Summary
Här demonstrerar vi ett optimerat BODIPY 493/503 fluorescensbaserat protokoll för lipiddroppkarakterisering i levervävnad. Genom användning av ortogonala projektioner och 3D-rekonstruktioner möjliggör fluoroforen framgångsrik diskriminering mellan mikrovesikulär och makrovesikulär steatos och kan representera ett komplementärt tillvägagångssätt till de klassiska histologiska protokollen för bedömning av leversteatos.
Abstract
Lipiddroppar (LD) är specialiserade organeller som förmedlar lipidlagring och spelar en mycket viktig roll för att undertrycka lipotoxicitet och förhindra dysfunktion orsakad av fria fettsyror (FA). Levern, med tanke på dess kritiska roll i kroppens fettmetabolism, hotas ständigt av den intracellulära ackumuleringen av LD i form av både mikrovesikulär och makrovesikulär leversteatos. Den histologiska karakteriseringen av LD är typiskt baserad på lipidlösliga diazofärgämnen, såsom Oil Red O (ORO) färgning, men ett antal nackdelar hindrar konsekvent användningen av denna analys med leverprover. På senare tid har lipofila fluoroforer 493/503 blivit populära för att visualisera och lokalisera LD på grund av deras snabba upptag och ackumulering i den neutrala lipiddroppkärnan. Även om de flesta applikationer är väl beskrivna i cellkulturer, finns det mindre bevis som visar tillförlitlig användning av lipofila fluoroforsonder som ett LD-avbildningsverktyg i vävnadsprover. Här föreslår vi ett optimerat bordipyrromethene (BODIPY) 493/503-baserat protokoll för utvärdering av LDs i leverprover från en djurmodell av fettrik diet (HFD)-inducerad leversteatos. Detta protokoll täcker leverprovberedning, vävnadssnittning, BODIPY 493/503-färgning, bildförvärv och dataanalys. Vi visar ett ökat antal, intensitet, areaförhållande och diameter av hepatiska LD vid HFD-matning. Med hjälp av ortogonala projektioner och 3D-rekonstruktioner var det möjligt att observera det fulla innehållet av neutrala lipider i LD-kärnan, som uppträdde som nästan sfäriska droppar. Dessutom kunde vi med fluoroforen BODIPY 493/503 skilja mikrovesiklar (1 μm < d ≤ 3 μm), mellanliggande vesiklar (3 μm < d ≤ 9 μm) och makrovesiklar (d > 9 μm), vilket möjliggjorde framgångsrik diskriminering av mikrovesikulär och makrovesikulär steatos. Sammantaget är detta BODIPY 493/503 fluorescensbaserade protokoll ett pålitligt och enkelt verktyg för hepatisk LD-karakterisering och kan representera ett komplementärt tillvägagångssätt till de klassiska histologiska protokollen.
Introduction
Lipiddroppar (LD), klassiskt betraktade som energidepåer, är specialiserade cellulära organeller som förmedlar lipidlagring, och de innefattar en hydrofob neutral lipidkärna, som huvudsakligen innehåller kolesterolestrar och triglycerider (TG), inkapslad av ett fosfolipidmonolager 1,2,3.
LD-biogenes förekommer i endoplasmatisk retikulum (ER), som börjar med syntesen av triacylglycerol (TAG) och sterolestrar. Neutrala lipider diffunderas mellan broschyrerna i ER-dubbelskiktet vid låga koncentrationer men samlas i oljelinser som växer och knoppas till nästan sfäriska droppar från ER-membranet när deras intracellulära koncentration ökar4. Därefter translokerar proteiner från ER-dubbelskiktet och cytosolen, särskilt perilipin (PLIN) -proteinfamiljen, till LD: s ytor för att underlätta spirande 5,6,7,8,9.
Genom ny fettsyrasyntes och LD-fusion eller koalescens växer LD till olika storlekar. Följaktligen skiljer sig storleken och antalet LD avsevärt mellan olika celltyper. Små droppar (300-800 nm diameter), som är kända som initiala LD (iLD), kan bildas av nästan alla celler4. Senare i LD-bildning kan de flesta celler omvandla vissa iLD till större expanderande LD (eLD >1 μm i diameter). Ändå har bara specifika celltyper, såsom adipocyter och hepatocyter, kapacitet att bilda jätte eller överdimensionerade LD (upp till tiotals mikron i diameter)4,10.
LD spelar en mycket viktig roll i regleringen av cellulär lipidmetabolism, undertrycker lipotoxicitet och förhindrar ER-stress, mitokondriell dysfunktion och i slutändan celldöd orsakad av fria fettsyror (FA) 11,12,13,14. Dessutom har LD också varit inblandade i regleringen av genuttryck, viral replikationsproteinbindning och membranhandel och signalering15,16,17. Därför är felreglering av LD-biogenes ett kännetecken för kroniska sjukdomar i samband med metaboliskt syndrom, fetma, typ 2-diabetes mellitus (T2DM) och / eller åderförkalkning, för att bara nämna några18,19,20.
Levern, som ett metaboliskt nav, är mest ansvarig för lipidmetabolism genom att lagra och bearbeta lipider, och därför hotas den ständigt av lipotoxicitet21. Leverstatos (HS) är ett vanligt inslag i en serie progressiva leversjukdomar och kännetecknas av överdriven intracellulär lipidackumulering i form av cytosoliska LD som i slutändan kan leda till levermetabolisk dysfunktion, inflammation och avancerade former av alkoholfri fettleversjukdom22,23,24,25. HS uppstår när hastigheten för fettsyraoxidation och export som triglycerider inom lipoproteiner med mycket låg densitet (VLDL) är lägre än graden av leverfettsyraupptag från plasma och de novo-fettsyrasyntes26. Den hepatiska ackumuleringen av lipider förekommer ofta i två former - mikrovesikulär och makrovesikulär steatos - och dessa visar distinkta cytoarkitektoniska egenskaper27. Typiskt kännetecknas mikrovesikulär steatos av närvaron av små LD dispergerade genom hepatocyten med kärnan placerad centralt, medan makrovesikulär steatos kännetecknas av närvaron av en enda stor LD som upptar större delen av hepatocyten och skjuter kärnan till periferin28,29. I synnerhet finns dessa två typer av steatos ofta tillsammans, och det är fortfarande oklart hur dessa två LD-mönster påverkar sjukdomspatogenesen, eftersom bevisen fortfarande är inkonsekventa31,32,33,34. Ändå används en sådan typ av analys ofta som en "referensstandard" i prekliniska och kliniska studier för att förstå LDs dynamiska beteende och karakterisera leversteatos 29,34,35,36.
Leverbiopsier, guldstandarden för diagnos och gradering av HS, utvärderas rutinmässigt genom histologisk hematoxylin och eosin (H &E) -analys, där lipiddroppar utvärderas som ofärgade vakuoler i H &E-färgade leversektioner37. Även om det är acceptabelt för utvärdering av makrovesikulär steatos, begränsar denna typ av färgning i allmänhet bedömningen av mikrovesikulär steatos38. Lipidlösliga diazofärgämnen, såsom Oil Red O (ORO), kombineras klassiskt med ljusfältmikroskopi för att analysera intracellulära lipidbutiker, men dessa har fortfarande ett antal nackdelar: (i) användningen av etanol eller isopropanol i färgningsprocessen, vilket ofta orsakar störning av de inhemska LD: erna och tillfällig fusion trots att cellerna är fixerade39; ii) Den tidskrävande karaktären, eftersom ORO-lösningen kräver upplösning och filtrering av färskt pulver på grund av den begränsade hållbarheten, vilket bidrar till mindre konsekventa resultat. (iii) och det faktum att ORO färgar mer än bara lipiddroppar och ofta överskattar leversteatos38.
Följaktligen har cellpermeabla lipofila fluoroforer, såsom Nile Red, använts i antingen levande eller fasta prover för att övervinna några av de ovan nämnda begränsningarna. Den icke-specifika karaktären av cellulär lipidorganellmärkning minskar emellertid upprepade gånger LD-bedömningar40. Dessutom varierar de spektrala egenskaperna hos Nile Red beroende på miljöns polaritet, vilket ofta kan leda till spektralförskjutningar41.
Den lipofila fluorescerande sonden 1,3,5,7,8-pentametyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (excitationsvåglängd: 480 nm; maximal emission: 515 nm; BODIPY 493/503) uppvisar hydrofobicitetsegenskaper som möjliggör dess snabba upptag av intracellulära LD, ackumuleras i lipiddroppkärnan och avger därefter ljusgrön fluorescens12. Till skillnad från Nile Red är BODIPY 493/503 okänslig för miljöpolariteten och har visat sig vara mer selektiv, eftersom den visar hög ljusstyrka för LD-avbildning. För att färga neutrala LD kan detta färgämne användas i levande eller fasta celler och framgångsrikt kopplas till andra färgnings- och / eller märkningsmetoder42. En annan fördel med färgämnet är att det kräver liten ansträngning att placera i en lösning och är stabil, vilket eliminerar behovet av att nyförbereda det för varje experiment42. Även om BODIPY 493/503-sonden framgångsrikt har använts för att visualisera lokaliseringen och dynamiken hos LD i cellkulturer, har vissa rapporter också visat tillförlitlig användning av detta färgämne som ett LD-avbildningsverktyg i vävnader inklusive den mänskliga vastus lateralis-muskeln43, råttan soleus-muskeln 42 och mustarmen44.
Här föreslår vi ett optimerat BODIPY 493/503-baserat protokoll som en alternativ analytisk metod för utvärdering av LD-antal, area och diameter i leverprover från en djurmodell av leversteatos. Denna procedur omfattar beredning av leverprov, vävnadssnittning, färgningsförhållanden, bildförvärv och dataanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som utfördes i denna studie godkändes av Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) Animal Welfare Body (ORBEA, #9/2018) och uppfyllde de nationella och europeiska direktiven för djurvård och ARRIVE-riktlinjerna.
1. Experimentell design
- Parhus 13 veckor gamla Wistar-hanråttor i ventilerade burar under kontrollerade miljöförhållanden med temperatur (22 °C ± 1 °C), fuktighet (50%-60%) och ljus (12 h ljus-mörk cykel) och med ad libitum tillgång till kranvatten och standard gnagarchow.
- Efter en 2 veckors acklimatiseringsperiod, tilldela godtyckligt råttorna i två grupper.
- Mata kontrollgrupperna (CTRL, n = 6) och fettrika dietgrupper (HFD, n = 6) med standard chow respektive en fettrik diet (45% kcal / fett) i 24 veckor.
- Övervaka kroppsvikt (BW) varje vecka. Registrera mat- och dryckeskonsumtionen dagligen per bur.
2. Beredning av leverprov
- Leverdissektion
- Förbered den peristaltiska pumpen: Kör 70% etanol genom slangen, anslut en 27 G nål till slangens utloppsände och fyll slangen med iskall (4 ° C) 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH ~ 7,4) (t.ex. 200 rpm på en peristaltisk pump med 1,6 mm I.D. kiselrör, IV mini droppsats). Justera för kroppsvikt (t.ex. för en 100-150 g råtta, använd en flödeshastighet på cirka 10-12 ml / min).
- Bedöva råttan genom en intraperitoneal injektion med hjälp av ett anestesiprotokoll (den slutliga koncentrationen av ketamin = 75 mg / kg och den slutliga koncentrationen av medetomidin = 1 mg / kg).
OBS: Se till att råttan är helt bedövad med hjälp av tåklämmangsmetoden. - Placera råttan på dissektionsbrickan.
- Sanera pälsen noggrant med 70% etanol och torka den med en pappershandduk.
- Använd sax, gör ett "U" -format snitt genom huden och skär upp under membranet. Skär sedan ribbburet rostralt på kanterna för att exponera hjärtat.
- Medan 1x PBS är igång, passera nålen genom vänster kammare in i stigande aorta och klämma. Därefter skärs det högra atriumet för att tillåta dränering när perfusionen har börjat.
OBS: Levern bör börja blanchera när blodet ersätts med PBS. - Använd sax och Dumont-pincett, ta bort levern försiktigt och skölj med 1x PBS.
- Överför levern till en petriskål och väg den.
- Använd en skalpell och samla levervävnadsprover med en tjocklek på 5 mm från sidosidan (1 cm från kanten) av leverns vänstra lob för inbäddningsprocessen.
OBS: Den återstående vävnaden kan förvaras vid -80 °C för långvarig lagring.
- Inbäddning av levervävnad
- Förbered en torrisbehållare och märk kryoformar ordentligt med prov-ID och orientering.
- Placera några droppar kryoinbäddningsmatris på mitten av kryomolen för att göra optimal skärtemperatur (OCT).
- Se till att vävnadsprovet är ordentligt orienterat för ett tvärsnitt.
OBS: Se till att sidan som vidrör botten av kryomolen är den sida som kommer att delas först. - Släpp försiktigt mer OCT på kryomolen tills den är helt täckt. Försök att undvika bildandet av luftbubblor. Om det behövs, med vanlig pincett, ta bort eventuella bubblor inuti OCT.
- Placera snabbt kryomolen med det OCT-täckta provet i en torrisbehållare.
OBS: Vävnaderna kan förvaras vid -80 ° C i 3 år.
3. Snittning av fryst vävnad
- Justera kryostattemperaturen (kammare: −21 °C; prov: −18 °C) och sätt in ett nytt sterilt blad.
- Placera proverna i kryostaten i 30 minuter innan du låter temperaturen balansera.
- Gör ett enda lager OCT på provskivan för att möjliggöra vidhäftning av provet. Låt ULT frysa och montera vävnadsprovet i önskad riktning.
OBS: Skärytan ska vara parallell med bladet. För att bibehålla god vidhäftning, placera värmeutsugen på toppen av provet. De föregående stegen kan också utföras i en torrisbehållare med torris. - Placera provet i provhuvudet och trimma vävnadens yta (några 30 μm vävnadsprovsektioner).
- När området av intresse är tillgängligt för sektionering, skär 12 μm tjocka sektioner och placera dem på märkta mikroskopglas som hålls vid rumstemperatur (RT).
OBS: För att samla sektionen, flytta långsamt bilden mot vävnadssektionen. Varje bild kan samla två leversektioner. - Låt objektglasen torka i 10 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Objektglasen kan förvaras vid −20 °C i 6-12 månader eller vid −80 °C i upp till 3 år.
4. BODIPY färgning
- Tina glasen i ett glidfärgningssystem vid RT i 30 minuter.
- Tvätta med 1x PBS (3x i 5 min vardera).
- Cirkel sektionen med ett hydrofobt skikt med en barriärpenna.
- Bered 500 μg/ml BODIPY 493/503 stamlösning: Lös 1 mg BODIPY 493/503 i 2 ml lösningsmedel (90 % DMSO; 10 % 1x PBS). Skydda mot ljus. Sonicate i ett ultraljudsbad för 1 h (9,5-10 W) vid 37 ° C.
OBS: Lösningen kan förvaras vid −20 °C i minst 30 dagar. - Bered BODIPY-färgningslösningen (1 μg/ml) genom att tillsätta 2 μl stamlösning BODIPY 493/503 och 0,1 μl DAPI-stamlösning (5 mg/ml) till 997,9 μl 1x PBS.
- Inkubera objektglasen (75 μl/objektglas) med BODIPY 493/503 (1 μg/ml) och DAPI (0,1 μg/ml) vid rumstemperatur i 40 minuter.
OBS: Håll bilderna i mörkret från detta steg och framåt. - Tvätta bilderna med 1x PBS (3x i 5 min vardera).
- Montera glasen med täckglas med ett fluorescensmonteringsmedium, låt dem torka i 30 minuter och försegla dem med nagellack.
OBS: Objektglasen kan förvaras vid 4 °C fram till avbildning.
5. Lipidkvantifiering
- Mät serumets totala kolesterol- och TG-nivåer med hjälp av en automatisk, validerad metod och utrustning.
- Mät de hepatiska TG-nivåerna med hjälp av ett kolorimetriskt analyskit för triglycerider (materialförteckning) enligt tillverkarens protokoll.
6. Bildinsamling
- Placera bilden på laserskanningens konfokalmikroskophållare.
- För bildvisualisering och förvärv, använd ett konfokalmikroskop med en 20x objektivlins (plan-apochromat: 20x/0.8).
- För att undvika överhörning mellan BODIPY 493/503 och DAPI, använd det sekventiella (bästa signal) skanningsläget på konfokalprogramvaran.
- Excitera BODIPY 593/503 med 488 nm argonlaserlinjen och DAPI med 405 nm laserlinjen. Ställ in emissionsområdena på 493–589 nm för BODIPY 493/503 och på 410–464 nm för DAPI.
- Använd följande inställningar: pinhole: 1 AU, upplösning: 1 024 pixlar x 1 024 pixlar, bitdjup: 12, pixelstorlek: 0,415 μm, dubbelriktat läge, skanningshastighet: 7 (~ 1,58 μs / pixel för ett 20x-mål), linjemedelvärde: 2x och digital zoom: 1.
Anmärkning: Ovannämnda skanningsparametrar måste optimeras för varje konfokalmikroskop och mål som används. - Ställ in förstärkning och digital förstärkning på rätt sätt så att inga mättade pixlar upptäcks på intervallindikatorn.
OBS: Korrigera bakgrundssignalen genom att justera förskjutningen. - När LD: erna är korrekt identifierade, hämta bilden med BODIPY- och DAPI-kanalerna.
OBS: Alla bilder måste förvärvas under samma förhållanden (exponering och allmänna inställningar) för varje färgkanal. - Om du vill skapa bredområdesbilder (bild 2) ändrar du målsättningen till a10x objektivobjektiv (plan-neofluar: 10x/0.3).
- Välj Tile Scan-läge och gör mosaik av 5 per 5 bilder.
OBS: I det här arbetet hade varje panel en överlappning på 10% för att på lämpligt sätt sammanfoga brickorna för analys. - För att skapa 3D-vyer och ortogonala vyer (figur 3A), placera en droppe nedsänkningsolja på toppen av täckglaset och ändra målet till en 40x objektivlins (plan-neofluar: 40x/1.30 olja).
- Välj Z-stack-läge och genom att justera Z-planet definierar du den första och sista positionen för förvärv med en optisk skiva med en optimal tjocklek (~ 0,5 μm) för att säkerställa att alla droppar fångas upp.
OBS: För att påskynda bildinsamlingen och undvika blekning kan den optiska skivan justeras till en suboptimal storlek, vilket säkerställer minst 30% översampling för en bra 3D-rekonstruktion. - Välj modulen Orto och skapa ortogonala vyer.
- Hämta 3D-bilder genom att välja 3D-modulen enligt Transparency Rendering Mode med konfokalmikroskopprogramvaran.
7. Analys av bilder
- Bearbeta och analysera enplansbilder (20x förstoring) med CellProfiler (version 4.2.5).
OBS: Rörledningen som användes i detta arbete anpassades från Adomshick et al.45. - Klicka på modulen Bilder i det övre vänstra hörnet av CellProfiler-fönstret och ladda upp bilderna som .tiff filer.
- Använd modulen NamesAndTypes för att sortera mellan BODIPY- (droplet) och DAPI- (kärnor) färgade bilder baserat på filnamnen. Utför LD-analysen endast med BODIPY-färgade bilder.
- Starta pipelinekonstruktionen genom att klicka på Justera moduler och välja modulen ColorToGray för att konvertera bilderna till gråskaleavbildningar.
För att identifiera objekt krävs gråskalebilder. - Identifiera droplets genom att använda modulen IdentifyPrimaryObjects med hjälp av gråskalebilden.
OBS: Parametrarna i denna modul måste justeras för att uppnå god LD-identifiering. I detta arbete ledde definitionen av LD med en storlek mellan 6 pixlar och 300 pixlar och en tröskelkorrigeringsfaktor på 1,0 till den mest exakta identifieringen. - Om du vill mäta pixelintensiteten för de identifierade lipiddropparna lägger du till en MeasureObjectIntensity modul.
- Lägg till ytterligare en FilterObjects-modul för att säkerställa att endast de starkaste signalerna kvantifieras medan mindre intensiva signaler utesluts från den slutliga lipiddroppanalysen (minsta intensitet: 0,15; maximal intensitet: 1 godtycklig enhet).
- Om du vill mäta LD:erna som är relaterade till utdata lägger du till modulen MeasureObjectSizeShape .
- Lägg till en OverlayOutlines-modul vid denna punkt för att lägga över den identifierade droppen på originalbilden och därmed se till att segmenteringen ser korrekt ut på den obearbetade bilden också.
OBS: Detta är ett valfritt steg (kvalitetskontroll). - Lägg till en ExportToSpreadsheet-modul i slutet och klicka på knappen Analysera bilder längst ned till vänster.
8. Statistisk analys
- Uttryck resultaten som medelvärde ± standardfel för medelvärdet (S.E.M.) med hjälp av något statistiskt analysprogram.
OBS: I denna studie användes GraphPad-programvaran för statistisk analys. - Analysera fördelningen av värden med hjälp av Kolmogorov-Smirnov-testet för att bedöma signifikanta avvikelser från normalitet. Analysera parametriska data med hjälp av studentens oparade t-test.
OBS: Värden på p < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det framgångsrika utförandet av denna teknik bör resultera i tydlig lipiddroppfärgning för samtidig karakterisering av LD-morfologin (form och lipidkärndensitet baserat på 3D-rekonstruktionen) tillsammans med deras rumsliga fördelning, antal per total yta och genomsnittlig storlek (bedömd med rörledningen ovan beskriven, figur 1).
Bild 1: Exempel på bildbehandling med CellProfiler . (A) Originalbild av LD färgade med BODIPY 493/503 (grön) och kärnor färgade med DAPI (blå) i CTL-gruppen. (B) De differentierade LD (magenta) i CTL-gruppen överlagrades med hjälp av OverlayOutlines-modulen . (C) Originalbild av LD färgade med BODIPY 493/503 (grön) och kärnor färgade med DAPI (blå) i HFD-gruppen. (D) HFD-gruppens differentierade LD (magenta) överlagrades med hjälp av OverlayOutlines-modulen . Bilderna togs med 20x förstoring med hjälp av ett konfokalmikroskop med laserpunktskanning. Skalstänger = 50 μm. Förkortningar: CTL = kontrollgrupp; HFD = fettrik dietgrupp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Serum TG, totalkolesterol, LDL-c, HDL-c, samt hepatisk TG-innehåll utvärderades (tabell 1). HFD-matade djur uppvisade en uttalad dyslipidemisk profil, kännetecknad av en accentuerad ackumulering av hepatiska TG (345% jämfört med CTL, p < 0,001), tillsammans med en subtil ökning av cirkulerande TG-nivåer (129% jämfört med CTL, p > 0,05).
| Parameter | CTL | HFD | |
| Serum | |||
| Totalt kolesterol (mg / dl) | 56.67 ± 9.35 | 80.40 ± 7.45 | |
| LDL (mg/dl) | 7.66 ± 0.84 | 7.40 ± 1.03 | |
| HDL (mg/dl) | 17,83 ± 2,93 | 28.40 ± 2.40 * | |
| Triglycerider (mg/dl) | 154,8 ± 40,17 | 201,2 ± 38,12 | |
| Lever | |||
| Triglycerider (mg/g) | 15.29 ± 1.31 | 52,83 ± 6,73 *** |
Tabell 1: Serum TG, totalkolesterol, LDL-c, HDL-c och hepatiskt TG-innehåll. Data uttrycks som medelvärde ± SEM (n = 5-6 per grupp). p < 0,001 jämfört med CTL. Statistisk analys utfördes med hjälp av en elevs oparade t-test. Förkortningar: CTL = kontrollgrupp; HFD = fettrik dietgrupp.
Figur 2 visar representativa bredområdesbilder (panelskanningar med ett 10x mål) av leversektioner där LD färgas med BODIPY 493/503 (grön) och kärnor färgas med DAPI (blå). Individuella LDs av olika storlekar visualiserades framgångsrikt med BODIPY 493/503-färgning, vilket visade ett utbrett distributionsmönster hos de HFD-matade djuren.
Figur 2: Representativa bilder av LD-ackumulering i levervävnad. LD färgade med BODIPY 493/503 (grön) och kärnor färgade med DAPI (blå). Bilderna togs med 10x förstoring med hjälp av ett konfokalmikroskop med laserpunktskanning. Skalstänger = 200 μm. Förkortningar: CTL = kontrollgrupp; HFD = fettrik dietgrupp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3A visar representativa ortogonala projektioner med ett 20x mål och 3D-bilder med ett 40x mål för hepatiska LD. Enplansbilder bearbetades och analyserades av CellProfiler (version 4.2.5) för att bedöma fluorescensintensiteten, antalet, arean och diametern hos LC (figur 3B-E). Det var möjligt att bekräfta att de HFD-matade djuren uppvisade ett ökat antal hepatiska LDs (151% jämfört med CTL, figur 3B), och detta bekräftades av den förstärkta BODIPY 493/503 fluorescensintensiteten (182% vs. CTL, p < 0,001, figur 3C). Dessutom nästan tredubblades ytkvoten för LD (360 % jämfört med CTL, p < 0,0001, figur 3D) eftersom de uppvisade större diametrar (182 % jämfört med CTL, figur 3E) hos de HFD-utfodrade djuren. För att bedöma storleksfördelningen kategoriserades LD i tre grupper enligt diameterintervallen: 1 μm < d ≤ 3 μm, 3 μm < d ≤ 9 μm och d > 9 μm (figur 3F). Djuren som utfodrades med HFD visade en ökning med mer än 20% av antalet superstora, makrovesikulära hepatiska LD (d > 9 μm, p < 0,0001) tillsammans med en nästan trefaldig minskning av antalet mikrovesiklar mindre än 3 μm i diameter (1 μm < d ≤ 3 μm, p < 0,0001).
Figur 3: Ortogonala/3D-vyer av LD och dataanalys. (A) Representativa ortogonala projektioner och 3D-renderade bilder av leverlipiddroppar (grön, BODIPY 493/503) och kärnor (blå, DAPI) i levern hos möss som utfodrats med normal diet eller HFD-diet. Bilderna togs med 20x (vänster) och 40x (höger) förstoring med hjälp av ett laserpunktscanningskonfokalmikroskop. Skalstänger = 20 μm. (B) Antal LD i levern. (C) Fluorescensintensiteten hos de hepatiska LDs. (D) Areaförhållandet för hepatiska LDs. (E) Lipiddroppdiametrar. F) Bråkförhållanden mellan grupper av leverlipiddroppar med olika diametrar: 1 μm < d ≤ 3 μm, 3 μm < d ≤ 9 μm och d > 9 μm. Data presenteras som medelvärde ± SEM. n = 5-6 möss/grupp; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001. Statistisk analys utfördes med hjälp av en elevs oparade t-test. Förkortningar: CTL = kontrollgrupp; HFD = fettrik dietgrupp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta BODIPY 493/503 fluorescensbaserade protokoll för LD-bedömning syftade till att utveckla en ny avbildningsmetod för utvärdering av leversteatos. Med tanke på den starka korrelationen mellan fetma och fettleversjukdom användes den västerländska fettrika kosten för att upprätta en djurmodell av leversteatos26. En robust ökning av hepatiskt TG-innehåll bekräftades av ett kvantitativt triglyceridkolorimetriskt analyskit, vilket föreslog ett ökat leverlipidosscenario hos de HFD-matade djuren. Därefter visualiserades graden av LD-ackumulering av den fluorescerande sonden BODIPY 493/503 under låg förstoring. Som förväntat avslöjade BODIPY 493/503-färgningen en utbredd fördelning av vesikulära strukturer över levervävnaden i HFD-gruppen. Genom att använda ortogonala projektioner och 3D-rekonstruktioner var det möjligt att observera att LD-kärnan presenterade ett fullständigt innehåll av neutrala lipider, som uppträdde som nästan sfäriska droppar. Dessutom var den robusta ökningen av LD-arean per total yta tydligt (360% jämfört med CTL-gruppen), och detta område var sannolikt fyllt med neutrala TG med tanke på deras kvantitativa poäng i HFD-gruppen (52,83 mg / g ± 6,73 mg / g; 346% jämfört med CTL-gruppen). För att ytterligare karakterisera LD-dynamiken vid HFD-matning analyserades den mikro- eller makrovesikulära naturen hos leversteatos. Med hjälp av LD-diameterområdena som tidigare beskrivits i litteraturen 4,46,47 var det möjligt att urskilja en signifikant minskning av det mikrovesikulära LD-antalet (1 μm < d ≤ 3 μm), vilket var parallellt med en proportionell ökning av LD-makrovesiklar (d > 9 μm). Flera studier har rapporterat att LD i hepatocyter kan bilda överdimensionerade LD (upp till tiotals mikron i diameter)4,46,47, vilket är i linje med nuvarande resultat.
Under senare år har klassiska lipidfärgämnen gradvis ersatts med en ny uppsättning fluorescerande lipofila sonder, såsom BODIPY, med tanke på deras neutrala och plana struktur stabiliserad av ett difluorboronkomplex48; dessa sonder har visat sig vara mycket effektiva vid märkning av LD för att studera deras morfologi, dynamik och interaktion med andra organeller i levande celler och vissa fasta vävnader49,50. Inom det fluorescerande färgade lipiddroppprotokollet som presenteras här för bedömning av leversteatos finns det några kritiska steg för framgången med tekniken som mestadels förlitar sig på vävnadsberedning och bildförvärv. Eftersom BODIPY-signalen kan blekas med UV-ljus51 måste LD-bildtagning ske före avbildning av andra fluorescerande färgämnen som exciteras av UV-ljus, såsom de allmänt kända DNA-fluorescerande färgämnena. Dessutom rekommenderas det starkt att skydda mikroskopglasen från ljusexponering för att förhindra att BODIPY fluorescenssläckning före avbildning. Även om 3D-rekonstruktionen av LD är mycket användbar för studier av deras morfologi, är det extremt tidskrävande, eftersom 3D-rekonstruerade bilder består av flera oberoende 2D-bilder. Därför bör forskare överväga att undvika detta steg när experimentets primära mål enbart är bedömningen av mikro- och makrovesikulär leversteatos. För att undvika bias bör två oberoende observatörer blindade för behandlingsgruppen utföra datainsamling och analys. Den halvautomatiska bildbehandlingsprogramvaran (Cell Profiler-pipeline) bidrar ytterligare till en halvblind kvantifiering och övervinner den ökade bearbetningstiden som konsekvent observerats vid manuell analys.
Denna teknik kan utvidgas till bredare tillämpningar i kombination med immunhistokemisk färgning av andra vävnader och arter, så länge de optimala BODIPY-koncentrationerna och bildinsamlingsinställningarna har bestämts för att maximera signal-/bakgrundsförhållandet. Sådana experimentella miljöer kan möjliggöra samtidig detektion av andra antigener, förutsatt att den andra fluorofor som används inte överlappar BODIPY-spektra för excitation/emission.
Sammantaget är det optimerade BODIPY 493/503 fluorescensbaserade protokollet som presenteras här ett tillförlitligt och enkelt verktyg för LD-karakterisering och kan representera ett komplementärt tillvägagångssätt till de klassiska histologiska protokoll som ofta används för att bekräfta och gradera leverstatos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av nationella och europeiska fonder via den portugisiska vetenskaps- och teknikstiftelsen (FCT), Europeiska regionala utvecklingsfonden (FEDER) och Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) och POCI-01-0145-FEDER-007440. Författarna vill tacka stödet från iLAB - Microscopy and Bioimaging Lab, en anläggning vid medicinska fakulteten vid universitetet i Coimbra och medlem i den nationella infrastrukturen PPBI-portugisiska plattformen för bioavbildning (POCI-01-0145-FEDER-022122), samt stöd från FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set | Fisher Scientific | ||
| 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D3922 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR | D1306 | |
| 70% ethanol | Honeywell | 10191455 | |
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
| Automatic analyzer Hitachi 717 | Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany | 8177-30-0010 | |
| Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) | Daido Sangyo Co., Ltd, Japon | _ | |
| Blade | Leica | 221052145 | Used in the cryostat |
| Cell Profiler version 4.2.5 | https://cellprofiler.org/releases/ | Used to analyse the acquired images | |
| Coverslips | Menzel-Glaser, Germany | _ | |
| Cryomolds | Tissue-Tek | _ | |
| Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S | Leica Biosystems | _ | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D-8418 | Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Dry ice container (styrofoam cooler) | Novolab | A26742 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools, Germany | 11295-10 | |
| Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) |
Thermo Scientific | 150318 | Used to weigh the liver after dissection |
| Glycergel | DAKO Omnis | S303023 | |
| GraphPad Prism software, version 9.3.1 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA | ||
| High-fat diet | Envigo, Barcelona, Spain | MD.08811 | |
| Ketamine (Nimatek 100 mg/mL) | Dechra | 791/01/14DFVPT | Used at a final concentration of 75 mg/kg |
| Laser scanning confocal microscope (QUASAR detection unit; ) | Carl Zeiss, germany | LSM 710 Axio Observer Z1 microscope | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Dechra | 1838 ESP / 020/01/07RFVPT | Used at a final concentration of 1 mg/kg |
| Needle | BD microlance | 300635 | |
| No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade |
Swann-Morton | 205 | |
| Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) | Carl Zeiss, Germany | ||
| Paint brushes | Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections | |
| Peristaltic pump (Minipuls 3) | Gilson | 1004170 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | P3813 | |
| Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 | Swann-Morton | 0208 | |
| Slide staining system StainTray | Simport Scientific | M920 | |
| Standard diet | Mucedola | 4RF21 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Menzel-Glaser, Germany | J1800AMNZ | |
| Tissue-Tek OCT mounting media | VWR CHEMICALS | 361603E | |
| Triglycerides colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 10010303 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | TK 52 | |
| Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge |
Fine Science Tools, Germany | 15000-00 | |
| ZEN Black software | Zeiss |
References
- Klemm, R. W., Ikonen, E. The cell biology of lipid droplets: More than just a phase. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 1-3 (2020).
- Martin, S., Parton, R. G. Lipid droplets: A unified view of a dynamic organelle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 373-378 (2006).
- Thiele, C., Penno, A. Lipid droplets. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. , Academic Press. Cambridge, MA. 273-278 (2016).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: From basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Bickel, P. E., Tansey, J. T., Welte, M. A. PAT proteins, an ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid stores. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 419-440 (2009).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Wang, L., Liu, J., Miao, Z., Pan, Q., Cao, W. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Jackson, C. L.
- Onal, G., Kutlu, O., Gozuacik, D., Dokmeci Emre, S. Lipid droplets in health and disease. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 128 (2017).
- Wang, H., Quiroga, A. D., Lehner, R. Lipid Droplets. Methods in Cell Biology. Yang, H., Li, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 107-127 (2013).
- Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 24, Unit 24.2 (2007).
- Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).
- Roberts, M. A., Olzmann, J. A. Protein quality control and lipid droplet metabolism). Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 115-139 (2020).
- Filali-Mouncef, Y., et al. The ménage à trois of autophagy, lipid droplets and liver disease. Autophagy. 18 (1), 50-72 (2022).
- Bandyopadhyay, D., et al. Lipid droplets promote phase separation of Ago2 to accelerate Dicer1 loss and decelerate miRNA activity in lipid exposed hepatic cells. bioRxiv. , (2020).
- Farías, M. A., Diethelm-Varela, B., Navarro, A. J., Kalergis, A. M., González, P. A. Interplay between lipid metabolism, lipid droplets, and DNA virus infections. Cells. 11 (14), 2224 (2022).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: Lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
- Xu, S., Zhang, X., Liu, P. Lipid droplet proteins and metabolic diseases. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (5), 1968-1983 (2018).
- Herms, A., et al. Cell-to-cell heterogeneity in lipid droplets suggests a mechanism to reduce lipotoxicity. Current Biology. 23 (15), 1489-1496 (2013).
- Hooper, A. J., Adams, L. A., Burnett, J. R. Genetic determinants of hepatic steatosis in man. Journal of Lipid Research. 52 (4), 593-617 (2011).
- Parafati, M., Kirby, R. J., Khorasanizadeh, S., Rastinejad, F., Malany, S. A nonalcoholic fatty liver disease model in human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes, created by endoplasmic reticulum stress-induced steatosis. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2018).
- Nassir, F., Rector, R. S., Hammoud, G. M., Ibdah, J. A. Pathogenesis and prevention of hepatic steatosis. Gastroenterology & Hepatology. 11 (3), 167-175 (2015).
- Starekova, J., Reeder, S. B. Liver fat quantification: Where do we stand. Abdominal Radiology. 45 (11), 3386-3399 (2020).
- Fabbrini, E., Sullivan, S., Klein, S. Obesity and nonalcoholic fatty liver disease: Biochemical, metabolic, and clinical implications. Hepatology. 51 (2), 679-689 (2010).
- Kristiansen, M. N. B., Veidal, S. S., Christoffersen, C., Jelsing, J., Rigbolt, K. T. G. Molecular characterization of microvesicular and macrovesicular steatosis shows widespread differences in metabolic pathways. Lipids. 54 (1), 109-115 (2019).
- Tsutsumi, V., Nakamura, T., Ueno, T., Torimura, T., Aguirre-García, J. Chapter 2: Structure and ultrastructure of the normal and diseased liver. Liver Pathophysiology. Muriel, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 23-44 (2017).
- Tandra, S., et al. Presence and significance of microvesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 55 (3), 654-659 (2011).
- Nascimbeni, F., et al. Clinical relevance of liver histopathology and different histological classifications of NASH in adults. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 351-367 (2018).
- Yerian, L. Histopathological evaluation of fatty and alcoholic liver diseases. Journal of Digestive Diseases. 12 (1), 17-24 (2011).
- Stöppeler, S., et al. Gender and strain-specific differences in the development of steatosis in rats. Laboratory Animals. 47 (1), 43-52 (2013).
- Hübscher, S. G. Alcohol-induced liver disease. Practical Hepatic Pathology: A Diagnostic Approach (Second Edition). Saxena, R. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 371-390 (2018).
- Sethunath, D., et al. Automated assessment of steatosis in murine fatty liver. PLoS One. 13 (5), e0197242 (2018).
- Sinton, M. C., et al. Macrovesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease is a consequence of purine nucleotide cycle driven fumarate accumulation. bioRxiv. , (2020).
- de Conti, A., et al. Characterization of the variability in the extent of nonalcoholic fatty liver induced by a high-fat diet in the genetically diverse collaborative cross mouse model. The FASEB Journal. 34 (6), 7773-7785 (2020).
- Virarkar, M., Szklaruk, J., Jensen, C. T., Taggart, M. W., Bhosale, P.
- Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), e51092 (2012).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 42 (2015).
- Daemen, S., van Zandvoort, M. A. M. J., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2015).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), e77774 (2013).
- Nakano, T., et al. Ezetimibe impairs transcellular lipid trafficking and induces large lipid droplet formation in intestinal absorptive epithelial cells. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1865 (12), 158808 (2020).
- Adomshick, V., Pu, Y., Veiga-Lopez, A. Automated lipid droplet quantification system for phenotypic analysis of adipocytes using CellProfiler. Toxicology Mechanisms and Methods. 30 (5), 378-387 (2020).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Martinez-Lopez, N., Singh, R. Autophagy and lipid droplets in the liver. Annual Review of Nutrition. 35, 215-237 (2015).
- Collot, M., et al. Ultrabright and fluorogenic probes for multicolor imaging and tracking of lipid droplets in cells and tissues. Journal of the American Chemical Society. 140 (16), 5401-5411 (2018).
- Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-Lopez de Carrizosa, M. A. Fiber type and subcellular-specific analysis of lipid droplet content in skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: Jove. (184), e63718 (2022).
- Zhuang, H., et al. Long-term high-fat diet consumption by mice throughout adulthood induces neurobehavioral alterations and hippocampal neuronal remodeling accompanied by augmented microglial lipid accumulation. Brain, Behavior, and Immunity. 100, 155-171 (2022).
- Chen, J., Yue, F., Kuang, S. Labeling and analyzing lipid droplets in mouse muscle stem cells. STAR Protocols. 3 (4), 101849 (2022).
