Candidatus Liberibacter asiaticus", CLas, huanglongbing, HLB, Citrus tristeza virus, CTV, scientific video journal" />

Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Automatisering av sitrusbudvedbehandling for nedstrøms patogendeteksjon gjennom instrumentteknikk

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65159
Automatic Translation
*1,6, *2, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5, *1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside, 2Technology Evolving Solutions (TES), 3Department of Bioengineering, University of California Riverside, 4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV, 5University of California Riverside, 6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Vi konstruerte, fabrikkerte og validerte et instrument som raskt behandler floemrike bark sitrus budwood vev. Sammenlignet med dagens metoder har budwood tissue extractor (BTE) økt prøvegjennomstrømningen og redusert de nødvendige arbeids- og utstyrskostnadene.

Abstract

Graft-overførbare, floem-begrensede patogener av sitrus som virus, viroider og bakterier er ansvarlige for ødeleggende epidemier og alvorlige økonomiske tap over hele verden. For eksempel drepte sitrus tristeza-viruset over 100 millioner sitrustrær globalt, mens "Candidatus Liberibacter asiaticus" har kostet Florida 9 milliarder dollar. Bruken av patogentestet sitrus budwood for forplantning av trær er nøkkelen til forvaltningen av slike patogener. Citrus Clonal Protection Program (CCPP) ved University of California, Riverside, bruker polymerasekjedereaksjonsanalyser (PCR) for å teste tusenvis av prøver fra sitrusbudwood-kildetrær hvert år for å beskytte Californias sitrus og for å gi rene forplantningsenheter til National Clean Plant Network. En alvorlig flaskehals i molekylær påvisning av sitrusvirus og viroider med høy gjennomstrømning er behandlingstrinnet for plantevev.

Riktig vevsforberedelse er avgjørende for ekstraksjon av kvalitetsnukleinsyrer og nedstrøms bruk i PCR-analyser. Hakking av plantevev, veiing, frysetørking, sliping og sentrifugering ved lave temperaturer for å unngå nukleinsyrenedbrytning er tidkrevende og arbeidskrevende og krever dyrt og spesialisert laboratorieutstyr. Dette papiret presenterer valideringen av et spesialisert instrument konstruert for raskt å behandle floemrike barkvev fra sitrus budwood, kalt budwood tissue extractor (BTE). BTE øker prøvegjennomstrømningen med 100% sammenlignet med dagens metoder. I tillegg reduserer det arbeidskraft og kostnaden for utstyr. I dette arbeidet hadde BTE-prøvene et DNA-utbytte (80,25 ng / μL) som var sammenlignbart med CCPPs håndhakkingsprotokoll (77,84 ng / μL). Dette instrumentet og den raske plantevevsbehandlingsprotokollen kan være til nytte for flere sitrusdiagnostiske laboratorier og programmer i California og bli et modellsystem for vevsbehandling for andre treaktige flerårige avlinger over hele verden.

Introduction

Graft-overførbare floem-begrensede patogener av sitrus, som viroider, virus og bakterier, har forårsaket ødeleggende epidemier og alvorlige økonomiske tap i alle sitrusproduserende områder av verden. Sitrus viroider er begrensende produksjonsfaktorer på grunn av exocortis og kakeksi sykdommer de forårsaker i økonomisk viktige sitrustyper, som trifoliate, trifoliate hybrider, mandariner, klementiner og mandariner 1,2,3. I California er disse viroidfølsomme sitrustypene grunnlaget for det voksende og lønnsomme markedet for "lettskrellere", etter den skiftende trenden i forbrukernes preferanse for frukt som er lett å skrelle, segmentert og frøfri 4,5,6. Dermed er sitrusviroider regulert under California Department of Food and Agriculture (CDFA) "Citrus Nursery Stock Pest Cleanliness Program-Senate Bill 140", og laboratoriene til CDFAs Plant Pest Diagnostics Branch utfører tusenvis av sitrusviroidtester årlig 7,8,9,10 . Citrus tristeza virus (CTV) har vært ansvarlig for døden av over 100 millioner sitrus trær siden begynnelsen av den globale epidemien på 1930-tallet 3,9,10,11. I California utgjør stammegrop og trifoliate bruddmotstandsisolater av viruset en alvorlig trussel mot sitrusindustrien i California på 3,6 milliarder dollar12,13,14. Følgelig klassifiserer CDFA CTV som et regulert klasse A-planteskadegjører, og laboratoriet til Central California Tristeza Eradication Agency (CCTEA) utfører omfattende feltundersøkelser og tusenvis av virustester hvert år15,16. Bakterien "Candidatus Liberibacter asiaticus" (CLas) og huanglongbing (HLB) sykdommen anslås å ha forårsaket nær 9 milliarder dollar av økonomisk skade på Florida som følge av en 40% reduksjon av sitrus areal, en 57% reduksjon i sitrus operasjoner, og et tap på nesten 8000 arbeidsplasser17,18. I California ble en hypotetisk 20% reduksjon i sitrus areal på grunn av HLB spådd å resultere i mer enn 8,200 tap av arbeidsplasser og en reduksjon på over en halv milliard dollar i statens bruttonasjonalprodukt. Derfor bruker Citrus Pest and Disease Prevention Program over $ 40 millioner årlig på undersøkelser for å teste, oppdage og utrydde CLas fra California14,17,19,20.

Et sentralt element i forvaltningen av sitrusviroider, virus og bakterier er bruken av patogentestede forplantningsmaterialer (dvs. budwood) for treproduksjon. Patogentestet sitrusbudved produseres og vedlikeholdes innenfor omfattende karanteneprogrammer som bruker avanserte patogeneliminerings- og deteksjonsteknikker10,21. Citrus Clonal Protection Program (CCPP) ved University of California, Riverside, tester tusenvis av budwood-prøver hvert år fra sitrusvarianter som nylig er importert til staten og USA, samt kildetrær til sitrusbudwood, for å beskytte Californias sitrus og støtte funksjonene til National Clean Plant Network for Citrus10,17,22. For å håndtere det store volumet av sitrustesting, er høy gjennomstrømning, pålitelige og kostnadseffektive patogendeteksjonsanalyser en grunnleggende komponent for suksessen til programmer som CCPP 7,10,22.

Mens molekylærbaserte patogendeteksjonsanalyser som polymerasekjedereaksjon (PCR) har tillatt betydelige økninger i gjennomstrømning i plantediagnostiske laboratorier, er vår erfaring at en av de mest kritiske flaskehalsene i implementeringen av protokoller med høy gjennomstrømning er behandlingstrinnet for plantevevsprøver. Dette gjelder spesielt for sitrus fordi de tilgjengelige protokollene for behandling av floemrike vev som bladbladblader og budwoodbark er arbeidskrevende, tidkrevende og krever dyrt og spesialisert laboratorieutstyr. Disse protokollene krever håndhugging, veiing, frysetørking, sliping og sentrifugering ved lave temperaturer for å unngå nukleinsyrenedbrytning 8,23,24. For eksempel, ved CCPPs diagnostiske laboratorium, inkluderer prøvebehandling (i) håndhakking (6-9 prøver/t/operatør), (ii) frysetørking (16-24 timer), (iii) pulverisering (30-60 s) og (iv) sentrifugering (1-2 timer). Prosessen krever også spesialiserte forsyninger (f.eks. kraftige safe-lock rør, rustfritt stål slipekuler, adaptere, kniver, hansker) og flere stykker kostbart laboratorieutstyr (f.eks. ultra-lav fryser, frysetørker, vevpulverisator, flytende nitrogenkryostasjon, nedkjølt sentrifuge).

Som i enhver bransje er utstyrsteknikk og automatisering av prosesser nøkkelen til å senke kostnadene, øke gjennomstrømningen og tilby ensartede produkter og tjenester av høy kvalitet. Sitrusindustrien trenger rimelige vevsbehandlingsinstrumenter som krever minimal ferdighet for å operere, og som sådan er enkle å overføre til diagnostiske laboratorier og feltoperasjoner for å tillate høy prøvebehandlingskapasitet for rask nedstrøms patogendeteksjon. Technology Evolving Solutions (TES) og CCPP utviklet (dvs. design og fabrikasjon) og validert (dvs. testet med sitrusprøver og sammenlignet med standard laboratorieprosedyrer) et billig (dvs. eliminert behovet for spesialisert laboratorieutstyr) instrument for rask behandling av floemrike sitrusvev (dvs. budwood), kalt budwood tissue extractor (BTE). Som vist i figur 1 inneholder BTE en basekomponent for strøm og kontroller, pluss et avtagbart kammer for behandling av sitrusbudved. BTE-kammeret består av et slipeskive som er spesielt designet for å fjerne floemrike barkvev fra sitrusknoppveden. Det strimlede barkvevet kastes raskt ut gjennom en glideport inn i en sprøyte som inneholder ekstraksjonsbuffer, filtreres og klargjøres for nukleinsyreekstraksjon og rensing uten ytterligere håndtering eller klargjøring (figur 1). BTE-systemet inkluderer også en papirløs prøvesporingsapplikasjon og en integrert veieapplikasjon som registrerer prøvebehandlingsinformasjonen i en online database i sanntid.

BTE-systemet har økt CCPPs laboratoriediagnostiske kapasitet med over 100% og har konsekvent produsert sitrusvevekstrakter egnet for rensing av nukleinsyrer av høy kvalitet og nedstrøms påvisning av transplantatoverførbare patogener av sitrus ved hjelp av PCR-analyser. Mer spesifikt har BTE redusert tiden for vevsbehandling fra over 24 timer til ~ 3 minutter per prøve, erstattet laboratorieinstrumenter som koster over $ 60 000 (figur 2, trinn 2-4), og tillatt behandling av større prøvestørrelser.

Dette papiret presenterer BTE høy gjennomstrømning sitrus bark vev behandling, nukleinsyre ekstraksjon, og patogen deteksjon validering data med sitrus budwood prøver fra kilde trær, inkludert alle relevante positive og negative kontroller fra CCPP Rubidoux Quarantine Facility og Lindcove Foundation Facility, henholdsvis. Vi presenterer også endringer i gjennomstrømning og behandlingstid sammenlignet med dagens laboratorieprosedyre (figur 2). I tillegg gir dette arbeidet en detaljert, trinnvis protokoll for testlaboratorier for sitruspatogener og demonstrerer hvordan BTE kan støtte funksjonene til patogen-ren barnehagelager, undersøkelse og utryddelsesprogrammer.

Figure 1
Figur 1: Budwood vev extractor. BTE inneholder en basekomponent for strøm og kontroller, pluss et flyttbart kammer for behandling av sitrusbudved. BTE-kammeret består av et slipeskive som er spesielt designet for å stripe det floemrike barkvevet fra sitrusknopp. Det strimlede barkvevet kastes raskt ut gjennom en glideport i en sprøyte, filtreres og gjøres klar for nukleinsyreekstraksjon og rensing uten ytterligere håndtering eller forberedelse. Forkortelse: BTE = budwood vev extractor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Trinnvis sammenligning mellom den konvensjonelle laboratorieprosedyren for håndhakking og BTE-behandling. BTE-behandling innebærer behandling av sitrusbarkvev med høy gjennomstrømning, nukleinsyreekstraksjon og patogendeteksjon. Tiden for hvert trinn er angitt i parentes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Innsamling av sitrusbudvedprøver for å sende

  1. Send Technology Evolving Solutions et regneark med treinformasjon som de kan laste inn på webserveren (til slutt vil brukeren opprette nye trær).
  2. Bruk telefonappen TES-tracker til å velge et tre, og hold en NFC-kragekode (nærfeltskommunikasjon) til telefonen for å laste treinformasjonen til taggen.
  3. Sett inn tre til fire sitrusbudvedprøver i den BTE-kompatible plastposeholderen, og lukk med lokket.
    1. Sørg for at lengden på budveden ikke overstiger 8 tommer og ikke er mindre enn 5 tommer.
      1. Hvis lengden er større enn 8 tommer, bruk et sterilt engangs barberblad eller beskjæringssaks dekontaminert med 10% blekemiddelløsning (1% natriumhypokloritt) for å gjøre den kortere.
      2. Hvis lengden er mindre enn 5 tommer, samle en annen budwood prøve å sette inn i posen.
    2. Sørg for at eventuell aksillær vekst eller store torner fjernes for hånd eller ved hjelp av 10% blekemiddel-sanitized skjæreverktøy (1% natriumhypokloritt).
      MERK: Dette trinnet er viktig slik at budwood er lettere å manøvrere i åpningen av kammeret.
    3. Sørg for at det ikke er noen budwood-prøver som har buede trekk. Hvis de gjør det, fjern dem ved hjelp av 10% blekemiddel-sanitiserte skjæreverktøy (1% natriumhypokloritt), og legg i BTE-posene bare de rette delene av prøven.
      MERK: Buet budwood er svært vanskelig å manøvrere inn i instrumentet, noe som resulterer i ujevn barkstriping.
  4. Bruk telefonappen TES-tracker til å skanne NFC-kragetaggen på treet og koble den til NFC-klipptaggen på prøveposen.
  5. Vær oppmerksom på tykkelsen på budveden, da det bestemmer hvordan operatøren vil strippe den floemrike budvedbarken inne i BTE-kammeret.
    1. Hvis budveden har en tykkelse under 0,20 tommer, vær forsiktig med å strippe budveden fordi de høyhastighets spinnende trådene i kammeret vil pulverisere hele budveden til kjernen, utover barklaget og inn i det ikke-floemrike vevet av tre og grop.
    2. Velg tykkere budwood fordi det er lettere å stripe barkvevet samtidig som du unngår det ikke-floemrike budwoodvevet.
  6. Legg prøvene i en isolert fraktbeholder med noen isposer.

2. Oppsett i avtrekkshetten

MERK: Det er foretrukket å betjene BTE inne i en avtrekkshette. Dette vil redusere risikoen for krysskontaminering av plantevev og laboratorieforurensning.

  1. Desinfiser med en 10% (1% natriumhypokloritt) sprayflaske.
    1. Spray overflaten på hetten, og la blekemiddelet sitte i ca. 1 min før du tørker det med et papirhåndkle.
    2. Spray et papirhåndkle med blekemiddelløsningen. Tørk av TE-basen, vektskalakomponentene (skala, luftskjold og tårn) og en markørpenn.
  2. Pakk ut et sprøytesett for antall prøver som skal behandles, og legg dem i en dekket pappkasse.
  3. Ha en pakke vattpinner tilgjengelig utenfor hetten i tilfelle de trengs.
  4. Forbered vektskalaen.
    1. Fjern vekttårnet fra vekten, og hold inne av/på-knappen for å slå det på. Plasser tårnet midt på skalaen etter at skalaen viser 0.
    2. Skyv luftskjoldet for vektskalaen over fronten av vekten.
  5. Forbered vevsekstraktorbasen ved å vri bryteren på baksiden. Forsikre deg om at bryteren på venstre side av boksen er trykket ned på toppen. Vent til en blinkende grønn LED, som indikerer at kammeret er klart.

3. Sett opp rengjøringsstasjonene (tilleggsfigur S1).

  1. Plasser 1 liter vann i ultralydrenseren.
  2. Pakk to søppelposer over toppen av ultralydrenseren.
  3. Hell ~ 5 L 10% blekemiddel (1% natriumhypoklorittoppløsning) i ultralydrenseren.
  4. Fyll vannbeholderen med nok vann til å senke et kammer.
  5. Slå på luftkompressoren og åpne ventilen.
  6. Sett opp et bakteppe for å fange væsken mens kammeret tørker.

4. Bearbeiding av materialet til BTE for stripping av sitrusbudbark

  1. Legg kammeret på BTE-basen.
    1. Forbered BTE-kammeret.
      1. Fest en tom prøvepose på baksiden av kammeret. Bruk to O-ringer for å feste den tomme posen til baksiden av BTE-kammeret.
      2. Inspiser bladet for tegn på slitasje eller skade, for eksempel kutt som dannes på kappskiven der det fortsetter inn i plasten eller kutt som dannes på spissen. Kontroller at pilen på bladet er på linje med symbolet for enkel lås.
      3. Sørg for at luftutløsningen på bunnen av kammeret vendes mot O-symbolet . Plasser det klare lokket over kammeråpningen, og skyv det klare BTE-lysbildet på kammeret ved hjelp av sporet til høyre for kammeret. Skyv låsen på bunnen av kammeret så langt den kan gå inn i lysbildet. Forsikre deg om at stempelhetten er montert på toppen av lysbildet.
    2. Plasser kammeret på BTE-basen med BTE-basens dyse som stikker ut på baksiden av kammeret. Vent til den blå LED-lampen blinker, noe som indikerer at plasseringen er vellykket.
  2. Last prøven på BTE-basen ved å flytte det hvite klistremerket på NFC-klipptaggen til en Z på høyre side av boksen. Flytt taggen i en langsom sirkelbevegelse på Z til det gule lyset begynner å blinke. Fest prøven til BTE-basen, og sørg for at prøveposen ikke har hull i den; Hvis det er et hull, det med tape. Plasser O-ringen over prøveposen for å feste den foran på BTE-dysen.
  3. Legg i det ubrukte sprøytesettet.
    1. Tare sprøytesettet. Plasser det ubrukte sprøytesettet på vekttårnet. Fjern sprøytesettet når et rødt lys begynner å blinke eller skalaen viser 0.
    2. Fjern stempelet fra sprøyten med filteret. Forsikre deg om at væsken er i den nederste (ikke-filter) sprøyten. Plasser stempelet til side på et papirhåndkle eller på tårnet der det svarte stempelet ikke berører noen overflater.
    3. Fest sprøyten til glideutgangsporten ved å trykke utgangsporten inn i sprøyten og vri 90°.
  4. Behandle budwood-prøven.
    FORSIKTIG: BTE har høyhastighets bevegelige deler. All drift må skje inne i en avtrekkshette. Alle brukere bør bruke vernebriller, øreklokker (ørepropper) og alt annet personlig verneutstyr (PPE), for eksempel hansker og laboratoriefrakker.
    1. Trykk på den svarte knappen øverst for å starte maskinen. Trykk en gang til for å stoppe motoren når som helst under behandlingen.
      MERK: Boksen har hastighets- og temperaturføling for å sikre at den fungerer som den skal.
    2. Ta tak i en budvedpinne gjennom posen, og legg den gjennom toppen av BTE-dysen.
    3. Ta tak i budvedpinnen på den andre siden av kammeret med den andre hånden, og sakte tomme ned i bladet. Lytt etter en mild summende lyd som indikerer at budveden blir strippet for barken. Beveg knoppveden sakte frem og tilbake mens du roterer den.
      1. Hvis du hører en høy, aggressiv hakkelyd, flytter du grenen raskt til toppen og/eller trykker på den øvre knappen for å stoppe motoren. For å stoppe motoren, bruk høyre sidebryter for å fullføre behandlingen (se trinn 4.4.3.2).
      2. Hvis det ikke kommer noe materiale ut av utgangen når du skjærer, har kammeret en tilstopping. Slå av motoren, fjern glidestempelhetten og bruk plastpinnen til å skyve tetter ut utgangen av maskinen. Bruk høyre sidebryter for å fullføre behandlingen: Opp = Fremoverskjæring; Midt = Motor av; Ned = Omvendt skjæring.
    4. Gjenta trinn 4.4.2 og trinn 4.4.3 for de resterende grenene.
      MERK: En generell indikator på at nok knoppbark har blitt strippet, er når 25% av sprøyten er fylt med plantevev. Graft-overførbare patogener av sitrus kan være ujevnt fordelt i treet. Derfor samles tre til fire budvedprøver fra rundt sitrustrekronen. Det er viktig at hver budvedprøve i BTE-bæreposen bidrar til den endelige jordvevsprøven for å sikre at en fullstendig trerepresentativ prøve blir testet for patogener.
    5. Trykk på den øverste svarte knappen for å stoppe behandlingen. Vent til lyset begynner å blinke gult igjen.
  5. Kontroller prøvevekten.
    1. Roter sprøyten 90°, og trekk den ned for å løsne. Sett stempelet tilbake på sprøyten og plasser sprøyten på tårnet.
    2. Vent til vekten automatisk registrerer prøven, og finn ut om den er innenfor riktig vektområde (0,25 ± 0,05 g). Hvis prøvevekten er for lav (<0,20 g), gjenta trinn 4.4. den røde LED-lampen begynner å blinke. Hvis prøvevekten er for høy (>0,30 g), fjern noe av prøvematerialet. den gule LED-lampen begynner å blinke saktere. Hvis prøven er innenfor området, begynner den grønne LED-lampen å blinke.
  6. Homogenisering av budwood-prøven
    1. Fjern stempelet fra sprøyten med prøven, skyv væsken inn i sprøyten med prøven og tilsett stempelet igjen. Stempelet skyver bufferen og plantesaften gjennom nettfilteret (holder tilbake store barkvevstykker) og via gummislangen inn i den tomme sprøyten.
    2. Bland prøven ved å skyve bufferen og plantesaften frem og tilbake fra den ene sprøyten til den andre. Gjenta ~ 3x-4x og til prøven blir en homogen grønn væskeblanding.
    3. Når den er godt homogenisert, skyv plantesaftprøven inn i sprøyten uten maskefilteret, og løsne gummislangen og sprøyten med filteret fra sprøyten med prøven.
    4. Fjern plantesaftprøven fra sprøyten i et 2 ml sterilt mikrosentrifugerør, og oppbevar ved -20 °C til videre bruk. Bruk en permanent markør for å merke prøven med posenummeret.
      MERK: Planteprøvesevjen fra trinn 4.6.5 kan nå behandles med hvilken som helst av de tilgjengelige nukleinsyre-, RNA- eller DNA-ekstraksjonsmetodene basert på fenol-kloroform, silikakolonne eller magnetiske perler 9,25,26,27 for nukleinsyreekstraksjon og rensing (se trinn 7) og nedstrøms påvisning av transplantatoverførbare patogener av sitrus (se trinn 8).

5. Desinfisering av BTE flyttbart kammer

FORSIKTIG: Hvis bufferen fra sprøytesettet kommer på kammeret eller glir, skyll og følg alle sikkerhetsreglene i laboratoriet før rengjøring. Sprøytesettet inneholder guanidintiocyanat. Hvis bufferen fra sprøytesettet kommer i kontakt med blekemiddel, vil den skape cyanidgass.

  1. Utfør følgende trinn etter at den 10. prøven er behandlet i kammeret. Merk at den grønne LED-lampen fortsetter å blinke i stedet for å blinke blått.
  2. Demonter BTE-kammeret for å rengjøre alle mulige forurensninger; Fjern det klare plastdekselet, tøm kammerglidet og tøm tettporten på kammerlysbildet.
  3. Vri luftutløsningsventilen på bunnen av kammeret til åpen stilling (åpent hengelåsmerke). Plasser kammerkomponentene i ultralydrenseren (se trinn 3.1). Plasser lokket under kammeret for å forhindre at det flyter. Kjør ultralydrenseren i 15 minutter.
    MERK: Ultralydrengjøringsbadet (5 L) kan holde opptil to kamre.
  4. Skyll kammerkomponentene i vannbadet (trinn 3.4) i minst 30 s. Flytt kammerkomponentene til tørkestasjonen.
    FORSIKTIG: Tørking vil forårsake deler i kammeret som beveger seg raskt, høye lyder (~85 desibel [dB]) og mulig sprut. Alle brukere bør bruke vernebriller, øreklokker (ørepropper), laboratoriefrakker og alt annet PPE som kreves av sikkerhetsreglene i operasjonslaboratoriet.
  5. Tørk BTE-kammeret.
    1. Plasser luftpistolen på linje med sporet til kammerets øvre åpning (der lysbildet vanligvis vil være). Trykk på avtrekkeren til pistolen for å dispensere luft i ~ 30 s.
      MERK: Forsikre deg om at åpningen er borte fra brukeren mot bakgrunnen. Dette skal spinne bladsettet for å fjerne væsken som er fanget under det.
    2. Plasser luftpistolen mot de øverste dysene i kammeret. Trykk på avtrekkeren til luftpistolen, og spor sakte tre fulle sirkler av hver dyseinngang.
    3. Plasser luftpistolen i midten av BTE. Start fra det innerste punktet, hold avtrekkeren nede og beveg deg til luftpistolen peker mot der lysbildet ville være.
    4. Kjør luft raskt over hele kammeret, foran og bak, for å få overflatevannet bort fra utsiden.
  6. Tørk BTE-lysbildet.
    1. Plasser luftpistolen i stempelåpningen på lysbildet, og trykk på avtrekkeren for å kaste vann ut av glideutgangen.
    2. Kjør en luftpistol langs den indre overflaten av lysbildet for å tørke den.
    3. Kjør en luftpistol langs glidesporet for å presse ut vann.
    4. Kjør luft raskt over hele utsiden for å få overflatevann av den.
  7. Tørk komponentene.
    1. Hold glidebryterhetten og O-ringene i hånden, og trykk på utløseren.
    2. Kjør en luftpistol over lokkets indre overflate.
    3. Plasser komponentene i kammeret og skyv for å fortsette å tørke eller sette dem sammen igjen.
      MERK: For et høyt vevsbehandlingsmiljø med flere funksjonelle BTE-er, kan det leveres et batch-desinfiseringssystem som er i stand til å dekontaminere 10 kamre samtidig.

6. Avhending og desinfisering

  1. Kast sprøytene og gummislangen i den angitte guanidinavfallsbeholderen.
  2. Kast plantemateriale i beholderen for biologisk farlig avfall.
  3. Fjern BTE-kammeret fra BTE-basen.
  4. Demonter BTE-kammeret og fortsett til dekontaminering, som beskrevet i trinn 5.

7. Vurdering av vevsbehandlingen og kvaliteten på RNA renset fra BTE sitrus budwood ekstrakter

MERK: I denne protokollen brukte vi budwood-prøver fra 255 sitrustrær for å sammenligne tiden som kreves for sitrusbudvedvevsbehandling og kvaliteten på RNA renset fra barkvevekstrakter fremstilt av BTE (figur 2, høyre side, trinn 1, trinn 5 og trinn 6) versus det som er utarbeidet etter den regulatorisk godkjente sitrusbudwood-vevsbehandlingsmetoden ved hjelp av håndpeeling og hakking, frysetørking, pulverisering og sentrifugering av barkvevet, som beskrevet av Dang et al.23 (figur 2, venstre side, trinn 1-6).

  1. Gjeldende laboratorieprosedyre: Klargjøre budvedprøver for vevsbehandling i henhold til forskriftsmessig godkjent metode23.
    1. Utfør håndpeeling og hakking av barkvevet, frysetørking, pulverisering, sentrifugering og overføring av plantesevjen til RNA-ekstraksjonsrøret, som beskrevet av Dang et al.23 (figur 2, venstre side, trinn 1-6).
    2. Etter håndpeeling av de tre til fire budwood-prøvene fra hvert testet tre, plasser all budwood inne i en BTE-kompatibel plastposeholder, og oppbevar ved 4 ° C til BTE-behandlingen (trinn 7.2).
  2. BTE prosedyre: Start BTE sitrus budwood vev behandling (seksjon 4, trinn 4.1-4.6; Figur 2, høyre side, trinn 1, trinn 5 og trinn 6).
    1. Bruk budwood-prøvene som er lagret inne i BTE-bæreposene fra trinn 7.1.2.
  3. Trekk ut og rens RNA fra plantesaften oppnådd fra den nåværende laboratorieprosedyren (trinn 7.1.1) og BTE-prosedyren (trinn 7.2.2) ved hjelp av den regulatorisk godkjente halvautomatiserte magnetiske perlebaserte metoden 8,23,28.
  4. Vurder RNA-kvaliteten ved å måle konsentrasjonen, renheten og integriteten 8,23,24,29,3 3,31.
    1. For å beregne konsentrasjonen, bruk spektrofotometri og optisk tetthet (OD) ved en bølgelengde på 260 nm.
    2. For å vurdere renheten, bruk et spektrofotometrisk OD-forhold på 260/280.
    3. For å kontrollere integriteten, bruk revers transkripsjon (RT) kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) reaksjon rettet mot mRNA av NADH dehydrogenase sitrusgenet 24,32.

8. Vurdering av krysskontaminering og påvisning av sitrusvirus og viroider ved bruk av RNA renset fra BTE sitrus budwood ekstrakter

MERK: I denne protokollen brukte vi budwood-prøver fra 72 ikke-infiserte sitrustrær og ett tre mix-infisert med virus og viroider for å vurdere potensialet for krysskontaminering mellom prøver når de behandles av BTE (figur 2, høyre side, trinn 1, trinn 5 og trinn 6) og egnetheten til RNA renset fra barkvevekstrakter fremstilt av BTE for å bli brukt som en mal for RT-qPCR-påvisning av sitrusvirus og viroider.

  1. Første BTE-prøvebehandling: Gjennomfør et baseline-eksperiment med 72 ikke-infiserte prøver.
    1. Forbered tre (A-C) BTE-kamre (trinn 4.1.1).
    2. Forbered alle ikke-infiserte sitrusbudvedprøver (1-72) i BTE-bæreposer, og lag like mange (72) i BTE-prøveinnsamlingssystemet med to sprøyter, med ett sprøytesystem for hver prøve (trinn 2.4).
    3. Skill prøvebærerposene og prøveoppsamlingssprøytene i seks batcher (I-VI) med 12 prøver hver.
    4. Start BTE-sitrusknoppbehandlingen (trinn 4) ved å følge sekvensen nedenfor (trinn 8.1.4.1-8.1.4.6) (se tabell 1, første BTE-prøvebehandling).
      1. For batch I / prøver 1-12, behandle 12 prøver ved hjelp av kammer A. Desinfiser kammer A etter prøve 12 (trinn 5).
      2. For batch II / prøver 13-24, behandle 12 prøver ved hjelp av kammer B. Desinfiser kammer B etter prøve 24 (trinn 5).
      3. For batch III / prøver 25-36, behandle 12 prøver ved hjelp av kammer C. Desinfiser kammer C etter prøve 36 (trinn 5).
      4. For batch IV / prøver 37-48, behandle 12 prøver ved hjelp av det saniterte kammeret A (trinn 8.1.4.1).
      5. For batch V / prøver 49--60, behandle 12 prøver ved hjelp av det saniterte kammeret B (trinn 8.1.4.2).
      6. For batch VI / prøver 60-72, behandle 12 prøver ved hjelp av det saniterte kammeret C (trinn 8.1.4.3).
    5. Oppbevar BTE-bæreposene med alle prøvene ved 4 °C til bruk i trinn 8.2.
    6. Trekk ut og rens RNA fra de 72 plantesaftprøvene som genereres i trinn 8.1.4.1-8.1.4.6 ved hjelp av den regulatorisk godkjente halvautomatiserte magnetiske perlebaserte metoden 8,23,28.
    7. Utfør RT-qPCR for påvisning av sitrusvirus og viroider, som tidligere beskrevet 8,33.
  2. For den andre BTE-prøvebehandlingen, utfør et krysskontamineringseksperiment med 70 ikke-infiserte prøver og to blandede infiserte prøver.
    1. Forbered tre (A-C) BTE-kamre (trinn 4.1.1).
    2. Forbered den blandeinfiserte sitrusbudvedprøven (73) i to BTE-bæreposer (trinn 1.3) for et totalt antall på to infiserte prøver.
    3. Samle BTE-bæreposene med de ikke-infiserte sitrusbudvedprøvene fra trinn 8.1.5, unntatt prøve 3-batch I og prøve 51-batch V (se prøveutskifting i trinn 8.2.4), for totalt antall 70 ikke-infiserte prøver.
    4. Inkluder den første BTE-bæreposen med den blandeinfiserte prøven 73 i stedet for prøve 3 i batch I og den andre i stedet for prøve 51 i batch V for totalt antall 72 prøver.
    5. Klargjør like mange (72) i BTE-prøvetakingssystemet med to sprøyter, med ett dobbeltsprøytesystem for hver prøve (trinn 2.4).
    6. Skill de 72 prøvebæreposene og prøveoppsamlingssprøytene i seks batcher (I-VI) med 12 prøver hver.
    7. Start BTE citrus budwood tissue processing (trinn 4), følg samme rekkefølge som i trinn 8.1.4.1-8.1.4.6.
      MERK: Den eneste forskjellen er erstatningen av prøve 3 i batch I og prøve 51 i batch V med den infiserte prøven 73 (trinn 8.2.4) (tabell 1, andre BTE-prøvebehandling).
    8. Trekk ut og rens RNA fra de 72 plantesaftprøvene generert i trinn 8.2.7 som i trinn 8.1.6.
    9. Utfør RT-qPCR for påvisning av sitrusvirus og viroider, som i trinn 8.1.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

RNA-ekstraksjon, rensing og kvalitet ved bruk av BTE-behandlet budwood sitrusvev og vurdering av tid for vevsbehandling
Vi brukte budwood-prøver fra 255 representative sitrustrær for denne testen for å sammenligne RNA-kvaliteten fra BTE mot standardprosedyren. Prøvene ble behandlet av budwood tissue extractor (BTE) (protokolltrinn 4.1-4.6 og figur 2, høyre side, trinn 1, trinn 5 og trinn 6) eller utarbeidet etter den regulatorisk godkjente behandlingsmetoden for sitrusknopptre, som bruker håndpeeling og hakking, frysetørking, pulverisering og sentrifugering av barkvevet, som beskrevet av Dang et al.23 (figur 2, venstre side, trinn 1-6).

Side-ved-side-sammenligningen av BTE med den konvensjonelle håndhakkings- og laboratorieutstyrsprotokollen for sitrusvevsbehandling viste at kvaliteten (dvs. konsentrasjon, renhet og integritet) av de ekstraherte nukleinsyrene (figur 3A-C) og egnethet for nedstrøms bruk for PCR-påvisning av sitruspatogener (data ikke vist) var sammenlignbare. Samtidig ble tiden brukt på å behandle prøver betydelig redusert ved hjelp av TE / BTE-systemet. BTE mer enn doblet prøvegjennomstrømningen til CCPP-laboratoriet, og reduserte arbeidskraften og laboratorieutstyrskostnadene ved å eliminere behovet for titusenvis av dollar av instrumenter, for eksempel perleslagere, sentrifuger og kryostasjoner.

Nukleinsyrene ekstrahert med BTE hadde en gjennomsnittlig konsentrasjon på 76,96 ng / μL ± 26,23 ng / μL (n = 181) og var av høy renhet, med lav proteinforurensning (A260 / A280 2,27 ± 0,17, n = 181) (figur 3B, C). Disse verdiene var sammenlignbare med nukleinsyrene produsert av CCPPs standard manuelle protokoll (konsentrasjon: 82,25 ng / μL ± 33,95 ng / μL, n = 181 og A260 / A280 2,22 ± 0,10, n = 181) (figur 3B,C). Nukleinsyreintegriteten (RT-qPCR for sitrusgenet nad5) var svært lik for BTE (Cq 20,97 ± 2,26, n = 181) og standard manuell CCPP-protokoll (Cq 19,25 ± 1,53, n = 181) (figur 3A). Resultatene viste også at BTE-instrumentet kunne behandle et høyere prøvevolum i samme tidsramme sammenlignet med den konvensjonelle metoden. Den konvensjonelle laboratorieprosedyren krevde ~ 7-10 min for håndhakking per prøve og totalt 12 min for vevsbehandling (frysetørking, sliping og sentrifuge), mens BTE kunne behandle sitrusvev for nukleinsyreekstraksjon i ~ 3 min per prøve.

Figure 3
Figur 3: Kvaliteten på nukleinsyreekstraktene fra de 181 representative sitrusbudvedprøvene, som definert av konsentrasjon, renhet og integritet. Prøvene ble behandlet av BTE og den konvensjonelle protokollen for håndhugging og laboratorieutstyr. (A) Nukleinsyrekonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av absorbans ved 260 nm; (B) renheten ble bestemt som forholdet mellom absorbansene ved 260 nm og 280 nm (A260/280). (C) Nukleinsyreintegriteten ble analysert ved RT-qPCR rettet mot mRNA av NADH dehydrogenase (Nad5) sitrusgenet. Områdene med optimale verdier er angitt mellom røde stiplede sirkler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Påvisning av transplantat-overførbare patogener av sitrus, vurdering av krysskontaminering og påvisning av sitrusvirus og viroider ved bruk av RNA renset fra BTE sitrus budwood ekstrakter
Validiteten av vevsbehandlingsmetoden ble evaluert ved å behandle 72 friske sitrusknoppprøver side om side med alle friske prøver og med innføring av to prøver fra en treblanding infisert med virus og viroider (tabell 1 og figur 4A,B). Nukleinsyrer ekstrahert fra begge batchene ble utsatt for konvensjonell laboratoriebasert q-PCR som tidligere beskrevet 8,33. Ingen av de 72 friske prøvene fra den første BTE-prøvebehandlingen ga amplifikasjonskurver for de testede sitruspatogenene (dvs. falske positive) (figur 4A). Resultatene tyder på at BTE kan behandle sitrusvev like godt sammenlignet med standard laboratorieprotokoll med håndhakkingsmetoder. I den andre BTE-prøvebehandlingen vurderte vi potensialet for krysskontaminering mellom BTE-hoder og i prøver behandlet med samme BTE-hode (trinn 1-6) og nukleinsyrenes egnethet for nedstrøms applikasjoner (dvs. for bruk som mal for RT-qPCR-deteksjon av sitrusvirus og viroider). I den andre BTE-prøvebehandlingen med to introduserte blandingsinfiserte prøver, ble nukleinsyrene produsert av BTE-protokollen vellykket brukt til å oppdage forskjellige sitrusvirus og viroider (f.eks. triplexvirus, sitrusbladflekkvirus [CLBV], sitruspsorosevirus [CPsV], sitrus tristeza virus [CTV]), apscaviroids (sitrus bøyd bladviroid [CBLVd], sitrus dvergviroid [CDVd], sitrus viroid V [CVd-V], sitrusviroid VI [CVd-VI], og sitrus viroid VII [CVd-VII]), ikke-apscaviroids hop stunt viroid (HSVd; hostuviroid), sitrus bark cracking viroid (CBCVd; cocadviroid), og sitrus exocortis viroid (CEVd; pospiviroid) i batch 1 og batch 5. Innen batch 1 og batch 5 var prøver som fulgte den infiserte positive for de ovennevnte plantesykdommene, men hadde økende Cq-verdier. Det ble imidlertid ikke påvist krysskontaminering mellom hodene eller falskt positive eller negative resultater (figur 4B).

Batch Eksempel BTE Første BTE Andre BTE
Kammer Prøvebehandling Prøvebehandling
Jeg 12 januar En 1-12 Ikke-infiserte 1-2 og 4-12 Ikke-infiserte
Prøve # 3 er erstattet med blanding infisert
II 13-24 B 13-24 13-24
Ikke-infiserte Ikke-infiserte
III 25-36 C 25-36 25-36
Ikke-infiserte Ikke-infiserte
IV 37-48 A-desinfisert 37-48 37-48
Ikke-infiserte Ikke-infiserte
V 49-60 B-desinfisert 49-60 49-50 og 52-60 ikke-infiserte
Ikke-infiserte
Prøve # 51 er erstattet med blanding infisert
VI 61-72 C-desinfisert 61-72 Ikke-infiserte 61-72 Ikke-infiserte

Tabell 1: Prosess fulgt for validering av BTE-vevsbehandlingsmetoden ved bruk av 72 sitrusknoppprøver. Hver behandling ble gjentatt to ganger. Det var 6 batcher med 12 prøver hver. I den første prøvebehandlingen var alle de 72 sitrusbudvedprøvene friske. I den andre BTE-prøvebehandlingen ble prøve 3 og prøve 51 erstattet med to prøver fra en treblanding infisert med virus og viroider i batch 1 og batch 5.

Figure 4
Figur 4: Validering av BTE-vevsbehandlingsmetoden ved bruk av 72 sitrusbudtreprøver. Hver behandling ble gjentatt to ganger. Det var 6 batcher med 12 prøver hver. (A) Alle de 72 sitrusknoppene var friske. (B) De samme 72 sitrusknoppprøvene med innføring av to prøver fra en treblanding infisert med virus og viroider i batch 1 (prøve 3) og batch 5 (prøve 51). NTC- og vannkontrollene hadde alle ubestemte Cq-verdier (dvs. DNA-mål som ikke var tilstede i prøven). De positive kontrollene for triplex (CLBV, CPsV, CTV) hadde Cq-verdier på henholdsvis 23,9, 25,2 og 22,4. De positive kontrollene for apscaviroider (CBLVd, CDVd og CBCVd) hadde Cq-verdier på henholdsvis 23,39, 21,27 og 25,17. De positive kontrollene for ikke-apskaviroider (CEVd, HSVd, IV) hadde Cq-verdier på henholdsvis 26,9, 27,0 og 26,5. Forkortelser: BTE = budwood vev extractor; NTC = ikke-malkontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur S1: Oppsett av rengjøringsstasjoner. Etter at den 10. prøven er behandlet i kammeret, skal protokolltrinn 3.1-3.6 følges for å forberede rengjøringsstasjonen for å desinfisere kammeret. Som i protokoll trinn 3.1, plasseres 1 liter vann i ultralydrenseren. To søppelposer er pakket over toppen av ultralydrenseren (protokoll trinn 3.2), og ~ 5 L 10% blekemiddel (1% natriumhypoklorittoppløsning) helles i ultralydrenseren (protokoll trinn 3.3). Vannbeholderen er fylt med nok vann til å senke et kammer (protokolltrinn 3.4), luftkompressoren slås av og ventilen åpnes (protokolltrinn 3.5). Et bakteppe er satt opp for å fange væsken mens kammeret tørker (protokoll trinn 3.6). Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Med fremkomsten av HLB sitrussykdom, for å redusere tap, har sitrusindustrien, reguleringsorganer og diagnostiske laboratorier blitt oppfordret til å stole på nukleinsyreekstraksjonsmetoder med høy gjennomstrømning kombinert med manuell prøvebehandling med lav gjennomstrømning og patogendeteksjonsanalyser som qPCR34 for testing av individuelle trær, i kombinasjon med sykdomshåndteringspraksis35. Californias HLB-positivitetsrate har gått fra 0.01% i 2012 til 1.2% i 2020. Selv om qPCR er et kraftig og pålitelig patogendeteksjonsverktøy, tillater ikke de tilgjengelige teknologiene at et tilstrekkelig volum plantevev blir samplet og behandlet, noe som resulterer i klar undersampling og undertesting for CLas i sitrustrær i California. Undersampling og undertesting forekommer både i forhold til antall testede trær og mengden plantemateriale per tre som behandles (dvs. antall blader), og på grunn av den sporadiske fordelingen av infiserte blader i trekronen, er det stor sannsynlighet for å gå glipp av tidlige eller milde infeksjoner. De nåværende metodene for prøvetaking og CLAS-testing kan ikke skaleres med økt etterspørsel på grunn av kostnader (f.eks. arbeidskraft og utstyr). For tiden krever prøvebehandlingsmetoden som brukes av de fleste sitrusdiagnostiske laboratorier i California for å skaffe nukleinsyrer egnet for sitruspatogentesting, over 17 timer for manuell prøvehåndtering og spesialiserte forsyninger og utstyr som koster over $ 100.000.

Her presenterer vi valideringen av et spesialisert instrument konstruert for raskt å behandle sitrusknoppbarkvev, kalt budwood tissue extractor (BTE), og en detaljert, trinnvis protokoll for prøvehåndtering for sitrusdiagnostiske laboratorier. Forskningen fokuserte på å utvikle en innovativ vevsbehandlingsmetode for å erstatte dagens arbeidskrevende håndhugging av budvedprøver og bygge det høyeste gjennomstrømningen og mest kostnadseffektive sitrusbudvedbehandlingsinstrumentet som er mulig. Resultatene viser at BTE øker prøvegjennomstrømningen og reduserer kostnadene for utstyr og forsyninger som brukes ved CCPPs diagnostiske laboratorium. Den presenterte teknologien og metoden inkluderer også bruk av NFC-koder, en telefonapp og en online database for sporing av sanntidsprøveinformasjon. Etter at budwood-prøver er samlet inn, kobler telefonappen NFC-prøveposeklipsen til NFC-tretaggen. Prøvene sendes deretter til laboratoriet for behandling med BTE-maskinen. Informasjon for hver prøve registreres med et raskt sveip over siden av BTE-kroppen. Gjennom prøven NFC -taggen blir behandlingstiden for hver prøve og prøvens vekt også registrert og lastet opp til den elektroniske databasen i sanntid. Denne metoden gir et svært tidseffektivt system, forbedrer kvalitetskontrollen (dvs. ved å unngå prøve-ID-feil) og øker laboratorieeffektiviteten.

BTEs høykapasitetsbehandling og validering ble utført med "virkelige / felt" sitrusprøver, noe som viser at andre diagnostiske laboratorier lett kan ta i bruk teknologien og metodikken. Å ta i bruk denne teknologien vil gjøre det mulig å redusere driftskostnadene og øke diagnostisk kapasitet og laboratorieeffektivitet, og dermed øke sjansene for å identifisere syke trær på et tidligere stadium etter at infeksjon oppstår og redusere sjansene for sykdomsspredning. Side-ved-side-sammenligningen av BTE versus konvensjonelle vevsbehandlingsmetoder viser at kvaliteten på ekstrahert nukleinsyre (dvs. konsentrasjon, renhet og integritet) og resultatene av nedstrøms patogendeteksjon er sammenlignbare (figur 3A-C). Imidlertid reduseres tiden brukt til å behandle prøvene betydelig ved bruk av BTE sammenlignet med manuelle behandlingsprotokoller (dvs. 3,3 min vs. 6,8 min). Kamrene og BTE-basen krever en regelmessig rengjøringsplan. Selv om rengjøringen er tidkrevende og utgjør en begrensning av metoden, gjør teknologien det mulig å behandle flere prøver raskt i BTE før kammeret må rengjøres. Konvensjonelle metoder krever mindre rengjøring ettersom hver prøve har sin egen behandlingsbeholder, som i mange tilfeller er engangsbeholder, men de trenger flere beholdere og lagringsplass (f.eks. 4 °C kjøleskap og -20 °C eller -80 °C frysere).

BTE-prosessen ble unnfanget og bygget for å øke sannsynligheten for å identifisere et problemområde via bulkprøvebehandling og testing (dvs. å finne et sykt tre i en stor sitrusbakteriefundamentblokk, barnehage eller frukthage) ved å kjøre bare et lite antall bulktester som kan identifisere hot spots. Derfor avviker det bare når et positivt resultat er funnet. Når dette skjer (figur 4B, batch 1 og batch 5), kreves etterfølgende prøvebehandling og testing av individuelle prøver fra samme batch som inneholder det positive materialet (dvs. bare en delmengde av prøver) for å bestemme hvilke prøver som er positive. Det er derfor viktig å merke seg at denne prosedyren først og fremst er egnet for tilfeller med lave infeksjonsrater, der den tillater testing av et høyt volum materiale fra mange trær, noe som til gjengjeld øker sannsynligheten for sykdomsdeteksjon uten å måtte teste et stort antall individuelle prøver. Konvensjonelle metoder vil være det optimale alternativet i tilfeller med høye infeksjonsrater, da de gjør at hver prøve kan testes individuelt. Dette er spesielt viktig når det gjelder HLB-undersøkelser i California20 (fortsatt med lav HLB-positivitetsrate), der de anvendte PCR-baserte metodene for CLAS-deteksjon primært er ment å bekrefte tilstedeværelsen eller fraværet av CLas i asymptomatiske trær (dvs. ingen typisk flekkete mottle, baldakinguling eller trenedgang) som har blitt utsatt for CLas-positive asiatiske sitruspsyllider (ACP). Gitt det faktum at vi ikke vet hvor i treet en smittsom ACP har matet, er sjansene for å identifisere et infisert, men asymptomatisk tre i feltet eller i et annet stort område eller operasjon ved å teste et lite antall prøver, svært lave (f.eks. I California samles for tiden 20 blader og 12 blader testes per tre20). Selvfølgelig, jo større trekronen, desto lavere er sjansene for CLAS-deteksjon. Selv om kostnadene ved PCR selv (dvs. reagenser, grunnleggende laboratorieutstyr og termocykler), som følger prøvebehandlingen, og nukleinsyreekstraksjonen og rensingen fortsetter uendret i BTE-prosessen, fortsetter usikkerheten om hvor man skal samle prøvene fra asymptomatiske trær for å avgjøre om de er smittet eller ikke, og etter vår mening, er akilleshælen til HLB-undersøkelsen i California. Det presenterte instrumentet, teknologien, metoden og forbedringene vil tillate behandling av større prøvestørrelser på kortere tid og til en lavere kostnad. Derfor vil denne metoden øke sannsynligheten for å identifisere infiserte trær i tide og forbedre utryddelsesinnsatsen for HLB eller andre invasive patogener av sitrus i California (f.eks. sitrusgult venefjerningsvirus rapportert i California i august 2022).

Kombinert med automatiserte vevsbehandlingsmetoder, vil bulkprøvetaking og testing tillate reduksjon av plantevevsbehandlingskostnader. Denne kostnadsreduksjonen vil tillate mange diagnostiske laboratorier å mer effektivt skjerme frukthager i mange stater og bedre spore bevegelsen av HLB og andre sykdommer. Til syvende og sist betyr dette at produsentene vil ha et mer effektivt verktøy for å bremse spredningen av sykdommer gjennom mer effektiv storskala testing. Mens BTE-instrumentet kan forbedre sitruslaboratorienes nåværende diagnostiske kapasitet og være til nytte for hele sitrusindustrien, kan teknologien samtidig overføres til andre treavlinger. De foreløpige dataene for nukleinsyrekonsentrasjon og renhet, som estimert av OD, har indikert at BTE effektivt kan behandle vev fra mandel (59,87 ng / μL ± 7,43 ng / μL og A260 / A280 1,17 ± 0,05, n = 9), vinranke (135,74 ng / μL ± 50,74 ng / μL og A260 / A280 1,17 ± 0,06, n = 9) og fersken (66,50 ng / μL ± 6,07 ng / μL og A260 / A280 1,29 ± 0,05, n = 9) (prøver vennlig levert av Foundation Plant Services ved UC Davis).

Budwood vevsbehandlingsplattform som presenteres her har inspirert utviklingen av ekstra plantevevsbehandlingsutstyr. For eksempel er en bladvevsekstraktor (LTE) for tiden under utvikling. Foreløpige testresultater ved bruk av sitrusblader har vist at LTE-instrumentet kunne behandle omtrent syv ganger flere blader med bare en 35% økning i behandlingstiden i forhold til dagens standard 12-bladmetode som brukes i California20. Vi har estimert at en LTE-støttet bulkprøvetaking og testprotokoll kan redusere den totale kostnaden per sitrusbladtest med en fjerdedel. Forskning for å bevise verdien av den praktiske anvendelsen av denne teknologien pågår for tiden under en CDFA Specialty Crop Block Grant i våre laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner Cahuilla-folket som de tradisjonelle vokterne av landet der det eksperimentelle arbeidet ble fullført. Vi er takknemlige for professor Norman Ellstrand ved University of California, Riverside, for å gi laboratorieplass til å utføre forskningsaktiviteter for dette prosjektet under UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ) Initiative. Denne forskningen ble støttet av CDFA - Specialty Crop Block Grant Program (stipend nr. 18-0001-055-SC). Ytterligere støtte ble også gitt av CRB-prosjektet 6100; USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch prosjekt 1020106; og National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Health Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, & AP20PPQS&T00C049) tildelt Georgios Vidalakis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.08" Hex Trimmer line PowerCare FPRO07065 Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor California Air Tools 8010 Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube Globe Scientific 111558B Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set Technology Evolving Solutions TE006-F1-10A-G1000-E1 Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach
12" Ruler Westcott ‎16012 To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite Hasa 1041 Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer Insignia NS-CZ70WH0 Store sample after processing
4" x 12" plastic bags Plymor FP20-4x12-10 Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab Puritan 806-PCL Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote HDX 206152 Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun JASTIND ‎JTABG103A Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie Sharpie  S-19421 Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor Brand Z627569 Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber Technology Evolving Solutions TE002BB-A05-E1 Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap Dawn 57445CT Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter Air Science P5-36XT-A Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container PolarTech 261/J50C Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat Red Kap KP14WH LN 46 Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop Microsoft Surface Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone Samsung Galaxy S9 Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag Technology Evolving Solutions TE005-Clip-E1 Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag Technology Evolving Solutions TE005-Collar-E1 Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves Usa Scientific 3915-4400 Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff 3M 90565-4DC-PS Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose FYPower ‎510019 Attaches air gun to compressor
Saftey glasses Solidwork SW8329-US Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle JohnBee B08QM81BJV Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base Technology Evolving Solutions TE001-A-E1 System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale Technology Evolving Solutions TE003-A05-200g-01-E1 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield 
Vermiculite EasyGoProducts B07WQDZGRP Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter Boenfu ‎BOWC-06002-US Wire cutters to cut trimmer line

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
  2. Vernière, C., et al. Citrus viroids: Symptom expression and effect on vegetative growth and yield of clementine trees grafted on trifoliate orange. Plant Disease. 88 (11), 1189-1197 (2004).
  3. Zhou, C., et al. Chapter 19 - Citrus viruses and viroids. The Genus Citrus. Talon, M., Caruso, M., Gmitter, F. G. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 391-410 (2020).
  4. Luckstead, J., Devadoss, S. Trends and issues facing the U.S. citrus industry. Choices Magazine Online. 36 (2), Available from: https://www.choicesmagazine.org/choices-magazine/theme-articles/trends-and-challenges-in-fruit-and-tree-nut-sectors/trends-and-issues-facing-the-us-citrus-industry (2021).
  5. Simnitt, S., Calvin, L. Fruit and Tree Nuts Outlook. United States Department of Agriculture-Economic Research Service. , Available from: https://www.ers.usda.gov/webdocs/outlooks/98171/fts-370.pdf?v=5697 (2020).
  6. Forsyth, J., Fruits Damiani, J. C. itrus Citrus Fruits. Types on the market. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. , Academic Press. Cambridge, MA. 1329-1335 (2003).
  7. Bostock, R. M., Thomas, C. S., Hoenisch, R. W., Golino, D. A., Vidalakis, G. Plant health: How diagnostic networks and interagency partnerships protect plant systems from pests and pathogens. California Agriculture. 68 (4), 117-124 (2014).
  8. Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).
  9. Wang, J., et al. Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale. Frontiers in Microbiology. 4, 366 (2013).
  10. Gergerich, R. C., et al. Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization. Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).
  11. Moreno, P., Ambrós, S., Albiach-Martí, M. R., Guerri, J., Peña, L. Citrus tristeza virus: A pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology. 9 (2), 251-268 (2008).
  12. Yokomi, R. K., et al. Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California. Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).
  13. Selvaraj, V., Maheshwari, Y., Hajeri, S., Yokomi, R. A rapid detection tool for VT isolates of Citrus tristeza virus by immunocapture-reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay. PLoS One. 14 (9), 0222170 (2019).
  14. Babcock, B. A. Economic impact of California's citrus industry in 2020. Journal of Citrus Pathology. 9, (2022).
  15. Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).
  16. Yokomi, R., et al. Molecular and biological characterization of a novel mild strain of citrus tristeza virus in California. Archives of Virology. 163 (7), 1795-1804 (2018).
  17. Fuchs, M., et al. Economic studies reinforce efforts to safeguard specialty crops in the United States. Plant Disease. 105 (1), 14-26 (2021).
  18. Singerman, A. The real cost of HLB in Florida. Citrus Industry Magazine. , Available from: https://citrusindustry.net/2019/07/30/the-real-cost-of-hib-in-florida/ (2019).
  19. McRoberts, N., et al. Using models to provide rapid programme support for California's efforts to suppress Huanglongbing disease of citrus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1776), 20180281 (2019).
  20. Albrecht, C., et al. Action plan for Asian citrus psyllid and huanglongbing (citrus greening) in California. Journal of Citrus Pathology. 7 (1), (2020).
  21. Navarro, L., et al. The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the period 1975-2001. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15 (15), (2002).
  22. Vidalakis, G., Gumpf, D. J., Polek, M. L., Bash, J. A. The California Citrus Clonal Protection Program. Citrus Production Manual. Ferguson, L., Grafton-Cardwell, E. E. , University of California, Agriculture and Natural Resources. Oakland, California. 117-130 (2014).
  23. Dang, T., et al. High-throughput RNA extraction from citrus tissues for the detection of viroids. In Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  24. Osman, F., Vidalakis, G. Real-time detection of viroids using singleplex and multiplex quantitative polymerase chain reaction. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  25. Li, R., et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Saponari, M., Manjunath, K., Yokomi, R. K. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 147 (1), 43-53 (2008).
  27. Damaj, M. B., et al. Reproducible RNA preparation from sugarcane and citrus for functional genomic applications. International Journal of Plant Genomics. 2009, 765367 (2009).
  28. Dang, T., et al. First report of citrus leaf blotch virus infecting Bearss lime tree in California. Plant Disease. 104 (11), 3088 (2020).
  29. Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques. 20 (6), 968-970 (1996).
  30. Teare, J. M., et al. Measurement of nucleic acid concentrations using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques. 22 (6), 1170-1174 (1997).
  31. Imbeaud, S. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 56-56 (2005).
  32. Menzel, W., Jelkmann, W., Maiss, E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods. 99 (1-2), 81-92 (2002).
  33. Vidalakis, G., et al. SYBR Green RT-qPCR for the universal detection of citrus viroids. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. , Humana. New York, NY. 211-217 (2022).
  34. Arredondo Valdés, R., et al. A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus. Canadian Journal of Microbiology. 62 (10), 803-811 (2016).
  35. Li, S., Wu, F., Duan, Y., Singerman, A., Guan, Z. Citrus greening: Management strategies and their economic impact. HortScience. 55 (5), 604-612 (2020).
  36. CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes. , Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019).

Tags

Bioengineering Budwood vev ekstraksjon hånd hakking "Candidatus Liberibacter asiaticus" CLas huanglongbing HLB Citrus tristeza virus CTV

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

to:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

Automatisering av sitrusbudvedbehandling for nedstrøms patogendeteksjon gjennom instrumentteknikk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E.,… More

Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E., Uribe, G., De Francesco, A., Milton, R., De La Torre, A., Mounkam, A., Dang, T., Bodaghi, S., Lavagi-Craddock, I., Syed, A., Grover, W., Okamba, A., Vidalakis, G. Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. J. Vis. Exp. (194), e65159, doi:10.3791/65159 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter