Candidatus Liberibacter asiaticus", CLas, huanglongbing, HLB, Citrus tristeza virus, CTV, scientific video journal" />

Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Automatisering af citrusknoptræbehandling til nedstrøms patogendetektion gennem instrumentteknik

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65159
Automatic Translation
*1,6, *2, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5, *1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside, 2Technology Evolving Solutions (TES), 3Department of Bioengineering, University of California Riverside, 4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV, 5University of California Riverside, 6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Vi konstruerede, fremstillede og validerede et instrument, der hurtigt behandler floemrig bark citrus budwood væv. Sammenlignet med nuværende metoder har knoptrævævsekstraktoren (BTE) øget prøvegennemstrømningen og reduceret de krævede arbejds- og udstyrsomkostninger.

Abstract

Graft-overførbare, phloem-begrænsede patogener af citrus såsom vira, viroider og bakterier er ansvarlige for ødelæggende epidemier og alvorlige økonomiske tab over hele verden. For eksempel dræbte citrustristeza-viruset over 100 millioner citrustræer globalt, mens "Candidatus Liberibacter asiaticus" har kostet Florida 9 milliarder dollars. Anvendelsen af patogentestet citrusknopved til træformering er nøglen til forvaltningen af sådanne patogener. Citrus Clonal Protection Program (CCPP) ved University of California, Riverside, bruger polymerasekædereaktion (PCR) assays til at teste tusindvis af prøver fra citrusknoptræ kildetræer hvert år for at beskytte Californiens citrus og for at levere rene formeringsenheder til National Clean Plant Network. En alvorlig flaskehals i den molekylære påvisning af citrusvirus og viroider med høj kapacitet er plantevævsbehandlingstrinnet.

Korrekt vævsforberedelse er afgørende for ekstraktion af nukleinsyrer af høj kvalitet og downstream-anvendelse i PCR-assays. Hakning, vejning, frysetørring, slibning og centrifugering af plantevæv ved lave temperaturer for at undgå nedbrydning af nukleinsyre er tidskrævende og arbejdskrævende og kræver dyrt og specialiseret laboratorieudstyr. Dette papir præsenterer valideringen af et specialiseret instrument konstrueret til hurtigt at behandle floemrige barkvæv fra citrusknopved, kaldet budwoodvævsekstraktoren (BTE). BTE øger prøvegennemstrømningen med 100 % sammenlignet med de nuværende metoder. Derudover reducerer det arbejdskraft og omkostningerne ved udstyr. I dette arbejde havde BTE-prøverne et DNA-udbytte (80,25 ng/μL), der var sammenligneligt med CCPP's håndhuggeprotokol (77,84 ng/μL). Dette instrument og protokollen for hurtig plantevævsbehandling kan gavne flere citrusdiagnostiske laboratorier og programmer i Californien og blive et modelsystem til vævsbehandling til andre træagtige flerårige afgrøder over hele verden.

Introduction

Graft-overførbare phloem-begrænsede patogener af citrus, såsom viroider, vira og bakterier, har forårsaget ødelæggende epidemier og alvorlige økonomiske tab i alle citrusproducerende områder i verden. Citrusviroider begrænser produktionsfaktorer på grund af de exocortis og kakeksi sygdomme, de forårsager i økonomisk vigtige citrustyper, såsom trifoliate, trifoliate hybrider, mandariner, klementiner og mandariner 1,2,3. I Californien er disse viroidfølsomme citrustyper grundlaget for det voksende og rentable marked for "easy-peelers", der følger den skiftende tendens i forbrugernes præference for frugter, der er lette at skrælle, segmenteret og frøfri 4,5,6. Således reguleres citrusviroider under California Department of Food and Agriculture (CDFA) "Citrus Nursery Stock Pest Cleanliness Program-Senate Bill 140", og laboratorierne i CDFA's Plant Pest Diagnostics Branch udfører tusindvis af citrusviroidtest årligt 7,8,9,10 . Citrus tristeza virus (CTV) har været ansvarlig for døden af over 100 millioner citrustræer siden begyndelsen af den globale epidemi i 1930'erne 3,9,10,11. I Californien udgør stammegruber og trifoliatbrydende resistensisolater af virussen en alvorlig trussel mod den californiske citrusindustri på 3,6 milliarder dollars12,13,14. Derfor klassificerer CDFA CTV som en reguleret klasse A plante skadedyr, og laboratoriet i Central California Tristeza Eradication Agency (CCTEA) udfører omfattende feltundersøgelser og tusindvis af virustest hvert år15,16. Bakterien "Candidatus Liberibacter asiaticus" (CLas) og huanglongbing (HLB) sygdommen anslås at have forårsaget tæt på 9 milliarder dollars økonomisk skade på Florida som følge af en 40% reduktion af citrusareal, et fald på 57% i citrusoperationer og et tab på næsten 8.000 job17,18. I Californien blev en hypotetisk reduktion på 20% i citrusareal på grund af HLB forudsagt at resultere i mere end 8.200 tab af arbejdspladser og en reduktion på over en halv milliard dollars i statens bruttonationalprodukt. Derfor bruger Citrus Pest and Disease Prevention Program over 40 millioner dollars årligt på undersøgelser for at teste, opdage og udrydde CLas fra Californien14,17,19,20.

Et nøgleelement i forvaltningen af citrusviroider, vira og bakterier er brugen af patogentestede formeringsmaterialer (dvs. knoptræ) til træproduktion. Patogentestet citrusknoptræ produceres og vedligeholdes inden for omfattende karantæneprogrammer, der anvender avancerede patogeneliminerings- og detektionsteknikker10,21. Citrus Clonal Protection Program (CCPP) ved University of California, Riverside, tester tusindvis af knoptræprøver hvert år fra citrussorter, der nyligt importeres til staten og USA, samt citrusknoptrækildetræer for at beskytte Californiens citrus og understøtte funktionerne i National Clean Plant Network for Citrus10,17,22. For at håndtere den store mængde citrustest er pålidelige og omkostningseffektive patogendetektionsassays med høj gennemstrømning en grundlæggende komponent for succes med programmer som CCPP 7,10,22.

Mens molekylærbaserede patogendetektionsassays såsom polymerasekædereaktion (PCR) har muliggjort betydelige stigninger i gennemstrømningen i plantediagnostiske laboratorier, er det vores erfaring, at en af de mest kritiske flaskehalse i implementeringen af protokoller med høj gennemstrømning er behandlingstrinnet for plantevævsprøver. Dette gælder især for citrus, fordi de aktuelt tilgængelige protokoller til behandling af floemrige væv såsom bladblade og knopbark er arbejdskrævende, tidskrævende og kræver dyrt og specialiseret laboratorieudstyr. Disse protokoller kræver håndhakning, vejning, frysetørring, slibning og centrifugering ved lave temperaturer for at undgå nedbrydning af nukleinsyre 8,23,24. For eksempel omfatter prøvebehandling på CCPP-diagnoselaboratoriet (i) håndhakning (6-9 prøver / h / operatør), (ii) frysetørring (16-24 timer), iii) pulverisering (30-60 s) og (iv) centrifugering (1-2 timer). Processen kræver også specialiserede forsyninger (f.eks. kraftige safe-lock-rør, slibekugler i rustfrit stål, adaptere, knive, handsker) og flere stykker dyrt laboratorieudstyr (f.eks. ultra-lav fryser, frysetørrer, vævspulverisator, flydende nitrogenkryostation, kølecentrifuge).

Som i enhver branche er udstyrsteknik og automatisering af processer nøglen til at sænke omkostningerne, øge gennemstrømningen og levere ensartede produkter og tjenester af høj kvalitet. Citrusindustrien har brug for billige vævsbehandlingsinstrumenter, der kræver et minimum af færdigheder for at fungere, og som sådan er lette at overføre til diagnostiske laboratorier og feltoperationer for at muliggøre høj prøvebehandlingskapacitet til hurtig nedstrøms patogendetektion. Technology Evolving Solutions (TES) og CCPP udviklede (dvs. design og fabrikation) og validerede (dvs. testet med citrusprøver og sammenlignet med standard laboratorieprocedurer) et billigt (dvs. elimineret behovet for specialiseret laboratorieudstyr) instrument til hurtig behandling af floemrige citrusvæv (dvs. budwood), kaldet budwood tissue extractor (BTE). Som det fremgår af figur 1, indeholder BTE en basiskomponent til strøm og styring samt et aftageligt kammer til forarbejdning af citrusknopved. BTE-kammeret består af et slibehjul, der er specielt designet til at fjerne det floemrige barkvæv fra citrusknopved. Det strimlede barkvæv skubbes hurtigt ud gennem en glideport ind i en sprøjte indeholdende ekstraktionsbuffer, filtreres og gøres klar til nukleinsyreekstraktion og oprensning uden yderligere håndtering eller forberedelse (figur 1). BTE-systemet omfatter også en papirløs prøvesporingsapplikation og en integreret vejeapplikation, der registrerer prøvebehandlingsoplysningerne i en online database i realtid.

BTE-systemet har øget CCPP's laboratoriediagnostiske kapacitet med over 100 % og har konsekvent fremstillet citrusvævsekstrakter, der er egnede til oprensning af nukleinsyrer af høj kvalitet og nedstrøms påvisning af transplantatoverførbare patogener af citrusfrugter ved hjælp af PCR-assays. Mere specifikt har BTE reduceret tiden til vævsbehandling fra over 24 timer til ~ 3 minutter pr. prøve, erstattet laboratorieinstrumenter, der koster over $ 60,000 (figur 2, trin 2-4) og tilladt behandling af større prøvestørrelser.

Dette papir præsenterer BTE-citrusbarkvævsbehandling med høj kapacitet, nukleinsyreekstraktion og validering af patogendetektion med citrusknoptræprøver fra kildetræer, herunder alle de relevante positive og negative kontroller fra henholdsvis CCPP Rubidoux Quarantine Facility og Lindcove Foundation Facility. Vi viser også ændringer i gennemløb og behandlingstid sammenlignet med den aktuelle laboratorieprocedure (figur 2). Derudover giver dette arbejde en detaljeret, trinvis protokol til citruspatogentestlaboratorier og demonstrerer, hvordan BTE kan understøtte funktionerne i patogen-rene planteskolebestand, undersøgelse og udryddelsesprogrammer.

Figure 1
Figur 1: Knoptræ vævsekstraktor. BTE indeholder en basiskomponent til strøm og styring samt et aftageligt kammer til behandling af citrusknoptræ. BTE-kammeret består af en slibeskive, der er specielt designet til at fjerne det floemrige barkvæv fra citrusknopved. Det strimlede barkvæv skubbes hurtigt ud gennem en glideport i en sprøjte, filtreres og gøres klar til nukleinsyreekstraktion og oprensning uden yderligere håndtering eller forberedelse. Forkortelse: BTE = knoptræ vævsekstraktor. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Trin-for-trin sammenligning mellem den konventionelle håndhakkende laboratorieprocedure og BTE-behandling. BTE-behandling involverer citrusbarkvævsbehandling med høj kapacitet, nukleinsyreekstraktion og patogendetektion. Tiden for hvert trin er angivet i parentes. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Indsamling af citrusknoptræprøverne til afsendelse

  1. Send Technology Evolving Solutions et regneark med træoplysninger, som de kan indlæse på deres webserver (til sidst opretter brugeren nye træer).
  2. Brug telefonappens TES-tracker til at vælge et træ, og hold et NFC-halsbåndsmærke (Near Field Communication) på telefonen for at indlæse træoplysningerne i tagget.
  3. Indsæt tre til fire citrusknoptræprøver i den BTE-kompatible plastikposeholder, og luk med låget.
    1. Sørg for, at knoptræets længde ikke overstiger 8 tommer og ikke er mindre end 5 tommer.
      1. Hvis længden er større end 8 tommer, skal du bruge et sterilt engangsbarberblad eller beskæresaks dekontamineret med 10% blegemiddelopløsning (1% natriumhypochlorit) for at gøre den kortere.
      2. Hvis længden er mindre end 5 tommer, skal du samle en anden knoptræprøve til at lægge i posen.
    2. Sørg for, at enhver aksillær vækst eller store torner fjernes manuelt eller ved hjælp af 10% blegemiddel-desinficerede skæreværktøjer (1% natriumhypochlorit).
      BEMÆRK: Dette trin er vigtigt, så knoptræet er lettere at manøvrere i kammerets åbning.
    3. Sørg for, at der ikke er knoptræprøver, der har buede funktioner. Hvis de gør det, fjernes de med 10 % blegemiddeldesinficerede skæreværktøjer (1 % natriumhypochlorit), og de lige dele af prøven anbringes kun i BTE-poserne.
      BEMÆRK: Buet knoptræ er meget vanskeligt at manøvrere ind i instrumentet, hvilket resulterer i ujævn barkafstribning.
  4. Brug telefonappens TES-tracker til at scanne træets NFC-kravemærke og linke det til NFC-klipmærket på prøveposen.
  5. Vær opmærksom på knoptræets tykkelse, da det bestemmer, hvordan operatøren vil strippe den floemrige knoptræbark inde i BTE-kammeret.
    1. Hvis knoptræet har en tykkelse under 0,20 tommer, skal du være forsigtig, mens du stripper knopved, fordi de hurtige spindetråde i kammeret vil pulverisere hele knoptræet til dets kerne, ud over barklaget og ind i det ikke-floemrige væv af træ og pith.
    2. Vælg tykkere knopved, fordi det er lettere at strippe barkvævene, samtidig med at man undgår de ikke-floemrige knopvæv.
  6. Læg prøverne i en isoleret forsendelsescontainer med et par isposer.

2. Opsætning i stinkhætten

BEMÆRK: Det foretrækkes at betjene BTE inde i en stinkhætte. Dette vil reducere risikoen for krydskontaminering af plantevæv og laboratoriekontaminering.

  1. Desinficer med en 10% (1% natriumhypochlorit) sprayflaske.
    1. Sprøjt overfladen på emhætten, og lad blegemidlet sidde i ca. 1 min, før du tørrer det af med et køkkenrulle.
    2. Sprøjt et køkkenrulle med blegemiddelopløsningen. Tør TE-basen, vægtkomponenterne (vægt, luftskærm og tårn) og en markørpen af.
  2. Pak et sprøjtesæt ud for antallet af prøver, der skal behandles, og læg dem i en overdækket papkasse.
  3. Hav en pakke vatpinde til rådighed uden for emhætten, hvis de er nødvendige.
  4. Forbered vægtskalaen.
    1. Fjern vægttårnet fra vægten, og hold tænd/sluk-knappen nede for at tænde den. Placer tårnet i midten af skalaen, når skalaen viser 0.
    2. Skub vægtens luftskærm hen over vægtens forside.
  5. Forbered vævsekstraktorbasen ved at dreje kontakten på bagsiden. Sørg for, at kontakten på venstre side af kassen trykkes ned øverst. Vent på en blinkende grøn LED, som angiver, at kammeret er klar.

3. Opsæt rengøringsstationerne (supplerende figur S1).

  1. Placer 1 liter vand i ultralydsrenseren.
  2. Sæt to skraldeposer over toppen af ultralydsrenseren.
  3. Hæld ~ 5 L 10% blegemiddel (1% natriumhypochloritopløsning) i ultralydrenseren.
  4. Fyld vandkarret med nok vand til at nedsænke et kammer.
  5. Tænd for luftkompressoren, og åbn ventilen.
  6. Opret en baggrund for at fange væsken, mens kammeret tørrer.

4. Behandling af materialet til BTE til stripning af citrusknoptræ

  1. Læg kammeret på BTE-basen.
    1. Forbered BTE-kammeret.
      1. Fastgør en tom prøvepose bag på kammeret. Brug to O-ringe til at fastgøre den tomme pose til BTE-kammerets bagdyse.
      2. Undersøg bladet for tegn på slid eller skader, såsom snit, der dannes på bladet, hvor det fortsætter ind i plasten, eller snit, der dannes på spidsen. Sørg for, at pilen på bladet flugter med enkeltlåsesymbolet.
      3. Sørg for, at luftudløsningen i bunden af kammeret er vendt mod O-symbolet . Placer det klare låg over kammeråbningen, og skub den klare BTE-glide på kammeret ved hjælp af sporet til højre for kammeret. Skub låsen i bunden af kammeret så langt som muligt ind i diaset. Sørg for, at stempelhætten er monteret øverst på diaset.
    2. Placer kammeret på BTE-basen med BTE-basens dyse stikkende ind i bagsiden af kammeret. Vent på, at den blå LED blinker, hvilket indikerer, at placeringen er vellykket.
  2. Læg prøven på BTE-basen ved at flytte det hvide klistermærke på NFC-clipmærket til et Z i højre side af æsken. Flyt mærket i en langsom cirkulær bevægelse på Z, indtil det gule lys begynder at blinke. Fastgør prøven til BTE-basen, og sørg for, at prøveposen ikke har huller i den; Hvis der er et hul, skal du lappe det med tape. Placer O-ringen over prøveposen for at fastgøre den til forsiden af BTE-dysen.
  3. Ilæg det ubrugte sprøjtesæt.
    1. Tare sprøjtesættet. Placer den ubrugte sprøjte på vejevægttårnet. Fjern sprøjtesættet, når et rødt lys begynder at blinke, eller vægten viser 0.
    2. Fjern stemplet fra sprøjten med filteret. Sørg for, at væsken er i den nederste sprøjte (ikke-filter). Placer stemplet til side på et køkkenrulle eller på tårnet, hvor det sorte stempel ikke berører nogen overflader.
    3. Fastgør sprøjten til skydeudgangsporten ved at trykke udgangsporten ind i sprøjten og dreje 90°.
  4. Behandl knoptræprøven.
    FORSIGTIG: BTE har bevægelige dele med høj hastighed. Al drift skal ske inde i en stinkhætte. Alle brugere bør bruge beskyttelsesbriller, ørekopper (ørepropper) og alt andet personligt beskyttelsesudstyr (PPE), såsom handsker og laboratoriefrakker.
    1. Tryk på den øverste sorte knap for at starte maskinen. Tryk en gang til for at stoppe motoren når som helst under behandlingen.
      BEMÆRK: Boksen har hastigheds- og temperaturregistrering for at sikre, at den fungerer korrekt.
    2. Tag en knoptræspind gennem posen, og læg den gennem toppen af BTE-dysen.
    3. Tag fat i knoptræspinden på den anden side af kammeret med den anden hånd, og langsomt tomme ned i bladet. Lyt efter en blid summende lyd, der indikerer, at knoptræet bliver fjernet fra sin bark. Bevæg langsomt knoptræet frem og tilbage, mens du roterer det.
      1. Hvis der høres en høj, aggressiv hakkelyd, skal du hurtigt flytte grenen til toppen og/eller trykke på den øverste knap for at stoppe motoren. For at stoppe motoren skal du bruge kontakten i højre side til at afslutte behandlingen (se trin 4.4.3.2).
      2. Hvis der ikke kommer noget materiale ud af udgangen, når der skæres, har kammeret en tilstopning. Sluk for motoren, fjern glidestempelhætten, og brug vatpindens plastik til at skubbe tilstopningen ud af maskinens udgang. Brug kontakten til højre til at afslutte behandlingen: Op = Fremadskæring; Mellem = Motor slukket; Ned = omvendt skæring.
    4. Gentag trin 4.4.2 og trin 4.4.3 for de resterende grene.
      BEMÆRK: En generel indikator for, at nok knoptræbark er fjernet, er, når 25% af sprøjten er fyldt med plantevæv. Transplantatoverførbare patogener af citrus kan være ujævnt fordelt i træet. Derfor indsamles tre til fire knoptræprøver fra omkring citrustræets baldakin. Det er vigtigt, at hver knoptræsprøve i BTE-bæreposen bidrager til den endelige formalede vævsprøve for at sikre, at en fuld trærepræsentativ prøve testes for patogener.
    5. Tryk på den øverste sorte knap for at stoppe behandlingen. Vent på, at lyset begynder at blinke gult igen.
  5. Kontroller prøvens vægt.
    1. Drej sprøjten 90°, og træk den ned for at løsne den. Sæt stemplet tilbage på sprøjten, og placer sprøjten på tårnet.
    2. Vent på, at vægten automatisk registrerer prøven, og find ud af, om den ligger inden for det korrekte vægtområde (0,25 ± 0,05 g). Hvis prøvevægten er for lav (<0,20 g), gentages trin 4.4. den røde LED begynder at blinke. Hvis prøvevægten er for høj (>0,30 g), fjernes noget af prøvematerialet; den gule LED begynder at blinke langsommere. Hvis prøven er inden for området, begynder den grønne LED at blinke.
  6. Homogenisering af knoptræprøven
    1. Fjern stemplet fra sprøjten med prøven, skub væsken ind i sprøjten med prøven, og tilsæt stemplet igen. Stemplet skubber bufferen og plantesaften gennem netfilteret (tilbageholder eventuelle store barkvævsstykker) og via gummislangen ind i den tomme sprøjte.
    2. Bland prøven ved at skubbe bufferen og plantesaften frem og tilbage fra den ene sprøjte til den anden. Gentag ~3x-4x, og indtil prøven bliver en homogen grøn væskeblanding.
    3. Når den er godt homogeniseret, skubbes plantesaftprøven ind i sprøjten uden maskefilteret, og gummislangen og sprøjten med filteret fjernes fra sprøjten med prøven.
    4. Fjern plantesaftprøven fra sprøjten til et 2 ml sterilt mikrocentrifugeglas, og opbevar ved -20 °C indtil yderligere brug. Brug en permanent markør til at mærke prøven med posenummeret.
      BEMÆRK: Planteprøvesaft fra trin 4.6.5 kan nu behandles med enhver af de tilgængelige nukleinsyre, RNA eller DNA, ekstraktionsmetoder baseret på phenol-chloroform, silicasøjle eller magnetiske perler 9,25,26,27 til nukleinsyreekstraktion og oprensning (se trin 7) og nedstrøms påvisning af transplantatoverførbare patogener af citrus (se trin 8).

5. Desinficering af BTE's aftagelige kammer

FORSIGTIG: Hvis bufferen fra sprøjtesættet kommer ind i kammeret eller glider, skal du skylle og følge alle laboratoriets sikkerhedsregler før rengøring. Sprøjtesættet indeholder guanidinthiocyanat. Hvis bufferen fra sprøjtesættet kommer i kontakt med blegemiddel, vil det skabe cyanidgas.

  1. Udfør følgende trin, når den 10. prøve er behandlet i kammeret. Bemærk, at den grønne LED fortsætter med at blinke i stedet for at skifte til blåt blink.
  2. Demonter BTE-kammeret for at rense alle mulige forurenende stoffer; Fjern det klare plastikdæksel, ryd kammerglideren, og ryd tilstopningsporten på kammerglideren.
  3. Drej luftudløsningsventilen i bunden af kammeret til åben position (åbent hængelåsmærke). Placer kammerkomponenterne i opsætningen ultralydsrenser (se trin 3.1). Placer låget under kammeret for at forhindre, at det flyder. Kør ultralydsrenseren i 15 min.
    BEMÆRK: Ultralydsrensebadet (5 L) kan rumme op til to kamre.
  4. Skyl kammerkomponenterne i vandbadet (trin 3.4) i mindst 30 s. Flyt kammerkomponenterne til tørrestationen.
    FORSIGTIG: Tørring vil forårsage hurtigt bevægelige dele i kammeret, høje lyde (~ 85 decibel [dB]) og mulig stænk. Alle brugere skal bruge beskyttelsesbriller, ørekopper (ørepropper), laboratoriefrakker og alle andre personlige værnemidler som krævet i driftslaboratoriets sikkerhedsregler.
  5. Tør BTE-kammeret.
    1. Placer luftpistolen på linje med rillen i kammerets øverste åbning (hvor glideren typisk ville være). Tryk på pistolens udløser for at dispensere luft i ~ 30 s.
      BEMÆRK: Sørg for, at åbningen er væk fra brugeren mod baggrunden. Dette skal dreje bladet indstillet for at fjerne væsken fanget under det.
    2. Placer luftpistolen mod kammerets øverste dyser. Tryk på udløseren på luftpistolen, og spor langsomt tre fulde cirkler af hver dyseindgang.
    3. Placer luftpistolen i midten af BTE. Start fra det inderste punkt, hold aftrækkeren nede og flyt, indtil luftpistolen peger mod det sted, hvor glideren ville være.
    4. Kør hurtigt luft over hele kammeret, forsiden og bagsiden, for at få overfladevandet væk udefra.
  6. Tør BTE-diaset.
    1. Placer luftpistolen i stemplets åbning på lysbilledet, og tryk på aftrækkeren for at skubbe vand ud af glideudgangen.
    2. Kør en luftpistol langs den indvendige overflade af diaset for at tørre den.
    3. Kør en luftpistol langs gliderillen for at skubbe vand ud.
    4. Kør hurtigt luft over hele ydersiden for at få overfladevand væk fra det.
  7. Tør komponenterne.
    1. Hold glidestempelhætten og O-ringene i hånden, og tryk på udløseren.
    2. Kør en luftpistol over lågets indvendige overflade.
    3. Placer komponenterne i kammeret og skub for at fortsætte tørringen eller samle dem igen.
      BEMÆRK: For et miljø med høj vævsbehandling med flere funktionelle BTE'er kan der leveres et batchrensningssystem, der er i stand til at dekontaminere 10 kamre samtidigt.

6. Bortskaffelse og desinficering

  1. Bortskaf sprøjterne og gummislangen i den udpegede guanidinaffaldsbeholder.
  2. Bortskaf alt plantemateriale i beholderen til biofarligt affald.
  3. Fjern BTE-kammeret fra BTE-basen.
  4. BTE-kammeret skilles ad, og der fortsættes til dekontaminering som beskrevet i trin 5.

7. Vurdering af vævsbehandlingen og kvaliteten af RNA oprenset fra BTE-citrusknoptræekstrakterne

BEMÆRK: I denne protokol brugte vi knoptræprøver fra 255 citrustræer til at sammenligne den tid, der kræves til behandling af citrusknoptrævæv, og kvaliteten af RNA renset fra barkvævsekstrakter fremstillet af BTE (figur 2, højre side, trin 1, trin 5 og trin 6) versus den, der er fremstillet efter den lovgivningsmæssigt godkendte citrusknoptrævævsbehandlingsmetode ved hjælp af håndskrælning og hakning, frysetørring, pulverisering og centrifugering af barkvævet, som beskrevet af Dang et al.23 (figur 2, venstre side, trin 1-6).

  1. Nuværende laboratorieprocedure: Forbered knoptræprøver til vævsbehandling i henhold til den lovgivningsmæssigt godkendte metode23.
    1. Udfør håndskrælning og hakning af barkvævet, frysetørring, pulverisering, centrifugering og overførsel af plantesaften til RNA-ekstraktionsrøret som beskrevet af Dang et al.23 (figur 2, venstre side, trin 1-6).
    2. Efter håndskrælning af prøverne af tre til fire knoptræer fra hvert testet træ anbringes alt knoptræet i en BTE-kompatibel plastikposeholder, og det opbevares ved 4 °C indtil BTE-behandlingen (trin 7.2).
  2. BTE-procedure: Start BTE-behandling af citrusknoptræ (afsnit 4, trin 4.1-4.6; Figur 2, højre side, trin 1, trin 5 og trin 6).
    1. Brug knoptræprøverne, der er gemt inde i BTE-bæreposerne fra trin 7.1.2.
  3. RNA'et ekstraheres og renses fra plantesaften opnået ved den aktuelle laboratorieprocedure (trin 7.1.1) og BTE-proceduren (trin 7.2.2) ved hjælp af den forskriftsmæssigt godkendte halvautomatiske magnetiske perlebaserede metode 8,23,28.
  4. Vurder RNA-kvaliteten ved at måle dens koncentration, renhed og integritet 8,23,24,29,3 3,31.
    1. For at beregne koncentrationen skal du bruge spektrofotometri og optisk densitet (OD) ved en bølgelængde på 260 nm.
    2. For at vurdere renheden skal du bruge et spektrofotometrisk OD-forhold på 260/280.
    3. For at kontrollere integriteten skal du bruge revers transkription (RT) kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) rettet mod mRNA'et af NADH-dehydrogenasecitrusgenet 24,32.

8. Vurdering af krydskontaminering og påvisning af citrusvira og -viroider ved hjælp af RNA renset fra BTE-citrusknoptræekstrakter

BEMÆRK: I denne protokol brugte vi knoptræprøver fra 72 ikke-inficerede citrustræer og et træ blandet inficeret med vira og viroider til at vurdere potentialet for krydskontaminering mellem prøver, når de behandles af BTE (figur 2, højre side, trin 1, trin 5 og trin 6) og egnetheden af RNA renset fra barkvævsekstrakter fremstillet af BTE til brug som skabelon til RT-qPCR-påvisning af citrusvira og viroider.

  1. Første behandling af BTE-prøver: Udfør et baseline-eksperiment med 72 ikke-inficerede prøver.
    1. Der fremstilles tre (A-C) BTE-kamre (trin 4.1.1).
    2. Alle ikke-inficerede citrusknoptræprøver (1-72) tilberedes i BTE-bæreposer, og der tilberedes et lige antal (72) i BTE-prøveopsamlingssystemet med to sprøjter med et sprøjtesystem til hver prøve (trin 2.4).
    3. Prøvebæreposerne og prøveopsamlingssprøjterne adskilles i seks batcher (I-VI) med hver 12 prøver.
    4. Behandlingen af BTE-citrusknoptræ påbegyndes (trin 4) ved at følge nedenstående sekvens (trin 8.1.4.1-8.1.4.6) (se tabel 1, Første behandling af BTE-prøven).
      1. For batch I/prøve 1-12 behandles 12 prøver ved hjælp af kammer A. Kammer A desinficeres efter prøve 12 (trin 5).
      2. For batch II/prøve 13-24 behandles 12 prøver ved hjælp af kammer B. Kammer B desinficeres efter prøve 24 (trin 5).
      3. For batch III/prøve 25-36 behandles 12 prøver ved hjælp af kammer C. Kammer C desinficeres efter prøve 36 (trin 5).
      4. For batch IV/prøve 37-48 behandles 12 prøver ved hjælp af det desinficerede kammer A (trin 8.1.4.1).
      5. For batch V/prøver 49--60 behandles 12 prøver ved hjælp af det desinficerede kammer B (trin 8.1.4.2).
      6. For batch VI/prøve 60-72 behandles 12 prøver ved hjælp af det desinficerede kammer C (trin 8.1.4.3).
    5. BTE-bæreposerne med alle prøverne opbevares ved 4 °C indtil brug i trin 8.2.
    6. RNA'et ekstraheres og renses fra de 72 plantesaftprøver, der genereres i trin 8.1.4.1-8.1.4.6 ved hjælp af den lovmæssigt godkendte halvautomatiske magnetiske perlebaserede metode 8,23,28.
    7. Udfør RT-qPCR til påvisning af citrusvirus og viroider, som tidligere beskrevet 8,33.
  2. Til den anden behandling af BTE-prøver udføres et krydskontamineringsforsøg med 70 ikke-inficerede prøver og to blandede inficerede prøver.
    1. Der fremstilles tre (A-C) BTE-kamre (trin 4.1.1).
    2. Den blandingsinficerede citrusknoptræprøve (73) fremstilles i to BTE-bæreposer (trin 1.3) til i alt to inficerede prøver.
    3. BTE-bæreposerne samles med de ikke-inficerede prøver af citrusknoptræ fra trin 8.1.5, undtagen prøve 3-batch I og prøve 51-batch V (se prøveerstatning i trin 8.2.4), til i alt 70 ikke-inficerede prøver.
    4. Medtag den første BTE-bærepose med den blandede inficerede prøve 73 i stedet for prøve 3 i batch I og den anden i stedet for prøve 51 i batch V for et samlet antal på 72 prøver.
    5. Forbered et lige stort antal (72) i BTE-prøveopsamlingssystemet med to sprøjter med et dobbeltsprøjtesystem til hver prøve (trin 2.4).
    6. De 72 prøvebæreposer og prøveopsamlingssprøjter opdeles i seks batcher (I-VI) med hver 12 prøver.
    7. BTE-forarbejdning af citrusknoptræ påbegyndes (trin 4) i samme rækkefølge som i trin 8.1.4.1-8.1.4.6.
      BEMÆRK: Den eneste forskel er udskiftningen af prøve 3 i batch I og prøve 51 i batch V med den inficerede prøve 73 (trin 8.2.4) (tabel 1, anden BTE-prøvebehandling).
    8. RNA'et ekstraheres og renses fra de 72 plantesaftprøver, der genereres i trin 8.2.7 som i trin 8.1.6.
    9. Udfør RT-qPCR til påvisning af citrusvirus og viroider som i trin 8.1.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

RNA-ekstraktion, oprensning og kvalitet ved hjælp af BTE-behandlet knoptræ citrusvæv og vurdering af tid til vævsbehandling
Vi brugte knoptræprøver fra 255 repræsentative citrustræer til denne test for at sammenligne RNA-kvaliteten fra BTE versus standardproceduren. Prøverne blev behandlet af knoptrævævsekstraktoren (BTE) (protokoltrin 4.1-4.6 og figur 2, højre side, trin 1, trin 5 og trin 6) eller fremstillet efter den lovgivningsmæssigt godkendte citrusknoptrævævsbehandlingsmetode, der anvender håndskrælning og hakning, frysetørring, pulverisering og centrifugering af barkvævet, som beskrevet af Dang et al.23 (figur 2, venstre side, trin 1-6).

Sammenligningen side om side af BTE med den konventionelle protokol for håndhakning og laboratorieudstyr til behandling af citrusvæv viste, at kvaliteten (dvs. koncentrationen, renheden og integriteten) af de ekstraherede nukleinsyrer (figur 3A-C) og egnetheden til downstream-anvendelse til PCR-påvisning af citruspatogener (data ikke vist) var sammenlignelige. Samtidig blev den tid, der blev brugt på behandling af prøver, reduceret betydeligt ved hjælp af TE/BTE-systemet. BTE mere end fordoblede prøvegennemstrømningen i CCPP-laboratoriet, hvilket reducerede arbejds- og laboratorieudstyrsomkostningerne ved at eliminere behovet for titusinder af dollars instrumenter, såsom perler, beaters, centrifuger og kryostationer.

Nukleinsyrerne ekstraheret med BTE havde en gennemsnitlig koncentration på 76,96 ng/μL ± 26,23 ng/μL (n = 181) og var af høj renhed med lav proteinforurening (A260/A280 2,27 ± 0,17, n = 181) (figur 3B,C). Disse værdier var sammenlignelige med nukleinsyrer produceret af CCPP's standard manuelle protokol (koncentration: 82,25 ng/μL ± 33,95 ng/μL, n = 181 og A260/A280 2,22 ± 0,10, n = 181) (figur 3B,C). Nukleinsyreintegriteten (RT-qPCR for citrusgenet nad5) var meget ens for BTE (Cq 20,97 ± 2,26, n = 181) og den standard manuelle CCPP-protokol (Cq 19,25 ± 1,53, n = 181) (figur 3A). Resultaterne viste også, at BTE-instrumentet kunne behandle et højere prøvevolumen inden for samme tidsramme sammenlignet med den konventionelle metode. Den konventionelle laboratorieprocedure krævede ~ 7-10 minutter til håndhakning pr. prøve og i alt 12 minutter til vævsbehandling (frysetørring, slibning og centrifugering), mens BTE kunne behandle citrusvæv til nukleinsyreekstraktion i ~ 3 minutter pr. Prøve.

Figure 3
Figur 3: Kvaliteten af nukleinsyreekstrakterne i de 181 repræsentative citrusknoptræprøver som defineret ved koncentration, renhed og integritet. Prøverne blev behandlet ved hjælp af BTE og den konventionelle protokol for håndhakning og laboratorieudstyr. A) Nukleinsyrekoncentrationen blev bestemt ved absorbans ved 260 nm; B) renheden blev bestemt som forholdet mellem absorbanserne ved 260 nm og 280 nm (A260/280). (C) Nukleinsyreintegriteten blev analyseret ved RT-qPCR rettet mod mRNA'et af NADH-dehydrogenase (Nad5) citrusgenet. Intervallerne for optimale værdier er angivet mellem røde stiplede cirkler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Påvisning af transplantatoverførbare patogener af citrusfrugter, vurdering af krydskontaminering og påvisning af citrusvira og viroider ved hjælp af RNA renset fra BTE-citrusknoptræekstrakter
Vævsbehandlingsmetodens validitet blev evalueret ved at behandle 72 sunde citrusknoptræprøver side om side med alle sunde prøver og med introduktion af to prøver fra en træblanding inficeret med vira og viroider (tabel 1 og figur 4A, B). Nukleinsyrer ekstraheret fra begge batcher blev udsat for konventionel laboratoriebaseret q-PCR som tidligere beskrevet 8,33. Ingen af de 72 sunde prøver fra den første BTE-prøvebehandling gav amplifikationskurver for de testede citruspatogener (dvs. falske positive) (figur 4A). Resultaterne tyder på, at BTE kan behandle citrusvæv lige så godt sammenlignet med standardlaboratorieprotokollen med håndhakkemetoder. I den anden behandling af BTE-prøver vurderede vi potentialet for krydskontaminering mellem BTE-hoveder og i prøver behandlet med samme BTE-hoved (trin 1-6) og nukleinsyrernes egnethed til downstream-applikationer (dvs. til brug som skabelon til RT-qPCR-påvisning af citrusvira og viroider). I den anden BTE-prøvebehandling med to indførte blandede inficerede prøver blev nukleinsyrer produceret af BTE-protokollen med succes anvendt til at detektere forskellige citrusvira og viroider (f.eks. triplexvirus, citrusbladpletvirus [CLBV], citruspsorosevirus [CPsV], citrustristezavirus [CTV]), apscaviroider (citrusbøjet bladviroid [CBLVd], citrusdværgviroid [CDVd], citrusviroid [CVd-V], citrusviroid V [CVd-V], citrusviroid VI [CVd-VI] og citrusviroid VII [CVd-VII]), ikke-apscaviroider hopstuntviroid (HSVd; hostuviroid), citrusbarkkrakkende viroid (CBCVd; cocadviroid) og citrus exocortis viroid (CEVd; pospiviroid) i batch 1 og batch 5. Inden for batch 1 og batch 5 var prøver, der fulgte den inficerede, positive for ovennævnte plantesygdomme, men havde stigende Cq-værdier. Der blev imidlertid ikke påvist krydskontaminering mellem hovederne eller falske positive eller negative resultater (figur 4B).

Batch Prøve BTE Første BTE Anden BTE
Kammer Behandling af prøver Behandling af prøver
Jeg 12. januar En 1-12 Ikke-inficerede 1-2 & 4-12 Ikke-inficeret
Prøve #3 erstattes med mix inficeret
II 13-24 B 13-24 13-24
Ikke-inficeret Ikke-inficeret
III 25-36 C 25-36 25-36
Ikke-inficeret Ikke-inficeret
IV 37-48 A-desinficeret 37-48 37-48
Ikke-inficeret Ikke-inficeret
V 49-60 B-desinficeret 49-60 49-50 & 52-60 Ikke-inficerede
Ikke-inficeret
Prøve #51 erstattes med mix inficeret
VI 61-72 C-desinficeret 61-72 Ikke-inficerede 61-72 Ikke-inficerede

Tabel 1: Fremgangsmåde anvendt ved validering af BTE-vævsbehandlingsmetoden ved anvendelse af 72 citrusknoptræprøver. Hver behandling blev gentaget to gange. Der var 6 partier med 12 prøver hver. I den første prøvebehandling var alle 72 citrusknoptræprøver sunde. I den anden BTE-prøvebehandling blev prøve 3 og prøve 51 erstattet med to prøver fra en træblanding, der var inficeret med vira og viroider i batch 1 og batch 5.

Figure 4
Figur 4: Validering af BTE-vævsbehandlingsmetoden ved hjælp af 72 citrusknoptræprøver. Hver behandling blev gentaget to gange. Der var 6 partier med 12 prøver hver. (A) Alle 72 citrusknoptræprøver var sunde. B) De samme 72 prøver af citrusknopwood med indsættelse af to prøver fra en træblanding, der er inficeret med vira og viroider, i batch 1 (prøve 3) og batch 5 (prøve 51). NTC og vandkontrollerne havde alle ubestemte Cq-værdier (dvs. DNA-mål, der ikke var til stede i prøven). De positive kontroller for triplex (CLBV, CPsV, CTV) havde Cq-værdier på henholdsvis 23,9, 25,2 og 22,4. De positive kontroller for apscaviroider (CBLVd, CDVd og CBCVd) havde Cq-værdier på henholdsvis 23,39, 21,27 og 25,17. De positive kontroller for ikke-apscaviroider (CEVd, HSVd, IV) havde Cq-værdier på henholdsvis 26,9, 27,0 og 26,5. Forkortelser: BTE = knoptræ vævsekstraktor; NTC = kontrolelement uden skabelon. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: Opsætning af rengøringsstation. Når den 10. prøve er behandlet i kammeret, skal protokoltrin 3.1-3.6 følges for at forberede rengøringsstationen til at desinficere kammeret. Som i protokoltrin 3.1 placeres 1 liter vand i ultralydsrenseren. To skraldespand er pakket over toppen af ultralydrenseren (protokol trin 3.2), og ~ 5 L 10% blegemiddel (1% natriumhypochloritopløsning) hældes i ultralydrenseren (protokol trin 3.3). Vandkarret er fyldt med nok vand til at nedsænke et kammer (protokoltrin 3.4), luftkompressoren slukkes, og ventilen åbnes (protokoltrin 3.5). Der er opsat en baggrund til at fange væsken, mens kammeret tørrer (protokoltrin 3.6). Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Med fremkomsten af HLB-citrussygdom er citrusindustrien, reguleringsagenturer og diagnostiske laboratorier for at reducere tab blevet opfordret til at stole på nukleinsyreekstraktionsmetoder med høj kapacitet kombineret med manuel prøvebehandling med lav kapacitet og patogendetektionsassays såsom qPCR34 til testning af individuelle træer i kombination med sygdomshåndteringspraksis35. Californiens HLB-positivitetsrate er gået fra 0,01% i 2012 til 1,2% i 2020. Selv om qPCR er et kraftfuldt og pålideligt patogendetektionsværktøj, tillader de aktuelt tilgængelige teknologier ikke, at der udtages prøver og behandles en tilstrækkelig mængde plantevæv, hvilket resulterer i klar underprøveudtagning og undertestning for CLas i citrustræer i Californien. Undersampling og undertesting forekommer både i forhold til antallet af testede træer og mængden af plantemateriale pr. træ, der forarbejdes (dvs. antallet af blade), og på grund af den sporadiske fordeling af inficerede blade i trækronerne er der stor sandsynlighed for manglende tidlige eller milde infektioner. De nuværende metoder til prøveudtagning og CLas-test kan ikke skaleres med øget efterspørgsel på grund af omkostninger (f.eks. Arbejdskraft og udstyr). I øjeblikket kræver prøvebehandlingsmetoden, der anvendes af de fleste citrusdiagnostiske laboratorier i Californien til at erhverve nukleinsyrer, der er egnede til citruspatogentestning, over 17 timer til manuel prøvehåndtering og specialiserede forsyninger og udstyr, der koster over $ 100.000.

Her præsenterer vi valideringen af et specialiseret instrument, der er konstrueret til hurtigt at behandle citrusknoptræbarkvæv, kaldet budwood-vævsekstraktoren (BTE), og en detaljeret, trinvis protokol for prøvehåndtering til citrusdiagnostiske laboratorier. Forskningen fokuserede på at udvikle en innovativ vævsbehandlingsmetode til erstatning for den nuværende arbejdskrævende håndhakning af knoptræprøver og opbygge det højeste gennemstrømning og mest omkostningseffektive citrusknoptræbehandlingsinstrument muligt. Resultaterne viser, at BTE øger prøvegennemstrømningen og reducerer omkostningerne til udstyr og forsyninger, der anvendes på CCPP-diagnoselaboratoriet. Den præsenterede teknologi og metode inkluderer også brugen af NFC-tags, en telefonapp og en online database til sporing af eksempelinformation i realtid. Når budwood-prøver er indsamlet, forbinder telefonappen NFC-prøveposeclipsen med NFC-træmærket. Prøverne sendes derefter til laboratoriet til behandling med BTE-maskinen. Oplysninger om hver prøve registreres med et hurtigt stryg hen over siden af BTE-kroppen. Gennem eksemplet NFC-tag registreres behandlingstiden for hver prøve og prøvens vægt også og uploades til onlinedatabasen i realtid. Denne metode giver et meget tidseffektivt system, forbedrer kvalitetskontrol (dvs. ved at undgå prøve-ID-fejl) og øger laboratorieeffektiviteten.

BTE-højkapacitetsbehandling og validering blev udført med citrusprøver fra "det virkelige liv/felt", hvilket viste, at andre diagnostiske laboratorier let kan vedtage teknologien og metoden. Vedtagelse af denne teknologi vil gøre det muligt at reducere driftsomkostningerne og øge diagnosticeringskapaciteten og laboratorieeffektiviteten, hvilket øger chancerne for at identificere syge træer på et tidligere tidspunkt efter infektion opstår og mindsker chancerne for sygdomsspredning. Sammenligningen side om side af BTE versus konventionelle vævsbehandlingsmetoder viser, at kvaliteten af ekstraheret nukleinsyre (dvs. koncentration, renhed og integritet) og resultaterne af downstreampatogendetektionen er sammenlignelige (figur 3A-C). Den tid, der bruges på at behandle prøverne, reduceres dog betydeligt ved hjælp af BTE sammenlignet med manuelle behandlingsprotokoller (dvs. 3,3 minutter vs. 6,8 minutter). Kamrene og BTE-basen kræver en regelmæssig rengøringsplan. Selvom rengøringen er tidskrævende og udgør en begrænsning af metoden, gør teknologien det muligt hurtigt at behandle flere prøver i BTE, før kammeret skal rengøres. Konventionelle metoder kræver mindre rengøring, da hver prøve har sin egen forarbejdningsbeholder, som i mange tilfælde er engangsbrug, men de har brug for flere beholdere og lagerplads (f.eks. 4 °C køleskabe og -20 °C eller -80 °C frysere).

BTE-processen blev udtænkt og bygget til at øge sandsynligheden for at identificere et problemområde via bulkprøvebehandling og test (dvs. finde et sygt træ inden for en stor citruskimplasmafundamentblok, planteskole eller frugtplantage) ved kun at køre et lille antal bulktests, der kan identificere hot spots. Derfor afviger det kun, når der findes et positivt resultat. Når dette sker (figur 4B, batch 1 og batch 5), kræves efterfølgende prøvebehandling og testning af individuelle prøver fra samme batch indeholdende det positive materiale (dvs. kun en delmængde af prøver) for at bestemme, hvilke prøver der er positive. Det er således vigtigt at bemærke, at denne procedure primært er egnet til tilfælde med lave infektionshastigheder, hvor den tillader test af en stor mængde materiale fra mange træer, hvilket til gengæld øger sandsynligheden for sygdomspåvisning uden at skulle teste et stort antal individuelle prøver. Konventionelle metoder vil være den optimale løsning i tilfælde med høje infektionshastigheder, da de gør det muligt at teste hver prøve individuelt. Dette er især vigtigt i tilfælde af HLB-undersøgelser i Californien20 (stadig med en lav HLB-positivitetsrate), hvor de anvendte PCR-baserede metoder til CLas-detektion primært er beregnet til at bekræfte tilstedeværelsen eller fraværet af CLas i asymptomatiske træer (dvs. ingen typisk plettet plettet, baldakin gulfarvning eller trætilbagegang), der har været udsat for CLas-positive asiatiske citruspsyllider (ACP). I betragtning af at vi ikke ved, hvor i træet en smitsom AVS har fodret, er chancerne for at identificere et inficeret, men asymptomatisk træ i marken eller i ethvert andet stort område eller operation ved at teste et lille antal prøver meget lave (f.eks. I Californien indsamles der i øjeblikket 20 blade, og 12 blade testes pr. Træ20). Det er klart, at jo større trækronen er, jo lavere er chancerne for CLas-detektion. Selvom omkostningerne ved selve PCR (dvs. reagenser, basislaboratorieudstyr og termocykler), som følger prøvebehandlingen, og nukleinsyreekstraktionen og oprensningen fortsætter uændret i BTE-processen, fortsætter usikkerheden om, hvor prøverne skal indsamles fra asymptomatiske træer for at afgøre, om de er inficerede eller ej, stadig, og efter vores mening er akilleshælen i HLB-undersøgelsen i Californien. Det præsenterede instrument, teknologi, metode og forbedringer vil muliggøre behandling af større prøvestørrelser på kortere tid og til en lavere pris. Derfor vil denne metode øge sandsynligheden for at identificere inficerede træer rettidigt og forbedre udryddelsesindsatsen for HLB eller andre invasive patogener af citrus i Californien (f.eks. citrusgul venerydningsvirus rapporteret i Californien i august 2022).

Kombineret med automatiserede vævsbehandlingsmetoder vil masseprøveudtagning og -testning gøre det muligt at reducere omkostningerne til forarbejdning af plantevæv. Denne omkostningsreduktion ville gøre det muligt for mange diagnostiske laboratorier mere effektivt at screene frugtplantager i mange stater og bedre spore bevægelsen af HLB og andre sygdomme. I sidste ende betyder det, at avlerne vil have et mere effektivt redskab til at bremse spredningen af sygdomme gennem mere effektiv testning i stor skala. BTE-instrumentet kan forbedre citruslaboratoriernes nuværende diagnostiske kapacitet og gavne hele citrusindustrien, men samtidig kan teknologien også overføres til andre træafgrøder. De foreløbige data for nukleinsyrekoncentration og renhed, som estimeret af OD, har vist, at BTE effektivt kan behandle væv fra mandel (59,87 ng/μL ± 7,43 ng/μL og A260/A280 1,17 ± 0,05, n = 9), vinranker (135,74 ng/μL ± 50,74 ng/μL og A260/A280 1,17 ± 0,06, n = 9) og fersken (66,50 ng/μL ± 6,07 ng/μL og A260/A280 1,29 ± 0,05, n = 9) (prøver venligst leveret af Foundation Plant Services ved UC Davis).

Budwood-vævsbehandlingsplatformen, der præsenteres her, har inspireret udviklingen af yderligere plantevævsbehandlingsudstyr. For eksempel er en bladvævsekstraktor (LTE) i øjeblikket under udvikling. Foreløbige testresultater ved hjælp af citrusblade har vist, at LTE-instrumentet kunne behandle omkring syv gange flere blade med kun en 35% stigning i behandlingstiden i forhold til den nuværende standard 12-bladsmetode, der anvendes i Californien20. Vi har anslået, at en LTE-understøttet bulkprøveudtagnings- og testprotokol kunne reducere de samlede omkostninger pr. citrusbladtest med en fjerdedel. Forskning for at bevise værdien af den praktiske anvendelse af denne teknologi er i øjeblikket i gang under et CDFA Specialty Crop Block Grant i vores laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender Cahuilla-folket som de traditionelle vogtere af det land, hvor det eksperimentelle arbejde blev afsluttet. Vi er taknemmelige for professor Norman Ellstrand ved University of California, Riverside, for at give laboratorieplads til at udføre forskningsaktiviteter til dette projekt under UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ) Initiative. Denne forskning blev støttet af CDFA - Specialty Crop Block Grant Program (bevilling nr. 18-0001-055-SC). Der blev også ydet yderligere støtte under CRB-projekt 6100. USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch projekt 1020106; og National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Health Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, & AP20PPQS&T00C049) tildelt Georgios Vidalakis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.08" Hex Trimmer line PowerCare FPRO07065 Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor California Air Tools 8010 Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube Globe Scientific 111558B Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set Technology Evolving Solutions TE006-F1-10A-G1000-E1 Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach
12" Ruler Westcott ‎16012 To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite Hasa 1041 Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer Insignia NS-CZ70WH0 Store sample after processing
4" x 12" plastic bags Plymor FP20-4x12-10 Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab Puritan 806-PCL Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote HDX 206152 Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun JASTIND ‎JTABG103A Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie Sharpie  S-19421 Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor Brand Z627569 Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber Technology Evolving Solutions TE002BB-A05-E1 Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap Dawn 57445CT Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter Air Science P5-36XT-A Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container PolarTech 261/J50C Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat Red Kap KP14WH LN 46 Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop Microsoft Surface Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone Samsung Galaxy S9 Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag Technology Evolving Solutions TE005-Clip-E1 Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag Technology Evolving Solutions TE005-Collar-E1 Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves Usa Scientific 3915-4400 Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff 3M 90565-4DC-PS Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose FYPower ‎510019 Attaches air gun to compressor
Saftey glasses Solidwork SW8329-US Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle JohnBee B08QM81BJV Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base Technology Evolving Solutions TE001-A-E1 System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale Technology Evolving Solutions TE003-A05-200g-01-E1 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield 
Vermiculite EasyGoProducts B07WQDZGRP Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter Boenfu ‎BOWC-06002-US Wire cutters to cut trimmer line

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
  2. Vernière, C., et al. Citrus viroids: Symptom expression and effect on vegetative growth and yield of clementine trees grafted on trifoliate orange. Plant Disease. 88 (11), 1189-1197 (2004).
  3. Zhou, C., et al. Chapter 19 - Citrus viruses and viroids. The Genus Citrus. Talon, M., Caruso, M., Gmitter, F. G. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 391-410 (2020).
  4. Luckstead, J., Devadoss, S. Trends and issues facing the U.S. citrus industry. Choices Magazine Online. 36 (2), Available from: https://www.choicesmagazine.org/choices-magazine/theme-articles/trends-and-challenges-in-fruit-and-tree-nut-sectors/trends-and-issues-facing-the-us-citrus-industry (2021).
  5. Simnitt, S., Calvin, L. Fruit and Tree Nuts Outlook. United States Department of Agriculture-Economic Research Service. , Available from: https://www.ers.usda.gov/webdocs/outlooks/98171/fts-370.pdf?v=5697 (2020).
  6. Forsyth, J., Fruits Damiani, J. C. itrus Citrus Fruits. Types on the market. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. , Academic Press. Cambridge, MA. 1329-1335 (2003).
  7. Bostock, R. M., Thomas, C. S., Hoenisch, R. W., Golino, D. A., Vidalakis, G. Plant health: How diagnostic networks and interagency partnerships protect plant systems from pests and pathogens. California Agriculture. 68 (4), 117-124 (2014).
  8. Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).
  9. Wang, J., et al. Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale. Frontiers in Microbiology. 4, 366 (2013).
  10. Gergerich, R. C., et al. Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization. Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).
  11. Moreno, P., Ambrós, S., Albiach-Martí, M. R., Guerri, J., Peña, L. Citrus tristeza virus: A pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology. 9 (2), 251-268 (2008).
  12. Yokomi, R. K., et al. Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California. Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).
  13. Selvaraj, V., Maheshwari, Y., Hajeri, S., Yokomi, R. A rapid detection tool for VT isolates of Citrus tristeza virus by immunocapture-reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay. PLoS One. 14 (9), 0222170 (2019).
  14. Babcock, B. A. Economic impact of California's citrus industry in 2020. Journal of Citrus Pathology. 9, (2022).
  15. Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).
  16. Yokomi, R., et al. Molecular and biological characterization of a novel mild strain of citrus tristeza virus in California. Archives of Virology. 163 (7), 1795-1804 (2018).
  17. Fuchs, M., et al. Economic studies reinforce efforts to safeguard specialty crops in the United States. Plant Disease. 105 (1), 14-26 (2021).
  18. Singerman, A. The real cost of HLB in Florida. Citrus Industry Magazine. , Available from: https://citrusindustry.net/2019/07/30/the-real-cost-of-hib-in-florida/ (2019).
  19. McRoberts, N., et al. Using models to provide rapid programme support for California's efforts to suppress Huanglongbing disease of citrus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1776), 20180281 (2019).
  20. Albrecht, C., et al. Action plan for Asian citrus psyllid and huanglongbing (citrus greening) in California. Journal of Citrus Pathology. 7 (1), (2020).
  21. Navarro, L., et al. The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the period 1975-2001. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15 (15), (2002).
  22. Vidalakis, G., Gumpf, D. J., Polek, M. L., Bash, J. A. The California Citrus Clonal Protection Program. Citrus Production Manual. Ferguson, L., Grafton-Cardwell, E. E. , University of California, Agriculture and Natural Resources. Oakland, California. 117-130 (2014).
  23. Dang, T., et al. High-throughput RNA extraction from citrus tissues for the detection of viroids. In Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  24. Osman, F., Vidalakis, G. Real-time detection of viroids using singleplex and multiplex quantitative polymerase chain reaction. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  25. Li, R., et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Saponari, M., Manjunath, K., Yokomi, R. K. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 147 (1), 43-53 (2008).
  27. Damaj, M. B., et al. Reproducible RNA preparation from sugarcane and citrus for functional genomic applications. International Journal of Plant Genomics. 2009, 765367 (2009).
  28. Dang, T., et al. First report of citrus leaf blotch virus infecting Bearss lime tree in California. Plant Disease. 104 (11), 3088 (2020).
  29. Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques. 20 (6), 968-970 (1996).
  30. Teare, J. M., et al. Measurement of nucleic acid concentrations using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques. 22 (6), 1170-1174 (1997).
  31. Imbeaud, S. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 56-56 (2005).
  32. Menzel, W., Jelkmann, W., Maiss, E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods. 99 (1-2), 81-92 (2002).
  33. Vidalakis, G., et al. SYBR Green RT-qPCR for the universal detection of citrus viroids. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. , Humana. New York, NY. 211-217 (2022).
  34. Arredondo Valdés, R., et al. A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus. Canadian Journal of Microbiology. 62 (10), 803-811 (2016).
  35. Li, S., Wu, F., Duan, Y., Singerman, A., Guan, Z. Citrus greening: Management strategies and their economic impact. HortScience. 55 (5), 604-612 (2020).
  36. CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes. , Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019).

Tags

Bioengineering Budwood væv ekstraktion hånd hakning "Candidatus Liberibacter asiaticus" CLas huanglongbing HLB Citrus tristeza virus CTV

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

to:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

Automatisering af citrusknoptræbehandling til nedstrøms patogendetektion gennem instrumentteknik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E.,… More

Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E., Uribe, G., De Francesco, A., Milton, R., De La Torre, A., Mounkam, A., Dang, T., Bodaghi, S., Lavagi-Craddock, I., Syed, A., Grover, W., Okamba, A., Vidalakis, G. Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. J. Vis. Exp. (194), e65159, doi:10.3791/65159 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter