d’agrumes BTE
REMARQUE: Dans ce protocole, nous avons utilisé des échantillons de bourgeons provenant de 255 agrumes pour comparer le temps nécessaire au traitement des tissus de bourgeons d’agrumes et la qualité de l’ARN purifié à partir d’extraits de tissus d’écorce préparés par BTE (Figure 2, côté droit, étape 1, étape 5 et étape 6) par rapport à celui préparé selon la méthode de traitement des tissus de bourgeons d’agrumes approuvée par la réglementation utilisant l’épluchage et le hachage à la main. la lyophilisation, la pulvérisation et la centrifugation du tissu de l’écorce, telles que décrites par Dang et al.23 (figure 2, côté gauche, étapes 1 à 6).
- Procédure de laboratoire actuelle : Préparer les échantillons de bois de bourgeon pour le traitement des tissus conformément à la méthode approuvée par la réglementation23.
- Procéder à l’épluchage et au hachage à la main du tissu de l’écorce, à la lyophilisation, à la pulvérisation, à la centrifugation et au transfert de la sève de la plante dans le tube d’extraction de l’ARN, comme décrit par Dang et al.23 (figure 2, côté gauche, étapes 1 à 6).
- Après avoir pelé à la main les trois à quatre échantillons de bourgeons de chaque arbre testé, placez tout le bois de bourgeons dans un porte-sac en plastique compatible avec les contours d’oreille et conservez-les à 4 °C jusqu’au traitement des contours d’oreille (étape 7.2).
- Procédure de contour d’oreille : Lancer le traitement des tissus de bourgeons d’agrumes d’ATB (section 4, étapes 4.1 à 4.6; Figure 2, côté droit, étape 1, étape 5 et étape 6).
- Utilisez les échantillons de bois de bourgeon stockés à l’intérieur des sacs de transport du contour d’oreille de l’étape 7.1.2.
- Extraire et purifier l’ARN de la sève de la plante obtenue à partir de la procédure de laboratoire actuelle (étape 7.1.1) et de la procédure BTE (étape 7.2.2) à l’aide de la méthode semi-automatisée à base de billes magnétiquesapprouvée par la réglementation 8,23,28.
- Évaluer la qualité de l’ARN en mesurant sa concentration, sa pureté et son intégrité 8,23,24,29,3 3,31.
- Pour calculer la concentration, utilisez la spectrophotométrie et la densité optique (OD) à une longueur d’onde de 260 nm.
- Pour évaluer la pureté, utilisez un rapport spectrophotométrique OD de 260/280.
- Pour vérifier l’intégrité, utilisez la réaction quantitative en chaîne par polymérase (qPCR) à transcription inverse (RT) ciblant l’ARNm du gène24,32 de la NADH déshydrogénase des agrumes.
8. Évaluation de la contamination croisée et détection des virus et des viroïdes d’agrumes à l’aide d’ARN purifié à partir d’extraits de bourgeons d’agrumes BTE
REMARQUE : Dans ce protocole, nous avons utilisé des échantillons de bourgeons provenant de 72 agrumes non infectés et d’un mélange d’arbres infectés par des virus et des viroïdes pour évaluer le potentiel de contamination croisée entre les échantillons lorsqu’ils sont traités par BTE (Figure 2, côté droit, étape 1, étape 5 et étape 6) et la pertinence de l’ARN purifié à partir d’extraits de tissus d’écorce préparés par BTE pour être utilisé comme modèle pour la détection RT-qPCR des virus et des viroïdes des agrumes.
- Premier traitement de l’échantillon de contour d’oreille : Effectuez une expérience de base avec 72 échantillons non infectés.
- Préparez trois chambres de BTE (A-C) (étape 4.1.1).
- Préparez tous les échantillons de bourgeons d’agrumes non infectés (1 à 72) dans des sacs de transport d’ATB et préparez-en un nombre égal (72) dans le système de prélèvement d’échantillons d’ébouillons à deux seringues, avec un système de seringues pour chaque échantillon (étape 2.4).
- Séparez les sacs de transport d’échantillons et les seringues de prélèvement d’échantillons en six lots (I-VI) de 12 échantillons chacun.
- Amorcer le traitement des tissus du bourgeon d’agrumes du contour d’oreille (étape 4) en suivant la séquence ci-dessous (étapes 8.1.4.1 à 8.1.4.6) (voir le tableau 1, Traitement du premier échantillon de contour d’être).
- Pour le lot I/échantillons 1 à 12, traiter 12 échantillons à l’aide de la chambre A. Désinfecter la chambre A après l’échantillon 12 (étape 5).
- Pour le lot II/échantillons 13-24, traiter 12 échantillons à l’aide de la chambre B. Désinfecter la chambre B après l’échantillon 24 (étape 5).
- Pour le lot III/échantillons 25-36, traiter 12 échantillons à l’aide de la chambre C. Désinfecter la chambre C après l’échantillon 36 (étape 5).
- Pour le lot IV/échantillons 37-48, traiter 12 échantillons à l’aide de la chambre désinfectée A (étape 8.1.4.1).
- Pour le lot V/échantillons 49 à 60, traiter 12 échantillons à l’aide de la chambre désinfectée B (étape 8.1.4.2).
- Pour le lot VI/échantillons 60-72, traiter 12 échantillons à l’aide de la chambre désinfectée C (étape 8.1.4.3).
- Conservez les sacs de transport contour d’oreille avec tous les échantillons à 4 °C jusqu’à l’utilisation à l’étape 8.2.
- Extraire et purifier l’ARN des 72 échantillons de sève végétale générés aux étapes 8.1.4.1 à 8.1.4.6 à l’aide de la méthode semi-automatisée à base de billes magnétiques 8,23,28 approuvée par la réglementation.
- Effectuer la RT-qPCR pour la détection des virus et des viroïdes des agrumes, comme décrit précédemment 8,33.
- Pour le deuxième traitement d’échantillons d’objets contours d’oreille, effectuez une expérience de contamination croisée avec 70 échantillons non infectés et deux échantillons infectés mixtes.
- Préparez trois chambres de BTE (A-C) (étape 4.1.1).
- Préparer l’échantillon de bourgeons d’agrumes infectés par le mélange (73) dans deux sacs de transport d’ETC (étape 1.3) pour un nombre total de deux échantillons infectés.
- Rassemblez les sacs de transport du contour d’oreille avec les échantillons de bourgeons d’agrumes non infectés de l’étape 8.1.5, à l’exception de l’échantillon 3-lot I et de l’échantillon 51-lot V (voir le remplacement de l’échantillon à l’étape 8.2.4), pour un nombre total de 70 échantillons non infectés.
- Inclure le premier sac de transport du contour d’oreille avec l’échantillon 73 infecté par le mélange à la place de l’échantillon 3 dans le lot I et le second à la place de l’échantillon 51 dans le lot V pour un nombre total de 72 échantillons.
- Préparez un nombre égal (72) dans le système de prélèvement d’échantillons contour d’oreille à deux seringues, avec un système à double seringue pour chaque échantillon (étape 2.4).
- Séparez les 72 sacs de transport d’échantillons et les seringues de prélèvement d’échantillons en six lots (I-VI) de 12 échantillons chacun.
- Lancer le traitement des tissus du bourgeon d’agrumes BTE (étape 4), en suivant la même séquence qu’aux étapes 8.1.4.1-8.1.4.6.
REMARQUE : La seule différence est le remplacement de l’échantillon 3 du lot I et de l’échantillon 51 du lot V par l’échantillon 73 infecté (étape 8.2.4) (Tableau 1, Traitement du deuxième échantillon d’objet contour d’oreille). - Extraire et purifier l’ARN des 72 échantillons de sève végétale générés à l’étape 8.2.7 comme à l’étape 8.1.6.
- Effectuez une RT-qPCR pour la détection des virus et des viroïdes des agrumes, comme à l’étape 8.1.7.
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Representative Results
Extraction, purification et qualité de l’ARN à l’aide de tissus d’agrumes de bourgeons traités par BTE et évaluation du temps de traitement des tissus
Nous avons utilisé des échantillons de bourgeons provenant de 255 agrumes représentatifs pour ce test afin de comparer la qualité de l’ARN du contour d’oreille par rapport à la procédure standard. Les échantillons ont été traités à l’aide de l’extracteur de tissus de bourgeons (BTE) (étapes 4.1 à 4.6 du protocole et figure 2, côté droit, étapes 1, 5 et 6) ou préparés selon la méthode de traitement des tissus de bourgeons d’agrumes approuvée par la réglementation, qui utilise l’épluchage et le hachage à la main, la lyophilisation, la pulvérisation et la centrifugation du tissu de l’écorce, tel que décrit par Dang et al.23 (figure 2, côté gauche, étapes 1 à 6).
La comparaison côte à côte du contour d’oreille avec le protocole conventionnel de hachage manuel et d’équipement de laboratoire pour le traitement des tissus d’agrumes a démontré que la qualité (c.-à-d. la concentration, la pureté et l’intégrité) des acides nucléiques extraits (figure 3A-C) et l’aptitude à une utilisation en aval pour la détection par PCR des agents pathogènes des agrumes (données non présentées) étaient comparables. Dans le même temps, le temps de traitement des échantillons a été considérablement réduit grâce au système TE/BTE. Le contour d’oreille a plus que doublé le débit d’échantillons du laboratoire CCPP, réduisant ainsi les coûts de main-d’œuvre et d’équipement de laboratoire en éliminant le besoin de dizaines de milliers de dollars d’instruments, tels que des batteurs de billes, des centrifugeuses et des cryostations.
Les acides nucléiques extraits par BTE avaient une concentration moyenne de 76,96 ng/μL ± 26,23 ng/μL (n = 181) et étaient d’une grande pureté, avec une faible contamination protéique (A260/A280 2,27 ± 0,17, n = 181) (Figure 3B,C). Ces valeurs étaient comparables à celles des acides nucléiques produits par le protocole manuel standard du CCPP (concentration : 82,25 ng/μL ± 33,95 ng/μL, n = 181 et A260/A280 2,22 ± 0,10, n = 181) (Figure 3B,C). L’intégrité des acides nucléiques (RT-qPCR pour le gène nad5 des agrumes) était très similaire pour le contour d’oreille (Cq 20,97 ± 2,26, n = 181) et le protocole manuel standard CCPP (Cq 19,25 ± 1,53, n = 181) (Figure 3A). Les résultats ont également démontré que l’instrument contour d’oreille pouvait traiter un volume d’échantillon plus élevé dans le même laps de temps par rapport à la méthode conventionnelle. La procédure de laboratoire conventionnelle nécessitait ~7 à 10 minutes pour le hachage manuel par échantillon et un total de 12 minutes pour le traitement des tissus (lyophilisation, broyage et centrifugation), tandis que le contour d’oreille pouvait traiter les tissus d’agrumes pour l’extraction des acides nucléiques en ~ 3 minutes par échantillon.
Figure 3 : Qualité des extraits d’acides nucléiques des 181 échantillons représentatifs de bourgeons d’agrumes, telle que définie par la concentration, la pureté et l’intégrité. Les échantillons ont été traités par BTE et selon le protocole conventionnel de hachage à la main et d’équipement de laboratoire. (A) La concentration d’acides nucléiques a été déterminée à l’aide de l’absorbance à 260 nm; (B) la pureté a été déterminée comme le rapport des absorbances à 260 nm et 280 nm (A260/280). (C) L’intégrité de l’acide nucléique a été analysée par RT-qPCR ciblant l’ARNm du gène de la NADH déshydrogénase (Nad5) des agrumes. Les plages de valeurs optimales sont indiquées entre des cercles en pointillés rouges. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Détection d’agents pathogènes d’agrumes transmissibles par les greffons, évaluation de la contamination croisée et détection de virus et de viroïdes d’agrumes à l’aide d’ARN purifié à partir d’extraits de bourgeons d’agrumes BTE
La validité de la méthode de traitement des tissus a été évaluée en traitant 72 échantillons de bourgeons d’agrumes sains côte à côte avec tous les échantillons sains et en introduisant deux échantillons provenant d’un mélange d’arbres infectés par des virus et des viroïdes (tableau 1 et figure 4A,B). Les acides nucléiques extraits des deux lots ont été soumis à une q-PCR conventionnelle en laboratoire, comme décrit précédemment 8,33. Aucun des 72 échantillons sains prélevés lors du premier traitement des échantillons d’échauffement conjoncturel n’a donné de courbes d’amplification pour les agents pathogènes des agrumes testés (c.-à-d. faux positifs) (figure 4A). Les résultats suggèrent que le contour d’oreille peut traiter les tissus d’agrumes aussi bien que le protocole de laboratoire standard avec des méthodes de hachage à la main. Dans le deuxième traitement d’échantillons de contours d’oreille, nous avons évalué le potentiel de contamination croisée entre les têtes de contours d’oreille et dans les échantillons traités avec la même tête de contour d’oreille (étapes 1 à 6) et l’adéquation des acides nucléiques pour les applications en aval (c’est-à-dire pour une utilisation comme modèle pour la détection RT-qPCR des virus et des viroïdes des agrumes). Dans le deuxième traitement d’échantillons d’ATB avec deux échantillons introduits infectés par un mélange, les acides nucléiques produits par le protocole d’ECB ont été utilisés avec succès pour détecter différents virus et viroïdes d’agrumes (p. ex., virus triplex, virus de la tache foliaire des agrumes [CLBV], virus de la psorose des agrumes [CPsV], virus de la tristeza des agrumes [CTV]), apscaviroïdes (viroïde des feuilles courbées des agrumes [CBLVd], viroïde nanifiant des agrumes [CDVd], viroïde V des agrumes [CVd-V], viroïde VI des agrumes [CVd-VI] et viroïde VII des agrumes [CVd-VII]), le viroïde du rabougrissement du houblon non apscaviroïdé (HSVd; hostuviroïde), le viroïde de la fissuration de l’écorce des agrumes (CBCVd; cocadviroid) et le viroïde exocortis des agrumes (CEVd; pospiviroide) dans les lots 1 et 5. Dans les lots 1 et 5, les échantillons qui ont suivi le lot infecté étaient positifs pour les maladies des plantes ci-dessus, mais présentaient des valeurs de Cq croissantes. Cependant, aucune contamination croisée entre les têtes n’a été détectée, ni aucun résultat faussement positif ou négatif (figure 4B).
| Lot | Échantillon | Contour d’oreille | Premier contour d’oreille | Deuxième contour d’oreille |
| Chambre | Traitement des échantillons | Traitement des échantillons | ||
| Je | 12-janv. | Un | 1-12 Non infecté | 1-2 & 4-12 Non infecté |
| L’échantillon #3 est remplacé par un mélange infecté | ||||
| II | 13-24 | B | 13-24 | 13-24 |
| Non infecté | Non infecté | |||
| III | 25-36 | C | 25-36 | 25-36 |
| Non infecté | Non infecté | |||
| IV | 37-48 | A-Désinfecté | 37-48 | 37-48 |
| Non infecté | Non infecté | |||
| V | 49-60 | B-Désinfecté | 49-60 | 49-50 et 52-60 ans non infectés |
| Non infecté | ||||
| L’échantillon #51 est remplacé par un mélange infecté | ||||
| VI | 61-72 | C-Désinfecté | 61-72 Non infecté | 61-72 Non infecté |
Tableau 1 : Processus suivi pour la validation de la méthode de traitement des tissus BTE à l’aide de 72 échantillons de bourgeons d’agrumes. Chaque traitement a été répété deux fois. Il y avait 6 lots de 12 échantillons chacun. Lors du premier traitement des échantillons, les 72 échantillons de bourgeons d’agrumes étaient sains. Dans le deuxième traitement de l’échantillon d’éblouissement, l’échantillon 3 et l’échantillon 51 ont été remplacés par deux échantillons provenant d’un mélange d’arbres infectés par des virus et des viroïdes dans les lots 1 et 5.
Figure 4 : Validation de la méthode de traitement des tissus BTE à l’aide de 72 échantillons de bourgeons d’agrumes. Chaque traitement a été répété deux fois. Il y avait 6 lots de 12 échantillons chacun. (A) Les 72 échantillons de bourgeons d’agrumes étaient sains. (B) Les mêmes 72 échantillons de bourgeons d’agrumes avec l’introduction de deux échantillons provenant d’un mélange d’arbres infectés par des virus et des viroïdes dans le lot 1 (échantillon 3) et le lot 5 (échantillon 51). Les contrôles de CNT et d’eau avaient tous des valeurs de Cq indéterminées (c.-à-d. que la cible de l’ADN n’était pas présente dans l’échantillon). Les témoins positifs pour le triplex (CLBV, CPsV, CTV) avaient des valeurs de Cq de 23,9, 25,2 et 22,4 respectivement. Les témoins positifs pour les apscaviroïdes (CBLVd, CDVd et CBCVd) avaient des valeurs de Cq de 23,39, 21,27 et 25,17 respectivement. Les témoins positifs pour les non-apscaviroïdés (CEVd, HSVd, IV) avaient des valeurs de Cq de 26,9, 27,0 et 26,5 respectivement. Abréviations : BTE = extracteur de tissu de bourgeon ; NTC = contrôle sans modèle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire S1 : Configuration de la station de nettoyage. Une fois le 10e échantillon traité dans la chambre, les étapes du protocole 3.1 à 3.6 doivent être suivies pour préparer la station de nettoyage afin d’assainir la chambre. Comme à l’étape 3.1 du protocole, 1 L d’eau est placé dans le nettoyeur à ultrasons. Deux sacs poubelle sont enveloppés sur le dessus du nettoyeur à ultrasons (étape 3.2 du protocole) et ~5 L d’eau de Javel à 10 % (solution d’hypochlorite de sodium à 1 %) sont versés dans le nettoyeur à ultrasons (étape 3.3 du protocole). Le réservoir d’eau est rempli d’une quantité suffisante d’eau pour immerger une chambre (étape de protocole 3.4), le compresseur d’air est éteint et la vanne est ouverte (étape de protocole 3.5). Une toile de fond est mise en place pour recueillir le liquide pendant le séchage de la chambre (étape 3.6 du protocole). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Avec l’avènement de la maladie HLB des agrumes, pour réduire les pertes, l’industrie des agrumes, les organismes de réglementation et les laboratoires de diagnostic ont été invités à s’appuyer sur des méthodes d’extraction d’acides nucléiques à haut débit combinées à des tests manuels de traitement des échantillons et de détection d’agents pathogènes à faible débit tels que la qPCR34 pour tester des arbres individuels, en combinaison avec des pratiques de gestion des maladies35. Le taux de positivité du HLB en Californie est passé de 0,01 % en 2012 à 1,2 % en 2020. Même si la qPCR est un outil de détection des agents pathogènes puissant et fiable, les technologies actuellement disponibles ne permettent pas d’échantillonner et de traiter un volume adéquat de tissus végétaux, ce qui entraîne un sous-échantillonnage et un sous-test évidents pour les CLas dans les agrumes en Californie. Le sous-échantillonnage et le sous-échantillonnage se produisent en fonction du nombre d’arbres testés et de la quantité de matériel végétal par arbre à traiter (c.-à-d. le nombre de feuilles), et en raison de la distribution sporadique des feuilles infectées dans le couvert forestier, il y a une forte probabilité de passer à côté d’infections précoces ou bénignes. Les méthodes actuelles d’échantillonnage et d’analyse CLas ne peuvent pas s’adapter à l’augmentation de la demande en raison des coûts (p. ex., main-d’œuvre et équipement). À l’heure actuelle, la méthode de traitement des échantillons utilisée par la plupart des laboratoires de diagnostic des agrumes en Californie pour acquérir des acides nucléiques adaptés à l’analyse des agents pathogènes des agrumes nécessite plus de 17 heures pour la manipulation manuelle des échantillons et des fournitures et équipements spécialisés coûtant plus de 100 000 $.
Ici, nous présentons la validation d’un instrument spécialisé conçu pour traiter rapidement les tissus d’écorce de bourgeon d’agrumes, appelé extracteur de tissus de bourgeon (BTE), et un protocole détaillé, étape par étape, de manipulation d’échantillons pour les laboratoires de diagnostic d’agrumes. La recherche s’est concentrée sur le développement d’une méthode innovante de traitement des tissus pour remplacer le hachage manuel actuel des échantillons de bourgeons et construire l’instrument de traitement du bois de bourgeon d’agrumes le plus rapide et le plus rentable possible. Les résultats montrent que le contour d’oreille augmente le débit d’échantillons et diminue le coût de l’équipement et des fournitures utilisés au laboratoire de diagnostic du PPCC. La technologie et la méthode présentées comprennent également l’utilisation de balises NFC, d’une application téléphonique et d’une base de données en ligne pour le suivi en temps réel des informations sur les échantillons. Une fois les échantillons de bourgeons prélevés, l’application pour téléphone relie le clip du sac d’échantillons NFC à l’étiquette d’arbre NFC. Les échantillons sont ensuite expédiés au laboratoire pour être traités avec la machine BTE. Les informations relatives à chaque échantillon sont enregistrées d’un simple glissement sur le côté du corps du contour d’oreille. Grâce à l’étiquette NFC de l’échantillon, le temps de traitement de chaque échantillon et le poids de l’échantillon sont également enregistrés et téléchargés dans la base de données en ligne en temps réel. Cette méthode permet d’obtenir un système très rapide, d’améliorer le contrôle de la qualité (c’est-à-dire en évitant les erreurs d’identification des échantillons) et d’augmenter l’efficacité du laboratoire.
Le traitement et la validation à haut débit des contours d’oreille ont été réalisés avec des échantillons d’agrumes « réels/sur le terrain », démontrant que d’autres laboratoires de diagnostic peuvent facilement adopter la technologie et la méthodologie. L’adoption de cette technologie permettra de réduire les coûts d’exploitation et d’augmenter la capacité de diagnostic et l’efficacité du laboratoire, augmentant ainsi les chances d’identifier les arbres malades à un stade plus précoce après l’infection et réduisant les risques de propagation de la maladie. La comparaison côte à côte des contours d’oreille par rapport aux méthodes conventionnelles de traitement des tissus démontre que la qualité de l’acide nucléique extrait (c.-à-d. la concentration, la pureté et l’intégrité) et les résultats de la détection de l’agent pathogène en aval sont comparables (figure 3A-C). Cependant, le temps consacré au traitement des échantillons est considérablement réduit à l’aide du contour d’oreille par rapport aux protocoles de traitement manuel (c’est-à-dire 3,3 min contre 6,8 min). Les chambres et la base du contour d’oreille nécessitent un nettoyage régulier. Bien que le nettoyage prenne du temps et constitue une limitation de la méthode, la technologie permet de traiter rapidement plusieurs échantillons dans le contour d’oreille avant que la chambre ne doive être nettoyée. Les méthodes conventionnelles nécessitent moins de nettoyage, car chaque échantillon a son propre récipient de traitement, qui, dans de nombreux cas, est jetable, mais elles nécessitent plus de récipients et d’espace de stockage (par exemple, des réfrigérateurs à 4 °C et des congélateurs à −20 °C ou −80 °C).
Le procédé BTE a été conçu et construit pour augmenter la probabilité d’identifier une zone problématique par le traitement et l’analyse d’échantillons en vrac (c’est-à-dire la découverte d’un arbre malade dans un grand bloc de base de matériel génétique d’agrumes, une pépinière ou un verger) en n’exécutant qu’un petit nombre de tests en vrac qui peuvent identifier les points chauds. Par conséquent, il ne s’écarte que lorsqu’un résultat positif est trouvé. Lorsque cela se produit (figure 4B, lot 1 et lot 5), le traitement subséquent des échantillons et l’analyse d’échantillons individuels du même lot contenant le matériau positif (c.-à-d. seulement un sous-ensemble d’échantillons) sont nécessaires pour déterminer quels échantillons sont positifs. Ainsi, il est important de noter que cette procédure convient principalement aux cas à faible taux d’infection, où elle permet de tester un volume élevé de matériel provenant de nombreux arbres, ce qui, en retour, augmente la probabilité de détection de la maladie sans avoir à tester un grand nombre d’échantillons individuels. Les méthodes conventionnelles seront l’option optimale dans les cas où les taux d’infection sont élevés, car elles permettent de tester chaque échantillon individuellement. Ceci est particulièrement important dans le cas des enquêtes sur le HLB en Californie20 (toujours à un faible taux de positivité du HLB), où les méthodes de PCR utilisées pour la détection des CLas sont principalement destinées à confirmer la présence ou l’absence de CLas dans les arbres asymptomatiques (c’est-à-dire pas de marbrures tachetées typiques, de jaunissement de la canopée ou de dépérissement des arbres) qui ont été exposés à des psylles asiatiques des agrumes (ACP) positifs aux CLas. Étant donné que nous ne savons pas à quel endroit de l’arbre une ACP infectieuse s’est nourrie, les chances d’identifier un arbre infecté mais asymptomatique dans le champ ou dans toute autre grande zone ou exploitation en testant un petit nombre d’échantillons sont très faibles (p. ex., en Californie, actuellement 20 feuilles sont prélevées et 12 feuilles sont testées par arbre20). Évidemment, plus la canopée des arbres est grande, plus les chances de détection de CLas sont faibles. Même si les coûts de la PCR elle-même (c’est-à-dire les réactifs, l’équipement de laboratoire de base et le thermocycleur), qui suit le traitement des échantillons, ainsi que l’extraction et la purification des acides nucléiques restent inchangés dans le processus de contour d’oreille, l’incertitude quant à l’endroit où prélever les échantillons sur les arbres asymptomatiques pour déterminer s’ils sont infectés ou non persiste et, à notre avis, est le talon d’Achille de l’enquête HLB en Californie. L’instrument, la technologie, la méthode et les améliorations présentés permettront de traiter des échantillons de plus grande taille en moins de temps et à moindre coût. Par conséquent, cette méthode augmentera la probabilité d’identifier les arbres infectés en temps opportun et améliorera les efforts d’éradication du HLB ou d’autres agents pathogènes envahissants des agrumes en Californie (par exemple, le virus de l’élimination des veines jaunes des agrumes signalé en Californie en août 2022).
Combinés à des méthodes automatisées de traitement des tissus, l’échantillonnage et l’analyse en vrac permettraient de réduire les coûts de traitement des tissus végétaux. Cette réduction des coûts permettrait à de nombreux laboratoires de diagnostic de dépister plus efficacement les vergers dans de nombreux États et de mieux suivre les déplacements du HLB et d’autres maladies. En fin de compte, cela signifie que les producteurs disposeraient d’un outil plus efficace pour ralentir la propagation des maladies grâce à des tests à grande échelle plus efficaces. Bien que l’instrument BTE puisse améliorer la capacité de diagnostic actuelle des laboratoires d’agrumes et bénéficier à l’ensemble de l’industrie des agrumes, la technologie peut également être transférée à d’autres cultures arboricoles. Les données préliminaires sur la concentration et la pureté des acides nucléiques, telles qu’estimées par la DO, ont indiqué que les contours d’oreille peuvent traiter efficacement les tissus de l’amande (59,87 ng/μL ± 7,43 ng/μL et A260/A280 1,17 ± 0,05, n = 9), de la vigne (135,74 ng/μL ± 50,74 ng/μL et A260/A280 1,17 ± 0,06, n = 9) et de la pêche (66,50 ng/μL ± 6,07 ng/μL et A260/A280 1,29 ± 0,05, n = 9) (échantillons aimablement fournis par Foundation Plant Services à l’UC Davis).
La plate-forme de traitement des tissus de bourgeons présentée ici a inspiré le développement d’équipements supplémentaires de traitement des tissus végétaux. Par exemple, un extracteur de tissus foliaires (LTE) est actuellement en cours de développement. Les résultats préliminaires des tests utilisant des feuilles d’agrumes ont démontré que l’instrument LTE pouvait traiter environ sept fois plus de feuilles avec une augmentation de seulement 35 % du temps de traitement par rapport à la méthode standard actuelle à 12 feuilles utilisée en Californie20. Nous avons estimé qu’un protocole d’échantillonnage et de test en vrac pris en charge par LTE pourrait réduire d’un quart le coût global par test de feuille d’agrumes. Des recherches visant à prouver la valeur de l’application pratique de cette technologie sont actuellement en cours dans le cadre d’une subvention globale pour les cultures spéciales du CDFA dans nos laboratoires.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent le peuple Cahuilla comme les gardiens traditionnels de la terre sur laquelle les travaux expérimentaux ont été achevés. Nous sommes reconnaissants au professeur Norman Ellstrand de l’Université de Californie, Riverside, d’avoir fourni un espace de laboratoire pour mener des activités de recherche dans le cadre de ce projet dans le cadre de l’initiative UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ). Cette recherche a été financée par le Programme de subventions globales pour les cultures spéciales (subvention no 18-0001-055-SC). Un soutien supplémentaire a également été fourni par le projet CRB 6100; Institut national de l’alimentation et de l’agriculture de l’USDA, projet Hatch 1020106; et le National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, & AP20PPQS&T00C049) décerné à Georgios Vidalakis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.08" Hex Trimmer line | PowerCare | FPRO07065 | Needed to replace blades. |
| 1 Hp, 8 gal air compressor | California Air Tools | 8010 | Quickly dry chambers after rinsed |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Globe Scientific | 111558B | Store sample in after swishing with syinges |
| 10 mL Syringe Set | Technology Evolving Solutions | TE006-F1-10A-G1000-E1 | Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach |
| 12" Ruler | Westcott | 16012 | To measure trimmer line before cutting |
| 12% Sodium Hypochlorite | Hasa | 1041 | Disinfects chambers after processing |
| -20 C Freezer | Insignia | NS-CZ70WH0 | Store sample after processing |
| 4" x 12" plastic bags | Plymor | FP20-4x12-10 | Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal |
| 6" Cotton Swab | Puritan | 806-PCL | Swab to remove clogs |
| 7 Gallon Storage Tote | HDX | 206152 | Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers |
| Air blow gun | JASTIND | JTABG103A | Directs air into the chambers at high pressure |
| Black Sharpie | Sharpie | S-19421 | Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later |
| Bottle Top Dispensor | Brand | Z627569 | Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe |
| BTE Chamber | Technology Evolving Solutions | TE002BB-A05-E1 | Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool |
| Dish Soap | Dawn | 57445CT | Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber |
| Fume hood with hepa filter | Air Science | P5-36XT-A | Fume hood with hepa filter (ASTS-030) to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Insulated foam shipping container | PolarTech | 261/J50C | Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected |
| Lab coat | Red Kap | KP14WH LN 46 | Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Laptop | Microsoft | Surface | Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base |
| NFC Capable Phone | Samsung | Galaxy S9 | Phone to download and use TES phone app |
| NFC clip tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Clip-E1 | Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app |
| NFC Collar Tag | Technology Evolving Solutions | TE005-Collar-E1 | Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app |
| Nitrile Gloves | Usa Scientific | 3915-4400 | Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills |
| Noise-Reducing Earmuff | 3M | 90565-4DC-PS | Protect ears while operating air compressor and tissue processing base |
| Polyurethane Recoil Air Hose | FYPower | 510019 | Attaches air gun to compressor |
| Saftey glasses | Solidwork | SW8329-US | Protect eyes for chemical and physical hazards |
| Spray bottle | JohnBee | B08QM81BJV | Spray bleach to deconatinate surfaces |
| Tissue Extractor Base | Technology Evolving Solutions | TE001-A-E1 | System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench |
| Tissue Processing Base Weight Scale | Technology Evolving Solutions | TE003-A05-200g-01-E1 | 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield |
| Vermiculite | EasyGoProducts | B07WQDZGRP | Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service |
| Wire Cutter | Boenfu | BOWC-06002-US | Wire cutters to cut trimmer line |
References
- Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
- Vernière, C., et al. Citrus viroids: Symptom expression and effect on vegetative growth and yield of clementine trees grafted on trifoliate orange. Plant Disease. 88 (11), 1189-1197 (2004).
- Zhou, C., et al. Chapter 19 - Citrus viruses and viroids. The Genus Citrus. Talon, M., Caruso, M., Gmitter, F. G. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 391-410 (2020).
- Luckstead, J., Devadoss, S. Trends and issues facing the U.S. citrus industry. Choices Magazine Online. 36 (2), Available from: https://www.choicesmagazine.org/choices-magazine/theme-articles/trends-and-challenges-in-fruit-and-tree-nut-sectors/trends-and-issues-facing-the-us-citrus-industry (2021).
- Simnitt, S., Calvin, L. Fruit and Tree Nuts Outlook. United States Department of Agriculture-Economic Research Service. , Available from: https://www.ers.usda.gov/webdocs/outlooks/98171/fts-370.pdf?v=5697 (2020).
- Forsyth, J., Fruits Damiani, J. C. itrus Citrus Fruits. Types on the market. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. , Academic Press. Cambridge, MA. 1329-1335 (2003).
- Bostock, R. M., Thomas, C. S., Hoenisch, R. W., Golino, D. A., Vidalakis, G. Plant health: How diagnostic networks and interagency partnerships protect plant systems from pests and pathogens. California Agriculture. 68 (4), 117-124 (2014).
- Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).
- Wang, J., et al. Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale. Frontiers in Microbiology. 4, 366 (2013).
- Gergerich, R. C., et al. Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization. Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).
- Moreno, P., Ambrós, S., Albiach-Martí, M. R., Guerri, J., Peña, L. Citrus tristeza virus: A pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology. 9 (2), 251-268 (2008).
- Yokomi, R. K., et al. Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California. Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).
- Selvaraj, V., Maheshwari, Y., Hajeri, S., Yokomi, R. A rapid detection tool for VT isolates of Citrus tristeza virus by immunocapture-reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay. PLoS One. 14 (9), 0222170 (2019).
- Babcock, B. A. Economic impact of California's citrus industry in 2020. Journal of Citrus Pathology. 9, (2022).
- Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).
- Yokomi, R., et al. Molecular and biological characterization of a novel mild strain of citrus tristeza virus in California. Archives of Virology. 163 (7), 1795-1804 (2018).
- Fuchs, M., et al. Economic studies reinforce efforts to safeguard specialty crops in the United States. Plant Disease. 105 (1), 14-26 (2021).
- Singerman, A. The real cost of HLB in Florida. Citrus Industry Magazine. , Available from: https://citrusindustry.net/2019/07/30/the-real-cost-of-hib-in-florida/ (2019).
- McRoberts, N., et al. Using models to provide rapid programme support for California's efforts to suppress Huanglongbing disease of citrus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1776), 20180281 (2019).
- Albrecht, C., et al. Action plan for Asian citrus psyllid and huanglongbing (citrus greening) in California. Journal of Citrus Pathology. 7 (1), (2020).
- Navarro, L., et al. The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the period 1975-2001. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15 (15), (2002).
- Vidalakis, G., Gumpf, D. J., Polek, M. L., Bash, J. A. The California Citrus Clonal Protection Program. Citrus Production Manual. Ferguson, L., Grafton-Cardwell, E. E. , University of California, Agriculture and Natural Resources. Oakland, California. 117-130 (2014).
- Dang, T., et al. High-throughput RNA extraction from citrus tissues for the detection of viroids. In Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
- Osman, F., Vidalakis, G. Real-time detection of viroids using singleplex and multiplex quantitative polymerase chain reaction. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
- Li, R., et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2), 48-55 (2008).
- Saponari, M., Manjunath, K., Yokomi, R. K. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 147 (1), 43-53 (2008).
- Damaj, M. B., et al. Reproducible RNA preparation from sugarcane and citrus for functional genomic applications. International Journal of Plant Genomics. 2009, 765367 (2009).
- Dang, T., et al. First report of citrus leaf blotch virus infecting Bearss lime tree in California. Plant Disease. 104 (11), 3088 (2020).
- Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques. 20 (6), 968-970 (1996).
- Teare, J. M., et al. Measurement of nucleic acid concentrations using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques. 22 (6), 1170-1174 (1997).
- Imbeaud, S. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 56-56 (2005).
- Menzel, W., Jelkmann, W., Maiss, E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods. 99 (1-2), 81-92 (2002).
- Vidalakis, G., et al. SYBR Green RT-qPCR for the universal detection of citrus viroids. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. , Humana. New York, NY. 211-217 (2022).
- Arredondo Valdés, R., et al. A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus. Canadian Journal of Microbiology. 62 (10), 803-811 (2016).
- Li, S., Wu, F., Duan, Y., Singerman, A., Guan, Z. Citrus greening: Management strategies and their economic impact. HortScience. 55 (5), 604-612 (2020).
- CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes. , Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019).
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Bio-ingénierie Numéro 194 Extraction de tissus de bois de bourgeon hachage à la main « Candidatus Liberibacter asiaticus » CLas huanglongbing HLB Virus de la tristeza des agrumes CTVErratum
Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:
Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside
to:
Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside
