Summary
במסמך זה, אנו מדגימים פרוטוקול מותאם BODIPY 493/503 מבוסס פלואורסצנטיות לאפיון טיפות שומנים ברקמת הכבד. באמצעות שימוש בהקרנות אורתוגונליות ושחזורים תלת-ממדיים, הפלואורופור מאפשר הבחנה מוצלחת בין סטאטוזיס מיקרו-שלפוחית וסטאטוזיס מקרו-שלפוחית ועשוי לייצג גישה משלימה לפרוטוקולים ההיסטולוגיים הקלאסיים להערכת סטאטוזיס בכבד.
Abstract
טיפות שומנים (LDs) הן אברונים מיוחדים המתווכים אחסון שומנים וממלאים תפקיד חשוב מאוד בדיכוי רעילות ליפוטוקסית ובמניעת תפקוד לקוי הנגרם על ידי חומצות שומן חופשיות (FAs). הכבד, בהתחשב בתפקידו הקריטי בחילוף החומרים של השומן בגוף, מאוים באופן מתמשך על ידי הצטברות תוך תאית של LDs בצורה של סטאטוזיס כבד microvesicular ו macrovesicular. האפיון ההיסטולוגי של LDs מבוסס בדרך כלל על צבעי דיאזו מסיסים בשומנים, כגון צביעת שמן אדום O (ORO), אך מספר חסרונות מעכבים באופן עקבי את השימוש בניתוח זה עם דגימות כבד. לאחרונה, פלואורופורים ליפופיליים 493/503 הפכו פופולריים להדמיה ואיתור LDs בשל קליטתם המהירה והצטברותם בליבת טיפת השומנים הניטרלית. למרות שרוב היישומים מתוארים היטב בתרביות תאים, יש פחות ראיות המוכיחות את השימוש האמין בבדיקות פלואורופור ליפופיליות ככלי הדמיה LD בדגימות רקמות. בזאת, אנו מציעים פרוטוקול אופטימלי מבוסס בורון דיפירומתין (BODIPY) 493/503 להערכת LDs בדגימות כבד ממודל בעלי חיים של סטאטוזיס כבד המושרה על ידי דיאטה עתירת שומן (HFD). פרוטוקול זה מכסה הכנת דגימות כבד, חתך רקמות, צביעת BODIPY 493/503, רכישת תמונה וניתוח נתונים. אנו מדגימים מספר מוגבר, עוצמה, יחס שטח וקוטר של LDs בכבד בעת הזנת HFD. באמצעות הקרנות אורתוגונליות ושחזורים תלת-ממדיים, ניתן היה לצפות בתוכן המלא של שומנים ניטרליים בליבת LD, שהופיעו כטיפות כמעט כדוריות. יתר על כן, עם פלואורופור BODIPY 493/503, הצלחנו להבחין בין microvesicles (1 מיקרומטר < d ≤ 3 מיקרומטר), שלפוחיות ביניים (3 מיקרומטר < d ≤ 9 מיקרומטר) ו macrovesicles (d > 9 מיקרומטר), המאפשר הבחנה מוצלחת של סטאטוזיס microvesicular ו macrovesicular. בסך הכל, פרוטוקול BODIPY 493/503 מבוסס פלואורסצנטיות זה הוא כלי אמין ופשוט לאפיון LD בכבד ועשוי לייצג גישה משלימה לפרוטוקולים ההיסטולוגיים הקלאסיים.
Introduction
טיפות ליפידים (LDs), הנתפסות באופן קלאסי כמחסני אנרגיה, הן אברונים תאיים מיוחדים המתווכים אחסון שומנים, והן מהוות ליבת שומנים הידרופובית ניטרלית, המכילה בעיקר אסטרי כולסטרול וטריגליצרידים (TGs), עטופים בשכבה אחת פוספוליפידית 1,2,3.
ביוגנזה של LD מתרחשת ברשתית האנדופלסמית (ER), החל בסינתזה של טריאצילגליצרול (TAG) ואסטרי סטרול. שומנים ניטרליים מפוזרים בין העלעלים של השכבה הדו-שכבתית של חדר המיון בריכוזים נמוכים, אך מתמזגים לעדשות שמן שגדלות ונובטות לטיפות כמעט כדוריות מממברנת המיון כאשר הריכוז התוך-תאי שלהם עולה4. לאחר מכן, חלבונים מדו-שכבתיים של ER וציטוזול, במיוחד ממשפחת החלבונים פריליפין (PLIN), עוברים טרנסלוקציה לפני השטח של LDs כדי להקל על ניצנים 5,6,7,8,9.
באמצעות סינתזת חומצות שומן חדשות ואיחוי LD או התמזגות, LDs גדלים לגדלים שונים. בהתאם לכך, הגודל והמספר של LDs שונים במידה ניכרת בין סוגי תאים שונים. טיפות קטנות (בקוטר 300-800 ננומטר), הידועות בשם LDs ראשוניים (iLDs), יכולות להיווצר כמעט על ידי כל התאים4. מאוחר יותר בהיווצרות LD, רוב התאים מסוגלים להמיר iLDs מסוימים ל- LDs גדולים יותר המרחיבים (eLDs בקוטר >1 מיקרומטר). עם זאת, רק סוגי תאים ספציפיים, כגון אדיפוציטים והפטוציטים, יש את היכולת ליצור LDs ענקיים או גדולים (עד עשרות מיקרון קוטר)4,10.
LDs ממלאים תפקיד חשוב מאוד בוויסות חילוף החומרים של שומנים בתאים, דיכוי ליפוטוקסיות ומניעת לחץ בחדר המיון, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, ובסופו של דבר, מוות תאי הנגרם על ידי חומצות שומן חופשיות (FAs)11,12,13,14. יתר על כן, LDs היו מעורבים גם בוויסות ביטוי גנים, שכפול נגיפים של חלבונים, וסחר בממברנות ואיתות15,16,17. לכן, הרגולציה השגויה של ביוגנזה LD היא סימן היכר של מחלות כרוניות הקשורות לתסמונת מטבולית, השמנת יתר, סוכרת מסוג 2 (T2DM) ו / או טרשת עורקים, אם להזכיר רק כמה 18,19,20.
הכבד, כמרכז מטבולי, אחראי בעיקר על חילוף החומרים של שומנים על ידי אחסון ועיבוד שומנים, ולכן, הוא מאוים כל הזמן על ידי lipotoxicity21. סטאטוזיס בכבד (HS) הוא מאפיין נפוץ של סדרה של מחלות כבד מתקדמות ומאופיין בהצטברות שומנים תוך-תאית מוגזמת בצורה של LDs ציטוסוליים, שבסופו של דבר עלולים להוביל לתפקוד מטבולי לקוי של הכבד, דלקת וצורות מתקדמות של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי22,23,24,25. HS מתרחש כאשר קצב החמצון והייצוא של חומצות שומן כטריגליצרידים בתוך ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה מאוד (VLDLs) נמוך מקצב ספיגת חומצות השומן בכבד מהפלזמה ומסינתזת חומצות השומן דה נובו 26. הצטברות הכבד של שומנים מתרחשת לעתים קרובות בשתי צורות - סטאטוזיס microvesicular ו macrovesicular - ואלה מציגים מאפיינים cytoarchitectonic מובהקים27. בדרך כלל, סטאטוזיס microvesicular מאופיין על ידי נוכחות של LDs קטנים מפוזרים ברחבי hepatocyte עם הגרעין ממוקם במרכז, ואילו סטאטוזיס macrovesicular מאופיין על ידי נוכחות של LD גדול אחד שתופס את החלק הגדול של hepatocyte, דוחף את הגרעין לפריפריה28,29. יש לציין כי שני סוגים אלה של סטאטוזיס נמצאים לעתים קרובות יחד, ועדיין לא ברור כיצד שני דפוסי LD אלה משפיעים על פתוגנזה של מחלות, שכן הראיות עדיין אינן עקביות 31,32,33,34. עם זאת, סוג כזה של ניתוח משמש לעתים קרובות כ"תקן ייחוס" במחקרים פרה-קליניים וקליניים כדי להבין את ההתנהגות הדינמית של LDs ולאפיין סטאטוזיס בכבד 29,34,35,36.
ביופסיות כבד, תקן הזהב לאבחון ודירוג HS, מוערכות באופן שגרתי על ידי ניתוח היסטולוגי של המטוקסילין ואאוזין (H&E), שבו טיפות שומנים מוערכות כוואקולים לא מוכתמים במקטעי כבד מוכתמים H&E37. בעוד מקובל עבור הערכת סטאטוזיס macrovesicular, סוג זה של מכתים בדרך כלל מצמצם את ההערכה של סטאטוזיס microvesicular38. צבעי דיאזו מסיסים בשומנים, כגון Oil Red O (ORO), משולבים באופן קלאסי עם מיקרוסקופ brightfield כדי לנתח מאגרי שומנים תוך תאיים, אך עדיין יש להם מספר חסרונות: (i) השימוש באתנול או איזופרופנול בתהליך הצביעה, אשר לעתים קרובות גורם לשיבוש של LDs המקוריים ואיחוי מדי פעם למרות שהתאים קבועים39; (ii) האופי הגוזל זמן, שכן פתרון ORO דורש המסה וסינון של אבקה טרייה בשל חיי המדף המוגבלים, ובכך תורם לתוצאות פחות עקביות; (iii) והעובדה כי ORO מכתים יותר מאשר רק טיפות שומנים ולעתים קרובות מעריך יתר על המידה סטאטוזיסבכבד 38.
כתוצאה מכך, פלואורופורים ליפופיליים חדירים לתאים, כגון אדום הנילוס, שימשו בדגימות חיות או קבועות כדי להתגבר על חלק מהמגבלות שהוזכרו לעיל. עם זאת, האופי הלא ספציפי של תיוג אברוני שומנים בתאים מצמצם שוב ושוב את הערכות LD40. יתר על כן, התכונות הספקטרליות של אדום הנילוס משתנות בהתאם לקוטביות הסביבה, מה שלעתים קרובות יכול להוביל לשינויים ספקטרליים41.
הגשושית הפלואורסצנטית הליפופילית 1,3,5,7,8-פנטמתיל-4-בורה-3a,4adiaza-s-indacene (אורך גל עירור: 480 ננומטר; פליטה מרבית: 515 ננומטר; BODIPY 493/503) מציג מאפיינים הידרופוביים המאפשרים ספיגה מהירה שלו על ידי LDs תוך תאי, מצטבר בליבת טיפת השומנים, ולאחר מכן, פולט פלואורסצנטיות ירוקה בהירה12. שלא כמו אדום הנילוס, BODIPY 493/503 אינו רגיש לקוטביות הסביבה והוכח כסלקטיבי יותר, מכיוון שהוא מציג בהירות גבוהה עבור הדמיית LD. על מנת להכתים LDs ניטרליים, ניתן להשתמש בצבע זה בתאים חיים או קבועים ולשלב בהצלחה עם שיטות צביעה ו / או תיוג אחרות42. יתרון נוסף של הצבע הוא שהוא דורש מאמץ מועט כדי להכניס לתמיסה והוא יציב, ובכך מבטל את הצורך להכין אותו טרי לכל ניסוי42. למרות שהגשושית BODIPY 493/503 שימשה בהצלחה כדי להמחיש את הלוקליזציה והדינמיקה של LDs בתרביות תאים, דיווחים מסוימים הדגימו גם את השימוש האמין בצבע זה ככלי הדמיה LD ברקמות, כולל שריר vastus lateralis43 האנושי, שריר סוליאוסחולדה 42 ומעי עכבר44.
בזאת, אנו מציעים פרוטוקול מותאם מבוסס BODIPY 493/503 כגישה אנליטית חלופית להערכת מספר, שטח וקוטר LD בדגימות כבד ממודל בעלי חיים של סטאטוזיס כבד. הליך זה מכסה הכנת דגימות כבד, חתך רקמות, תנאי צביעה, רכישת תמונה וניתוח נתונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי מכון קוימברה למחקר קליני וביו-רפואי (iCBR) הגוף לרווחת בעלי חיים (ORBEA, #9/2018) ועמדו בהנחיות הלאומיות והאירופיות לטיפול בבעלי חיים ובהנחיות ARRIVE.
1. תכנון ניסיוני
- זוג חולדות וויסטאר זכרים בני 13 שבועות בכלובים מאווררים בתנאים סביבתיים מבוקרים של טמפרטורה (22 מעלות צלזיוס ± 1 מעלות צלזיוס), לחות (50%-60%) ואור (מחזור אור-חושך של 12 שעות) ועם גישה למי ברז וצ'או מכרסמים סטנדרטי.
- לאחר תקופה של שבועיים של התאקלמות, הקצו את החולדות באופן שרירותי לשתי קבוצות.
- האכילו את קבוצת הביקורת (CTRL, n = 6) ואת קבוצות הדיאטה עתירות השומן (HFD, n = 6) בצ'או סטנדרטי ובתזונה עתירת שומן (45% קק"ל / שומן), בהתאמה, במשך 24 שבועות.
- עקוב אחר משקל הגוף (BW) מדי שבוע. תעד את צריכת המזון והמשקאות היומית בכל כלוב.
2. הכנת דגימת כבד
- דיסקציה של הכבד
- הכינו את המשאבה הפריסטלטית: העבירו 70% אתנול דרך הצינור, חברו מחט 27 G לקצה היציאה של הצינור, והפעילו את הצינור במי מלח קרים כקרח (4°C) 1x מלוחים חוצצי פוספט (PBS, pH ~7.4) (למשל, 200 סל"ד על משאבה פריסטלטית עם צינורות סיליקון 1.6 מ"מ I.D, סט טפטוף מיני IV). התאימו את עצמכם למשקל הגוף (למשל, עבור חולדה של 100-150 גרם, השתמשו בקצב זרימה של כ-10-12 מ"ל/דקה).
- מרדימים את החולדה בזריקה תוך צפקית באמצעות פרוטוקול הרדמה (הריכוז הסופי של קטמין = 75 מ"ג/ק"ג, והריכוז הסופי של מדטומידין = 1 מ"ג/ק"ג).
הערה: ודאו שהחולדה מורדמת לחלוטין בשיטת התגובה לצביטה בבוהן. - הניחו את החולדה על מגש הנתיחה.
- לחטא את הפרווה ביסודיות עם אתנול 70%, ולייבש אותו עם מגבת נייר.
- בעזרת מספריים, לבצע חתך בצורת "U" דרך העור, לחתוך פתוח מתחת לסרעפת. לאחר מכן, לחתוך את כלוב הצלעות rostrally על הקצוות כדי לחשוף את הלב.
- בזמן שה-PBS 1x פועל, העבירו את המחט דרך החדר השמאלי לתוך אבי העורקים העולה, ומהדקים. לאחר מכן, חותכים את האטריום הימני כדי לאפשר ניקוז לאחר תחילת הזילוח.
הערה: הכבד אמור להתחיל להתכווץ כאשר הדם מוחלף ב-PBS. - בעזרת מספריים ומלקחיים של Dumont, מוציאים את הכבד בזהירות ושוטפים עם 1x PBS.
- מעבירים את הכבד לצלוחית פטרי ושוקלים אותו.
- באמצעות אזמל, לאסוף דגימות רקמת כבד של 5 מ"מ עובי מן הצד לרוחב (1 ס"מ מן הקצה) של האונה השמאלית של הכבד עבור תהליך הטבעה.
הערה: ניתן לאחסן את הרקמה הנותרת בטמפרטורה של -80°C לאחסון לטווח ארוך.
- הטבעה של רקמת כבד
- הכינו מיכל קרח יבש, ותייגו כראוי קריומולדים עם מזהה הדגימה והכיוון.
- הניחו כמה טיפות של מטריצת הטבעה של קריומולד על מרכז הקריומולד כדי ליצור את טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT).
- ודא שדגימת הרקמה מכוונת כראוי לחתך רוחבי.
הערה: ודא שהצד הנוגע בתחתית הקריומולד הוא הצד שיחתך ראשון. - בזהירות לטפטף עוד OCT על cryomold עד שהוא מכוסה לחלוטין. נסו להימנע מהיווצרות בועות אוויר. במידת הצורך, בעזרת מלקחיים פשוטים, הסירו את כל הבועות בתוך ה-OCT.
- הניחו במהירות את הקריומולד עם הדגימה המכוסה ב-OCT במיכל קרח יבש.
הערה: ניתן לאחסן את הרקמות בטמפרטורה של -80°C למשך 3 שנים.
3. חתך רקמות קפואות
- כוונן את טמפרטורת ההקפאה (תא: -21 ° C; דגימה: -18 ° C), והכנס להב סטרילי חדש.
- הניחו את הדגימות בהקפאה למשך 30 דקות לפני שתאפשרו לטמפרטורה להתאזן.
- צור שכבה אחת של OCT על דיסק הדגימה כדי לאפשר הדבקת דגימה. אפשר ל-OCT לקפוא, והרכיב את דגימת הרקמה בכיוון הרצוי.
הערה: משטח החיתוך צריך להיות מקביל ללהב. כדי לשמור על הדבקה טובה, הניחו את מחלץ החום על החלק העליון של הדגימה. השלבים הקודמים יכולים להתבצע גם במיכל קרח יבש עם קרח יבש. - מניחים את הדגימה בראש הדגימה, וחותכים את פני הרקמה (כמה קטעי דגימת רקמה של 30 מיקרומטר).
- ברגע שאזור העניין נגיש לחתך, חתכו מקטעים בעובי 12 מיקרומטר, והניחו אותם על שקופיות מיקרוסקופ מסומנות הנשמרות בטמפרטורת החדר (RT).
הערה: כדי לאסוף את המקטע, הזז באיטיות את השקופית לכיוון מקטע הרקמות. כל שקופית יכולה לאסוף שני חלקי כבד. - אפשר לשקופיות להתייבש במשך 10 דקות ב- RT.
הערה: ניתן לאחסן את השקופיות ב -20 ° C במשך 6-12 חודשים או ב -80 ° C עד 3 שנים.
4. צביעת BODIPY
- הפשירו את המגלשות במערכת צביעת שקופיות ב-RT למשך 30 דקות.
- יש לשטוף עם 1x PBS (3x למשך 5 דקות כל אחד).
- הקיפו את הקטע בשכבה הידרופובית באמצעות עט מחסום.
- הכינו תמיסת מלאי BODIPY 493/503 של 500 מיקרוגרם/מ"ל: המסו 1 מ"ג של BODIPY 493/503in 2 מ"ל של ממס (90% DMSO; 10% 1x PBS). יש להגן מפני אור. סוניק באמבטיה קולית במשך 1 שעות (9.5-10 W) ב 37 ° C.
הערה: ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של -20°C למשך 30 יום לפחות. - הכינו את תמיסת הצביעה BODIPY (1 מיקרוגרם/מ"ל) על ידי הוספת 2 מיקרוליטר של תמיסת מלאי BODIPY 493/503 ו-0.1 מיקרוליטר של תמיסת מלאי DAPI (5 מ"ג/מ"ל) ל-997.9 מיקרוליטר של 1x PBS.
- דגור על המגלשות (75 מיקרוליטר/מגלשה) עם BODIPY 493/503 (1 מיקרוגרם/מ"ל) ו-DAPI (0.1 מיקרוגרם/מ"ל) ב-RT למשך 40 דקות.
הערה: השאר את השקופיות בחושך משלב זה ואילך. - שטפו את המגלשות עם 1x PBS (3x למשך 5 דקות כל אחת).
- הרכיבו את המגלשות עם כיסויים באמצעות אמצעי הרכבה פלואורסצנטי, אפשרו להן להתייבש במשך 30 דקות ואטמו אותן בלק.
הערה: ניתן לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של 4°C עד להדמיה.
5. כימות שומנים
- מדדו את רמות הכולסטרול הכולל והTG בסרום באמצעות שיטה וציוד אוטומטיים ומתוקפים.
- למדוד את רמות TG בכבד באמצעות ערכת בדיקה קולורימטרית טריגליצרידים (טבלה של חומרים) על פי פרוטוקול היצרן.
6. רכישת תמונות
- הנח את השקופית על מחזיק השקופיות של המיקרוסקופ הקונפוקלי הסורק בלייזר.
- להדמיה ורכישה של תמונה, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם עדשה אובייקטיבית של 20x (plan-apochromat: 20x/0.8).
- כדי למנוע דיבור צולב בין BODIPY 493/503 ו- DAPI, השתמש במצב סריקה רציף (האות הטוב ביותר) בתוכנת קונפוקל.
- הפעל את BODIPY 593/503 באמצעות קו לייזר ארגון 488 ננומטר ואת DAPI באמצעות קו לייזר 405 ננומטר. הגדר את טווחי הפליטה על 493-589 ננומטר עבור BODIPY 493/503 ועל 410-464 ננומטר עבור DAPI.
- השתמש בהגדרות הבאות: חור סיכה: 1 AU, רזולוציה: 1,024 פיקסלים x 1,024 פיקסלים, עומק סיביות: 12, גודל פיקסל: 0.415 מיקרומטר, מצב דו-כיווני, מהירות סריקה: 7 (~ 1.58 μs לפיקסל למטרה של 20x), ממוצע קו: 2x וזום דיגיטלי: 1.
הערה: פרמטרי הסריקה הנ"ל חייבים להיות מותאמים לכל מיקרוסקופ קונפוקלי ומטרה בשימוש. - הגדר את הרווח ואת הרווח הדיגיטלי כראוי כך שלא יזוהו פיקסלים רוויים במחוון הטווח.
הערה: תקן את אות הרקע על-ידי התאמת ההסטה. - לאחר זיהוי נכון של ה- LDs, רכוש את התמונה עם ערוצי BODIPY ו- DAPI.
הערה: יש לרכוש את כל התמונות באותם תנאים (חשיפה והגדרות כלליות) עבור כל ערוץ צבע. - ליצירת תמונות בשטח רחב (איור 2), שנו את המטרה לעדשה אובייקטיבית a10x (plan-neofluar: 10x/0.3).
- בחר במצב סריקת אריחים וצור פסיפסים של 5 לכל 5 תמונות.
הערה: בעבודה זו, לכל אריח הייתה חפיפה של 10% כדי למזג כראוי את האריחים לניתוח. - כדי ליצור תצוגות תלת-ממדיות ואורתוגונליות (איור 3A), הניחו טיפת שמן טבילה על החלק העליון של זכוכית הכיסוי, ושנו את המטרה לעדשה אובייקטיבית של 40x (שמן plan-neofluar: 40x/1.30).
- בחר במצב Z-Stack, ועל-ידי התאמת מישור Z, הגדר את המיקום הראשון והאחרון לרכישה באמצעות פרוסה אופטית בעובי אופטימלי (~0.5 מיקרומטר) כדי להבטיח שכל הטיפות יילכדו.
הערה: כדי להאיץ את רכישת התמונה ולהימנע מהלבנה, ניתן לכוונן את הפרוסה האופטית לגודל לא אופטימלי, מה שמבטיח דגימת יתר של לפחות 30% לשחזור תלת-ממדי טוב. - בחר במודול Ortho וצור תצוגות אורתוגונליות.
- קבל תמונות תלת-ממדיות על-ידי בחירת מודול התלת-ממד הבא אחר מצב עיבוד שקיפות עם תוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי.
7. ניתוח תמונות
- עבד ונתח את התמונות במישור יחיד (הגדלה של פי 20) באמצעות CellProfiler (גרסה 4.2.5).
הערה: הצינור ששימש בעבודה זו הותאם מ- Adomshick et al.45. - לחץ על מודול התמונות בפינה השמאלית העליונה של חלון CellProfiler, והעלה את התמונות כקבצי .tiff.
- השתמש במודול NamesAndTypes כדי למיין בין תמונות מוכתמות BODIPY (droplet) ו- DAPI (גרעינים) בהתבסס על שמות הקבצים. בצע את ניתוח LD רק עם תמונות מוכתמות BODIPY.
- כדי להתחיל את קונסטרוקציית הצינור, לחץ על התאמת מודולים, ובחר את המודול ColorToGray כדי להמיר את התמונות לתמונות בגווני אפור.
הערה: כדי לזהות אובייקטים, נדרשות תמונות בגווני אפור. - זהה טיפות על-ידי שימוש במודול IdentifyPrimaryObjects באמצעות התמונה בגווני אפור.
הערה: יש להתאים את הפרמטרים במודול זה כדי להשיג זיהוי LD טוב. בעבודה זו, הגדרת LDs בגודל שבין 6 פיקסלים ל-300 פיקסלים ומקדם תיקון סף של 1.0 הובילה לזיהוי המדויק ביותר. - למדידת עוצמת הפיקסלים של טיפות השומנים שזוהו, הוסיפו מודול MeasureObjectIntensity .
- הוסף מודול FilterObjects נוסף כדי להבטיח שרק האותות החזקים ביותר מכומתים בעוד שאותות פחות אינטנסיביים אינם נכללים בניתוח טיפות השומנים הסופי (עוצמה מינימלית: 0.15; עוצמה מרבית: יחידה שרירותית אחת).
- כדי למדוד את רכיבי LD הקשורים לנתוני הפלט, הוסף את מודול MeasureObjectSizeShape .
- הוסף מודול OverlayOutlines בשלב זה כדי לכסות את הטיפה המזוהה על התמונה המקורית, ובכך להבטיח שהסגמנטציה תיראה מדויקת גם בתמונה הלא מעובדת.
הערה: זהו שלב אופציונלי (בקרת איכות). - הוסף מודול ExportToSpreadsheet בסוף ולחץ על כפתור ניתוח תמונות בפינה השמאלית התחתונה.
8. ניתוח סטטיסטי
- בטא את התוצאות כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (S.E.M.) באמצעות כל יישום תוכנה לניתוח סטטיסטי.
הערה: במחקר זה, תוכנת GraphPad שימשה לניתוח סטטיסטי. - לנתח את התפלגות הערכים באמצעות מבחן Kolmogorov-Smirnov כדי להעריך סטיות משמעותיות מן הנורמליות. נתח את הנתונים הפרמטריים באמצעות מבחן t לא מזווג של התלמיד.
הערה: ערכים של p < 0.05 נחשבו מובהקים סטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הביצוע המוצלח של טכניקה זו אמור לגרום לצביעת טיפות שומנים ברורות לצורך אפיון סימולטני של מורפולוגיית LD (צורה וצפיפות ליבת שומנים בהתבסס על שחזור תלת-ממדי) יחד עם הפיזור המרחבי שלהם, מספר לשטח כולל וגודל ממוצע (מוערך עם הצינור המתואר לעיל, איור 1).
איור 1: עיבוד תמונה לדוגמה באמצעות CellProfiler . (A) תמונה מקורית של LDs מוכתמים ב-BODIPY 493/503 (ירוק) וגרעינים מוכתמים ב-DAPI (כחול) בקבוצת CTL. (B) ה-LDs המובחנים (מגנטה) של קבוצת CTL היו שכבת-על באמצעות מודול OverlayOutlines . (C) תמונה מקורית של LDs מוכתמים ב-BODIPY 493/503 (ירוק) וגרעינים מוכתמים ב-DAPI (כחול) בקבוצת HFD. (D) ה-LDs המובחנים (מגנטה) של קבוצת HFD היו שכבת-על באמצעות מודול OverlayOutlines . התמונות צולמו בהגדלה של פי 20 באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק נקודת לייזר. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: CTL = קבוצת ביקורת; HFD = קבוצת דיאטה עתירת שומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
נבדקו TGs בסרום, כולסטרול כללי, LDL-c, HDL-c, כמו גם תכולת TG בכבד (טבלה 1). בעלי חיים שניזונו מ-HFD הציגו פרופיל דיסליפידמי בולט, המאופיין בהצטברות מודגשת של TGs בכבד (345% בהשוואה ל-CTL, p <-0.001), יחד עם עלייה קלה ברמות TG במחזור הדם (129% בהשוואה ל-CTL, p > 0.05).
| פרמטר | CTL | HFD | |
| סרום | |||
| סה"כ כולסטרול (מ"ג/ד"ל) | 56.67 ± 9.35 | 80.40 ± 7.45 | |
| LDL (מ"ג/ד"ל) | 7.66 ± 0.84 | 7.40 ± 1.03 | |
| HDL (מ"ג/ד"ל) | 17.83 ± 2.93 | 28.40 ± 2.40 * | |
| טריגליצרידים (מ"ג/ד"ל) | 158.8 ± 40.17 | 201.2 ± 38.12 | |
| כבד | |||
| טריגליצרידים (מ"ג/גרם) | 15.29 ± 1.31 | 52.83 ± 6.73 *** |
טבלה 1: TGs בסרום, כולסטרול כללי, LDL-c, HDL-c ותכולת TG בכבד. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM (n = 5-6 לקבוצה). p < 0.001 לעומת CTL. הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t לא מזווג של סטודנט. קיצורים: CTL = קבוצת ביקורת; HFD = קבוצת דיאטה עתירת שומן.
איור 2 מציג תמונות מייצגות של שטחים רחבים (סריקות אריחים עם מטרה של 10x) של מקטעי כבד שבהם LDs מוכתמים ב-BODIPY 493/503 (ירוק) וגרעינים מוכתמים ב-DAPI (כחול). LDs בודדים בגדלים שונים הודגמו בהצלחה עם צביעת BODIPY 493/503, אשר הראתה דפוס תפוצה נרחב בבעלי חיים הניזונים מ- HFD.
איור 2: תמונות מייצגות של הצטברות LD ברקמת הכבד. LDs מוכתמים ב-BODIPY 493/503 (ירוק), וגרעינים מוכתמים ב-DAPI (כחול). התמונות צולמו בהגדלה של פי 10 באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק נקודת לייזר. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצורים: CTL = קבוצת ביקורת; HFD = קבוצת דיאטה עתירת שומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3A מראה הקרנות אורתוגונליות מייצגות עם מטרה של 20x ותמונות תלת-ממדיות עם מטרה של 40x LDs בכבד. תמונות במישור יחיד עובדו ונותחו על-ידי CellProfiler (גרסה 4.2.5) כדי להעריך את עוצמת הפלואורסצנטיות, המספר, השטח והקוטר של ה-LCs (איור 3B-E). אפשר היה לאשר שהחיות שניזונו מ-HFD הציגו מספר מוגבר של LDs בכבד (151% לעומת CTL, איור 3B), וזה אומת על-ידי עוצמת הפלואורסצנטיות המוגברת של BODIPY 493/503 (182% לעומת CTL, p < 0.001, איור 3C). יתר על כן, יחס השטח של LDs כמעט שולש (360% לעומת CTL, p < 0.0001, איור 3D) כאשר הם הציגו קטרים גדולים יותר (182% לעומת CTL, איור 3E) בחיות שניזונו מ-HFD. כדי להעריך את התפלגות הגודל, ה-LDs סווגו לשלוש קבוצות לפי טווחי הקוטר: 1 מיקרומטר < d ≤ 3 מיקרומטר, 3 מיקרומטר < d ≤ 9 מיקרומטר, ו-d >-9 מיקרומטר (איור 3F). בעלי החיים שניזונו מה-HFD הראו עלייה של יותר מ-20% במספר ה-LDs המורחבים בכבד (d >-9 μm, p <-0.0001) יחד עם ירידה של כמעט פי שלושה במספר המיקרו-שלפוחיות הקטנות מ-3 מיקרומטר בקוטר (1 מיקרומטר < d ≤ 3 מיקרומטר, p < 0.0001).
איור 3: תצוגות אורתוגונליות/תלת-ממדיות של LDs וניתוח נתונים. (A) הקרנות אורתוגונליות מייצגות ותמונות תלת-ממדיות של טיפות שומנים בכבד (ירוק, BODIPY 493/503) וגרעינים (כחול, DAPI) בכבד של עכברים שניזונו מתזונה רגילה או HFD. התמונות צולמו בהגדלה של 20x (משמאל) ו- 40x (מימין) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק נקודת לייזר. מוטות קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B) מספר LDs בכבד. (C) עוצמת פלואורסצנטיות של LDs בכבד. (D) יחס שטח של LDs בכבד. (E) קוטר טיפות שומנים. (F) יחסי שברים של קבוצות טיפות שומנים בכבד בקטרים שונים: 1 מיקרומטר < d ≤ 3 μm, 3 μm < d ≤ 9 μm, ו- d > 9 μm. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. n = 5-6 עכברים לקבוצה; * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001. הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t לא מזווג של סטודנט. קיצורים: CTL = קבוצת ביקורת; HFD = קבוצת דיאטה עתירת שומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול BODIPY 493/503 מבוסס פלואורסצנטיות להערכת LD נועד לפתח גישת הדמיה חדשה להערכת סטאטוזיס בכבד. בהתחשב בקורלציה החזקה בין השמנת יתר למחלת כבד שומני, הדיאטה עתירת השומן בסגנון מערבי שימשה לביסוס מודל חייתי של סטאטוזיס כבד26. עלייה חזקה בתכולת TG בכבד אושרה על ידי ערכת בדיקה כמותית של טריגליצרידים קולורימטריים, אשר הציעה תרחיש ליפידוזיס מוגבר בכבד בבעלי חיים הניזונים מ- HFD. לאחר מכן, מידת הצטברות LD הודגמה על ידי הבדיקה הפלואורסצנטית BODIPY 493/503 תחת הגדלה נמוכה. כצפוי, צביעת BODIPY 493/503 חשפה פיזור נרחב של מבני שלפוחית על פני רקמת הכבד בקבוצת HFD. תוך שימוש בהקרנות אורתוגונליות ושחזורים תלת-ממדיים, ניתן היה להבחין כי ליבת LD הציגה תוכן מלא של שומנים ניטרליים, שהופיעו כטיפות כמעט כדוריות. יתר על כן, הגידול החזק באזור LD לשטח כולל ניכר בבירור (360% לעומת קבוצת CTL), ואזור זה היה ככל הנראה מלא TGs ניטרליים בהתחשב בציון הכמותי שלהם בקבוצת HFD (52.83 מ"ג / גרם ± 6.73 מ"ג / גרם; 346% לעומת קבוצת CTL). כדי לאפיין עוד יותר את הדינמיקה של LD עם הזנת HFD, נותח האופי המיקרו או המקרובסיקולרי של סטאטוזיס בכבד. באמצעות טווחי הקוטר של LD שתוארו קודם לכן בספרות 4,46,47, ניתן היה להבחין בירידה משמעותית בספירת LD מיקרושלפוחית (1 מיקרומטר < d ≤ 3 מיקרומטר), אשר מקבילה לעלייה פרופורציונלית במקרובועיות LD (d > 9 מיקרומטר). מספר מחקרים דיווחו כי LDs בהפטוציטים יכולים ליצור LDs גדולים (עד עשרות מיקרון קוטר)4,46,47, אשר עולה בקנה אחד עם התוצאות הנוכחיות.
בשנים האחרונות, צבעי שומנים קלאסיים הוחלפו בהדרגה במערך חדש של בדיקות ליפופיליות פלואורסצנטיות, כגון BODIPY, בהתחשב במבנה הניטרלי והמישורי שלהם המיוצב על ידי קומפלקס דיפלואורובורון48; בדיקות אלה הוכחו כיעילות מאוד בתיוג LDs כדי לחקור את המורפולוגיה, הדינמיקה והאינטראקציה שלהם עם אברונים אחרים בתאים חיים וכמה רקמות קבועות49,50. במסגרת פרוטוקול טיפות השומנים המוכתמות בפלואורסצנטי המוצג כאן להערכת סטאטוזיס בכבד, ישנם כמה צעדים קריטיים להצלחת הטכניקה המסתמכים בעיקר על הכנת רקמות ורכישת תמונה. מכיוון שאות BODIPY יכול להיות מולבן על ידי אור UV51, רכישת הדמיה LD חייבת להתרחש לפני הדמיה של צבעים פלואורסצנטיים אחרים המעוררים על ידי אור UV, כגון צבעי DNA פלואורסצנטיים ידועים. כמו כן, מומלץ מאוד להגן על מגלשות המיקרוסקופ מפני חשיפה לאור על מנת למנוע מרווה פלואורסצנטית של BODIPY לפני ההדמיה. אף על פי שהשחזור התלת-ממדי של LDs שימושי מאוד לחקר המורפולוגיה שלהם, הוא גוזל זמן רב, מכיוון שתמונות המשוחזרות בתלת-ממד מורכבות ממספר תמונות דו-ממדיות עצמאיות. לכן, החוקרים צריכים לשקול להימנע משלב זה כאשר המטרה העיקרית של הניסוי היא אך ורק הערכה של סטאטוזיס כבד מיקרו ו macrovesicular. כדי למנוע הטיה, שני משקיפים עצמאיים עיוורים לקבוצת הטיפול צריכים לבצע את איסוף הנתונים וניתוחם. תוכנת עיבוד התמונה החצי-אוטומטית (Cell Profiler pipeline) תורמת עוד יותר לכימות סמי-עיוור ומתגברת על זמן העיבוד המוגבר שנצפה באופן עקבי בניתוח ידני.
טכניקה זו עשויה להיות מורחבת ליישומים רחבים יותר בשילוב עם צביעה אימונוהיסטוכימית של רקמות ומינים אחרים, כל עוד ריכוזי BODIPY אופטימליים והגדרות רכישת תמונה נקבעו כדי למקסם את יחס האות / רקע. הגדרות ניסוי כאלה עשויות לאפשר זיהוי סימולטני של אנטיגנים אחרים בתנאי שהפלואורופור השני המשמש אינו חופף לספקטרום העירור/פליטה של BODIPY.
בסך הכל, הפרוטוקול האופטימלי מבוסס הפלואורסצנטיות BODIPY 493/503 המוצג כאן הוא כלי אמין ופשוט לאפיון LD ועשוי לייצג גישה משלימה לפרוטוקולים ההיסטולוגיים הקלאסיים המשמשים לעתים קרובות כדי לאשר ולדרג סטאטוזיס כבד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי קרנות לאומיות ואירופיות באמצעות קרן המדע והטכנולוגיה הפורטוגזית (FCT), הקרן האירופית לפיתוח אזורי (FEDER) ו- Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) ו- POCI-01-0145-FEDER-007440. המחברים רוצים להודות על התמיכה של iLAB - Microscopy and Bioimaging Lab, מתקן של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת קוימברה וחבר בתשתית הלאומית PPBI-Portuguese Platform of BioImaging (POCI-01-0145-FEDER-022122), כמו גם תמיכה של FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set | Fisher Scientific | ||
| 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D3922 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR | D1306 | |
| 70% ethanol | Honeywell | 10191455 | |
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
| Automatic analyzer Hitachi 717 | Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany | 8177-30-0010 | |
| Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) | Daido Sangyo Co., Ltd, Japon | _ | |
| Blade | Leica | 221052145 | Used in the cryostat |
| Cell Profiler version 4.2.5 | https://cellprofiler.org/releases/ | Used to analyse the acquired images | |
| Coverslips | Menzel-Glaser, Germany | _ | |
| Cryomolds | Tissue-Tek | _ | |
| Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S | Leica Biosystems | _ | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D-8418 | Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Dry ice container (styrofoam cooler) | Novolab | A26742 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools, Germany | 11295-10 | |
| Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) |
Thermo Scientific | 150318 | Used to weigh the liver after dissection |
| Glycergel | DAKO Omnis | S303023 | |
| GraphPad Prism software, version 9.3.1 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA | ||
| High-fat diet | Envigo, Barcelona, Spain | MD.08811 | |
| Ketamine (Nimatek 100 mg/mL) | Dechra | 791/01/14DFVPT | Used at a final concentration of 75 mg/kg |
| Laser scanning confocal microscope (QUASAR detection unit; ) | Carl Zeiss, germany | LSM 710 Axio Observer Z1 microscope | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Dechra | 1838 ESP / 020/01/07RFVPT | Used at a final concentration of 1 mg/kg |
| Needle | BD microlance | 300635 | |
| No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade |
Swann-Morton | 205 | |
| Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) | Carl Zeiss, Germany | ||
| Paint brushes | Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections | |
| Peristaltic pump (Minipuls 3) | Gilson | 1004170 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | P3813 | |
| Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 | Swann-Morton | 0208 | |
| Slide staining system StainTray | Simport Scientific | M920 | |
| Standard diet | Mucedola | 4RF21 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Menzel-Glaser, Germany | J1800AMNZ | |
| Tissue-Tek OCT mounting media | VWR CHEMICALS | 361603E | |
| Triglycerides colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 10010303 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | TK 52 | |
| Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge |
Fine Science Tools, Germany | 15000-00 | |
| ZEN Black software | Zeiss |
References
- Klemm, R. W., Ikonen, E. The cell biology of lipid droplets: More than just a phase. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 1-3 (2020).
- Martin, S., Parton, R. G. Lipid droplets: A unified view of a dynamic organelle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 373-378 (2006).
- Thiele, C., Penno, A. Lipid droplets. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. , Academic Press. Cambridge, MA. 273-278 (2016).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: From basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Bickel, P. E., Tansey, J. T., Welte, M. A. PAT proteins, an ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid stores. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 419-440 (2009).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Wang, L., Liu, J., Miao, Z., Pan, Q., Cao, W. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Jackson, C. L.
- Onal, G., Kutlu, O., Gozuacik, D., Dokmeci Emre, S. Lipid droplets in health and disease. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 128 (2017).
- Wang, H., Quiroga, A. D., Lehner, R. Lipid Droplets. Methods in Cell Biology. Yang, H., Li, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 107-127 (2013).
- Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 24, Unit 24.2 (2007).
- Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).
- Roberts, M. A., Olzmann, J. A. Protein quality control and lipid droplet metabolism). Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 115-139 (2020).
- Filali-Mouncef, Y., et al. The ménage à trois of autophagy, lipid droplets and liver disease. Autophagy. 18 (1), 50-72 (2022).
- Bandyopadhyay, D., et al. Lipid droplets promote phase separation of Ago2 to accelerate Dicer1 loss and decelerate miRNA activity in lipid exposed hepatic cells. bioRxiv. , (2020).
- Farías, M. A., Diethelm-Varela, B., Navarro, A. J., Kalergis, A. M., González, P. A. Interplay between lipid metabolism, lipid droplets, and DNA virus infections. Cells. 11 (14), 2224 (2022).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: Lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
- Xu, S., Zhang, X., Liu, P. Lipid droplet proteins and metabolic diseases. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (5), 1968-1983 (2018).
- Herms, A., et al. Cell-to-cell heterogeneity in lipid droplets suggests a mechanism to reduce lipotoxicity. Current Biology. 23 (15), 1489-1496 (2013).
- Hooper, A. J., Adams, L. A., Burnett, J. R. Genetic determinants of hepatic steatosis in man. Journal of Lipid Research. 52 (4), 593-617 (2011).
- Parafati, M., Kirby, R. J., Khorasanizadeh, S., Rastinejad, F., Malany, S. A nonalcoholic fatty liver disease model in human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes, created by endoplasmic reticulum stress-induced steatosis. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2018).
- Nassir, F., Rector, R. S., Hammoud, G. M., Ibdah, J. A. Pathogenesis and prevention of hepatic steatosis. Gastroenterology & Hepatology. 11 (3), 167-175 (2015).
- Starekova, J., Reeder, S. B. Liver fat quantification: Where do we stand. Abdominal Radiology. 45 (11), 3386-3399 (2020).
- Fabbrini, E., Sullivan, S., Klein, S. Obesity and nonalcoholic fatty liver disease: Biochemical, metabolic, and clinical implications. Hepatology. 51 (2), 679-689 (2010).
- Kristiansen, M. N. B., Veidal, S. S., Christoffersen, C., Jelsing, J., Rigbolt, K. T. G. Molecular characterization of microvesicular and macrovesicular steatosis shows widespread differences in metabolic pathways. Lipids. 54 (1), 109-115 (2019).
- Tsutsumi, V., Nakamura, T., Ueno, T., Torimura, T., Aguirre-García, J. Chapter 2: Structure and ultrastructure of the normal and diseased liver. Liver Pathophysiology. Muriel, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 23-44 (2017).
- Tandra, S., et al. Presence and significance of microvesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 55 (3), 654-659 (2011).
- Nascimbeni, F., et al. Clinical relevance of liver histopathology and different histological classifications of NASH in adults. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 351-367 (2018).
- Yerian, L. Histopathological evaluation of fatty and alcoholic liver diseases. Journal of Digestive Diseases. 12 (1), 17-24 (2011).
- Stöppeler, S., et al. Gender and strain-specific differences in the development of steatosis in rats. Laboratory Animals. 47 (1), 43-52 (2013).
- Hübscher, S. G. Alcohol-induced liver disease. Practical Hepatic Pathology: A Diagnostic Approach (Second Edition). Saxena, R. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 371-390 (2018).
- Sethunath, D., et al. Automated assessment of steatosis in murine fatty liver. PLoS One. 13 (5), e0197242 (2018).
- Sinton, M. C., et al. Macrovesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease is a consequence of purine nucleotide cycle driven fumarate accumulation. bioRxiv. , (2020).
- de Conti, A., et al. Characterization of the variability in the extent of nonalcoholic fatty liver induced by a high-fat diet in the genetically diverse collaborative cross mouse model. The FASEB Journal. 34 (6), 7773-7785 (2020).
- Virarkar, M., Szklaruk, J., Jensen, C. T., Taggart, M. W., Bhosale, P.
- Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), e51092 (2012).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 42 (2015).
- Daemen, S., van Zandvoort, M. A. M. J., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2015).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), e77774 (2013).
- Nakano, T., et al. Ezetimibe impairs transcellular lipid trafficking and induces large lipid droplet formation in intestinal absorptive epithelial cells. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1865 (12), 158808 (2020).
- Adomshick, V., Pu, Y., Veiga-Lopez, A. Automated lipid droplet quantification system for phenotypic analysis of adipocytes using CellProfiler. Toxicology Mechanisms and Methods. 30 (5), 378-387 (2020).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Martinez-Lopez, N., Singh, R. Autophagy and lipid droplets in the liver. Annual Review of Nutrition. 35, 215-237 (2015).
- Collot, M., et al. Ultrabright and fluorogenic probes for multicolor imaging and tracking of lipid droplets in cells and tissues. Journal of the American Chemical Society. 140 (16), 5401-5411 (2018).
- Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-Lopez de Carrizosa, M. A. Fiber type and subcellular-specific analysis of lipid droplet content in skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: Jove. (184), e63718 (2022).
- Zhuang, H., et al. Long-term high-fat diet consumption by mice throughout adulthood induces neurobehavioral alterations and hippocampal neuronal remodeling accompanied by augmented microglial lipid accumulation. Brain, Behavior, and Immunity. 100, 155-171 (2022).
- Chen, J., Yue, F., Kuang, S. Labeling and analyzing lipid droplets in mouse muscle stem cells. STAR Protocols. 3 (4), 101849 (2022).
