Summary
Neste artigo, demonstramos um protocolo otimizado baseado em fluorescência BODIPY 493/503 para caracterização de gotículas lipídicas em tecido hepático. Através do uso de projeções ortogonais e reconstruções 3D, o fluoróforo permite o sucesso da discriminação entre esteatose microvesicular e macrovesicular e pode representar uma abordagem complementar aos protocolos histológicos clássicos para avaliação da esteatose hepática.
Abstract
As gotículas lipídicas (DLs) são organelas especializadas que medeiam o armazenamento lipídico e desempenham um papel muito importante na supressão da lipotoxicidade e na prevenção da disfunção causada pelos ácidos graxos livres (AGs). O fígado, dado seu papel crítico no metabolismo da gordura do corpo, é persistentemente ameaçado pelo acúmulo intracelular de DLs na forma de esteatose hepática microvesicular e macrovesicular. A caracterização histológica dos LDs é tipicamente baseada em corantes diazo lipossolúveis, como a coloração Oil Red O (ORO), mas uma série de desvantagens consistentemente dificulta o uso dessa análise com espécimes hepáticos. Mais recentemente, os fluoróforos lipofílicos 493/503 tornaram-se populares para visualizar e localizar DLs devido à sua rápida captação e acúmulo no núcleo de gotículas lipídicas neutras. Embora a maioria das aplicações seja bem descrita em culturas celulares, há menos evidências demonstrando o uso confiável de sondas de fluoróforo lipofílico como uma ferramenta de imagem de DL em amostras de tecido. Neste trabalho, propomos um protocolo otimizado baseado em dipirrometeno de boro (BODIPY) 493/503 para a avaliação de DLs em espécimes hepáticos de um modelo animal de esteatose hepática induzida por dieta hiperlipídica (DHL). Este protocolo abrange preparo de amostras de fígado, secção tecidual, coloração BODIPY 493/503, aquisição de imagens e análise de dados. Demonstramos um aumento do número, intensidade, razão de área e diâmetro das DLs hepáticas após a alimentação com DH. Usando projeções ortogonais e reconstruções 3D, foi possível observar o conteúdo total de lipídios neutros no núcleo LD, que apareceu como gotículas quase esféricas. Além disso, com o fluoróforo BODIPY 493/503, conseguimos distinguir microvesículas (1 μm < d ≤ 3 μm), vesículas intermediárias (3 μm < d ≤ 9 μm) e macrovesículas (d > 9 μm), permitindo a discriminação bem sucedida da esteatose microvesicular e macrovesicular. Em geral, este protocolo baseado em fluorescência BODIPY 493/503 é uma ferramenta confiável e simples para a caracterização da DL hepática e pode representar uma abordagem complementar aos protocolos histológicos clássicos.
Introduction
As gotículas lipídicas (DLs), classicamente vistas como depósitos de energia, são organelas celulares especializadas que medeiam o armazenamento lipídico e compreendem um núcleo lipídico neutro hidrofóbico, que contém principalmente ésteres de colesterol e triglicérides (TGs), encapsulados por uma monocamada fosfolipídica 1,2,3.
A biogênese da DL ocorre no retículo endoplasmático (RE), iniciando-se com a síntese de triacilgliceróis (TAG) e ésteres esteróis. Os lipídios neutros são difundidos entre os folíolos da bicamada de RE em baixas concentrações, mas coalescem em lentes de óleo que crescem e brotam em gotículas quase esféricas da membrana de RE quando sua concentração intracelular aumenta4. Posteriormente, proteínas da bicamada de RE e do citosol, particularmente da família de proteínas perilipina (PLIN), translocam-se para as superfícies dos DLs para facilitar o brotamento 5,6,7,8,9.
Através de nova síntese de ácidos graxos e fusão ou coalescência de LD, LDs crescem em diferentes tamanhos. Assim, o tamanho e o número de LDs diferem consideravelmente entre os diferentes tipos de células. Pequenas gotículas (300-800 nm de diâmetro), conhecidas como DLs iniciais (iLDs), podem ser formadas por quase todas as células4. Mais tarde na formação de LD, a maioria das células é capaz de converter algumas iLDs em LDs maiores de expansão (eLDs >1 μm de diâmetro). No entanto, apenas tipos celulares específicos, como adipócitos e hepatócitos, têm a capacidade de formar LDs gigantes ou superdimensionadas (até dezenas de mícrons de diâmetro)4,10.
Os DLs desempenham um papel muito importante na regulação do metabolismo lipídico celular, suprimindo a lipotoxicidade e prevenindo o estresse de RE, a disfunção mitocondrial e, finalmente, a morte celular causada pelos ácidos graxos livres (AGs)11,12,13,14. Além disso, as DLs também têm sido implicadas na regulação da expressão gênica, no sequestro de proteínas de replicação viral, no tráfego e sinalização de membranas15,16,17. Portanto, a desregulação da biogênese da DL é uma característica das doenças crônicas associadas à síndrome metabólica, obesidade, diabetes mellitus tipo 2 (DM2) e/ou arteriosclerose, para citar apenas algumas18,19,20.
O fígado, como polo metabólico, é o principal responsável pelo metabolismo lipídico, armazenando e processando lipídios, sendo, portanto, constantemente ameaçado pela lipotoxicidade21. A esteatose hepática (EH) é uma característica comum a uma série de doenças hepáticas progressivas e é caracterizada pelo acúmulo excessivo de lipídios intracelulares na forma de LDs citosólicos que, em última instância, podem levar à disfunção metabólica hepática, inflamação e formas avançadas de doença hepática gordurosa não alcoólica22,23,24,25. A SH ocorre quando a taxa de oxidação de ácidos graxos e exportação como triglicerídeos dentro de lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDLs) é menor do que a taxa de captação de ácidos graxos hepáticos do plasma e síntese de novos ácidos graxos26. O acúmulo hepático de lipídios frequentemente ocorre em duas formas - esteatose microvesicular e macrovesicular - e estas apresentam características citoarquitetônicasdistintas27. Tipicamente, a esteatose microvesicular é caracterizada pela presença de pequenos DLs dispersos por todo o hepatócito com o núcleo posicionado centralmente, enquanto a esteatose macrovesicular é caracterizada pela presença de um único grande DL que ocupa a maior parte do hepatócito, empurrando o núcleo para a periferia28,29. Notavelmente, esses dois tipos de esteatose são frequentemente encontrados juntos, e ainda não está claro como esses dois padrões de DL influenciam a patogênese da doença, pois as evidências ainda são inconsistentes31,32,33,34. No entanto, esse tipo de análise é frequentemente empregado como "padrão de referência" em estudos pré-clínicos e clínicos para entender o comportamento dinâmico dos DLs e caracterizar a esteatose hepática29,34,35,36.
As biópsias hepáticas, padrão-ouro para o diagnóstico e classificação da EH, são rotineiramente avaliadas pela análise histológica de hematoxilina e eosina (H&E), onde gotículas lipídicas são avaliadas como vacúolos não corados em cortes hepáticos corados por H&E37. Embora aceitável para avaliação da esteatose macrovesicular, esse tipo de coloração geralmente estreita a avaliação da esteatose microvesicular38. Corantes diazo lipossolúveis, como o Oil Red O (ORO), são classicamente combinados com microscopia de campo claro para analisar os estoques lipídicos intracelulares, mas estes ainda apresentam uma série de desvantagens: (i) o uso de etanol ou isopropanol no processo de coloração, o que muitas vezes causa a ruptura dos LDs nativos e fusão ocasional apesar das células estarem fixas39; (ii) a natureza demorada, uma vez que a solução de ORO requer dissolução e filtragem de pó fresco devido ao prazo de validade limitado, contribuindo assim para resultados menos consistentes; (iii) e o fato de que a ORO cora mais do que apenas gotículas lipídicas e muitas vezes superestima a esteatose hepática38.
Consequentemente, fluoróforos lipofílicos permeáveis a células, como o Nile Red, têm sido usados em amostras vivas ou fixas para superar algumas das limitações mencionadas. No entanto, a natureza inespecífica da marcação de organelas lipídicas celulares restringe repetidamente as avaliações de DL40. Além disso, as propriedades espectrais do Vermelho do Nilo variam de acordo com a polaridade do ambiente, o que muitas vezes pode levar a deslocamentos espectrais41.
A sonda fluorescente lipofílica 1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4adiaza-s-indaceno (comprimento de onda de excitação: 480 nm; emissão máxima: 515 nm; BODIPY 493/503) apresenta características de hidrofobicidade que permitem sua rápida captação pelos LDs intracelulares, acumula-se no núcleo lipídico das gotículas e, posteriormente, emite fluorescência verde brilhante12. Ao contrário do Nile Red, o BODIPY 493/503 é insensível à polaridade do ambiente e tem se mostrado mais seletivo, pois exibe alto brilho para imagens LD. Para corar LDs neutros, esse corante pode ser usado em células vivas ou fixas e acoplado com sucesso a outros métodos de coloração e/ou marcação42. Outra vantagem do corante é que ele requer pouco esforço para ser colocado em uma solução e é estável, eliminando a necessidade de prepará-lo na hora para cada experimento42. Embora a sonda BODIPY 493/503 tenha sido empregada com sucesso para visualizar a localização e dinâmica de DLs em culturas celulares, alguns relatos também demonstraram o uso confiável desse corante como ferramenta de imagem de DL em tecidos, incluindo o músculo vasto lateral humano43, o músculo sóleo de rato 42 e o intestino de camundongo44.
Neste trabalho, propomos um protocolo otimizado baseado em BODIPY 493/503 como uma abordagem analítica alternativa para a avaliação do número, área e diâmetro de DL em espécimes hepáticos de um modelo animal de esteatose hepática. Esse procedimento abrange o preparo de amostras de fígado, corte tecidual, condições de coloração, aquisição de imagens e análise de dados.
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Protocol
Todos os procedimentos em animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Instituto Coimbra de Investigação Clínica e Biomédica (iCBR) Animal Welfare Body (ORBEA, #9/2018) e cumpriram as diretivas nacionais e europeias de cuidados com animais e as diretrizes ARRIVE.
1. Delineamento experimental
- Ratos Wistar machos de 13 semanas de idade em gaiolas ventiladas sob condições ambientais controladas de temperatura (22 °C ± 1 °C), umidade (50%-60%) e luz (ciclo claro-escuro de 12 h) e com acesso ad libitum à água da torneira e ração padrão para roedores.
- Após um período de 2 semanas de aclimatação, arbitrariamente atribuir os ratos em dois grupos.
- Alimentar os grupos controle (CTRL, n = 6) e dieta hiperlipídica (DH, n = 6) com ração padrão e dieta hiperlipídica (45% kcal/gordura), respectivamente, por 24 semanas.
- Monitorar o peso corporal (PC) semanalmente. Registre o consumo diário de alimentos e bebidas por gaiola.
2. Preparação da amostra de fígado
- Dissecção hepática
- Prepare a bomba peristáltica: Passe etanol 70% através da tubulação, conecte uma agulha de 27 G à extremidade de saída da tubulação e prepare a tubulação com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH ~7,4) gelada (4 °C) (por exemplo, 200 rpm em uma bomba peristáltica com tubulação de silício de 1,6 mm I.D., mini conjunto de gotejamento IV). Ajuste para o peso corporal (por exemplo, para um rato de 100-150 g, use uma taxa de fluxo de aproximadamente 10-12 mL/min).
- Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal utilizando um protocolo de anestesia (concentração final de cetamina = 75 mg/kg e concentração final de medetomidina = 1 mg/kg).
NOTA: Certifique-se de que o rato está completamente anestesiado usando o método de resposta de pinça do dedo do pé. - Coloque o rato na bandeja de dissecção.
- Higienize bem o pelo com etanol 70% e seque-o com um papel toalha.
- Usando tesoura, faça uma incisão em forma de "U" através da pele e abra abaixo do diafragma. Em seguida, corte a caixa torácica rostralmente nas bordas para expor o coração.
- Enquanto o PBS 1x estiver funcionando, passe a agulha através do ventrículo esquerdo para a aorta ascendente e pinça. Em seguida, o átrio direito é cortado para permitir a drenagem após o início da perfusão.
NOTA: O fígado deve começar a branquear à medida que o sangue é substituído por PBS. - Usando tesoura e pinça Dumont, retire o fígado com cuidado e enxágue com 1x PBS.
- Transfira o fígado para uma placa de Petri e pese-o.
- Com bisturi, coletar amostras de tecido hepático de 5 mm de espessura da face lateral (1 cm da borda) do lobo esquerdo do fígado para o processo de incorporação.
NOTA O tecido restante pode ser armazenado a -80 °C para armazenamento a longo prazo.
- Incorporação de tecido hepático
- Prepare um recipiente de gelo seco e rotule adequadamente os criomoldes com o ID e a orientação da amostra.
- Coloque algumas gotas de matriz de incorporação de crio no centro do criomold para obter a temperatura de corte ideal (OCT).
- Certifique-se de que a amostra de tecido está devidamente orientada para uma secção transversal.
NOTA: Certifique-se de que o lado que toca a parte inferior do criomold é o lado que será seccionado primeiro. - Solte cuidadosamente mais OCT no criomold até que ele esteja completamente coberto. Tente evitar a formação de bolhas de ar. Se necessário, com pinças lisas, remova quaisquer bolhas dentro do OCT.
- Coloque rapidamente o criomold com a amostra coberta pelo OCT em um recipiente de gelo seco.
NOTA: Os tecidos podem ser armazenados a -80 °C durante 3 anos.
3. Secção de tecidos congelados
- Ajuste a temperatura do criostato (câmara: -21 °C; amostra: -18 °C) e insira uma nova lâmina estéril.
- Colocar as amostras no criostato durante 30 minutos antes de deixar a temperatura equilibrar-se.
- Faça uma única camada de OCT no disco da amostra para permitir a adesão da amostra. Deixe a OCT congelar e monte a amostra de tecido na orientação desejada.
NOTA: A superfície de corte deve ser paralela à lâmina. Para manter uma boa aderência, coloque o extrator de calor na parte superior da amostra. As etapas anteriores também podem ser realizadas em um recipiente de gelo seco com gelo seco. - Coloque a amostra na cabeça da amostra e corte a superfície do tecido (algumas seções de amostra de tecido de 30 μm).
- Uma vez que a região de interesse esteja acessível para seccionamento, corte cortes de 12 μm de espessura e coloque-os em lâminas de microscópio marcadas mantidas à temperatura ambiente (TR).
NOTA: Para coletar a seção, mova lentamente a lâmina em direção à seção de tecido. Cada lâmina pode coletar duas seções de fígado. - Deixe as lâminas secarem por 10 min no RT.
NOTA: As lâminas podem ser armazenadas a -20 °C por 6-12 meses ou a -80 °C por até 3 anos.
4. Coloração BODIPY
- Descongele as lâminas em um sistema de coloração de lâminas em RT por 30 min.
- Lave com 1x PBS (3x por 5 min cada).
- Circule a seção com uma camada hidrofóbica usando uma caneta de barreira.
- Preparar 500 μg/mL de solução-mãe de BODIPY 493/503: Dissolver 1 mg de BODIPY 493/503 em 2 mL de solvente (DMSO 90%; 10% 1x PBS). Proteger da luz. Sonicate em banho ultra-sônico por 1 h (9,5-10 W) a 37 °C.
NOTA: A solução pode ser armazenada a -20 °C durante, pelo menos, 30 dias. - Preparar a solução corante BODIPY (1 μg/mL) adicionando 2 μL de solução-mãe BODIPY 493/503 e 0,1 μL de solução-mãe DAPI (5 mg/mL) a 997,9 μL de 1x PBS.
- Incubar as lâminas (75 μL/lâmina) com BODIPY 493/503 (1 μg/mL) e DAPI (0,1 μg/mL) em TR por 40 min.
NOTA: Mantenha os slides no escuro a partir desta etapa. - Lave as lâminas com 1x PBS (3x por 5 min cada).
- Monte as lâminas com lamínulas usando um meio de montagem por fluorescência, deixe-as secar por 30 min e sela-as com esmalte.
NOTA: As lâminas podem ser armazenadas a 4 °C até a obtenção de imagens.
5. Quantificação de lipídios
- Medir os níveis séricos de colesterol total e TG usando um método e equipamento automáticos e validados.
- Medir os níveis hepáticos de TG usando um kit de ensaio colorimétrico de triglicerídeos (Tabela de Materiais) de acordo com o protocolo do fabricante.
6. Aquisição de imagens
- Coloque a lâmina no suporte da lâmina do microscópio confocal de varredura a laser.
- Para visualização e aquisição das imagens, utilizar microscópio confocal com objetiva de 20x (plano-apocromático: 20x/0,8).
- Para evitar cross-talk entre o BODIPY 493/503 e o DAPI, use o modo de varredura sequencial (melhor sinal) no software confocal.
- Excite o BODIPY 593/503 usando a linha de laser de argônio de 488 nm e o DAPI usando a linha de laser de 405 nm. Defina as faixas de emissão em 493-589 nm para BODIPY 493/503 e em 410-464 nm para DAPI.
- Use as seguintes configurações: pinhole: 1 UA, resolução: 1.024 pixels x 1.024 pixels, profundidade de bits: 12, tamanho do pixel: 0,415 μm, modo bidirecional, velocidade de digitalização: 7 (~1,58 μs/pixel para uma objetiva de 20x), média de linha: 2x e zoom digital: 1.
NOTA: Os parâmetros de varredura acima mencionados devem ser otimizados para cada microscópio confocal e objetivo usado. - Defina o ganho e o ganho digital adequadamente para que nenhum pixel saturado seja detectado no indicador de intervalo.
Observação : corrija o sinal de fundo ajustando o deslocamento. - Uma vez que os LDs estejam corretamente identificados, adquira a imagem com os canais BODIPY e DAPI.
NOTA: Todas as fotos devem ser adquiridas nas mesmas condições (exposição e configurações gerais) para cada canal de cor. - Para criar imagens de área ampla (Figura 2), altere a objetiva para a10x (plan-neofluar: 10x/0,3).
- Selecione o modo Tile Scan e crie mosaicos de 5 por 5 imagens.
NOTA: Neste trabalho, cada bloco teve uma sobreposição de 10%, a fim de mesclar adequadamente os blocos para análise. - Para criar vistas 3D e ortogonais (Figura 3A), coloque uma gota de óleo de imersão na parte superior do vidro da tampa e mude a objetiva para uma objetiva de 40x (plan-neofluar: óleo de 40x/1,30).
- Selecione o modo Z-Stack e, ajustando o plano Z, defina a primeira e a última posições para aquisição com um corte óptico em uma espessura ideal (~0,5 μm) para garantir que todas as gotículas sejam capturadas.
NOTA: Para acelerar a aquisição da imagem e evitar o clareamento, o corte óptico pode ser ajustado para um tamanho abaixo do ideal, garantindo pelo menos 30% de sobreamostragem para uma boa reconstrução 3D. - Selecione o módulo Ortho e crie exibições ortogonais.
- Adquira imagens 3D selecionando o módulo 3D seguindo o Modo de Renderização de Transparência com o software de microscópio confocal.
7. Análise das imagens
- Processar e analisar as imagens de plano único (aumento de 20x) com o CellProfiler (versão 4.2.5).
NOTA: O pipeline utilizado neste trabalho foi adaptado de Adomshick et al.45. - Clique no módulo Imagens no canto superior esquerdo da janela do CellProfiler e carregue as imagens como arquivos .tiff.
- Use o módulo NamesAndTypes para classificar entre imagens coradas BODIPY- (gota) e DAPI- (núcleos) com base nos nomes dos arquivos. Realizar a análise de DL apenas com imagens coradas com BODIPY.
- Para iniciar a construção do pipeline, clique em Ajustar módulos e selecione o módulo ColorToGray para converter as imagens em tons de cinza.
Observação : para identificar objetos, imagens em tons de cinza são necessárias. - Identifique gotículas empregando o módulo IdentifyPrimaryObjects usando a imagem em tons de cinza.
NOTA: Os parâmetros neste módulo devem ser ajustados para realizar uma boa identificação LD. Neste trabalho, a definição de LDs com tamanho entre 6 pixels e 300 pixels e fator de correção de limiar de 1,0 levou à identificação mais precisa. - Para medir a intensidade de pixel das gotículas lipídicas identificadas, adicione um módulo MeasureObjectIntensity .
- Adicione um módulo FilterObjects adicional para garantir que apenas os sinais mais fortes sejam quantificados, enquanto os sinais menos intensos são excluídos da análise final de gotículas lipídicas (intensidade mínima: 0,15; intensidade máxima: 1 unidade arbitrária).
- Para medir os LDs relacionados aos dados de saída, adicione o módulo MeasureObjectSizeShape .
- Adicione um módulo OverlayOutlines neste ponto para sobrepor a gota identificada na imagem original e, assim, garantir que a segmentação pareça precisa na imagem não processada também.
NOTA: Esta é uma etapa opcional (controle de qualidade). - Adicione um módulo ExportToSpreadsheet no final e clique no botão Analisar imagens no canto inferior esquerdo.
8. Análise estatística
- Expresse os resultados como média ± erro padrão da média (S.E.M.) usando qualquer software de análise estatística.
OBS: Neste estudo, o software GraphPad foi utilizado para análise estatística. - Analisar a distribuição dos valores utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnov para avaliar desvios significativos da normalidade. Analise os dados paramétricos usando o teste t de Student não pareado.
LEGENDA: Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
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Representative Results
A execução bem-sucedida desta técnica deve resultar em coloração clara de gotículas lipídicas para a caracterização simultânea da morfologia da DL (forma e densidade do núcleo lipídico com base na reconstrução 3D), juntamente com sua distribuição espacial, número por área total e tamanho médio (avaliado com a tubulação acima descrita, Figura 1).
Figura 1: Processamento de imagens de amostra usando CellProfiler . (A) Imagem original de LDs corados com BODIPY 493/503 (verde) e núcleos corados com DAPI (azul) no grupo CTL. (B) Os LDs diferenciados (magenta) do grupo CTL foram sobrepostos usando o módulo OverlayOutlines . (C) Imagem original de LDs corados com BODIPY 493/503 (verde) e núcleos corados com DAPI (azul) no grupo HFD. (D) Os LDs diferenciados (magenta) do grupo HFD foram sobrepostos usando o módulo OverlayOutlines . As imagens foram obtidas em aumento de 20x usando um microscópio confocal de varredura com laser point. Barras de escala = 50 μm. Abreviações: CTL = grupo controle; DH = grupo dieta hiperlipidóide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Foram avaliados os TGs séricos, colesterol total, LDL-c, HDL-c, bem como o conteúdo hepático de TG (Tabela 1). Os animais alimentados com HFD apresentaram um perfil dislipidêmico acentuado, caracterizado por um acúmulo acentuado de TGs hepáticos (345% quando comparados com CTL, p < 0,001), juntamente com um discreto aumento nos níveis de TG circulantes (129% quando comparados com CTL, p > 0,05).
| Parâmetro | CTL | DHH | |
| Soro | |||
| Colesterol Total (mg/dL) | 56,67 ± 9,35 | 80,40 ± 7,45 | |
| LDL (mg/dL) | 7,66 ± 0,84 | 7.40 ± 1.03 | |
| HDL (mg/dL) | 17,83 ± 2,93 | 28,40 ± 2,40 * | |
| Triglicerídeos (mg/dL) | 154,8 ± 40,17 | 201.2 ± 38.12 | |
| Fígado | |||
| Triglicerídeos (mg/g) | 15.29 ± 1.31 | 52,83 ± 6,73 *** |
Tabela 1: Valores séricos de TG, colesterol total, LDL-c, HDL-c e TG hepáticos. Os dados foram expressos como média ± EPM (n = 5-6 por grupo). p < 0,001 versus CTL. A análise estatística foi realizada por meio do teste t de Student não pareado. Abreviações: CTL = grupo controle; DH = grupo dieta hiperlipidóide.
A Figura 2 mostra imagens representativas de área ampla (varreduras em mosaico com objetiva de 10x) de cortes hepáticos nos quais os LDs são corados com BODIPY 493/503 (verde) e os núcleos são corados com DAPI (azul). LDs individuais de vários tamanhos foram visualizados com sucesso com a coloração BODIPY 493/503, que mostrou um padrão de distribuição generalizado nos animais alimentados com HFD.
Figura 2: Imagens representativas do acúmulo de DL no tecido hepático. LDs corados com BODIPY 493/503 (verde) e núcleos corados com DAPI (azul). As imagens foram obtidas em aumento de 10x usando um microscópio confocal de varredura com laser point. Barras de escala = 200 μm. Abreviações: CTL = grupo controle; DH = grupo dieta hiperlipidóide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 3A mostra projeções ortogonais representativas com objetiva de 20x e imagens 3D com objetiva de 40x de LDs hepáticas. As imagens monoplanares foram processadas e analisadas pelo CellProfiler (versão 4.2.5) para avaliar a intensidade, o número, a área e o diâmetro das CLs da fluorescência (Figura 3B-E). Foi possível confirmar que os animais alimentados com HFD apresentaram um número aumentado de LDs hepáticas (151% vs. CTL, Figura 3B), e isso foi corroborado pela intensidade aumentada da fluorescência BODIPY 493/503 (182% vs. CTL, p < 0,001, Figura 3C). Além disso, a razão de área dos GDs quase triplicou (360% vs. CTL, p < 0,0001, Figura 3D) por apresentarem diâmetros maiores (182% vs. CTL, Figura 3E) nos animais alimentados com HFD. Para avaliar a distribuição de tamanho, os GDs foram categorizados em três grupos de acordo com as faixas de diâmetro: 1 μm < d ≤ 3 μm, 3 μm < d ≤ 9 μm e d > 9 μm (Figura 3F). Os animais alimentados com HFD mostraram um aumento superior a 20% no número de LDs hepáticas macrovesiculares superdimensionadas (d > 9 μm, p < 0,0001), juntamente com uma redução de quase três vezes no número de microvesículas menores que 3 μm de diâmetro (1 μm < d ≤ 3 μm, p < 0,0001).
Figura 3: Visualizações ortogonais/3D dos GDs e análise dos dados. (A) Projeções ortogonais representativas e imagens renderizadas em 3D de gotículas lipídicas hepáticas (verde, BODIPY 493/503) e núcleos (azul, DAPI) no fígado de camundongos alimentados com dieta normal ou HFD. As imagens foram obtidas em aumentos de 20x (esquerda) e 40x (direita) usando um microscópio confocal de varredura com ponto laser. Barras de escala = 20 μm. (B) Número de LDs hepáticas. (C) Intensidade de fluorescência das DLs hepáticas. (D) Razão de área das DLs hepáticas. (E) Diâmetros de gotículas lipídicas. (F) Razões fracionárias de grupos de gotículas lipídicas hepáticas com diferentes diâmetros: 1 μm < d ≤ 3 μm, 3 μm < d ≤ 9 μm e d > 9 μm. Os dados são apresentados como média ± EPM. n = 5-6 camundongos/grupo; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001. A análise estatística foi realizada por meio do teste t de Student não pareado. Abreviações: CTL = grupo controle; DH = grupo dieta hiperlipidóide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo baseado em fluorescência BODIPY 493/503 para avaliação de DL teve como objetivo desenvolver uma nova abordagem de imagem para a avaliação da esteatose hepática. Dada a forte correlação entre obesidade e doença hepática gordurosa, a dieta hiperlipídica de estilo ocidental foi utilizada para estabelecer um modelo animal de esteatose hepática26. Um aumento robusto no conteúdo hepático de TG foi confirmado por um kit de ensaio colorimétrico quantitativo de triglicerídeos, que sugeriu um cenário de lipidose hepática aumentada nos animais alimentados com HFD. Posteriormente, o grau de acúmulo de DL foi visualizado pela sonda fluorescente BODIPY 493/503 sob baixa magnificação. Como esperado, a coloração BODIPY 493/503 revelou uma ampla distribuição das estruturas vesiculares através do tecido hepático no grupo HFD. Recorrendo a projeções ortogonais e reconstruções 3D, foi possível observar que o núcleo do LD apresentou um conteúdo completo de lipídios neutros, que apareceram como gotículas quase esféricas. Além disso, o aumento robusto na área de DL por área total foi claramente evidente (360% vs. grupo CTL), e essa área foi provavelmente preenchida com TGs neutros, dado seu escore quantitativo no grupo HFD (52,83 mg/g ± 6,73 mg/g; 346% vs. grupo CTL). Para caracterizar melhor a dinâmica da DL na alimentação com DH, a natureza micro ou macrovesicular da esteatose hepática foi analisada. Usando as faixas de diâmetro do DL previamente descritas na literatura4,46,47, foi possível discriminar uma queda significativa na contagem de DL microvesicular (1 μm < d ≤ 3 μm), que acompanhou um aumento proporcional nas macrovesículas de DL (d > 9 μm). Vários estudos relataram que os DLs em hepatócitos podem formar LDs superdimensionados (até dezenas de mícrons de diâmetro)4,46,47, o que está de acordo com os nossos resultados.
Nos últimos anos, os corantes lipídicos clássicos têm sido gradualmente substituídos por uma nova matriz de sondas lipofílicas fluorescentes, como a BODIPY, dada a sua estrutura neutra e plana estabilizada por um complexo difluoroboro48; essas sondas têm se mostrado muito eficazes na marcação de DLs para estudar sua morfologia, dinâmica e interação com outras organelas em células vivas e alguns tecidos fixos49,50. Dentro do protocolo de gotículas lipídicas coradas por fluorescência apresentado para avaliação da esteatose hepática, existem algumas etapas críticas para o sucesso da técnica que dependem principalmente do preparo tecidual e da aquisição de imagens. Uma vez que o sinal BODIPY pode ser branqueado pela luz UV51, a aquisição da imagem LD deve ocorrer antes da obtenção de imagens de outros corantes fluorescentes que são excitados pela luz UV, como os comumente conhecidos corantes fluorescentes de DNA. Além disso, é altamente recomendável proteger as lâminas do microscópio da exposição à luz, a fim de evitar a extinção da fluorescência BODIPY antes da aquisição de imagens. Embora a reconstrução 3D de LDs seja muito útil para o estudo de sua morfologia, ela é extremamente demorada, uma vez que as imagens reconstruídas em 3D são compostas por várias imagens 2D independentes. Portanto, os pesquisadores devem considerar evitar essa etapa quando o objetivo primário do experimento é apenas a avaliação da esteatose hepática micro e macrovesicular. Para evitar viés, dois observadores independentes e cegos para o grupo de tratamento devem realizar a aquisição e análise dos dados. O software semi-automatizado de processamento de imagens (pipeline Cell Profiler) contribui ainda mais para uma quantificação semi-cega e supera o aumento do tempo de processamento consistentemente observado na análise manual.
Esta técnica pode ser estendida para aplicações mais amplas em combinação com a coloração imunohistoquímica de outros tecidos e espécies, desde que as concentrações ótimas de BODIPY e as configurações de aquisição de imagens tenham sido determinadas para maximizar a relação sinal/fundo. Tais configurações experimentais podem permitir a detecção simultânea de outros antígenos, desde que o segundo fluoróforo utilizado não se sobreponha aos espectros de excitação/emissão de BODIPY.
Em geral, o protocolo otimizado baseado em fluorescência BODIPY 493/503 aqui apresentado é uma ferramenta confiável e simples para a caracterização da DL e pode representar uma abordagem complementar aos protocolos histológicos clássicos frequentemente empregados para confirmar e graduar a esteatose hepática.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta investigação foi financiada por fundos nacionais e europeus através da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) e Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) e POCI-01-0145-FEDER-007440. Os autores agradecem o apoio do iLAB - Laboratório de Microscopia e Bioimagem, unidade da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra e membro da infraestrutura nacional PPBI-Plataforma Portuguesa de BioImagem (POCI-01-0145-FEDER-022122), bem como o apoio do FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set | Fisher Scientific | ||
| 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D3922 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR | D1306 | |
| 70% ethanol | Honeywell | 10191455 | |
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
| Automatic analyzer Hitachi 717 | Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany | 8177-30-0010 | |
| Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) | Daido Sangyo Co., Ltd, Japon | _ | |
| Blade | Leica | 221052145 | Used in the cryostat |
| Cell Profiler version 4.2.5 | https://cellprofiler.org/releases/ | Used to analyse the acquired images | |
| Coverslips | Menzel-Glaser, Germany | _ | |
| Cryomolds | Tissue-Tek | _ | |
| Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S | Leica Biosystems | _ | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D-8418 | Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Dry ice container (styrofoam cooler) | Novolab | A26742 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools, Germany | 11295-10 | |
| Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) |
Thermo Scientific | 150318 | Used to weigh the liver after dissection |
| Glycergel | DAKO Omnis | S303023 | |
| GraphPad Prism software, version 9.3.1 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA | ||
| High-fat diet | Envigo, Barcelona, Spain | MD.08811 | |
| Ketamine (Nimatek 100 mg/mL) | Dechra | 791/01/14DFVPT | Used at a final concentration of 75 mg/kg |
| Laser scanning confocal microscope (QUASAR detection unit; ) | Carl Zeiss, germany | LSM 710 Axio Observer Z1 microscope | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Dechra | 1838 ESP / 020/01/07RFVPT | Used at a final concentration of 1 mg/kg |
| Needle | BD microlance | 300635 | |
| No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade |
Swann-Morton | 205 | |
| Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) | Carl Zeiss, Germany | ||
| Paint brushes | Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections | |
| Peristaltic pump (Minipuls 3) | Gilson | 1004170 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | P3813 | |
| Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 | Swann-Morton | 0208 | |
| Slide staining system StainTray | Simport Scientific | M920 | |
| Standard diet | Mucedola | 4RF21 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Menzel-Glaser, Germany | J1800AMNZ | |
| Tissue-Tek OCT mounting media | VWR CHEMICALS | 361603E | |
| Triglycerides colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 10010303 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | TK 52 | |
| Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge |
Fine Science Tools, Germany | 15000-00 | |
| ZEN Black software | Zeiss |
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