Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Ex Vivo Imagem Multimodal Baseada em OCT de Olhos de Doadores Humanos para Pesquisa em Degeneração Macular Relacionada à Idade

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65240
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3,4, 5, *6, *1
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Alabama at Birmingham Heersink School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, University Hospital of Zurich, 3Vitreous Retina Macula Consultants of New York, 4Department of Ophthalmology, New York University Grossman School of Medicine, 5Advancing Sight Network, 6Department of Ophthalmology, University Hospital Bonn
* These authors contributed equally

Summary

Os ensaios laboratoriais podem alavancar o valor prognóstico da imagem multimodal baseada em tomografia de coerência óptica longitudinal (OCT) da degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Olhos de doadores humanos com e sem DMRI são fotografados usando OCT, oftalmoscopia a laser de varredura por reflectância no infravermelho próximo e autofluorescência em dois comprimentos de onda de excitação antes da secção do tecido.

Abstract

Uma sequência de progressão para degeneração macular relacionada à idade (DMRI) aprendida com imagens clínicas multimodais (MMI) baseadas em tomografia de coerência óptica (OCT) poderia adicionar valor prognóstico aos achados laboratoriais. Neste trabalho, OCT e IHM ex vivo foram aplicados em olhos de doadores humanos antes da secção do tecido da retina. Os olhos foram recuperados de doadores brancos não diabéticos com idade ≥80 anos, com tempo de morte até a preservação (DPP) de ≤6 h. Os globos foram recuperados no local, marcados com trefina de 18 mm para facilitar a remoção da córnea e imersos em paraformaldeído tamponada a 4%. As imagens de fundo de olho coloridas foram adquiridas após a remoção do segmento anterior com um telescópio dissecante e uma câmera SLR usando iluminação trans, epi e flash em três aumentos. Os globos foram colocados em um tampão dentro de uma câmara personalizada com uma lente de 60 dioptrias. Eles foram imageados com OCT de domínio espectral (cubo de mácula de 30°, espaçamento de 30 μm, média = 25), reflectância no infravermelho próximo, autofluorescência de 488 nm e autofluorescência de 787 nm. Os olhos com DMRI apresentavam alteração do epitélio pigmentado da retina (EPR), com depósitos drusenoides drusenoides (DDS) drusenóides (DRS) drusenos ou sub-retinianos, com ou sem neovascularização, e sem evidência de outras causas. Entre junho de 2016 e setembro de 2017, foram recuperados 94 olhos direitos e 90 esquerdos (DtoP: 3,9 ± 1,0 h). Dos 184 olhos, 40,2% tinham DMRI, incluindo DMRI intermediária precoce (22,8%), atrófica (7,6%) e neovascular (9,8%), e 39,7% tinham máculas normais. Drusen, SDDs, focos hiper-reflexivos, atrofia e cicatrizes fibrovasculares foram identificados usando OCT. Os artefatos incluíram opacificação tecidual, descolamentos (bacilar, retiniano, EPR, coroidal), alteração cística foveal, EPR ondulante e dano mecânico. Para guiar a criossecção, volumes de OCT foram usados para encontrar os pontos de referência da fóvea e da cabeça do nervo óptico e patologias específicas. Os volumes ex vivo foram registrados com os volumes in vivo , selecionando-se a função de referência para rastreamento ocular. A visibilidade ex vivo da patologia observada in vivo depende da qualidade da preservação. Dentro de 16 meses, 75 olhos de doadores rápidos DtoP em todos os estágios da DMRI foram recuperados e estadiados usando métodos clínicos de MMI.

Introduction

Quinze anos de manejo da degeneração macular relacionada à idade neovascular (DMRI) com terapia anti-VEGF sob a orientação da tomografia de coerência óptica (OCT) ofereceram novos insights sobre a sequência de progressão e a microarquitetura dessa causa prevalente de perda de visão. Um reconhecimento importante é que a DMRI é uma doença tridimensional que envolve a retina neurossensorial, o epitélio pigmentado da retina (EPR) e a coroide. Como resultado das imagens de OCT de pacientes do estudo e dos olhos de pacientes clínicos tratados, as características da patologia além daquelas vistas pela fotografia de fundo de olho colorido, um padrão clínico por décadas, são agora reconhecidas. Estes incluem neovascularização intrarretiniana (neovascularização macular tipo 31, anteriormente proliferação angiomatosa), depósitos drusenoides sub-retinianos (SDDs, também chamados pseudodrusen reticulares)2, múltiplas vias do destino do EPR3,4 e células de Müller intensamente glióticas em atrofia 5,6.

Sistemas modelo desprovidos de máculas (células e animais) recriam algumas fatias dessa complexa doença 7,8,9. Mais sucesso em melhorar a carga da DMRI poderia vir da descoberta e exploração da patologia primária em olhos humanos, entendendo a composição celular única da mácula, seguida de tradução para sistemas modelo. Este relatório retrata uma colaboração de três décadas entre um laboratório de pesquisa acadêmica e um banco de olhos. Os objetivos dos métodos de caracterização tecidual aqui descritos são dois: 1) informar a evolução da tecnologia diagnóstica, demonstrando a base da aparência do fundo de olho e fontes de sinal de imagem com microscopia, e 2) classificar espécimes de DMRI para técnicas de descoberta molecular direcionadas (imunohistoquímica) e não direcionadas (espectrometria de massa por imagem, IMS e transcriptômica espacial) que preservam a fóvea somente cônica e a para- e perifovea ricas em bastonetes. Tais estudos poderiam acelerar a tradução para OCT clínica, para a qual uma sequência de progressão e acompanhamento longitudinal são possíveis por meio do rastreamento ocular. Essa tecnologia, projetada para monitorar os efeitos do tratamento, registra exames de uma consulta clínica para outra usando vasos da retina. Associar a OCT rastreada pelos olhos aos resultados laboratoriais obtidos com técnicas destrutivas poderia fornecer um novo nível de valor prognóstico aos achados moleculares.

Em 1993, o laboratório de pesquisa capturou fotografias coloridas de fundo de olho post-mortem no filme10. Esse esforço foi inspirado na soberba fotomicroscopia e histologia da retina periférica humana de Foos e colaboradores11,12,13 e nas extensas correlações clínico-patológicas da DMRI de Sarks et al.14,15. A partir de 2009, a imagem multimodal (IHM) ex vivo ancorada na OCT de domínio espectral foi adotada. Essa transição foi inspirada pelos esforços semelhantes de outros 16,17 e, principalmente, pela constatação de que grande parte da ultraestrutura descrita pelos Sarks estava disponível em três dimensões, ao longo do tempo, na clínica 18,19. O objetivo era adquirir olhos com máculas aderidas em um prazo razoável para estudos bem fundamentados dos fenótipos em nível celular na retina, PSE e coroide. A intenção era ir além da estatística "por olho" para "por tipo de lesão", padrão influenciado pelos conceitos de "placa vulnerável" das doençascardiovasculares20,21.

O protocolo deste relato reflete a experiência com cerca de 400 pares de olhos doadores acessados em vários fluxos. Em 2011-2014, foi criado o site do Projeto MACULA de histopatologia da AMD, que inclui espessuras de camadas e anotações de 142 espécimes arquivados. Esses olhos foram preservados de 1996 a 2012 em fixador de glutaraldeído-paraformaldeído para histologia de alta resolução de resina epóxi e microscopia eletrônica. Todos os fundos de fundo foram fotografados coloridos quando recebidos e refotografados pela OCT imediatamente antes da histologia. Um suporte ocular originalmente projetado para estudos do nervo óptico22 foi usado para acomodar um punch de tecido de espessura total de 8 mm de diâmetro centrado na fóvea. OCT B-scans através do centro foveal e um local 2 mm superior, correspondente à histologia nos mesmos níveis, foram enviados para o site, além de uma fotografia de fundo de olho colorida. A escolha dos planos da OCT foi ditada pela proeminência da patologia da DMRI sob a fóvea23 e pela proeminência dos SDDs em áreas ricas em bastonetes superiores à fóvea24,25.

A partir de 2013, olhos com MMI ancorados em OCT durante a vida estavam disponíveis para correlações clinicopatológicas diretas. A maioria (7 de 10 doadores) envolveu pacientes em uma clínica de referência de retina (autor: K.B.F.), que oferecia um registro diretivo avançado para pacientes interessados em doar seus olhos após a morte para fins de pesquisa. Os olhos foram recuperados e preservados pelo banco de olhos local, transferidos para o laboratório e preparados da mesma forma que os olhos do Projeto MACULA. Os volumes clínicos de OCT pré-mortem foram lidos perfeitamente em laboratório, alinhando as características patológicas observadas durante a vida com as características vistas ao microscópio26.

A partir de 2014, a coleta prospectiva de olhos começou pela triagem para DMRI em olhos de doadores sem história clínica, mas preservados durante um limite de tempo definido (6 h). Para isso, o suporte para os olhos foi modificado para acomodar um globo inteiro. Isso reduziu a chance de descolamento ao redor das bordas de corte do punch de 8 mm usado anteriormente. Os olhos foram preservados em paraformaldeído tamponado a 4% para imunohistoquímica e transferidos para 1% no dia seguinte para armazenamento a longo prazo. Em 2016-2017 (pré-pandemia), foram recuperados 184 olhos de 90 doadores. As estatísticas e imagens deste relatório são geradas a partir desta série. Durante a era pandêmica (lockdowns e consequências de 2020), as coletas prospectivas para colaborações transcriptômicas e IMS continuaram em um ritmo reduzido, essencialmente usando os métodos de 2014.

Outros métodos para avaliação ocular do doador estão disponíveis. O Minnesota Grading System (MGS)27,28 é baseado no sistema clínico AREDS para fotografia de fundo de olhocolorido29. As limitações desse método incluem a combinação de DMRI atrófica e neovascular em um estágio de "DMRI tardia". Além disso, a MGS envolve a remoção da retina neurossensorial antes da fotodocumentação da coroide do EPR. Essa etapa desloca os DDS em graus variados30,31 e remove a correspondência espacial da retina externa e seu sistema de suporte. Assim, esforços para relacionar a demanda metabólica e a sinalização da retina à patologia na PSE-coróide podem ser impedidos. O Sistema Utah implementou a MMI usando fotografia colorida ex vivo e OCT para categorizar os olhos destinados à dissecção em regiões para extração de RNA e proteína32. Embora preferível às extrações inteiras da ocular, a área de 3 mm de diâmetro com maior risco de progressão da DMRI33,34 representa apenas 25% de um punch centrado na fóvea de 6 mm de diâmetro. Assim, técnicas que possam localizar achados referentes à fóvea, como cortes seriados para imuno-histoquímica, são vantajosas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

O comitê de revisão institucional da Universidade do Alabama em Birmingham aprovou os estudos laboratoriais, que aderiram às Boas Práticas de Laboratório e Nível de Biossegurança 2/2+. Todos os bancos de olhos dos EUA estão em conformidade com o Uniform Anatomical Gifts Act de 2006 e a Food and Drug Administration dos EUA. A maioria dos bancos de olhos dos EUA, incluindo a Advancing Sight Network, está em conformidade com os padrões médicos da Eye Bank Association of America.

A Tabela de Materiais lista os suprimentos e equipamentos. O Material Suplementar 1 fornece uma visão geral da dissecção, fotografia de fundo de olho colorido e IHM baseada em OCT. O Material Suplementar 2 fornece detalhes do MMI baseado nos OCT.

1. Critérios para coleta de tecidos

  1. Para maximizar o rendimento dos olhos de DMRI em uma triagem de doadores não documentados, defina os seguintes critérios para doadores aceitáveis: idade ≥80 anos, brancos, não diabéticos e ≤6 h de morte até a preservação (DtoP).
    NOTA: DtoP é definido como o tempo entre a morte e quando o olho é colocado em um conservante fornecido, seja no hospital ou no laboratório.

2. Meio de conservação e outras preparações (laboratório)

  1. Faça paraformaldeído tamponada com fosfato a 4% a partir de 20% do estoque (comprado). Preparar 1 L adicionando 200 ml de paraformaldeído a 20% (factor de diluição de 5) a 800 ml de tampão fosfato de Sorenson 0,1 M. Teste e ajuste para garantir que o pH é 7,2, se necessário. Conservar a 4 °C.
  2. Distribuir 30 mL de paraformaldeído tamponada com fosfato a 4% em frascos de 40 mL.
  3. Estoque rotulado 40 mL recipientes de conservante no banco de olhos para que o tecido possa ser recuperado a qualquer momento e em qualquer dia.
  4. Para o armazenamento dos olhos preservados, fazer paraformaldeído a 1% a partir da solução a 4%. Preparar 1 L adicionando 250 ml de paraformaldeído a 4% (factor de diluição de 4) a 750 ml de tampão fosfato de Sorenson 0,1 M. Teste e ajuste o pH se necessário. Conservar a 4 °C.
    1. Preparar 1 L de uma solução 0,1 M a partir da solução 0,2 M do tampão fosfato de Sorenson, pH 7,2, combinando 500 ml de água destilada e 500 ml de tampão Sorenson.
    2. Ajustar a queda de pH por gota usando 1 N de ácido clorídrico ou 1 N de hidróxido de sódio. Conservar a 4 °C.
  5. Crie um suporte para estabilizar os olhos durante a dissecção. Encha uma placa de Petri com cera dental aquecida até ficar líquido. Quando estiver ligeiramente frio, faça uma impressão hemisférica nele com um rolamento de esferas grande e, em seguida, congele o prato para facilitar a remoção do rolamento de esferas.

3. Métodos de banco de olhos

  1. Para garantir a rápida recuperação dos tecidos de pesquisa, recupere todos os tecidos rapidamente, incluindo aqueles destinados ao transplante.
  2. Receba encaminhamentos de óbito, conforme exigido por lei, dentro de 1 h após o óbito, e acompanhe cada doador com um número de sequência de referência que acompanhe o tecido.
  3. Para encontrar casos com potencial documentação clínica, faça perguntas específicas sobre DMRI e doenças oculares na entrevista de avaliação de risco de doadores de pesquisa.
  4. Para minimizar o tempo de viagem, recupere globos inteiros (diferente apenas de córneas para transplante) dentro de uma área compacta (ou seja, cidade e condado suburbano adjacente).
  5. Leve dois frascos de conservante (paraformaldeído tamponada a 4%) para o quarto do hospital do falecido para recuperação do tecido (em vez de esperar que o corpo seja transferido para um necrotério).
  6. Antes e durante a recuperação, comunique-se com os investigadores para confirmar a entrega e o prazo.
  7. Recuperar os globos oculares no local, abri-los por métodos de manuseio consistentes e imergir o olho aberto em conservante (Figura 1).
    1. Segure o olho do doador excisado no lugar usando uma bainha de gaze estabilizada por um hemostático.
    2. Para facilitar a remoção da córnea com uma borda de esclera de 2 mm de largura, use uma trefina de 18 mm de diâmetro para pontuar o globo ocular.
    3. Para liberar a córnea com uma borda de esclera acompanhante, corte ao longo do círculo marcado usando tesoura com mola com pontas curvas enquanto estabiliza o globo com a gaze cortada do hemostático.
    4. Levante a córnea da esclera, expondo a íris e o corpo ciliar.
    5. Para facilitar a penetração do conservante na câmara vítrea, faça uma fenda de 2 mm de comprimento na íris perpendicular à margem pupilar. Colocar os olhos em frascos de amostra com 30 mL de conservante a 4 °C e transferir para o laboratório em gelo úmido.
  8. Transmitir eletronicamente informações de doadores não identificados do banco de olhos para o banco de dados do laboratório de pesquisa.
    NOTA: O banco de dados mantém o número de referência, o número de tecido do banco de olhos e o número de identificação do laboratório para rastreamento, além de outras informações relevantes.

4. Preparação de tecidos para fotografia de fundo de olho colorido ex vivo

  1. Utilizar dois microscópios estéreo, um para dissecção e outro para fotografia de fundo de olho colorido.
    NOTA: Para que a transiluminação visualize alterações pigmentares, use uma base para microscopia de campo escuro.
  2. Remova os remanescentes do segmento anterior (íris e lente). Para estabilizar o olho durante a dissecção, coloque-o na placa de Petri preenchida com cera (Material Suplementar 1, lâminas 7-8). Para evitar que o corpo ciliar e a retina anexada colapsem na cavidade vítrea, minimize a perturbação do anel de vítreo espesso aderido ao corpo ciliar (base vítrea).
  3. Marque o polo superior para orientação. Coloque o globo anterior para baixo no prato. Encontre os tendões de inserção dos músculos reto superior e oblíquo superior. Usando um aplicador de madeira, aplique com moderação uma tinta de marcação em uma linha de 10 mm no sentido anterior para posterior (ou seja, perpendicular à inserção tendínea do músculo reto superior).
  4. Antes de fotografar, encha o fundo de olho com o tampão de fosfato de Sorensen frio.
  5. Insira um grânulo de rubi de 1 mm no fundo de olho como uma barra de escala interna a ser exibida em cada imagem27.
  6. Adquira imagens coloridas com uma câmera reflex de lente única montada em um microscópio estéreo equipado com um flash de anel. Use iluminação trans, epi e flash em cada uma das três ampliações padrão para capturar imagens destinadas a destacar áreas específicas (Material Suplementar 1, slide 11): 1) o fundo do ombro, 2) o polo posterior (arcadas vasculares, cabeça do nervo óptico, fóvea) e 3) a fóvea dentro da mácula lútea (mancha amarela).

5. Preparação para fotografia de fundo de olho colorido ex vivo

  1. Ligue a câmera e o monitor. Conecte o obturador remoto e solte o atuador no monitor de câmera/televisão (TV) de interface multimídia de alta definição (HDMI) e no cabo de exibição.
  2. Defina as configurações da câmera para a função ISO manual e a posição de travamento do espelho (travada no lugar para reduzir a vibração).
    NOTA: Consulte o manual do usuário do fabricante para obter as configurações na câmera usada. Aprenda com a exibição da câmera as configurações de sobre/subexposição relativas ao histograma e leituras de exposição.
  3. Dispor duas fontes de luz, cada uma com duas guias de luz flexíveis posicionadas perpendicularmente uma à outra, para iluminação nas quatro direções cardeais no estágio do microscópio (Material Suplementar 1, página 10).
  4. Ligue as fontes de luz de epi-iluminação até a potência máxima.
    NOTA: É útil, mas não é necessário ter uma cobertura de feltro preto ao redor do palco para limitar a dispersão de luz/flash para o fotógrafo.
  5. Ao microscópio dissecante, utilizar pinça para inserir o polo posterior em um cadinho de quartzo de 30 mL preenchido com tampão. Deixe o tecido afundar para o fundo. Insira uma bandagem, como uma esponja de tecido, entre o olho e a parede do cadinho para evitar o movimento. Introduzir o talão de rubi de 1 mm no polo posterior.
    NOTA: O talão pode cair no copo do nervo óptico.
  6. Coloque cuidadosamente o globo no cadinho no palco do estereomicroscópio e observe o fundo ocular interior através das oculares do microscópio. Usando a menor magnificação, orientar o olho identificando a marca de tecido na posição das 12 horas, a cabeça do nervo óptico (ONH) e a fóvea 5° abaixo da ONH. Gire o olho de modo que a fóvea caia abaixo de uma linha através da ONH em 5°.
    NOTA: Se for um olho direito, a ONH está à direita da fóvea, como visto através das oculares do microscópio. Se for um olho esquerdo, a ONH fica à esquerda da fóvea.
  7. Ligue a visualização remota do monitor a partir da câmera. Certifique-se de que o controle deslizante divisor de feixe do microscópio esteja configurado para observar através da porta da foto e não através da porta para os olhos. Dependendo do caminho da luz e do espelho, esteja preparado para girar o tecido 180° no palco para uma orientação adequada.

6. Aquisição de imagens utilizando fotografia de fundo de olho colorido ex vivo

  1. Com a epi-iluminação ligada, ajuste a ampliação para que toda a incisão trefina de 18 mm ocupe todo o campo de visão. Aumente a ampliação para que seja possível focar no fundo da fossa foveal. Reduza a ampliação para a configuração anterior.
  2. Ajuste as configurações ISO na faixa de 1.600-3.000 para que os tempos de exposição caiam na faixa central do medidor na câmera.
  3. Pressione o gatilho do obturador remoto. Ouça o espelho para travar na posição de cima. Pressione o gatilho novamente para exposição.
  4. Observe a imagem no monitor, com os metadados predefinidos mostrando vermelho, verde, azul (RGB) e um histograma colorido para a exposição correta. Se a exposição for aceitável, prossiga; Caso contrário, exclua, reavalie os parâmetros e crie novas imagens.
  5. Desligue as lâmpadas de pescoço de ganso para epi-iluminação para destacar drusen, e ligue o flash, com uma exposição de 1/4 s, uma velocidade do obturador da câmera de 1/250 s e um ISO de 100-320. Defina a velocidade do flash para o padrão ou modifique-a durante a configuração inicial da câmera. Adquira uma imagem e verifique o histograma para uma exposição adequada.
  6. Desligue o flash e ligue a fonte de luz de transiluminação. Redefina o ISO para acima de 5.000 e garanta que o tempo de exposição não fique abaixo de 1/30 s devido a possíveis vibrações no sistema fotográfico. Adquira uma imagem e verifique o histograma para uma exposição adequada.
  7. Aumente a ampliação para visualizar a ONH e a fóvea no campo de visão. Ligue as lâmpadas de epi-iluminação. Defina o intervalo ISO para 1.600-3.000. Certifique-se de que os tempos de exposição caiam na faixa central da câmera.
  8. Desligue as lâmpadas de epi-iluminação e ligue o flash, com uma exposição de 1/4 s, a velocidade predefinida do obturador da câmera definida como 1/250 s e o ISO definido como 400-800. Adquira uma imagem e verifique o histograma para uma exposição adequada.
  9. Desligue o flash e ligue a transiluminação usando a base de campo escuro. Redefina o ISO para acima de 5.000. Certifique-se de que o tempo de exposição não seja mais lento do que 1/30 s devido a vibrações potenciais no sistema fotográfico. Adquira uma imagem e verifique se há um histograma adequado.
  10. Desligue a transiluminação e ligue as lâmpadas de epi-iluminação novamente.
  11. Aumente a ampliação para a utilizada no passo 6.7. Reconcentre-se se necessário.
  12. Aumente o ISO dentro da faixa de 3.000-6.000 e ajuste o tempo de exposição para ficar dentro da faixa de exposição adequada da câmera. Adquira uma imagem.
    Observação : o grânulo rubi pode não aparecer mais no campo de exibição. Em caso afirmativo, capture imagens separadas do talão nesta ampliação para referência.
  13. Desligue as lâmpadas de epi-iluminação. Ligue o flash com uma exposição de 1/4 s e com a velocidade do obturador da câmera para 1/250 s. Defina a velocidade do flash para o padrão ou altere-a durante a configuração inicial da câmera e defina o ISO como 500-1.000. Adquira a imagem. Verifique o histograma para a exposição adequada.
  14. Desligue o flash e ligue as lâmpadas de transiluminação. Redefina o ISO para acima de 8.000 para permitir um tempo de exposição mais rápido com um sensor de imagem mais sensível. Certifique-se de que o tempo de exposição não fique abaixo de 1/30 s devido a vibrações potenciais no sistema fotográfico. Adquira uma imagem.
  15. Exporte as imagens da câmera para um computador. Revise as imagens antes de remover o espécime do estágio do microscópio caso algum precise ser capturado novamente.

7. Visão geral da aquisição de imagens para OCT ex vivo e oftalmoscopia a laser de varredura (SLO)

  1. Para OCT de domínio espectral, coloque os globos em tampão fosfato em um suporte de olho personalizado com uma câmara com uma lente de 60 dioptrias35. Monte o suporte ocular em um suporte em um dispositivo de imagem clínica da OCT e conecte-o ao local onde o paciente descansaria a testa. O dispositivo OCT insere automaticamente uma barra de escala em cada imagem.
  2. Ao mesmo tempo, usando o mesmo dispositivo e com o olho ainda no suporte, crie imagens dos globos com um oftalmoscópio a laser de varredura (SLO) usando reflectância no infravermelho próximo (NIR, usada como imagem localizadora pelo software de residência), autofluorescência de fundo de excitação de 488 nm (FAF) e reflectância livre de vermelho (RF).
    NOTA: O FAF de excitação de 787 nm neste dispositivo só é ocasionalmente adequado porque um divisor de feixe reduz a transmitância da luz para o SLO. Por esta razão, um segundo dispositivo para imagens FAF de 787 nm (ver próximo ponto) é usado.
  3. Separadamente, mas com o olho ainda no suporte ocular, imagine os globos com FAF de 787 nm para detectar distúrbio de EPR36 usando um dispositivo separado que exibe bem essa modalidade.

8. Protocolo de aquisição de imagens para OCT/SLO ex vivo (ver slides no Material Suplementar 2)

  1. Indicar o músculo reto superior com corante tecidual marcador. Ligue o laser (seta azul, Material Suplementar 2, página 1).
  2. Referindo-se à página 2 do Material Suplementar 2, posicione a cabeça do OCT movendo toda a unidade em dois eixos em relação à base (seta verde) e, em seguida, elevando a altura (y) girando o joystick no sentido horário/anti-horário (cw/ccw, setas azuis). Foque a imagem girando o botão (seta laranja), com a alavanca preta na posição R (*). Bloqueie a unidade prendendo o parafuso do polegar (seta roxa).
  3. Inserir o olho no suporte e estabilizar a partir da face posterior com espaçadores (Material Suplementar 1, página 13). Exerça o mínimo de pressão possível para evitar amassar a esclera. Orientar com a marcação tecidual para o músculo reto superior voltado para cima.
    NOTA: A distância aproximada da frente do suporte ocular ao dispositivo OCT é de 25 mm.
  4. Abra o software proprietário de visualização e análise para o dispositivo OCT. Uma lista de pacientes aparecerá na coluna da esquerda. Os doadores de olhos indexados por um número de código interno são os "pacientes". Consulte o manual do usuário do fabricante.
  5. Selecione o ícone Novo paciente . Preencha as informações de dados do paciente conforme necessário. Selecione OK. Use um sistema de numeração logicamente ordenado para olhos individuais, como YYYYNNNL,R_agesex. Por exemplo, isso pode ser 2017016R_97F.
  6. Depois de continuar a entrada de dados na janela a seguir, pressione OK. Selecione o operador e estude no menu suspenso.
    Observação : as informações inseridas aparecerão nos metadados exportáveis.
  7. Depois de visualizar uma tela em branco, toque no botão amarelo para iniciar a aquisição da imagem.
  8. Pressione IR + OCT (refletância no infravermelho próximo + OCT). Permitir que o laser adquira uma imagem SLO ao vivo do fundo de olho e OCT B-scan.
    1. Finalize a posição anatômica correta com base na ONH e na fóvea e use um aplicador de madeira para ajustar a posição dos olhos no suporte. No painel de controle, gire o botão redondo preto para ajustar a intensidade.
    2. Pressione o mesmo botão para uma média de 9-100 quadros (setas vermelhas; 9 é suficiente, 100 parece cremoso). Se a unidade estiver orientada corretamente, o fundo de olho deve estar em foco, e o OCT B-scan deve aparecer no terço superior do visor (Material Suplementar 2, página 9, seta vermelha dupla).
    3. Na imagem do fundo, use o cursor para mover a linha azul para centralizar a fóvea (Material Suplementar 2, página 9, seta branca). Pressione Adquirir.
      Observação : outros botões padrão são Retina, EDI (desativado) e verificação de linha.
  9. Pressione RF + OCT para a próxima aquisição. Verifique novamente a posição para garantir que a imagem não tenha sido movida ou degradada. Pressione o botão preto para obter a média. Pressione Adquirir.
  10. Alterne o cubo interno para obtenção de imagens de autofluorescência para os comprimentos de onda de excitação de 488 nm e 787 nm (Material Suplementar 2, página 10).
    Observação : A posição do cubo após a opção é mostrada.
  11. Selecione Modo de fluorescência automática . Verifique novamente o alinhamento. Pressione Adquirir.
  12. Para casos suspeitos de ruptura e atrofia do EPR, selecione ICGA (angiografia verde com indocianina ) para autofluorescência de 787 nm. Verifique novamente a posição dos olhos e pressione Adquirir.
    OBS: Uma imagem de fundo de olho muitas vezes não aparece nesta modalidade porque o cubo interno atenua o feixe.
  13. Alterne o cubo interno de volta para R para IR e imagens livres vermelhas para aquisição de volume.
    NOTA: A posição do cubo após o interruptor é mostrada na página 13 do Material Suplementar 2.
  14. Para adquirir os volumes da OCT, selecione IR e a configuração de volume. Corresponda a todas as configurações na página 14 do Material Suplementar 2 alternando os botões apropriados no módulo de controle (cubo de mácula de 30°, espaçamento de 30 μm, média dependendo dos requisitos experimentais).
  15. Observe que a visão do fundo de reflectância no infravermelho próximo é coberta por linhas azuis de varredura B. Verifique novamente a posição da OCT no terço superior da janela direita. Pressione Acquire no módulo de controle e aguarde 5 min até que a varredura de volume seja concluída. Quando a aquisição da imagem estiver concluída, selecione EXIT. As imagens serão salvas (seta vermelha).
    Observação : as linhas azuis delimitam as distâncias mostradas na exibição anterior em micrômetros. As varreduras começam a numeração de baixo (inferior) e prosseguem para cima. Observe a progressão da linha vermelha.
  16. Permitir que o computador processe as imagens adquiridas, que aparecerão na tela (Material Suplementar 2, página 16).
  17. Ao obter imagens dos olhos de um doador, não altere a posição do suporte de montagem entre os olhos. Se o olho esquerdo for fotografado primeiro, os resultados serão mostrados na coluna OD (olho direito). Clique com o botão direito do mouse para selecionar todas as imagens e, em seguida, selecione Exchange OS/OD. As imagens serão deslocadas para a coluna do sistema operacional.
  18. Pressione Select > janela > banco de dados. O padrão da tela é o painel 6 com a adição do olho doador fotografado na coluna da direita (Material Suplementar 2, página 18). Clique com o botão direito do mouse no paciente no menu suspenso, escolha Lote e exporte o arquivo E2E.
  19. Navegue até a pasta pré-determinada criada na área de trabalho para transferências de arquivos. Selecione OK. A pasta contém os arquivos E2E a serem copiados em um disco rígido externo e arquivados.
  20. Traga o olho em seu suporte para o oftalmoscópio a laser de varredura, que é usado principalmente para autofluorescência de 787 nm.
    NOTA: consulte o guia do usuário do fabricante para a aquisição e arquivamento das imagens.
  21. Ligue o computador e o laser.
  22. Selecione o ícone Novo paciente . Preencha os dados do paciente conforme necessário.
  23. Para manter a folha de dados do olho igual, pressione OK. Como a curva C permanece a mesma, pressione Continuar.
  24. Selecione Modo de estudo e digite a senha, se necessário. Mantenha a curva C em 7,7 mm. Pressione Ok.
  25. Selecione Continuar para verificar a curva C. Selecione o indicador amarelo para iniciar a câmera.
  26. Selecione a posição R . Alinhar e orientar o globo. Selecione o modo IR para focar e orientar como acima.
  27. Orientar a cabeça da câmera movendo toda a unidade em dois eixos em relação à base (Material Suplementar 2, página 28, seta verde) e, em seguida, elevando a altura (y) da unidade (setas azuis). Focalize a imagem girando o botão (seta laranja). A alavanca preta está na posição R (*). Depois que essa cabeça estiver na posição, bloqueie a unidade girando o parafuso do polegar (seta roxa).
  28. Observe que a tela aparece como mostrado na página 29 do Material Suplementar 2.
  29. Mova o botão seletor de R para A. Selecione ICGA (para alcançar autofluorescência de 787 nm) em azul, 100% de intensidade, um campo de visão de 30° e imagem monofásica.
    NOTA: Como o corante verde indocianina , a melanina é excitada pela luz de comprimento de onda de 787 nm.
  30. Observe que a tela aparece como mostrado na página 31 do Material Suplementar 2. Pressione o disco preto para obter a média e selecione Adquirir.
  31. Escolha Janela > Banco de Dados. Selecione Importar arquivos E2E do dispositivo SLO; Esses arquivos são armazenados em um disco rígido externo e carregados na área de trabalho.
  32. Selecione Abrir. Verifique se as marcas são o padrão e selecione OK.
  33. Note-se que o paciente passa a contar com duas abas: uma mostrando as imagens adquiridas do SLO (seta azul) e outra mostrando as imagens adquiridas do aparelho OCT (seta vermelha) (Material Suplementar 2, página 34).
  34. Clique com o botão direito do mouse na imagem de 786 nm (ICGA) e exporte a imagem para um arquivo rotulado SLO 786 na área de trabalho.
  35. Para salvar a imagem SLO de autofluorescência de 786 nm, selecione o paciente e clique com o botão direito do mouse para exportar imagens como arquivos RAW (para arquivos .vol) para uma pasta na área de trabalho.
  36. Para exportar imagens do dispositivo OCT para transferência para o computador de arquivamento, copie/cole de RAWEXPORT para uma pasta rotulada RAW.

9. Revisão por imagem

  1. Montar as imagens (coloridas, arquivo .vol, imagens SLO) em pastas para cada doador com subpastas para cada olho, e indexar as pastas consecutivamente por ID de laboratório.
  2. Registre as impressões teciduais (qualidade, patologia) em um banco de dados para um relatório padronizado.
  3. Revise os volumes da OCT exportados com um plug-in interno do ImageJ.
    1. Encontre o centro da fóvea, que pode ser reconhecido pelo centro do mergulho foveal, pela elevação interna das bandas retinianas externas ou pelo ponto mais fino. Na maioria dos casos, eles coincidem, mas nem sempre, pois isso depende da preservação foveal, da variabilidade individual e da presença de patologia.
    2. Encontre uma varredura padrão na perifovea superior (2 mm/67 B-scans de distância na direção superior; ou seja, aumentando o número de varreduras).
    3. Salve uma pilha de .tif de todo o volume para referência rápida no futuro.
    4. Percorra o volume da OCT na íntegra, a partir da varredura 1 (inferior), enquanto registra os números de varredura nos quais os recursos são reconhecidos.
    5. Verifique a área peripapilar, além da mácula.
      NOTA: A atrofia coriorretiniana peripapilar em olhos mais velhos inclui um depósito laminar basal distinto e neovascularização. Esta é uma área comum de alteração pigmentar em olhos míopes e glaucoma, bem como no envelhecimento e DMRI37.
  4. Inspecione as fotografias coloridas e vincule quaisquer descobertas às vistas pela OCT, se possível.
    NOTA: Em geral, é mais fácil ver a maioria das descobertas da OCT primeiro. Fotografias coloridas fornecem uma visão ampla da área fora da área no SLO, pigmentação coroidal, incluindo nevos, presença de heme e exsudatos duros, e pigmento preto na DMRI neovascular. O pigmento escuro na fóvea pode representar melanossomas frouxos do segmento anterior e deve ser lavado suavemente com tampão usando uma pipeta.
  5. Inspecione as imagens do SLO e vincule quaisquer descobertas às vistas pela OCT, se possível.
  6. Salve varreduras B padrão na fóvea e perifovea, varreduras B extras com patologia notável ou outras características e imagens SLO em um relatório de patologia.
  7. Categorize os olhos da seguinte forma: Normal, Questionável, DMRI Intermediário Precoce, DMRI Atrófica, DMRI Neovascular, Outra, Desconhecida, Não Graduável, Não Registrada. "Questionável" é usado se não estiver claro se as alterações são graves o suficiente para outra categorização. "Não graduável" é reservado para olhos sem exames úteis de OCT, como aqueles com retinas severamente descoladas. "Não gravado" é reservado para olhos que são processados imediatamente após o recebimento sem fotografia.
  8. Use estes critérios para DMRI: alteração grave do EPR com depósitos drusenoides drusenoides ou sub-retinianos, com ou sem sinais de neovascularização, como líquido ou fibrose, e sem evidência de outras causas (atualizado de Curcio et al.10 para acomodar SDDs).
    NOTA: O diagnóstico final é confirmado por análise histológica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A Tabela 1 mostra que, durante 2016-2017, foram recuperados 184 olhos de 94 doadores brancos não diabéticos >80 anos de idade. O tempo médio de morte até a preservação foi de 3,9 h (variação: 2,0-6,4 h). Dos 184 olhos revisados, 75 (40,2%) apresentavam DMRI alguma. Foram identificadas as seguintes categorias: Pouco notável (39,7%), Questionável (11,4%), DMRI Intermediário Precoce (22,8%), Atrófica (7,6%), Neovascular (9,8%), Outros (8,7%) e Ignorado/Não Registrado/Não Graduável (<1%). A Figura 2, a Figura 3, a Figura 4 e a Figura 5 mostram imagens ex vivo multidimensionais e multimodais de olhos excepcionalmente bem preservados desta série. Os olhos foram revisados em colaboração com um oftalmologista especializado em doenças da retina (J.A.K.). Enquanto alguns olhos mostraram características individuais melhores do que outros, esses casos foram escolhidos para alta qualidade geral.

Como descrito38, a fotografia colorida ex vivo difere da fotografia in vivo correspondente. O edema e/ou descolamento da retina pode reduzir a visibilidade dos tecidos pigmentados posteriores. Observações em olhos frescos indicam que essas alterações ocorrem post-mortem e não pioram acentuadamente com a fixação imediata. Além disso, os vasos coroidais se esvaziam após a morte. Devido a um fundo ondulado de vasos pálidos e tecido intersticial escuro, a avaliação das variações pigmentares no plano do EPR deve ser auxiliada por outras modalidades que não a cor. Na OCT ex vivo , há mais informações disponíveis do que na fotografia colorida. Ex vivo A OCT também difere significativamente da OCT in vivo . As principais diferenças incluem o aumento geral da refletividade do tecido, especialmente na retina interna, a refletividade consistente de algumas bandas (camada de fibras nervosas, camada plexiforme interna e externa, PSE), a menor visibilidade dos detalhes da coroide, especialmente sob a retina edematosa, e a visibilidade dos descolamentos da camada de tecido (veja abaixo). As bandas hiperrreflexivas externas da retina, envolvendo fotorreceptores e o EPR (zona elipsoide, EZ; zona de interdigitação, IZ), são inconsistentemente visíveis ex vivo e não são utilizadas como pontos de referência nesse contexto. O consenso clínico para OCT de domínio espectral usa o termo banda de membrana de PSE-Bruch (BrM). Entretanto, o termo PSE-banda lâmina basal (LB)-BrM é preferido por acomodar o aparecimento de depósitos laminares basais naDMRI24.

A Figura 2 mostra mácula normal e grandes vasos coroidais hiporreflexivos, com banda reflexiva de EPR-BL-BrM entre os dois. Um grande vaso na retina interna projeta uma sombra nas camadas posteriores. O IPL e o OPL são moderadamente reflexivos. No NIR SLO, tanto a vasculatura retiniana quanto a coroidal são visíveis. O SLO de reflectância livre de vermelho funciona melhor para características da retina interna e interfaces vitreorretinianas, como as fibras arqueadas e o feixe papilomacular do NFL. Em olhos normais, a SLO de autofluorescência de 488 nm mostra uma área de sinal globalmente reduzido na mácula central devido à parafovea espessada e, em alguns casos, absorção pelo pigmento amarelo da xantofila, bem como hiperautofluorescência que reveste os grandes vasos da retina, o que é sugestivo de bainhas de tecido conjuntivo. A autofluorescência a 787 nm mostra uma pequena região de aumento de sinal na mácula central do PSE, um sinal no estroma de coroide e faixas hipoautofluorescentes correspondentes aos vasos coroidais.

A Figura 3 mostra uma mácula com DMRI intermediária precoce. As características visíveis incluem uma drusa macia (elevação do EPR em forma de cúpula perto da fóvea), SDDs (refletividade intermitente com aparência dentada interna à banda PSE-BL-BrM), focos hiper-reflexivos (HRF, material reflexivo com a mesma refletividade do EPR na camada, localizado na retina) e alteração vitelliforme (uma expansão interna das organelas do EPR, tanto intracelular quanto extracelular, em conjunto com depósitos laminares basais39). A fotografia colorida mostra forte pigmentação correspondente à lesão vitelliforme, circundada por pigmentação reduzida. Nem o drusen nem os SDDs são claramente visíveis por cor. A reflectância NIR mostra a refletividade na fóvea. A autofluorescência na excitação de 488 nm mostra um sinal manchado na fóvea. Os DDS aparecem ocasionalmente nas modalidades SLO; isso é mais provável se os DDS forem abundantes, e os DDS forem mais facilmente vistos como um padrão pontual regularmente espaçado (ver Spaide e Curcio19, Figura 6). O padrão superior e temporal à fóvea na Figura 3I não é SDD, pois é irregular e localizado em um plano focal superficial. Todas as modalidades en face mostram dobras finas irradiando da fóvea. Em olhos menos bem preservados, dobras semelhantes podem ser grandes o suficiente para serem visíveis nas ampliações de visualização mais baixas.

A Figura 4 mostra uma mácula com DMRI atrófica. A fotografia de fundo de olho colorido mostra áreas atróficas circulares, hiperpigmentação central e pequenos pontos hiperpigmentados na parafóvea que correspondem na OCT à FCR ao nível da camada de fibras de Henle-camada nuclear externa (HFL-ONL). Além disso, na OCT, uma baixa elevação plana do EPR pode representar um depósito laminar basal, neovascularização tipo 1 não exsudativa ou ambas. A atrofia no exame de foca B é reconhecível pela subsidência da LPL-ONL, uma área de hipertransmissão (luz que brilha através da coroide), uma alteração viteliforme com aumento do sombreamento no centro foveal e FCR que projeta sombras. Neste olho, a reflectância NIR mostra manchas hiper-reflexivas na fóvea. A autofluorescência na excitação de 787 nm mostra efetivamente um sinal correspondente à hiperpigmentação foveal e à ausência de um sinal nas áreas atróficas circulares. A autofluorescência red-free e 488 nm mostra as características internas da retina.

A Figura 5 mostra mácula com atrofia macular secundária à DMRI neovascular. A fotografia de fundo de olho colorido mostra pigmentação preta dentro da área atrófica. A OCT mostra atrofia pela flacidez (subsidência) da HFL-ONL e aumento da hipertransmissão. A cintilografia foveal em B mostra um monte de material hiperreflexivo subfoveal e cistos intrarretinianos. A reflectância no infravermelho próximo mostra refletividade na área atrófica devido à perda de EPR e vasos coroidais. Uma área pequena e intensamente reflexiva na fóvea não é visível na cor. A reflectância livre de vermelho mostra vasos da retina e, dentro de uma zona anular, vasos coroidais. A autofluorescência (488 nm) mostra claramente uma borda atrófica aproximadamente circular e ilhas de atrofia incipiente. Uma área central desprovida de sinal é circundada por um anel de sinal moderado e vasos coroidais visíveis.

A Figura 6 mostra artefatos comuns em imagens ex vivo da OCT. O edema pode ser proeminente na retina interna, criando abaulamentos e pregas através da fóvea (Figura 6A,I). O dano mecânico pode ocorrer com tração no vítreo ou pelo contato direto da retina com as ferramentas dissecadoras, o que resulta no deslocamento do material e, às vezes, na perda desse material (Figura 6F,G). Descolamentos podem ocorrer ao longo de múltiplos planos teciduais e podem representar forças de tração relativas entre as camadas que também ocorrem in vivo. Qualquer descolamento pode se ampliar ainda mais após o processamento subsequente. O descolamento mais comum é o retiniano (isto é, entre os segmentos externos dos fotorreceptores e os processos apicais do EPR) (Figura 6B-D,F-I). Os processos apicais podem se desprender dos segmentos externos ou permanecer com os corpos celulares do EPR, conforme determinado pela histologia. Os descolamentos de retina podem ser grandes e volumosos (Figura 6 B,D,I) ou estreitos e pouco perceptíveis (Figura 6C,F,G). O descolamento da camada bacilar (BALAD40) foi visto primeiramente em laboratório e depois encontrado na OCT clínica. BALAD não deve ser confundido com SDD in ex vivo OCT. Um terceiro plano de descolamento é a membrana limitante interna (ILM), e frequentemente há líquido refletivo residual entre a ILM e as camadas remanescentes da retina (Figura 6A,B,I). O descolamento menos comum é entre a coroide e a esclera (Figura 6C). A fóvea frequentemente exibe espaços cistoides que não devem ser considerados patológicos sem evidências comprobatórias, como sinais de neovascularização (Figura 6H). Em varreduras B únicas, ondulações do EPR podem dar a impressão de drusen. A visão 3D de um volume de OCT esclarece que estes viajam ao longo dos vasos coroidais (Figura 6E,J). As ondulações podem ser devidas a alterações de volume diferencial entre os vasos e estroma interveniente após a morte e durante a fixação.

Para calibrar as expectativas de qualidade e explorar as limitações da OCT ex vivo, a Figura 7 compara os exames de imagem in vivo, ex vivo e histologia de três olhos clinicamente documentados com DMRI. Esses três olhos foram preservados de forma diferente da Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5. Para confirmar as fontes estruturais de refletividade da OCT, que sãosubcelulares41, os olhos da Figura 7 foram preservados em glutaraldeído a 2,5% e glutaraldeído a 1% para permitir histologia de resina epóxi de alta resolução e microscopia eletrônica correlativa. O glutaraldeído acrescenta opacidade a esses espécimes em relação aos da Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5. O efeito de uma DtoP mais curta versus mais longa é aparente (Figura 7A-F, 2,1 h vs. Figura 7G-I, 8,9 h). No olho com DtoP mais longa, o edema post-mortem alterou o contorno da retina e a ILM foi descolada. A patologia de interesse (tubulação externa da retina) foi sutil nos exames de imagem ex vivo. Ela foi encontrada porque o OCT in vivo rastreado pelo olho identificou o B-scan relevante, e os vasos coroidais puderam ser combinados. Nos dois olhos com DtoP mais curta, algumas patologias importantes (neovascularização macular tipo 3) foram imediatamente aparentes (Figura 7A-C). Outros foram encontrados com auxílio de rastreamento ocular (Figura 7D-F).

Figure 1
Figura 1: Excisão da córnea de olho de doador humano para fixação por imersão da retina. No canto superior esquerdo, o olho doador excisado é mantido no lugar por uma bainha de gaze estabilizada por um hemostático; no canto superior direito, uma trefina de 18 mm é usada para fazer uma pontuação circular incluindo a córnea e uma borda de esclera de 2 mm de largura; no meio, o círculo marcado é finalizado por um corte com tesoura curva com ponta de mola, enquanto o globo é estabilizado; no canto inferior esquerdo, a córnea e a borda escleral são levantadas, expondo a íris (azul) e o corpo ciliar (castanho-castanho); no meio inferior, a córnea com a borda é levantada completamente; No canto inferior direito, a íris é cortada perpendicularmente à margem pupilar para facilitar a penetração do conservante na câmara vítrea. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagem ex vivo multimodal de mácula normal. Mácula de uma doadora de 82 anos com intervalo morte-preservação de 1,97 h. (A) O fundo do olho direito visualizado com o segmento anterior removido (epi-iluminação). (B) Close-up da mácula (epi-iluminação). (C) Vista de perto da fóvea (epi-iluminação). As linhas verdes indicam os locais das varreduras B da OCT nos painéis D e E. (D,E) OCT B-scans através da (D) perifovea superior (E) e fóvea. A retina (R), a coroide (C) com grandes vasos hiporreflexivos e a banda interveniente hiperreflexiva RPE-BL-BrM são visíveis. Neste olho excepcionalmente bem preservado, a IPL moderadamente reflexiva e a OPL também são visíveis. (D) Um grande vaso na retina interna projeta uma sombra nas camadas posteriores. (E) A separação entre a retina e a PSE no painel E (ponta de seta amarela) é artifactual. (F) A reflectância no infravermelho próximo mostra o detalhe das vasculaturas da retina e da coroide. (G) A reflectância livre de vermelho mostra as fibras arqueadas (seta verde curva esquerda) e o feixe papilomacular (seta verde) da camada de fibras nervosas. (H) A autofluorescência do comprimento de onda de 488 nm mostra uma área de sinal global reduzido na mácula central devido a uma parafovea edematosa espessada, bem como anéis e um ponto de baixo sinal no centro foveal e hiperautofluorescência que reveste os grandes vasos da retina, o que é sugestivo de bainhas de tecido conjuntivo. (I) A autofluorescência a 787 nm mostra uma pequena região de aumento de sinal na mácula central do PSE, um sinal no estroma de coroide e faixas hipoautofluorescentes correspondentes a vasos coroidais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Gráfico 3. Imagem ex vivo multimodal de um olho doador com DMRI intermediária precoce. Olho de doador de uma doadora de 97 anos com intervalo morte-preservação de 3,1 h. (A) O fundo do olho direito visualizado com o segmento anterior removido (epi-iluminação). (B) Close-up da mácula (epi-iluminação). As linhas verdes indicam os locais das varreduras B da OCT nos painéis D, E e F. (C) Vista de perto da fóvea mostrando hiperpigmentação (seta, iluminação do flash). (D) Um SDD na perifovea superior (setas alaranjadas) é visto na OCT. I Alteração vitelliforme na PSE sob a fóvea (setas brancas). (F) Inferior à fóvea encontra-se uma drusa macia com uma linha hiporreflexiva na base (seta amarela) e um foco hiper-reflexivo acima (seta azul clara). (G-I) As imagens do oftalmoscópio a laser de varredura mostram pregas estreladas muito finas na fóvea (também vistas em C). (G) A reflectância no infravermelho próximo mostra material de reflectividade na fóvea correspondendo em parte a material vitelliforme. (H) A reflectância livre de vermelho mostra a superfície retiniana. (I) A autofluorescência do comprimento de onda de 488 nm mostra uma área de sinal global reduzido na mácula central devido a uma parafovea ligeiramente espessada. Os SDDs não são claramente visíveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Imagem ex vivo multimodal de um EPR completo e atrofia retiniana na degeneração macular relacionada à idade. Olho doador de uma mulher de 97 anos com intervalo morte-preservação de 2,33 h. (A) Fundo de olho esquerdo visualizado com transiluminação. (B) Close-up da mácula (epi-iluminação). As linhas verdes indicam os locais das varreduras B da OCT nos painéis D e E. (C) Close-up da fóvea (epi-iluminação) mostrando hiperpigmentação central (cabeça de seta verde) e pequenos pontos hiperpigmentados (cabeças de seta amarelas). O ponto central é marrom intenso porque a retina sobrejacente é muito fina. Os pontos parecem dessaturados porque a retina sobrejacente é espessa. Áreas atróficas circulares são indicadas (pontas de setas brancas). (D,E) OCT B-scans através da (D) perifovea (E) e fóvea. A retina (R) e a coroide fina (C) são visíveis. (D) Focos hiper-reflexivos (pontas de setas amarelas) ao nível da HFL-ONL correspondem aos pontos hiperpigmentados em C. A baixa elevação plana do EPR sob eles pode representar um depósito laminar basal, neovascularização tipo 1 não exsudativa ou ambos. (E) O exame em B através da fóvea mostra atrofia reconhecível pela subsidência da HFL-ONL (cabeça de seta vermelha), uma área de hipertransmissão, uma alteração vitelliforme com aumento do sombreamento no centro do foveal (asterisco verde) e focos hiper-reflexivos (cabeça de seta azulada) com sombra. O espaço hiporreflexivo entre a retina e a banda de EPR pode representar líquido sub-retiniano. (F) A reflectância no infravermelho próximo mostra pontos hiper-reflexivos na fóvea. (G) A imagem livre de vermelho mostra as fibras arqueadas do NFL e florações reflexivas na superfície da retina. (H) A autofluorescência de 488 nm focalizada na retina mostra sinal associado aos vasos da retina, ausência de sinal associado à PSE e pontos autofluorescentes fracos na área macular central. (I) A autofluorescência de 787 nm mostra um sinal correspondente à pigmentação em C. Áreas atróficas circulares são aparentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Imagem multimodal ex vivo da neovascularização tipo 1 e atrofia macular na degeneração macular relacionada à idade. Olho de doador de uma doadora de 86 anos com intervalo morte-preservação de 3,5 h. (A) O fundo do olho esquerdo visualizado com o segmento anterior removido (transiluminação). (B) Close-up da mácula detalhando bordas atróficas (pontas de setas amarelas). As linhas verdes indicam os locais das varreduras B da OCT nos painéis D e E. (C) O close-up da fóvea mostra pigmentação preta (pontas de setas verdes) dentro da área atrófica. (D,E) OCT B-Scans através da (D) perifovea (E) e fóvea. A retina I e a coroide fina (C) são visíveis. Neste olho excepcionalmente bem preservado, a IPL moderadamente reflexiva e a OPL também são visíveis. (D) A varredura B perifoveal pasta a borda superior da área atrófica. A atrofia é evidenciada pela flacidez da FL-ONL e aumento da hipertransmissão (cabeças de setas vermelhas). Possíveis depósitos drusenoides sub-retinianos são indicados (cabeças de seta fúcsia). (E) O exame foveal em B mostra um monte de material hiper-reflexivo subfoveal e cistos intrarretinianos (asterisco). O = cabeça do nervo óptico. (F) A reflectância no infravermelho próximo mostra uma área reflexiva de atrofia e vasos coroidais (pontas de setas mareadas), incluindo uma pequena área intensa na mácula central (cabeça de seta laranja) não visível por imagem colorida. (G) A reflectância livre em vermelho mostra vasos da retina e, dentro de uma zona anular, vasos coroidais. (H) A autofluorescência de 488 nm mostra uma borda atrófica aproximadamente circular (pontas de setas amarelas) e ilhas de atrofia incipiente. Uma área central desprovida de autofluorescência é circundada por um anel de autofluorescência moderada e vasos coroidais visíveis (cabeças de setas brancas). A autofluorescência de 787 nm não foi possível neste olho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Artefatos comuns observados na OCT ex vivo de olhos de doadores. Esses olhos vêm da série de olhos 2016-2017. A maioria das retinas é hiper-reflexiva em relação às retinas visualizadas in vivo, e as camadas internas da retina são mais reflexivas do que as camadas retinianas externas. O descolamento bacilar (pontas de setas amarelas nos painéis A, D, G e I) é definido como uma divisão ao nível do mioide do segmento interno do fotorreceptor, que cria uma cavidade intrarretiniana distinta40. O descolamento de retina (pontas de seta verdes nos painéis B, C, D, F, G e I) descreve uma separação de toda a retina neurossensorial do EPR subjacente42. Descolamentos da membrana limitante interna (ILM) separam a ILM e a camada de fibras nervosas (pontas de seta vermelhas nos painéis A, B e I). Um descolamento de coroide (cabeça de seta azul no painel C) é uma separação dentro da coroide ou entre a coroide e a esclera. Danos mecânicos (seta roxa nos painéis F e G) podem aparecer em qualquer nível e com quaisquer dimensões, como se aplica ao material ausente (seta verde no painel G) e material deslocado (seta amarela no painel G). O edema retiniano (estrelas roxas nos painéis A e I) aparece como um espessamento do tecido retiniano com limites mal definidos entre as camadas retinianas separadas. Um RPE ondulado (setas azuis nos painéis E e J) aparece como uma camada de RPE ondulada e irregular. As lesões cistoides (quadrado vermelho no painel H) correlacionam-se com alterações semelhantes a câmaras hiporreflexas no tecido da retina, comumente na fóvea. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Visibilidade ex vivo da patologia observada in vivo dependente da qualidade de preservação. (Um-Eu) Painéis Um, Be CPainéis D, Ee Fe painéis G, He Eu representam três olhos clinicamente documentados de dois doadores, cada um visto por rastreamento ocular in vivo (Um1-Um2,D1-D2,G1-G2) e ex vivo (B1-B2,E1-E2,H1-H2), seguida de histologia (C,F,Eu). As linhas verdes na reflectância do infravermelho próximo (NIR, Um1,B1,D1,E1,G1,H1) representam os níveis de tomografia de coerência óptica (OCT), tomografia de coerência óptica (OCT), varredura B e histologia panorâmica. Painéis Um, Be C e painéis D, Ee F, apresentam os olhos direito e esquerdo, respectivamente, de uma doadora na faixa dos 90 anos. Painéis G, He Eu mostrar o olho direito de uma segunda doadora, também na faixa dos 90 anos.Um-C) O tecido ocular bem preservado (DtoP: 2,1 h) permite boa visibilidade da patologia principal. (Um) Uma neovascularização macular intrarretiniana hiperreflexiva (NVM tipo 3, cabeça de seta verde) é circundada por líquido intrarretiniano 17 meses antes do óbito (Um2). O complexo de membrana PSE/Bruch é dividido por material hiporreflexivo e aparece como sinal de "dupla camada" (Um2). À esquerda há outro sinal de camada dupla com hipertransmissão de código de barras para a coroide (ponta de seta laranja). Em ex vivo PTU (B2), o MNV do tipo 3 e a hipertransmissão do código de barras são claramente visíveis e delineados. A retina é artifactualmente descolada, como mostra a ponta de seta branca. A histologia panorâmica mostra lesão de MNV tipo 3 orientada verticalmente (cabeça de seta verde, C1). Veja pesquisas anteriores43,44 para detalhes do caso original. (D-F) O tecido ocular bem preservado (DtoP: 2,1 h) pode resultar em transparência reduzida, mas ainda suficiente para detectar patologia maior. Os PTU (D2) mostra uma pilha de focos hiper-reflexivos intrarretinianos (FCR, cabeça de seta fúcsia) em um olho seguido para MNV exsudativa tipo 3. Nenhum cisto intrarretiniano é visível 11 meses antes da morte. Em ex vivo PTU (E2), a pilha de FCR é comprimida verticalmente (ponta de seta fúcsia), mas claramente delineada. Na histologia panorâmica (F1), uma torre de epitélio pigmentado da retina (cabeça de seta fúcsia) sobe para cima de uma drusa macia. (G-Eu) Tecido ocular menos bem preservado (DtoP: 8,9 h) resulta em redução da visibilidade da patologia principal. A OCT indica uma tubulação retiniana externa (TRO, cabeça de seta amarela) 48 meses antes do óbito (G2). Sobre o ex vivo OCT, a ORT aparece como um distúrbio sutil, e isso teria sido difícil de discernir sem conhecimento prévio (H2). A membrana limitante interna é destacada artifactualmente (cabeça de seta branca). O edema distorceu o contorno da retina. A análise histológica mostra o lúmen da ORT delimitado pela membrana limitante externa e os fotorreceptores projetando-se nela (Eu1). Veja pesquisas anteriores26,45 para detalhes do caso original. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Números Percentagens
Categoria diagnóstica Olhos Direitos: Olhos Esquerdos Total Olhos Direitos: Olhos Esquerdos Total
Normal 39 34 73 41.50% 37.80% 39.70%
AMD questionável 10 11 21 10.60% 12.20% 11.40%
Início da AMD 20 22 42 21.30% 24.40% 22.80%
DMRI atrófica 6 8 14 6.40% 8.90% 7.60%
DMRI Neovascular 11 7 18 11.70% 7.80% 9.80%
Outro 7 8 15 7.40% 8.90% 8.20%
Desconhecido 0 0 0 0.00% 0.00% 0.00%
Não gravado 1 0 1 1.10% 0.00% 0.50%
Total 94 90 184 100.00% 100.00% 100.00%
Certas AMD 37 37 75 39.40% 41.10% 40.20%
Possível AMD 47 48 95 50.00% 53.30% 51.60%
Os olhos foram acessados no período de 17/06/16 a 14/09/17. Critérios: ≥ 80 anos, brancos, não diabéticos, ≤6 h óbito até preservação. Alvo: 184 olhos (180 olhos de 90 doadores, preservados; 4 olhos de 4 doadores, preservados) Tempo óbito até a preservação (média, máximo, mínimo): 3,9 h, 6,4 h, 2,0 h

Tabela 1: Recuperação ocular do doador de 2016-2017.

Material Suplementar 1: Visão geral da dissecção, fotografia de fundo de olho colorido e imagem multimodal baseada em OCT. Clique aqui para baixar este arquivo.

Material Suplementar 2: Detalhes da imagem multimodal baseada em OCT para ilustrar as etapas nas seções 5-8. Clique aqui para baixar este arquivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Usando uma abordagem de triagem de base populacional durante um período de 16 meses na era pré-COVID, foi possível obter 75 olhos de doadores com DMRI. Todos foram recuperados com uma DtoP curta e estadiados usando MMI ancorado em OCT. O critério de idade (>80 anos) está fora da faixa etária típica para recuperações teciduais destinadas a córneas transplantáveis. Apesar da idade avançada, nossos critérios resultaram em olhos em todos os estágios da DMRI. Muitos fenótipos de EPR são comuns a todos os estágios da DMRI, e alguns são exclusivos da DMRI neovascular 3,46. A comparação direta de imagens ex vivo e in vivo (Figura 7) confirmou que a DtoP curta é um fator crítico, juntamente com o manuseio especializado (Figura 1), na produção de imagens ex vivo da retina externa suficientes para classificação diagnóstica de alto nível, e algumas dessas amostras foram adequadas para correlações diretas entre imagem e histologia 4,35, 47. Nem toda patologia é visível ex vivo. No entanto, muito mais é visível quando se utiliza OCT em comparação com métodos baseados em fotografia colorida10, especialmente aqueles que envolvem a separação da retina da PSE/coroide27. Além disso, o rastreamento ocular da OCT clínica direciona a atenção para características focais e, às vezes, pequenas (Figura 7).

Esse sistema de preservação envolve procedimentos típicos de banco de olhos e ferramentas para remoção de córneas, seguido pela imersão de um olho aberto em um conservante fornecido previamente. Dessa forma, o pessoal do banco de olhos pode recuperar tecidos de pesquisa continuamente (24/7). Esta última característica é crítica, pois os tecidos destinados a dissecções complexasimediatas 27,32 requerem equipe contínua dos investigadores, do banco de olhos ou de ambos. Outros estabilizadores que permitiriam a recuperação do tecido a qualquer hora, seguida de dissecção especializada e extrações durante o horário de trabalho, como o PAXgene Tissue System e o Hibernate-A, podem ser úteis no futuro se forem compatíveis com imagens de OCT.

Essa abordagem produz retinas que permanecem em grande parte ligadas ao EPR e, portanto, são capazes de gerar dados traduzíveis para imagens de OCT. A localização precisa é essencial porque a mácula é pequena (<3% da área da retina). Além disso, a progressão da DMRI impulsionada por depósito se alinha com a topografia dos cones e bastonetes48, e o início mais precoce e os defeitos visuais mais persistentes ocorrem em um local específico (ou seja, a parafóvea contendo bastonetes próxima à fóvea de todo o cone)49. Para comparação com OCT, a imuno-histoquímica com corantes colorimétricos é compatível com microscopia abrangente (por exemplo, campo claro) para levar em conta todos os elementos teciduais, marcados e não marcados4. Ensaios moleculares não direcionados baseados em matrizes de amostragem podem aproveitar o alinhamento horizontal de fotorreceptores compartimentados verticalmente e o EPR para aumentar efetivamente a resolução. A espectrometria de massa por imagem com pulsos de laser ionizante de 8 μm de diâmetro e 10-15 μm de distância pode localizar dezenas de lipídios nos compartimentos subcelulares das células externas da retina50. A transcriptômica espacialmente resolvida utiliza um conjunto pré-arranjado de primers de transcrição reversa com código de barras em lâminas de vidro, aos quais são aplicados cortes de tecido51. Atualmente, esta tecnologia é limitada à captura de 55 μm de diâmetro e espaçamento de 100 μm; Esperam-se melhorias na resolução que tornariam esta tecnologia adequada para a pesquisa da AMD.

Este protocolo tem limitações. O critério de recuperação omite diagnósticos de diabetes (30% entre os receptores do Medicare no Alabama)52 devido à importância da coroide em ambas as doenças. Essa exclusão reduz o total de doadores e prolonga o tempo necessário para coletar olhos suficientes para um estudo. Por razões históricas, os critérios de 2016-2017 omitiram doadores negros, que agora representam 14% dos doadores de olhos em todo o estado, e doadores negros agora estão incluídos em projetos prospectivos atuais. O registro de diretivas antecipadas para pessoas que desejam ser doadores de olhos é extenso, mas ainda não inclui o registro conveniente em clínicas locais de especialidade de retina que cuidam de pacientes com DMRI; Este projeto está atualmente em desenvolvimento. Durante uma triagem de base populacional como esta, olhos com condições sobrepostas no fenótipo com DMRI aparecerão e devem ser reconhecidos em consulta com a literatura clínica em evolução e um oftalmologista especializado em doenças da retina. Por exemplo, essa série de olhos incluía nevos com drusa53 e uma linha de distúrbio do EPR sobre um paquivaso (um vaso espesso na coroide interna)54. Finalmente, a AMD inicial e intermediária foram combinadas devido à falta de um sistema de classificação baseado em OCT para a AMD, que está em desenvolvimento pelo grupo55 da Classification of Atrophy Meeting. No entanto, a otimização da recuperação de tecidos e a caracterização baseada em OCT permitem que a pesquisa da AMD se concentre em aproveitar o elemento de tempo do MMI ancorado em OCT rastreado pelo olho para ser planejado, alimentado, programado e orçado em aplicativos de financiamento.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

C.A.C. recebe apoio de pesquisa da Heidelberg Engineering e presta consultoria para Apellis, Astellas, Boehringer Ingelheim, Character Bioscience e Osanni. T.A. recebe apoio de pesquisa da Novartis e presta consultoria para Roche, Novartis, Bayer, Nidek e Apellis. K.B.F. é consultor da Genentech, Zeiss, Heidelberg Engineering, Allergan, Bayer e Novartis.

Acknowledgments

Agradecemos à Heidelberg Engineering pela instrumentação e pelo design do suporte de olho original, Richard F. Spaide MD pela introdução à imagem multimodal baseada em OCT, Christopher Girkin MD por facilitar o acesso a dispositivos de imagem clínica e David Fisher pela Figura 1. A recuperação dos olhos de doadores humanos para pesquisa foi apoiada por bolsas do National Institutes of Health (NIH) R01EY06019 (C.A.C.), P30 EY003039 (Pittler), R01EY015520 (Smith), R01EY027948 (C.A.C., T.A.) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) e U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), a EyeSight Foundation of Alabama, a International Retinal Research Foundation (C.A.C.), a Arnold and Mabel Beckman Initiative for Macular Research (C.A.C.) e Research to Prevent Blindness AMD Catalyst (Schey).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beakers, 250 mL Fisher # 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex  Fisher # 10-462-719 storage for preservative
Bunsen burner or heat source Eisco # 17-12-818 To melt wax
Camera, digital Nikon D7200 D7200
Computer and storage Apple iMac Pro; 14 TB external hard drive Image storage
Container, insulated Fisher # 02-591-45 For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL Fisher Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86 For preservative
Crucible, quartz 30 mL Fisher # 08-072D Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL Fisher # 08-549G
Disinfectant cleaning supplies   https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket contact J. Messinger jeffreymessinger@uabmc.edu custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks Fisher # 19-910-667
Forceps, Harmon Fix Roboz  # RS-8247
Forceps, Micro Adson Roboz  # RS-5232
Forceps, Tissue Roboz # RS-5172
Glass petri dish, Kimax Fisher # 23064
Gloves Diamond Grip Fisher # MF-300
Gowns GenPro Fisher # 19-166-116
Image editing software Adobe Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes Fisher # 06-666
Lamps, 3 goosenecks Schott Imaging # A20800
Microscope, stereo Nikon SMZ 1000 for dissection
Microscope, stereo Olympus  SZX9 color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%  EMS # 15713-S for preservative; dilute for storage
pH meter Fisher  # 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2  EMS # 11600-10
Ring flash B & H Photo Video Sigma EM-140 DG 
Ruby bead, 1 mm diameter Meller Optics # MRB10MD
Safety Glasses 3M Fisher # 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope Heidelberg Engineering HRA2
Scissors, curved spring Roboz # RS-5681
Sharps container Fisher # 1482763
Shutter cord, remote Nikon MC-DC2
Spectral Domain OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA&OCT https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter McMaster-Carr # 9529K31
Tissue marking dye, black Cancer Diagnostics Inc # 0727-1
Tissue slicer blades Thomas Scientific # 6767C18
Trephine, 18-mm diameter Stratis Healthcare # 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera B&H Photo Video BH # COHD18G6PROB for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental EMS  # 72670
Wooden applicators Puritan # 807-12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spaide, R. F., et al. Consensus nomenclature for reporting neovascular age-related macular degeneration data: Consensus on neovascular age-related macular degeneration nomenclature study group. Ophthalmology. 127 (5), 616-636 (2020).
  2. Spaide, R. F., Ooto, S., Curcio, C. A. Subretinal drusenoid deposits a.k.a. pseudodrusen. Survey of Ophthalmology. 63 (6), 782-815 (2018).
  3. Curcio, C. A., Zanzottera, E. C., Ach, T., Balaratnasingam, C., Freund, K. B. Activated retinal pigment epithelium, an optical coherence tomography biomarker for progression in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (6), 211-226 (2017).
  4. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, OCT progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (10), 34 (2021).
  5. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, S12-S25 (2016).
  6. Edwards, M. M., et al. Subretinal glial membranes in eyes with geographic atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1352-1367 (2017).
  7. Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2 (2022).
  8. Jiang, M., et al. Microtubule motors transport phagosomes in the RPE, and lack of KLC1 leads to AMD-like pathogenesis. Journal of Cell Biology. 210 (4), 595-611 (2015).
  9. Collin, G. B., et al. Disruption of murine Adamtsl4 results in zonular fiber detachment from the lens and in retinal pigment epithelium dedifferentiation. Human Molecular Genetics. 24 (24), 6958-6974 (2015).
  10. Curcio, C. A., Medeiros, N. E., Millican, C. L. The Alabama Age-related Macular Degeneration Grading System for donor eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 39 (7), 1085-1096 (1998).
  11. Bastek, J. V., Siegel, E. B., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Pigmentary patterns of the peripheral fundus. Ophthalmology. 89 (12), 1455-1463 (1982).
  12. Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y., Lightfoot, D. O. Reticular degeneration of the pigment epithelium. Ophthalmology. 92 (11), 1485-1495 (1985).
  13. Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Multiple extramacular drusen. Ophthalmology. 93 (8), 1098-1112 (1986).
  14. Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of geographic atrophy of the retinal pigment epithelium. Eye. 2 (5), 552-577 (1988).
  15. Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of soft drusen in age-related macular degeneration. Eye. 8 (3), 269-283 (1994).
  16. Ghazi, N. G., Dibernardo, C., Ying, H. S., Mori, K., Gehlbach, P. L. Optical coherence tomography of enucleated human eye specimens with histological correlation: Origin of the outer "red line". American Journal of Ophthalmology. 141 (4), 719-726 (2006).
  17. Brown, N. H., et al. Developing SDOCT to assess donor human eyes prior to tissue sectioning for research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (8), 1069-1080 (2009).
  18. Helb, H. M., et al. Clinical evaluation of simultaneous confocal scanning laser ophthalmoscopy imaging combined with high-resolution, spectral-domain optical coherence tomography. Acta Ophthalmologica. 88 (8), 842-849 (2010).
  19. Spaide, R. F., Curcio, C. A. Drusen characterization with multimodal imaging. Retina. 30 (9), 1441-1454 (2010).
  20. Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part 1. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
  21. Garcia-Garcia, H. M., Gonzalo, N., Regar, E., Serruys, P. W. Virtual histology and optical coherence tomography: from research to a broad clinical application. Heart. 95 (16), 1362-1374 (2009).
  22. Strouthidis, N. G., et al. Comparison of clinical and spectral domain optical coherence tomography optic disc margin anatomy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (10), 4709-4718 (2009).
  23. Sarks, S. H. Ageing and degeneration in the macular region: A clinico-pathological study. British Journal of Ophthalmology. 60 (5), 324-341 (1976).
  24. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (13), 19 (2020).
  25. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (1), 33 (2021).
  26. Litts, K. M., et al. Clinicopathological correlation of outer retinal tubulation in age-related macular degeneration. JAMA Ophthalmology. 133 (5), 609-612 (2015).
  27. Olsen, T. W., Feng, X. The Minnesota grading system of eye bank eyes for age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4484-4490 (2004).
  28. Mano, F., Sprehe, N., Olsen, T. W. Association of drusen phenotype in age-related macular degeneration from human eye-bank eyes to disease stage and cause of death. Ophthalmology Retina. 5 (8), 743-749 (2021).
  29. Age-related eye disease study research group. The Age-Related Eye Disease Study system for classifying age-related macular degeneration from stereoscopic color fundus photographs: The Age-Related Eye Disease Study Report Number 6. American Journal of Ophthalmology. 132 (5), 668-681 (2001).
  30. Arnold, J. J., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Reticular pseudodrusen. A risk factor in age-related maculopathy. Retina. 15 (3), 183-191 (1995).
  31. Olsen, T. W., Bottini, A. R., Mendoza, P., Grossniklausk, H. E. The age-related macular degeneration complex: linking epidemiology and histopathology using the Minnesota grading system (the inaugural Frederick C. Blodi Lecture). Transactions of the American Ophthalmological Society. 113, (2015).
  32. Owen, L. A., et al. The Utah protocol for postmortem eye phenotyping and molecular biochemical analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (4), 1204-1212 (2019).
  33. Wang, J. J., et al. Ten-year incidence and progression of age-related maculopathy: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 114 (1), 92-98 (2007).
  34. Joachim, N., Mitchell, P., Burlutsky, G., Kifley, A., Wang, J. J. The incidence and progression of age-related macular degeneration over 15 years: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 122 (12), 2482-2489 (2015).
  35. Pang, C., Messinger, J. D., Zanzottera, E. C., Freund, K. B., Curcio, C. A. The onion sign in neovascular age-related macular degeneration represents cholesterol crystals. Ophthalmology. 122 (11), 2316-2326 (2015).
  36. Keilhauer, C. N., Delori, F. C. Near-infrared autofluorescence imaging of the fundus: Visualization of ocular melanin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3556-3564 (2006).
  37. Curcio, C. A., Saunders, P. L., Younger, P. W., Malek, G. Peripapillary chorioretinal atrophy: Bruch's membrane changes and photoreceptor loss. Ophthalmology. 107 (2), 334-343 (2000).
  38. Curcio, C. A. Imaging maculopathy in the post-mortem human retina. Vision Research. 45 (28), 3496-3503 (2005).
  39. Brinkmann, M., et al. Histology and clinical lifecycle of acquired vitelliform lesion, a pathway to advanced age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 240, 99-114 (2022).
  40. Ramtohul, P., et al. Bacillary layer detachment: Multimodal imaging and histologic evidence of a novel optical coherence tomography terminology. Literature review and proposed theory. Retina. 41 (11), 2193-2207 (2021).
  41. Wilson, J. D., Foster, T. H. Mie theory interpretations of light scattering from intact cells. Optics Letters. 30 (18), 2442-2444 (2005).
  42. Ghazi, N. G., Green, W. R. Pathology and pathogenesis of retinal detachment. Eye. 16 (4), 411-421 (2002).
  43. Berlin, A., et al. Correlation of optical coherence tomography angiography of type 3 macular neovascularization with corresponding histology. JAMA Ophthalmology. 140 (6), 628-633 (2022).
  44. Berlin, A., et al. Histology of type 3 macular neovascularization and microvascular anomalies in anti-VEGF treated age-related macular degeneration. Ophthalmology Science. 3 (3), 100280 (2023).
  45. Schaal, K. B., et al. Outer retinal tubulation in advanced age-related macular degeneration: optical coherence tomographic findings correspond to histology. Retina. 35 (7), 1339-1350 (2015).
  46. Chen, L., et al. Histology and clinical imaging lifecycle of black pigment in fibrosis secondary to neovascular age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 214, 108882 (2022).
  47. Balaratnasingam, C., et al. Histologic and optical coherence tomographic correlations in drusenoid pigment epithelium detachment in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 124 (1), 644-656 (2017).
  48. Curcio, C. A., et al. Subretinal drusenoid deposits in non-neovascular age-related macular degeneration: Morphology, prevalence, topography, and biogenesis model. Retina. 33 (2), 265-276 (2013).
  49. Owsley, C., et al. Biologically guided optimization of test target location for rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration: ALSTAR2 baseline. Ophthalmology Science. 3 (2), 100274 (2023).
  50. Anderson, D. M. G., et al. The molecular landscape of the human retina and supporting tissues by high resolution imaging mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (12), 2426-2436 (2020).
  51. Lee, J., Yoo, M., Choi, J. Recent advances in spatially resolved transcriptomics: challenges and opportunities. BMB Reports. 55 (3), 113-124 (2022).
  52. Diabetes. Alabama Public Health. , Available from: https://www.alabamapublichealth.gov/healthrankings/diabetes.html (2022).
  53. Francis, J. H., et al. Swept-source optical coherence tomography features of choroidal nevi. American Journal of Ophthalmology. 159 (1), 169-176 (2015).
  54. Inoue, M., Dansingani, K. K., Freund, K. B. Progression of age-related macular degeneration overlying a large choroidal vessel. Retina Cases Brief Reports. 10 (1), 22-25 (2016).
  55. Jaffe, G. J., et al. Imaging features associated with progression to geographic atrophy in age-related macular degeneration: CAM Report 5. Ophthalmology Retina. 5 (9), 855-867 (2021).

Tags

Neurociência Edição 195 Banco de olhos biobanco tomografia de coerência óptica imagem multimodal degeneração macular relacionada à idade
<em>Ex Vivo</em> Imagem Multimodal Baseada em OCT de Olhos de Doadores Humanos para Pesquisa em Degeneração Macular Relacionada à Idade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Messinger, J. D., Brinkmann, M.,… More

Messinger, J. D., Brinkmann, M., Kimble, J. A., Berlin, A., Freund, K. B., Grossman, G. H., Ach, T., Curcio, C. A. Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (195), e65240, doi:10.3791/65240 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter