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Bioengineering

Automatizzare la lavorazione delle gemme di agrumi per il rilevamento di agenti patogeni a valle attraverso l'ingegneria degli strumenti

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65159
Automatic Translation
*1,6, *2, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5, *1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside, 2Technology Evolving Solutions (TES), 3Department of Bioengineering, University of California Riverside, 4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV, 5University of California Riverside, 6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Abbiamo progettato, fabbricato e convalidato uno strumento che elabora rapidamente i tessuti di corteccia di agrumi ricchi di floema. Rispetto ai metodi attuali, l'estrattore di tessuti di gemme (BTE) ha aumentato la produttività dei campioni e diminuito i costi di manodopera e attrezzature necessari.

Abstract

Gli agenti patogeni degli agrumi trasmissibili e limitati al floema degli agrumi, come virus, viroidi e batteri, sono responsabili di epidemie devastanti e gravi perdite economiche in tutto il mondo. Ad esempio, il virus della tristeza degli agrumi ha ucciso oltre 100 milioni di alberi di agrumi in tutto il mondo, mentre il "Candidatus Liberibacter asiaticus" è costato alla Florida 9 miliardi di dollari. L'uso di gemme di agrumi testate per i patogeni per la propagazione degli alberi è fondamentale per la gestione di tali patogeni. Il Citrus Clonal Protection Program (CCPP) presso l'Università della California, Riverside, utilizza saggi di reazione a catena della polimerasi (PCR) per testare ogni anno migliaia di campioni di alberi di origine di gemme di agrumi per proteggere gli agrumi della California e per fornire unità di propagazione pulite al National Clean Plant Network. Un grave collo di bottiglia nella rilevazione molecolare ad alto rendimento di virus e viroidi degli agrumi è la fase di elaborazione dei tessuti vegetali.

Una corretta preparazione dei tessuti è fondamentale per l'estrazione di acidi nucleici di qualità e per l'uso a valle nei saggi PCR. La triturazione, la pesatura, la liofilizzazione, la macinazione e la centrifugazione a basse temperature dei tessuti vegetali per evitare la degradazione degli acidi nucleici richiedono molto tempo e manodopera e richiedono attrezzature di laboratorio costose e specializzate. Questo documento presenta la convalida di uno strumento specializzato progettato per elaborare rapidamente tessuti di corteccia ricchi di floema da gemme di agrumi, chiamato estrattore di tessuti di gemme (BTE). Il BTE aumenta la produttività del campione del 100% rispetto ai metodi attuali. Inoltre, riduce la manodopera e il costo delle apparecchiature. In questo lavoro, i campioni di BTE avevano una resa del DNA (80,25 ng/μL) paragonabile al protocollo di taglio manuale del CCPP (77,84 ng/μL). Questo strumento e il protocollo di elaborazione rapida dei tessuti vegetali possono avvantaggiare diversi laboratori e programmi diagnostici sugli agrumi in California e diventare un sistema modello per il trattamento dei tessuti per altre colture perenni legnose in tutto il mondo.

Introduction

Gli agenti patogeni trasmissibili degli agrumi a basso floema, come viroidi, virus e batteri, hanno causato epidemie devastanti e gravi perdite economiche in ogni area produttrice di agrumi del mondo. I viroidi degli agrumi sono fattori di produzione limitanti a causa delle malattie da esocortis e cachessia che causano in tipi di agrumi economicamente importanti, come trifogliati, ibridi trifogliati, mandarini, clementine e mandarini 1,2,3. In California, questi tipi di agrumi sensibili ai viroidi sono alla base del mercato in crescita e redditizio degli "easy-peelers", seguendo la tendenza mutevole nella preferenza dei consumatori per frutti facili da sbucciare, segmentati e senza semi 4,5,6. Pertanto, i viroidi degli agrumi sono regolamentati dal Dipartimento per l'alimentazione e l'agricoltura della California (CDFA) "Citrus Nursery Stock Cleaning Program-Senate Bill 140" e i laboratori del Plant Pest Diagnostics Branch del CDFA eseguono migliaia di test sui viroidi degli agrumi ogni anno 7,8,9,10 . Il virus Citrus tristeza (CTV) è stato responsabile della morte di oltre 100 milioni di alberi di agrumi dall'inizio dell'epidemia globale negli anni '30 3,9,10,11. In California, la vaiolatura del fusto e gli isolati di resistenza alla rottura trifogliata del virus rappresentano una seria minaccia per l'industria agrumicola californiana da 3,6 miliardi di dollari12,13,14. Di conseguenza, il CDFA classifica il CTV come un parassita delle piante regolamentato di classe A e il laboratorio dell'Agenzia per l'eradicazione della tristeza della California centrale (CCTEA) esegue indagini approfondite sul campo e migliaia di test sui virus ogni anno15,16. Si stima che il batterio "Candidatus Liberibacter asiaticus" (CLas) e la malattia huanglongbing (HLB) abbiano causato quasi 9 miliardi di dollari di danni economici alla Florida a causa di una riduzione del 40% della superficie coltivata a agrumi, una diminuzione del 57% delle operazioni di agrumi e una perdita di quasi 8.000posti di lavoro. In California, si prevedeva che un'ipotetica riduzione del 20% della superficie coltivata a agrumi a causa dell'HLB avrebbe comportato la perdita di oltre 8.200 posti di lavoro e una riduzione di oltre mezzo miliardo di dollari nel prodotto interno lordo dello stato. Pertanto, il Citrus Pest and Disease Prevention Program spende oltre 40 milioni di dollari all'anno in indagini per testare, rilevare e sradicare CLas dalla California14,17,19,20.

Un elemento chiave della gestione dei viroidi, dei virus e dei batteri degli agrumi è l'uso di materiali di propagazione testati contro i patogeni (ad esempio, gemme) per la produzione di alberi. Le gemme di agrumi testate per i patogeni vengono prodotte e mantenute nell'ambito di programmi di quarantena completi che impiegano tecniche avanzate di eliminazione e rilevamento dei patogeni10,21. Il Citrus Clonal Protection Program (CCPP) presso l'Università della California, Riverside, testa ogni anno migliaia di campioni di gemme di varietà di agrumi importate di recente nello stato e negli Stati Uniti, nonché alberi di origine di gemme di agrumi, per proteggere gli agrumi della California e sostenere le funzioni del National Clean Plant Network for Citrus10,17,22. Per gestire il grande volume di analisi degli agrumi, i saggi di rilevamento dei patogeni ad alta produttività, affidabili ed economici sono una componente fondamentale per il successo di programmi come il CCPP 7,10,22.

Mentre i saggi di rilevamento dei patogeni su base molecolare come la reazione a catena della polimerasi (PCR) hanno consentito un aumento significativo della produttività nei laboratori diagnostici vegetali, nella nostra esperienza, uno dei colli di bottiglia più critici nell'implementazione di protocolli ad alto rendimento è la fase di elaborazione dei campioni di tessuto vegetale. Ciò è particolarmente vero per gli agrumi perché i protocolli attualmente disponibili per la lavorazione di tessuti ricchi di floema come i piccioli delle foglie e la corteccia delle gemme sono laboriosi, richiedono tempo e attrezzature di laboratorio costose e specializzate. Questi protocolli richiedono la trinciatura manuale, la pesatura, la liofilizzazione, la macinazione e la centrifugazione a basse temperature per evitare la degradazione dell'acido nucleico 8,23,24. Ad esempio, presso il laboratorio diagnostico CCPP, l'elaborazione dei campioni comprende (i) la trinciatura manuale (6-9 campioni/h/operatore), (ii) la liofilizzazione (16-24 ore), (iii) la polverizzazione (30-60 s) e (iv) la centrifugazione (1-2 ore). Il processo richiede anche forniture specializzate (ad esempio, tubi con chiusura sicura per impieghi gravosi, sfere di macinazione in acciaio inossidabile, adattatori, lame, guanti) e più costose apparecchiature di laboratorio (ad esempio, congelatore ultra-basso, liofilizzatore, polverizzatore di tessuti, criostazione di azoto liquido, centrifuga refrigerata).

Come in qualsiasi settore, la progettazione delle apparecchiature e l'automazione dei processi sono fondamentali per ridurre i costi, aumentare la produttività e fornire prodotti e servizi uniformi e di alta qualità. L'industria agrumicola ha bisogno di strumenti per il trattamento dei tessuti a basso costo che richiedano competenze minime per funzionare e, in quanto tali, siano facili da trasferire ai laboratori diagnostici e alle operazioni sul campo per consentire un'elevata capacità di elaborazione dei campioni per un rapido rilevamento dei patogeni a valle. Technology Evolving Solutions (TES) e il CCPP hanno sviluppato (cioè progettato e fabbricato) e convalidato (cioè testato con campioni di agrumi e confrontato con le procedure di laboratorio standard) uno strumento a basso costo (cioè ha eliminato la necessità di attrezzature di laboratorio specializzate) per la lavorazione rapida di tessuti di agrumi ricchi di floema (cioè gemme), chiamato estrattore di tessuti di gemme (BTE). Come si vede nella Figura 1, il BTE include un componente di base per l'alimentazione e i controlli, oltre a una camera rimovibile per la lavorazione delle gemme di agrumi. La camera BTE è composta da una mola appositamente progettata per rimuovere i tessuti di corteccia ricchi di floema dal gemma di agrumi. Il tessuto di corteccia sminuzzato viene espulso rapidamente attraverso una porta di scorrimento in una siringa contenente tampone di estrazione, filtrato e reso pronto per l'estrazione e la purificazione dell'acido nucleico senza alcuna manipolazione o preparazione aggiuntiva (Figura 1). Il sistema BTE comprende anche un'applicazione di tracciamento dei campioni senza carta e un'applicazione di pesatura integrata, che registrano le informazioni di elaborazione dei campioni in un database online in tempo reale.

Il sistema BTE ha aumentato la capacità diagnostica di laboratorio del CCPP di oltre il 100% e ha prodotto costantemente estratti di tessuto di agrumi adatti alla purificazione di acidi nucleici di alta qualità e al rilevamento a valle di agenti patogeni trasmissibili agli innesti di agrumi utilizzando saggi PCR. Più specificamente, BTE ha ridotto il tempo per l'elaborazione dei tessuti da oltre 24 ore a ~3 minuti per campione, ha sostituito gli strumenti di laboratorio che costano oltre $ 60.000 (Figura 2, passaggi 2-4) e ha consentito l'elaborazione di campioni di dimensioni maggiori.

Questo documento presenta i dati di convalida del trattamento del tessuto di corteccia di agrumi ad alto rendimento BTE, l'estrazione dell'acido nucleico e il rilevamento di agenti patogeni con campioni di gemme di agrumi da alberi di origine, inclusi tutti i controlli positivi e negativi appropriati rispettivamente dalla CCPP Rubidoux Quarantine Facility e dalla Lindcove Foundation Facility. Presentiamo anche le variazioni di produttività e tempo di elaborazione rispetto all'attuale procedura di laboratorio (Figura 2). Inoltre, questo lavoro fornisce un protocollo dettagliato e passo-passo per i laboratori di analisi dei patogeni degli agrumi e dimostra come il BTE possa supportare le funzioni dei programmi di nursery clean per i patogeni, l'indagine e l'eradicazione.

Figure 1
Figura 1: Estrattore di tessuto di gemme. Il BTE comprende un componente di base per l'alimentazione e i controlli, oltre a una camera rimovibile per la lavorazione delle gemme di agrumi. La camera BTE è composta da una mola appositamente progettata per rimuovere i tessuti di corteccia ricchi di floema dal legno di agrumi. Il tessuto di corteccia triturato viene espulso rapidamente attraverso una porta scorrevole in una siringa, filtrato e preparato per l'estrazione e la purificazione dell'acido nucleico senza alcuna manipolazione o preparazione aggiuntiva. Abbreviazione: BTE = estrattore di tessuti di gemme. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Confronto passo dopo passo tra la procedura convenzionale di laboratorio di taglio manuale e la lavorazione BTE. L'elaborazione BTE comporta l'elaborazione del tessuto di corteccia di agrumi ad alto rendimento, l'estrazione dell'acido nucleico e il rilevamento di agenti patogeni. Il tempo per ogni passaggio è indicato tra parentesi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocol

1. Raccolta dei campioni di gemme di agrumi da spedire

  1. Inviare a Technology Evolving Solutions un foglio di calcolo con le informazioni sugli alberi da caricare nel server Web (alla fine, l'utente creerà nuovi alberi).
  2. Usa il localizzatore TES dell'app del telefono per selezionare un albero e tieni un collare NFC (Near Field Communication) tag sul telefono per caricare le informazioni sull'albero sul tag.
  3. Inserire tre o quattro campioni di gemme di agrumi nel portasacchetti di plastica compatibile con BTE e chiudere con il coperchio.
    1. Assicurarsi che la lunghezza del gemmo non superi gli 8 pollici e non sia inferiore a 5 pollici.
      1. Se la lunghezza è superiore a 8 pollici, utilizzare una lametta da barba sterile usa e getta o cesoie da potatura decontaminate con una soluzione di candeggina al 10% (ipoclorito di sodio all'1%) per accorciarlo.
      2. Se la lunghezza è inferiore a 5 pollici, raccogliere un campione di gemme diverso da mettere nel sacchetto.
    2. Assicurarsi che eventuali escrescenze ascellari o spine di grandi dimensioni vengano rimosse a mano o utilizzando utensili da taglio disinfettati con candeggina al 10% (ipoclorito di sodio all'1%).
      NOTA: Questo passaggio è importante in modo che il gemmolo sia più facile da manovrare nell'apertura della camera.
    3. Assicurarsi che non vi siano campioni di gemme con caratteristiche curve. In tal caso, rimuoverli utilizzando utensili da taglio disinfettati con candeggina al 10% (ipoclorito di sodio all'1%) e mettere nei sacchetti BTE solo le parti diritte del campione.
      NOTA: Il gemmolo curvo è molto difficile da manovrare nello strumento, con conseguente striatura irregolare della corteccia.
  4. Usa l'app del telefono TES tracker per scansionare l'etichetta del collare NFC dell'albero e collegarla con l'etichetta della clip NFC sul sacchetto del campione.
  5. Prestare attenzione allo spessore del legno di gemma in quanto ciò determina il modo in cui l'operatore rimuoverà la corteccia di gemma ricca di floema all'interno della camera BTE.
    1. Se il legno di gemma ha uno spessore inferiore a 0,20 pollici, fare attenzione durante lo stripping del legno di gemma perché i fili di filatura ad alta velocità nella camera polverizzeranno l'intero legno di gemma fino al suo nucleo, oltre lo strato di corteccia e nei tessuti non ricchi di floema di legno e midollo.
    2. Scegliete gemme più spesse perché è più facile rimuovere i tessuti della corteccia evitando i tessuti di gemme non ricchi di floema.
  6. Metti i campioni in un contenitore isolato con alcuni impacchi di ghiaccio.

2. Installazione nella cappa aspirante

NOTA: Si preferisce far funzionare il BTE all'interno di una cappa aspirante. Ciò ridurrà il rischio di contaminazione incrociata dei tessuti vegetali e di contaminazione di laboratorio.

  1. Disinfettare con un flacone spray al 10% (ipoclorito di sodio all'1%).
    1. Spruzza la superficie della cappa e lascia riposare la candeggina per circa 1 minuto prima di pulirla con un tovagliolo di carta.
    2. Spruzza un tovagliolo di carta con la soluzione di candeggina. Pulisci la base TE, i componenti della bilancia (bilancia, scudo aereo e torre) e un pennarello.
  2. Scartare un set di siringhe per il numero di campioni da processare e posizionarli all'interno di una scatola di cartone coperta.
  3. Tenere a disposizione una confezione di tamponi all'esterno del cofano nel caso in cui siano necessari.
  4. Prepara la bilancia.
    1. Rimuovere la torre pesi dalla bilancia e tenere premuto il pulsante di accensione per accenderla. Posiziona la torre al centro della bilancia dopo che la scala visualizza 0.
    2. Far scorrere lo scudo d'aria della bilancia sulla parte anteriore della bilancia.
  5. Preparare la base dell'estrattore di tessuti girando l'interruttore sul retro. Assicurarsi che l'interruttore sul lato sinistro della scatola sia premuto verso il basso sulla parte superiore. Attendere che un LED verde lampeggiante, che indica che la camera è pronta.

3. Predisporre le stazioni di pulizia (figura supplementare S1).

  1. Mettere 1 L di acqua nel pulitore ad ultrasuoni.
  2. Avvolgere due sacchetti della spazzatura sopra il pulitore ad ultrasuoni.
  3. Versare ~5 L di candeggina al 10% (soluzione di ipoclorito di sodio all'1%) nel pulitore ad ultrasuoni.
  4. Riempi la vasca dell'acqua con abbastanza acqua per immergere una camera.
  5. Accendere il compressore d'aria e aprire la valvola.
  6. Prepara uno sfondo per raccogliere il liquido mentre la camera si sta asciugando.

4. Lavorazione del materiale per il BTE per la rimozione della corteccia di agrumi

  1. Caricare la camera sulla base BTE.
    1. Preparare la camera BTE.
      1. Fissare un sacchetto vuoto per campioni sul retro della camera. Utilizzare due O-ring per fissare il sacchetto vuoto all'ugello posteriore della camera BTE.
      2. Ispezionare la lama per segni di usura o danni, come tagli che si formano sulla lama dove continua nella plastica o tagli che si formano sulla punta. Assicurarsi che la freccia sulla lama sia allineata con il simbolo del lucchetto singolo.
      3. Assicurarsi che il rilascio dell'aria sul fondo della camera sia rivolto verso il simbolo O . Posizionare il coperchio trasparente sull'apertura della camera e far scorrere il vetrino BTE trasparente sulla camera utilizzando il binario a destra della camera. Spingere il blocco sul fondo della camera fino in fondo nella slitta. Assicurarsi che il cappuccio dello stantuffo sia montato sulla parte superiore del vetrino.
    2. Posizionare la camera sulla base BTE con l'ugello della base BTE che sporge nella parte posteriore della camera. Attendere che il LED blu lampeggi, indicando che il posizionamento è andato a buon fine.
  2. Caricare il campione sulla base BTE spostando l'adesivo bianco sulla clip NFC tag su una Z sul lato destro della scatola. Muovi il tag con un lento movimento circolare su Z finché la luce gialla non inizia a lampeggiare. Fissare il campione alla base BTE e assicurarsi che il sacchetto del campione non abbia fori; Se c'è un buco, rattoppalo con del nastro adesivo. Posizionare l'O-ring sulla sacca del campione per fissarla alla parte anteriore dell'ugello BTE.
  3. Caricare il set di siringhe non utilizzato.
    1. Tarare il set di siringhe. Posizionare il set di siringhe non utilizzato sulla torre della bilancia. Rimuovere il set di siringhe quando una luce rossa inizia a lampeggiare o la bilancia visualizza 0.
    2. Rimuovere lo stantuffo dalla siringa con il filtro. Assicurarsi che il fluido si trovi nella siringa inferiore (senza filtro). Metti da parte lo stantuffo su un tovagliolo di carta o sulla torre dove lo stantuffo nero non tocca alcuna superficie.
    3. Collegare la siringa alla porta di uscita del vetrino premendo la porta di uscita nella siringa e ruotandola di 90°.
  4. Elaborare il campione di gemme.
    ATTENZIONE: BTE ha parti mobili ad alta velocità. Tutte le operazioni devono avvenire all'interno di una cappa aspirante. Tutti gli utenti devono utilizzare occhiali protettivi, paraorecchie (tappi per le orecchie) e tutti gli altri dispositivi di protezione individuale (DPI), come guanti e camici da laboratorio.
    1. Premere il pulsante nero in alto per avviare la macchina. Premere una seconda volta per arrestare il motore in qualsiasi momento durante la lavorazione.
      NOTA: La scatola è dotata di rilevamento della velocità e della temperatura per garantirne il corretto funzionamento.
    2. Prendi un bastoncino di gemme attraverso il sacchetto e inseriscilo nella parte superiore dell'ugello BTE.
    3. Afferra il bastoncino di gemme sull'altro lato della camera con l'altra mano e scendi lentamente nella lama. Ascolta un leggero ronzio che indica che il gemello viene spogliato della sua corteccia. Muovi lentamente il bocciolo avanti e indietro mentre lo giri.
      1. Se si sente un suono di taglio forte e aggressivo, spostare rapidamente il ramo verso l'alto e/o premere il pulsante superiore per arrestare il motore. Per arrestare il motore, utilizzare l'interruttore sul lato destro per terminare la lavorazione (vedere il passaggio 4.4.3.2).
      2. Se durante il taglio non esce materiale dall'uscita, la camera presenta un intasamento. Spegnere il motore, rimuovere il tappo dello stantuffo scorrevole e utilizzare la plastica del tampone per spingere l'intasamento fuori dall'uscita della macchina. Utilizzare l'interruttore sul lato destro per terminare la lavorazione: Su = Taglio in avanti; Centrale = Motore spento; Giù = Taglio inverso.
    4. Ripetere i passaggi 4.4.2 e 4.4.3 per i rami rimanenti.
      NOTA: Un indicatore generale che una quantità sufficiente di corteccia di gemme è stata rimossa è quando il 25% della siringa è stato riempito con tessuto vegetale. Gli agenti patogeni trasmissibili agli innesti degli agrumi potrebbero essere distribuiti in modo non uniforme nell'albero. Pertanto, vengono raccolti da tre a quattro campioni di gemme intorno alla chioma degli agrumi. È importante che ogni campione di gemme nella borsa di trasporto BTE contribuisca al campione finale di tessuto macinato per garantire che un campione rappresentativo dell'albero completo venga testato per gli agenti patogeni.
    5. Premere il pulsante nero in alto per interrompere l'elaborazione. Attendi che la spia inizi a lampeggiare di nuovo in giallo.
  5. Verificare il peso del campione.
    1. Ruotare la siringa di 90° e tirarla verso il basso per staccarla. Riposizionare lo stantuffo sulla siringa e posizionare la siringa sulla torre.
    2. Attendere che la bilancia rilevi automaticamente il campione e determinare se rientra nell'intervallo di peso corretto (0,25 ± 0,05 g). Se il peso del campione è troppo basso (<0,20 g), ripetere il passaggio 4.4; il LED rosso inizierà a lampeggiare. Se il peso del campione è troppo elevato (>0,30 g), rimuovere parte del materiale del campione; il LED giallo inizierà a lampeggiare più lentamente. Se il campione si trova all'interno dell'intervallo, il LED verde inizierà a lampeggiare.
  6. Omogeneizzazione del campione di gemme
    1. Rimuovere lo stantuffo dalla siringa con il campione, spingere il fluido nella siringa con il campione e aggiungere nuovamente lo stantuffo. Lo stantuffo spinge il tampone e la linfa vegetale attraverso il filtro a rete (trattenendo eventuali pezzi di tessuto di corteccia di grandi dimensioni) e attraverso il tubo di gomma nella siringa vuota.
    2. Mescolare il campione spingendo il tampone e la linfa della pianta avanti e indietro da una siringa all'altra. Ripetere ~3x-4x e fino a quando il campione diventa una miscela liquida verde omogenea.
    3. Una volta ben omogeneizzato, spingere il campione di linfa vegetale nella siringa senza il filtro a rete e staccare il tubo di gomma e la siringa con il filtro dalla siringa con il campione.
    4. Espellere il campione di linfa vegetale dalla siringa in una provetta sterile per microcentrifuga da 2 ml e conservare a -20 °C fino al nuovo utilizzo. Utilizzare un pennarello indelebile per etichettare il campione con il numero del sacchetto.
      NOTA: La linfa del campione vegetale della fase 4.6.5 può ora essere elaborata con uno qualsiasi dei metodi di estrazione di acido nucleico, RNA o DNA disponibili basati su fenolo-cloroformio, colonna di silice o microsfere magnetiche 9,25,26,27 per l'estrazione e la purificazione dell'acido nucleico (vedere la fase 7) e la rilevazione a valle di agenti patogeni trasmissibili all'innesto degli agrumi (vedere la fase 8).

5. Sanificazione della camera rimovibile BTE

ATTENZIONE: Se il tampone del set di siringhe entra nella camera o nel vetrino, sciacquare e seguire tutte le norme di sicurezza del laboratorio prima della pulizia. Il set di siringhe contiene tiocianato di guanidina. Se il tampone del set di siringhe entra in contatto con la candeggina, creerà gas cianuro.

  1. Eseguire i seguenti passaggi dopo che il 10° campione è stato processato nella camera. Si noti che il LED verde continuerà a lampeggiare invece di passare a lampeggiare in blu.
  2. Smontare la camera BTE per pulire tutti i possibili contaminanti; Rimuovere il coperchio di plastica trasparente, pulire il vetrino della camera e liberare la porta di intasamento sul vetrino della camera.
  3. Ruotare la valvola di rilascio dell'aria sul fondo della camera in posizione aperta (segno del lucchetto aperto). Posizionare i componenti della camera nel pulitore ad ultrasuoni di configurazione (vedere il passaggio 3.1). Posizionare il coperchio sotto la camera per evitare che galleggi. Far funzionare il pulitore ad ultrasuoni per 15 min.
    NOTA: Il bagno di lavaggio ad ultrasuoni (5 L) può contenere fino a due camere.
  4. Sciacquare i componenti della camera a bagnomaria (punto 3.4) per almeno 30 s. Spostare i componenti della camera nella stazione di essiccazione.
    ATTENZIONE: L'asciugatura causerà parti in rapido movimento all'interno della camera, rumori forti (~85 decibel [dB]) e possibili schizzi. Tutti gli utenti devono utilizzare occhiali protettivi, cuffie (tappi per le orecchie), camici da laboratorio e tutti gli altri DPI come richiesto dalle norme di sicurezza del laboratorio operativo.
  5. Asciugare la camera BTE.
    1. Posizionare la pistola ad aria compressa in linea con la scanalatura dell'apertura superiore della camera (dove in genere si trova il vetrino). Premere il grilletto della pistola per erogare aria per ~30 s.
      NOTA: Assicurarsi che l'apertura sia lontana dall'utente verso lo sfondo. Questo dovrebbe far girare il set di lame per rimuovere il liquido intrappolato sotto di esso.
    2. Posizionare la pistola ad aria compressa verso gli ugelli superiori della camera. Premere il grilletto della pistola ad aria compressa e tracciare lentamente tre cerchi completi di ciascun ingresso dell'ugello.
    3. Posizionare la pistola ad aria compressa al centro del BTE. Partendo dal punto più interno, tieni premuto il grilletto e muoviti finché la pistola ad aria compressa non punta verso il punto in cui si troverebbe il carrello.
    4. Fai scorrere rapidamente l'aria su tutta la camera, davanti e dietro, per far uscire l'acqua superficiale dall'esterno.
  6. Asciugare il vetrino BTE.
    1. Posizionare la pistola ad aria compressa nella fessura dello stantuffo del carrello e premere il grilletto per espellere l'acqua dall'uscita del vetrino.
    2. Far scorrere una pistola ad aria compressa lungo la superficie interna del vetrino per asciugarlo.
    3. Far scorrere una pistola ad aria compressa lungo la scanalatura di scorrimento per spingere fuori l'acqua.
    4. Fai scorrere rapidamente l'aria su tutto l'esterno per eliminare l'acqua superficiale.
  7. Asciugare i componenti.
    1. Tenere in mano il cappuccio dello stantuffo scorrevole e gli O-ring e premere il grilletto.
    2. Far passare una pistola ad aria compressa sulla superficie interna del coperchio.
    3. Posizionare i componenti nella camera e farli scorrere per continuare ad asciugarli o rimontarli.
      NOTA: Per un ambiente ad alta lavorazione dei tessuti con più BTE funzionali, è possibile fornire un sistema di sanificazione batch in grado di decontaminare 10 camere contemporaneamente.

6. Smaltimento e sanificazione

  1. Smaltire le siringhe e il tubo di gomma nell'apposito contenitore per rifiuti di guanidina.
  2. Smaltire qualsiasi materiale vegetale nel contenitore dei rifiuti a rischio biologico.
  3. Rimuovere la camera BTE dalla base BTE.
  4. Smontare la camera BTE e procedere alla loro decontaminazione, come descritto al punto 5.

7. Valutazione del trattamento tissutale e della qualità dell'RNA purificato dagli estratti di gemme di agrumi BTE

NOTA: In questo protocollo, abbiamo utilizzato campioni di gemme di 255 alberi di agrumi per confrontare il tempo necessario per la lavorazione del tessuto di gemme di agrumi e la qualità dell'RNA purificato dagli estratti di tessuto di corteccia preparati da BTE (Figura 2, lato destro, fase 1, fase 5 e fase 6) rispetto a quella preparata seguendo il metodo di lavorazione dei tessuti di gemme di agrumi approvato dalla regolamentazione utilizzando la pelatura e la triturazione a mano. liofilizzazione, polverizzazione e centrifugazione del tessuto corteccia, come descritto da Dang et al.23 (Figura 2, lato sinistro, passaggi 1-6).

  1. Procedura di laboratorio attuale: preparare campioni di gemme per la lavorazione dei tessuti secondo il metodo23 approvato dalla normativa.
    1. Eseguire la pelatura a mano e la triturazione del tessuto corteccia, la liofilizzazione, la polverizzazione, la centrifugazione e il trasferimento della linfa della pianta alla provetta di estrazione dell'RNA, come descritto da Dang et al.23 (Figura 2, lato sinistro, passaggi 1-6).
    2. Dopo aver staccato a mano i tre o quattro campioni di gemme da ciascun albero testato, posizionare tutto il legno di gemma all'interno di un sacchetto di plastica compatibile con BTE e conservare a 4 °C fino alla lavorazione del BTE (passaggio 7.2).
  2. Procedura BTE: avviare la lavorazione del tessuto di gemme di agrumi BTE (sezione 4, passaggi 4.1-4.6; Figura 2, lato destro, passaggio 1, passaggio 5 e passaggio 6).
    1. Utilizzare i campioni di gemme conservati all'interno dei sacchetti BTE del passaggio 7.1.2.
  3. Estrarre e purificare l'RNA dalla linfa vegetale ottenuta con l'attuale procedura di laboratorio (fase 7.1.1) e la procedura BTE (fase 7.2.2) utilizzando il metodo semiautomatico a biglie magnetiche 8,23,28, approvato dalla normativa.
  4. Valutare la qualità dell'RNA misurandone la concentrazione, la purezza e l'integrità 8,23,24,29,3 3,31.
    1. Per calcolare la concentrazione, utilizzare la spettrofotometria e la densità ottica (OD) a una lunghezza d'onda di 260 nm.
    2. Per valutare la purezza, utilizzare un rapporto OD spettrofotometrico di 260/280.
    3. Per verificare l'integrità, utilizzare la reazione di reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) a trascrizione inversa (RT) mirata all'mRNA del gene24,32 della NADH deidrogenasi degli agrumi.

8. Valutazione della contaminazione incrociata e individuazione di virus e viroidi degli agrumi mediante RNA purificato da estratti di gemme di agrumi BTE

NOTA: In questo protocollo, sono stati utilizzati campioni di gemme provenienti da 72 alberi di agrumi non infetti e da un mix di alberi infettati da virus e viroidi per valutare il potenziale di contaminazione incrociata tra i campioni quando processati da BTE (Figura 2, lato destro, fase 1, fase 5 e fase 6) e l'idoneità dell'RNA purificato da estratti di tessuto di corteccia preparati da BTE per essere utilizzato come modello per la rilevazione RT-qPCR di virus e viroidi degli agrumi.

  1. Prima elaborazione del campione BTE: condurre un esperimento di base con 72 campioni non infetti.
    1. Preparare tre camere BTE (A-C) (passaggio 4.1.1).
    2. Preparare tutti i campioni di gemme di agrumi non infetti (1-72) in sacchetti di trasporto BTE e prepararne un numero uguale (72) nel sistema di raccolta dei campioni BTE a due siringhe, con un sistema di siringhe per ciascun campione (fase 2.4).
    3. Separare le sacche per la raccolta dei campioni e le siringhe per la raccolta dei campioni in sei lotti (I-VI) di 12 campioni ciascuno.
    4. Avviare il trattamento del tessuto di gemme di agrumi BTE (fase 4) seguendo la sequenza seguente (passaggi 8.1.4.1-8.1.4.6) (vedere Tabella 1, Primo trattamento del campione BTE).
      1. Per il lotto I/campioni 1-12, elaborare 12 campioni utilizzando la camera A. Sanificare la camera A dopo il campione 12 (fase 5).
      2. Per il lotto II/campioni 13-24, processare 12 campioni utilizzando la camera B. Sanificare la camera B dopo il campione 24 (fase 5).
      3. Per il lotto III/campioni 25-36, elaborare 12 campioni utilizzando la camera C. Sanificare la camera C dopo il campione 36 (fase 5).
      4. Per il lotto IV/campioni 37-48, processare 12 campioni utilizzando la camera sanificata A (fase 8.1.4.1).
      5. Per il lotto V/campioni 49--60, processare 12 campioni utilizzando la camera sanificata B (passaggio 8.1.4.2).
      6. Per il lotto VI/campioni 60-72, processare 12 campioni utilizzando la camera sanificata C (fase 8.1.4.3).
    5. Conservare le buste BTE con tutti i campioni a 4 °C fino all'uso al punto 8.2.
    6. Estrarre e purificare l'RNA dai 72 campioni di linfa vegetale generati nelle fasi 8.1.4.1-8.1.4.6 utilizzando il metodo semiautomatico a biglie magneticheapprovato dalla normativa 8,23,28.
    7. Eseguire la RT-qPCR per la rilevazione di virus e viroidi degli agrumi, come descritto in precedenza 8,33.
  2. Per il secondo trattamento del campione BTE, eseguire un esperimento di contaminazione incrociata con 70 campioni non infetti e due campioni infetti misti.
    1. Preparare tre camere BTE (A-C) (passaggio 4.1.1).
    2. Preparare il campione di gemme di agrumi infetti da mix (73) in due buste di trasporto BTE (fase 1.3) per un numero totale di due campioni infetti.
    3. Raccogliere i sacchi BTE con i campioni di gemme di agrumi non infetti della fase 8.1.5, ad eccezione del campione 3-lotto I e del campione 51-lotto V (vedere la sostituzione del campione nella fase 8.2.4), per un numero totale di 70 campioni non infetti.
    4. Includere la prima busta BTE con il campione 73 infetto da miscela al posto del campione 3 nel lotto I e la seconda al posto del campione 51 nel lotto V per un numero totale di 72 campioni.
    5. Preparare un numero uguale (72) nel sistema di raccolta del campione BTE a due siringhe, con un sistema a doppia siringa per ciascun campione (fase 2.4).
    6. Separare le 72 sacche per la raccolta dei campioni e le siringhe per la raccolta dei campioni in sei lotti (I-VI) di 12 campioni ciascuno.
    7. Avviare la lavorazione del tessuto di gemme di agrumi BTE (fase 4), seguendo la stessa sequenza delle fasi 8.1.4.1-8.1.4.6.
      NOTA: L'unica differenza è la sostituzione del campione 3 nel lotto I e del campione 51 nel lotto V con il campione infetto 73 (fase 8.2.4) (Tabella 1, Elaborazione del secondo campione BTE).
    8. Estrarre e purificare l'RNA dai 72 campioni di linfa vegetale generati nel passaggio 8.2.7 come nel passaggio 8.1.6.
    9. Eseguire la RT-qPCR per il rilevamento di virus e viroidi degli agrumi, come al punto 8.1.7.

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Representative Results

Estrazione, purificazione e qualità dell'RNA utilizzando tessuto di agrumi di gemme trattato con BTE e valutazione del tempo per la lavorazione dei tessuti
Per questo test sono stati utilizzati campioni di gemme di 255 alberi di agrumi rappresentativi per confrontare la qualità dell'RNA del BTE rispetto alla procedura standard. I campioni sono stati processati dall'estrattore di tessuto di gemme (BTE) (fasi del protocollo 4.1-4.6 e Figura 2, lato destro, fase 1, fase 5 e fase 6) o preparati seguendo il metodo di lavorazione dei tessuti di gemme di agrumi approvato dalla normativa, che utilizza la pelatura e la trinciatura a mano, la liofilizzazione, la polverizzazione e la centrifugazione del tessuto della corteccia, come descritto da Dang et al.23 (Figura 2, lato sinistro, passaggi 1-6).

Il confronto fianco a fianco del BTE con il protocollo convenzionale di triturazione manuale e di laboratorio per la lavorazione del tessuto di agrumi ha dimostrato che la qualità (cioè la concentrazione, la purezza e l'integrità) degli acidi nucleici estratti (Figura 3A-C) e l'idoneità per l'uso a valle per la rilevazione PCR di patogeni degli agrumi (dati non mostrati) erano comparabili. Allo stesso tempo, il tempo impiegato per l'elaborazione dei campioni è stato notevolmente ridotto utilizzando il sistema TE/BTE. Il BTE ha più che raddoppiato la produttività dei campioni del laboratorio CCPP, riducendo i costi di manodopera e delle attrezzature di laboratorio eliminando la necessità di decine di migliaia di dollari di strumenti, come battitori di perline, centrifughe e criostazioni.

Gli acidi nucleici estratti con BTE avevano una concentrazione media di 76,96 ng/μL ± 26,23 ng/μL (n = 181) ed erano di elevata purezza, con bassa contaminazione proteica (A260/A280 2,27 ± 0,17, n = 181) (Figura 3B,C). Questi valori erano paragonabili agli acidi nucleici prodotti dal protocollo manuale standard del CCPP (concentrazione: 82,25 ng/μL ± 33,95 ng/μL, n = 181 e A260/A280 2,22 ± 0,10, n = 181) (Figura 3B,C). L'integrità dell'acido nucleico (RT-qPCR per il gene degli agrumi nad5) è risultata molto simile per la BTE (Cq 20,97 ± 2,26, n = 181) e per il protocollo CCPP manuale standard (Cq 19,25 ± 1,53, n = 181) (Figura 3A). I risultati hanno anche dimostrato che lo strumento BTE potrebbe elaborare un volume di campione più elevato nello stesso lasso di tempo rispetto al metodo convenzionale. La procedura di laboratorio convenzionale richiedeva ~ 7-10 minuti per il taglio manuale per campione e un totale di 12 minuti per la lavorazione dei tessuti (liofilizzazione, macinazione e centrifuga), mentre il BTE poteva elaborare il tessuto di agrumi per l'estrazione dell'acido nucleico in ~ 3 minuti per campione.

Figure 3
Figura 3: Qualità degli estratti di acidi nucleici dei 181 campioni rappresentativi di gemme di agrumi, come definito dalla concentrazione, dalla purezza e dall'integrità. I campioni sono stati processati mediante BTE e il protocollo convenzionale di taglio manuale e attrezzature di laboratorio. (A) La concentrazione di acido nucleico è stata determinata utilizzando l'assorbanza a 260 nm; (B) la purezza è stata determinata come rapporto tra le assorbanze a 260 nm e 280 nm (A260/280). (C) L'integrità dell'acido nucleico è stata analizzata mediante RT-qPCR mirata all'mRNA del gene degli agrumi della NADH deidrogenasi (Nad5). Gli intervalli dei valori ottimali sono indicati da cerchi tratteggiati rossi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Rilevamento di agenti patogeni trasmissibili agli agrumi da innesto, valutazione della contaminazione incrociata e rilevamento di virus e viroidi degli agrumi utilizzando l'RNA purificato da estratti di gemme di agrumi BTE
La validità del metodo di trattamento dei tessuti è stata valutata processando 72 campioni di gemme di agrumi sani fianco a fianco con tutti i campioni sani e con l'introduzione di due campioni da un mix di alberi infettato da virus e viroidi (Tabella 1 e Figura 4A,B). Gli acidi nucleici estratti da entrambi i lotti sono stati sottoposti a q-PCR convenzionale in laboratorio, come descritto in precedenza 8,33. Nessuno dei 72 campioni sani provenienti dal primo trattamento dei campioni BTE ha fornito curve di amplificazione per i patogeni degli agrumi testati (cioè falsi positivi) (Figura 4A). I risultati suggeriscono che il BTE è in grado di elaborare il tessuto degli agrumi altrettanto bene rispetto al protocollo di laboratorio standard con metodi di taglio a mano. Nel secondo trattamento del campione BTE, abbiamo valutato il potenziale di contaminazione incrociata tra le teste BTE e all'interno dei campioni processati con la stessa testa BTE (fasi 1-6) e l'idoneità degli acidi nucleici per applicazioni a valle (cioè per l'uso come modello per la rilevazione RT-qPCR di virus e viroidi degli agrumi). Nel secondo trattamento del campione BTE con due campioni contaminati da miscele introdotti, gli acidi nucleici prodotti dal protocollo BTE sono stati utilizzati con successo per rilevare diversi virus e viroidi degli agrumi (ad esempio, il virus triplex, il virus della macchia fogliare degli agrumi [CLBV], il virus della psorosi degli agrumi [CPsV], il virus della tristeza degli agrumi [CTV]), gli apscaviroidi (viroide delle foglie piegate degli agrumi [CBLVd], il viroide nanizzante degli agrumi [CDVd], il viroide V degli agrumi [CVd-V], viroide VI degli agrumi [CVd-VI] e viroide VII degli agrumi [CVd-VII]), viroide acrobatico del luppolo non apscaviroide (HSVd; hostuviroid), viroide di cracking della corteccia degli agrumi (CBCVd; cocadviroide) e viroide degli agrumi esocortis (CEVd; pospiviroide) nel lotto 1 e nel lotto 5. All'interno del lotto 1 e del lotto 5, i campioni che hanno seguito quello infetto erano positivi per le malattie delle piante di cui sopra, ma avevano valori di Cq crescenti. Tuttavia, non è stata rilevata alcuna contaminazione incrociata tra le teste né risultati falsi positivi o negativi (Figura 4B).

Lotto Campione BTE Primo BTE Secondo BTE
Camera Elaborazione dei campioni Elaborazione dei campioni
Io 12-gennaio Un 1-12 Non infetti 1-2 e 4-12 Non infetti
Il campione #3 viene sostituito con una miscela infetta
II 13-24 B 13-24 13-24
Non infetto Non infetto
III 25-36 C 25-36 25-36
Non infetto Non infetto
IV 37-48 A-Sanificato 37-48 37-48
Non infetto Non infetto
V 49-60 B-Sanificato 49-60 49-50 e 52-60 non infetti
Non infetto
Il campione #51 viene sostituito con una miscela infetta
VI 61-72 C-Sanificato 61-72 Non infetti 61-72 Non infetti

Tabella 1: Procedura seguita per la convalida del metodo di trattamento dei tessuti BTE utilizzando 72 campioni di gemme di agrumi. Ogni lavorazione è stata ripetuta due volte. C'erano 6 lotti con 12 campioni ciascuno. Nella prima elaborazione del campione, tutti i 72 campioni di gemme di agrumi erano sani. Nella seconda elaborazione del campione BTE, il campione 3 e il campione 51 sono stati sostituiti con due campioni provenienti da un mix di alberi infettati da virus e viroidi nel lotto 1 e nel lotto 5.

Figure 4
Figura 4: Convalida del metodo di trattamento dei tessuti BTE utilizzando 72 campioni di gemme di agrumi. Ogni lavorazione è stata ripetuta due volte. C'erano 6 lotti con 12 campioni ciascuno. (A) Tutti i 72 campioni di gemme di agrumi erano sani. (B) Gli stessi 72 campioni di gemme di agrumi con l'introduzione di due campioni da un mix di alberi infettati da virus e viroidi nel lotto 1 (campione 3) e nel lotto 5 (campione 51). I controlli NTC e acqua avevano tutti valori di Cq indeterminati (cioè il bersaglio del DNA non presente nel campione). I controlli positivi per il triplex (CLBV, CPsV, CTV) avevano valori di Cq rispettivamente di 23,9, 25,2 e 22,4. I controlli positivi per gli apscaviroidi (CBLVd, CDVd e CBCVd) avevano valori di Cq rispettivamente di 23,39, 21,27 e 25,17. I controlli positivi per i non-apscaviroidi (CEVd, HSVd, IV) avevano valori di Cq rispettivamente di 26,9, 27,0 e 26,5. Abbreviazioni: BTE = estrattore di tessuto di gemme; NTC = controllo senza modello. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare S1: Configurazione della stazione di pulizia. Dopo che il 10° campione è stato processato nella camera, è necessario seguire i passaggi del protocollo 3.1-3.6 per preparare la stazione di pulizia per sanificare la camera. Come nella fase 3.1 del protocollo, 1 L di acqua viene inserito nel pulitore ad ultrasuoni. Due sacchetti della spazzatura vengono avvolti sopra la parte superiore del pulitore ad ultrasuoni (fase 3.2 del protocollo) e ~5 L di candeggina al 10% (soluzione di ipoclorito di sodio all'1%) vengono versati nel pulitore ad ultrasuoni (fase 3.3 del protocollo). La vasca dell'acqua viene riempita con acqua sufficiente per immergere una camera (passaggio 3.4 del protocollo), il compressore d'aria viene spento e la valvola viene aperta (passaggio 3.5 del protocollo). Viene allestito un fondale per catturare il liquido durante l'essiccazione della camera (fase 3.6 del protocollo). Fare clic qui per scaricare il file.

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Discussion

Con l'avvento della malattia degli agrumi HLB, per ridurre le perdite, l'industria agrumicola, le agenzie di regolamentazione e i laboratori diagnostici sono stati esortati a fare affidamento su metodi di estrazione dell'acido nucleico ad alto rendimento combinati con l'elaborazione manuale dei campioni a basso rendimento e saggi di rilevamento dei patogeni come la qPCR34 per l'analisi dei singoli alberi, in combinazione con le pratiche di gestione delle malattie35. Il tasso di positività HLB della California è passato dallo 0,01% del 2012 all'1,2% del 2020. Anche se la qPCR è uno strumento di rilevamento dei patogeni potente e affidabile, le tecnologie attualmente disponibili non consentono di campionare e processare un volume adeguato di tessuto vegetale, con conseguente chiaro sottocampionamento e sottotest per CLas negli alberi di agrumi in California. Il sottocampionamento e il sottotest si verificano in relazione sia al numero di alberi testati che alla quantità di materiale vegetale per albero in lavorazione (cioè il numero di foglie) e, a causa della distribuzione sporadica di foglie infette all'interno della chioma dell'albero, c'è un'alta probabilità di perdere infezioni precoci o lievi. Gli attuali metodi per il campionamento e l'analisi CLas non possono scalare con l'aumento della domanda a causa dei costi (ad esempio, manodopera e attrezzature). Attualmente, il metodo di elaborazione dei campioni utilizzato dalla maggior parte dei laboratori diagnostici di agrumi in California per acquisire acidi nucleici adatti per l'analisi dei patogeni degli agrumi richiede oltre 17 ore per la manipolazione manuale dei campioni e forniture e attrezzature specializzate che costano oltre $ 100.000.

Qui, presentiamo la convalida di uno strumento specializzato progettato per elaborare rapidamente i tessuti di corteccia di gemme di agrumi, chiamato estrattore di tessuti di gemme (BTE), e un protocollo dettagliato e passo-passo di manipolazione dei campioni per i laboratori diagnostici di agrumi. La ricerca si è concentrata sullo sviluppo di un innovativo metodo di lavorazione dei tessuti per sostituire l'attuale taglio manuale ad alta intensità di manodopera dei campioni di gemme di gemme e costruire lo strumento di lavorazione delle gemme di agrumi più efficiente ed economico possibile. I risultati mostrano che il BTE aumenta la produttività del campione e diminuisce il costo delle apparecchiature e delle forniture utilizzate presso il laboratorio diagnostico CCPP. La tecnologia e il metodo presentati includono anche l'uso di tag NFC, un'app per telefono e un database online per il monitoraggio delle informazioni sui campioni in tempo reale. Dopo aver raccolto i campioni di gemme, l'app del telefono collega la clip del sacchetto del campione NFC con il tag dell'albero NFC. I campioni vengono poi spediti al laboratorio per la lavorazione con la macchina BTE. Le informazioni per ogni campione vengono registrate con un rapido passaggio sul lato del corpo del BTE. Attraverso il tag NFC del campione, vengono registrati anche il tempo di elaborazione per ogni campione e il peso del campione e caricati nel database online in tempo reale. Questo metodo fornisce un sistema molto efficiente in termini di tempo, migliora il controllo di qualità (ad esempio, evitando errori di identificazione del campione) e aumenta l'efficienza del laboratorio.

L'elaborazione e la convalida ad alto rendimento del BTE sono state effettuate con campioni di agrumi "reali/sul campo", dimostrando che altri laboratori diagnostici possono prontamente adottare la tecnologia e la metodologia. L'adozione di questa tecnologia consentirà di ridurre i costi operativi e aumentare la capacità diagnostica e l'efficienza del laboratorio, aumentando così le possibilità di identificare gli alberi malati in una fase precoce dopo che si è verificata l'infezione e riducendo le possibilità di diffusione della malattia. Il confronto fianco a fianco tra BTE e metodi convenzionali di trattamento dei tessuti dimostra che la qualità dell'acido nucleico estratto (cioè concentrazione, purezza e integrità) e i risultati del rilevamento dei patogeni a valle sono comparabili (Figura 3A-C). Tuttavia, il tempo impiegato per elaborare i campioni è significativamente ridotto utilizzando il BTE rispetto ai protocolli di elaborazione manuale (ad esempio, 3,3 minuti contro 6,8 minuti). Le camere e la base BTE richiedono un programma di pulizia regolare. Sebbene la pulizia richieda molto tempo e costituisca un limite del metodo, la tecnologia consente di elaborare rapidamente più campioni nel BTE prima che la camera debba essere pulita. I metodi convenzionali richiedono meno pulizia poiché ogni campione ha il proprio contenitore di lavorazione, che, in molti casi, è usa e getta, ma hanno bisogno di più contenitori e spazio di conservazione (ad esempio, frigoriferi a 4 °C e congelatori a -20 °C o -80 °C).

Il processo BTE è stato concepito e costruito per aumentare la probabilità di identificare un'area problematica attraverso l'elaborazione e l'analisi di campioni di massa (ad esempio, trovare un albero malato all'interno di un grande blocco di fondazione di germoplasma di agrumi, un vivaio o un frutteto) eseguendo solo un piccolo numero di test di massa in grado di identificare i punti caldi. Pertanto, si discosta solo quando viene trovato un risultato positivo. Quando ciò accade (Figura 4B, lotto 1 e lotto 5), è necessaria la successiva elaborazione del campione e l'analisi di singoli campioni dello stesso lotto contenente il materiale positivo (cioè solo un sottoinsieme di campioni) per determinare quali campioni sono positivi. Pertanto, è importante notare che questa procedura è adatta principalmente per i casi con bassi tassi di infezione, dove consente di testare un elevato volume di materiale da molti alberi, il che, in cambio, aumenta la probabilità di rilevamento della malattia senza dover testare un gran numero di singoli campioni. I metodi convenzionali saranno l'opzione ottimale nei casi con alti tassi di infezione, in quanto consentono di testare ogni campione individualmente. Ciò è particolarmente importante nel caso delle indagini HLB in California20 (ancora a un basso tasso di positività HLB), dove i metodi basati sulla PCR utilizzati per il rilevamento di CLas hanno principalmente lo scopo di confermare la presenza o l'assenza di CLas in alberi asintomatici (cioè, nessuna tipica chiazza, ingiallimento della chioma o declino degli alberi) che sono stati esposti a psillidi degli agrumi asiatici (ACP) CLas-positivi. Dato che non sappiamo in quale punto dell'albero si sia nutrito un ACP infetto, le probabilità di identificare un albero infetto ma asintomatico sul campo o in qualsiasi altra grande area o operazione testando un piccolo numero di campioni sono molto basse (ad esempio, in California, attualmente vengono raccolte 20 foglie e 12 foglie vengono testate per albero20). Ovviamente, più grande è la chioma dell'albero, minori sono le possibilità di rilevamento di CLas. Anche se i costi della PCR stessa (cioè reagenti, attrezzature di laboratorio di base e termociclatore), che segue l'elaborazione del campione, e l'estrazione e la purificazione dell'acido nucleico continuano invariati nel processo BTE, l'incertezza su dove raccogliere i campioni da alberi asintomatici per determinare se sono infetti o meno persiste ancora e, a nostro avviso, è il tallone d'Achille dell'indagine HLB in California. Lo strumento, la tecnologia, il metodo e i miglioramenti presentati consentiranno l'elaborazione di campioni di dimensioni maggiori in un tempo più breve e a un costo inferiore. Pertanto, questo metodo aumenterà la probabilità di identificare gli alberi infetti in modo tempestivo e migliorerà gli sforzi di eradicazione per l'HLB o altri patogeni invasivi degli agrumi in California (ad esempio, il virus di eliminazione delle vene gialle degli agrumi segnalato in California nell'agosto 2022).

In combinazione con i metodi automatizzati di trattamento dei tessuti, il campionamento e i test di massa consentirebbero di ridurre i costi di lavorazione dei tessuti vegetali. Questa riduzione dei costi consentirebbe a molti laboratori diagnostici di esaminare in modo più efficace i frutteti in molti stati e di monitorare meglio il movimento dell'HLB e di altre malattie. In definitiva, ciò significa che i coltivatori avrebbero uno strumento più efficace per rallentare la diffusione delle malattie attraverso test più efficienti su larga scala. Se da un lato lo strumento BTE può migliorare l'attuale capacità diagnostica dei laboratori agrumicoli e portare benefici all'intera industria agrumicola, dall'altro la tecnologia può essere trasferita anche ad altre colture arboree. I dati preliminari sulla concentrazione e la purezza dell'acido nucleico, stimati dall'OD, hanno indicato che la BTE è in grado di processare efficacemente tessuti di mandorle (59,87 ng/μL ± 7,43 ng/μL e A260/A280 1,17 ± 0,05, n = 9), vite (135,74 ng/μL ± 50,74 ng/μL e A260/A280 1,17 ± 0,06, n = 9) e pesca (66,50 ng/μL ± 6,07 ng/μL e A260/A280 1,29 ± 0,05, n = 9) (campioni gentilmente forniti da Foundation Plant Services presso UC Davis).

La piattaforma per la lavorazione dei tessuti in legno di gemma qui presentata ha ispirato lo sviluppo di ulteriori apparecchiature per la lavorazione dei tessuti vegetali. Ad esempio, un estrattore di tessuti fogliari (LTE) è attualmente in fase di sviluppo. I risultati preliminari dei test effettuati con l'utilizzo di foglie di agrumi hanno dimostrato che lo strumento LTE è in grado di elaborare un numero di foglie circa sette volte superiore con un aumento del tempo di lavorazione del 35% rispetto all'attuale metodo standard a 12 foglie utilizzato in California20. Abbiamo stimato che un protocollo di campionamento e test di massa supportato da LTE potrebbe ridurre di un quarto il costo complessivo per test sulle foglie di agrumi. La ricerca per dimostrare il valore dell'applicazione pratica di questa tecnologia è attualmente in corso nell'ambito di una sovvenzione CDFA Specialty Crop Block Grant nei nostri laboratori.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono il popolo Cahuilla come i Custodi Tradizionali della Terra su cui è stato completato il lavoro sperimentale. Siamo grati al professor Norman Ellstrand dell'Università della California, Riverside, per aver fornito uno spazio di laboratorio per svolgere attività di ricerca per questo progetto nell'ambito dell'iniziativa UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ). Questa ricerca è stata supportata dal CDFA - Specialty Crop Block Grant Program (sovvenzione n. 18-0001-055-SC). Un ulteriore sostegno è stato fornito anche dal progetto CRB 6100; Istituto nazionale per l'alimentazione e l'agricoltura dell'USDA, progetto Hatch 1020106; e il National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Health Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, & AP20PPQS&T00C049) assegnato a Georgios Vidalakis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.08" Hex Trimmer line PowerCare FPRO07065 Needed to replace blades.
1 Hp, 8 gal air compressor California Air Tools 8010 Quickly dry chambers after rinsed
1.5 mL microcentrifuge tube Globe Scientific 111558B Store sample in after swishing with syinges
10 mL Syringe Set Technology Evolving Solutions TE006-F1-10A-G1000-E1 Syringe material is cut into. 1 L bottle with guanidine thiocyanate buffer. WARNING - contains guanidine thiocyanate, hazardous waste service required - do not mix with bleach
12" Ruler Westcott ‎16012 To measure trimmer line before cutting
12% Sodium Hypochlorite Hasa 1041 Disinfects chambers after processing
-20 C Freezer Insignia NS-CZ70WH0 Store sample after processing
4" x 12" plastic bags Plymor FP20-4x12-10 Bags to hold branches during shipping. O-rings attach bag to BTE chamber to seal
6" Cotton Swab Puritan 806-PCL Swab to remove clogs
7 Gallon Storage Tote HDX 206152 Holds sodium hypochlorite solution to disinfect chambers and water to rinse chambers
Air blow gun JASTIND ‎JTABG103A Directs air into the chambers at high pressure
Black Sharpie Sharpie  S-19421 Mark 1.5 mL tubes so you can identify sample later
Bottle Top Dispensor Brand Z627569 Adjustable bottle top dispensor to dispense guandine into syringe
BTE Chamber Technology Evolving Solutions TE002BB-A05-E1 Used to process budwood. Includes O-rings, BTE Slide, slide plunger, drain valve, lid, blade set, and blade set removal tool
Dish Soap Dawn 57445CT Surfectant to improve sodium hypochlorite penetration into chamber
Fume hood with hepa filter Air Science P5-36XT-A Fume hood with hepa filter (ASTS-030)  to limit possible contamination and protect against chemical spills
Insulated foam shipping container PolarTech 261/J50C Insulated shipping container to ship samples on ice after they are collected
Lab coat Red Kap KP14WH LN 46 Lab coat to limit possible contamination and protect against chemical spills
Laptop Microsoft Surface Wifi capable laptop to run TES GUI. Needed for initial setup and provides more indepth information about the tissue processing base
NFC Capable Phone Samsung Galaxy S9 Phone to download and use TES phone app
NFC clip tag Technology Evolving Solutions TE005-Clip-E1 Sample tag that can be linked with trees. Made to function with TES phone app
NFC Collar Tag Technology Evolving Solutions TE005-Collar-E1 Tag that is attached to a tree. Made to function with TES phone app
Nitrile Gloves Usa Scientific 3915-4400 Gloves to limit possible contamination and protect against chemical spills
Noise-Reducing Earmuff 3M 90565-4DC-PS Protect ears while operating air compressor and tissue processing base
Polyurethane Recoil Air Hose FYPower ‎510019 Attaches air gun to compressor
Saftey glasses Solidwork SW8329-US Protect eyes for chemical and physical hazards
Spray bottle JohnBee B08QM81BJV Spray bleach to deconatinate surfaces
Tissue Extractor Base Technology Evolving Solutions TE001-A-E1 System to process plant tissue. Needs BTE or LTE chambers to function. Includes power cable, blade adapter, and 8/32" allen wrench
Tissue Processing Base Weight Scale Technology Evolving Solutions TE003-A05-200g-01-E1 200 g, 0.01 resolution weight scale that connects to tissue processing base to enforce weight ranges and/or link weights with sample. Includes scale, power cable, connection cable, 5ml syringe holder, tower air shield 
Vermiculite EasyGoProducts B07WQDZGRP Needed to transport hazardous waste (guanidine thiocyanate) using a hazardous waste disposal service
Wire Cutter Boenfu ‎BOWC-06002-US Wire cutters to cut trimmer line

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References

  1. Vernière, C., et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange. Phytopathology. 96 (4), 356-368 (2006).
  2. Vernière, C., et al. Citrus viroids: Symptom expression and effect on vegetative growth and yield of clementine trees grafted on trifoliate orange. Plant Disease. 88 (11), 1189-1197 (2004).
  3. Zhou, C., et al. Chapter 19 - Citrus viruses and viroids. The Genus Citrus. Talon, M., Caruso, M., Gmitter, F. G. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 391-410 (2020).
  4. Luckstead, J., Devadoss, S. Trends and issues facing the U.S. citrus industry. Choices Magazine Online. 36 (2), Available from: https://www.choicesmagazine.org/choices-magazine/theme-articles/trends-and-challenges-in-fruit-and-tree-nut-sectors/trends-and-issues-facing-the-us-citrus-industry (2021).
  5. Simnitt, S., Calvin, L. Fruit and Tree Nuts Outlook. United States Department of Agriculture-Economic Research Service. , Available from: https://www.ers.usda.gov/webdocs/outlooks/98171/fts-370.pdf?v=5697 (2020).
  6. Forsyth, J., Fruits Damiani, J. C. itrus Citrus Fruits. Types on the market. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. , Academic Press. Cambridge, MA. 1329-1335 (2003).
  7. Bostock, R. M., Thomas, C. S., Hoenisch, R. W., Golino, D. A., Vidalakis, G. Plant health: How diagnostic networks and interagency partnerships protect plant systems from pests and pathogens. California Agriculture. 68 (4), 117-124 (2014).
  8. Osman, F., Dang, T., Bodaghi, S., Vidalakis, G. One-step multiplex RT-qPCR detects three citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological Methods. 245, 40-52 (2017).
  9. Wang, J., et al. Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale. Frontiers in Microbiology. 4, 366 (2013).
  10. Gergerich, R. C., et al. Safeguarding fruit crops in the age of agricultural globalization. Plant Disease. 99 (2), 176-187 (2015).
  11. Moreno, P., Ambrós, S., Albiach-Martí, M. R., Guerri, J., Peña, L. Citrus tristeza virus: A pathogen that changed the course of the citrus industry. Molecular Plant Pathology. 9 (2), 251-268 (2008).
  12. Yokomi, R. K., et al. Identification and characterization of Citrus tristeza virus isolates breaking resistance in trifoliate orange in California. Phytopathology. 107 (7), 901-908 (2017).
  13. Selvaraj, V., Maheshwari, Y., Hajeri, S., Yokomi, R. A rapid detection tool for VT isolates of Citrus tristeza virus by immunocapture-reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification assay. PLoS One. 14 (9), 0222170 (2019).
  14. Babcock, B. A. Economic impact of California's citrus industry in 2020. Journal of Citrus Pathology. 9, (2022).
  15. Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).
  16. Yokomi, R., et al. Molecular and biological characterization of a novel mild strain of citrus tristeza virus in California. Archives of Virology. 163 (7), 1795-1804 (2018).
  17. Fuchs, M., et al. Economic studies reinforce efforts to safeguard specialty crops in the United States. Plant Disease. 105 (1), 14-26 (2021).
  18. Singerman, A. The real cost of HLB in Florida. Citrus Industry Magazine. , Available from: https://citrusindustry.net/2019/07/30/the-real-cost-of-hib-in-florida/ (2019).
  19. McRoberts, N., et al. Using models to provide rapid programme support for California's efforts to suppress Huanglongbing disease of citrus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1776), 20180281 (2019).
  20. Albrecht, C., et al. Action plan for Asian citrus psyllid and huanglongbing (citrus greening) in California. Journal of Citrus Pathology. 7 (1), (2020).
  21. Navarro, L., et al. The Citrus Variety Improvement Program in Spain in the period 1975-2001. International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15 (15), (2002).
  22. Vidalakis, G., Gumpf, D. J., Polek, M. L., Bash, J. A. The California Citrus Clonal Protection Program. Citrus Production Manual. Ferguson, L., Grafton-Cardwell, E. E. , University of California, Agriculture and Natural Resources. Oakland, California. 117-130 (2014).
  23. Dang, T., et al. High-throughput RNA extraction from citrus tissues for the detection of viroids. In Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  24. Osman, F., Vidalakis, G. Real-time detection of viroids using singleplex and multiplex quantitative polymerase chain reaction. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. 2316, Humana. New York, NY. (2022).
  25. Li, R., et al. A reliable and inexpensive method of nucleic acid extraction for the PCR-based detection of diverse plant pathogens. Journal of Virological Methods. 154 (1-2), 48-55 (2008).
  26. Saponari, M., Manjunath, K., Yokomi, R. K. Quantitative detection of Citrus tristeza virus in citrus and aphids by real-time reverse transcription-PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 147 (1), 43-53 (2008).
  27. Damaj, M. B., et al. Reproducible RNA preparation from sugarcane and citrus for functional genomic applications. International Journal of Plant Genomics. 2009, 765367 (2009).
  28. Dang, T., et al. First report of citrus leaf blotch virus infecting Bearss lime tree in California. Plant Disease. 104 (11), 3088 (2020).
  29. Manchester, K. L. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. BioTechniques. 20 (6), 968-970 (1996).
  30. Teare, J. M., et al. Measurement of nucleic acid concentrations using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques. 22 (6), 1170-1174 (1997).
  31. Imbeaud, S. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 56-56 (2005).
  32. Menzel, W., Jelkmann, W., Maiss, E. Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internal control. Journal of Virological Methods. 99 (1-2), 81-92 (2002).
  33. Vidalakis, G., et al. SYBR Green RT-qPCR for the universal detection of citrus viroids. Viroids: Methods and Protocols. Rao, A. L. N., Lavagi-Craddock, I., Vidalakis, G. , Humana. New York, NY. 211-217 (2022).
  34. Arredondo Valdés, R., et al. A review of techniques for detecting Huanglongbing (greening) in citrus. Canadian Journal of Microbiology. 62 (10), 803-811 (2016).
  35. Li, S., Wu, F., Duan, Y., Singerman, A., Guan, Z. Citrus greening: Management strategies and their economic impact. HortScience. 55 (5), 604-612 (2020).
  36. CDFA California Citrus Pest and Disease Prevention Program Operations Subcomittee Meeting. Meeting Minutes. , Available from: https://www.cdfa.ca.gov/citrus/docs/minutes/2019/OpsSubcoMinutes-11062019.pdf (2019).

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Bioingegneria Numero 194 Estrazione di tessuti di gemme taglio a mano "Candidatus Liberibacter asiaticus" CLas huanglongbing HLB Citrus tristeza virus CTV

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering
Posted by JoVE Editors on 10/03/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. The Authors section was updated from:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Botaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis2
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

to:

Deborah Pagliaccia1,6
Douglas Hill2
Emily Dang1
Gerardo Uribe1
Agustina De Francesco1
Ryan Milton2
Anthony De La Torre2
Axel Mounkam2
Tyler Dang1
Sohrab Bodaghi1
Irene Lavagi-Craddock1
Alexandra Syed1
William Grover3
Adriann Okamba4,5
Georgios Vidalakis1
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside
2Technology Evolving Solutions (TES)
3Department of Bioengineering, University of California Riverside
4Ecole Supérieure d'Ingénieurs Léonard de Vinci ESILV
5University of California Riverside
6California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ), University of California Riverside

Automatizzare la lavorazione delle gemme di agrumi per il rilevamento di agenti patogeni a valle attraverso l'ingegneria degli strumenti
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Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E.,… More

Pagliaccia, D., Hill, D., Dang, E., Uribe, G., De Francesco, A., Milton, R., De La Torre, A., Mounkam, A., Dang, T., Bodaghi, S., Lavagi-Craddock, I., Syed, A., Grover, W., Okamba, A., Vidalakis, G. Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering. J. Vis. Exp. (194), e65159, doi:10.3791/65159 (2023).

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