Summary
Laboratuvar tahlilleri, yaşa bağlı makula dejenerasyonunun (AMD) uzunlamasına optik koherens tomografi (OCT) tabanlı multimodal görüntülemesinden prognostik değerden yararlanabilir. AMD'li ve AMD'siz insan donör gözleri, doku kesitlemeden önce OCT, renk, yakın kızılötesi yansıma taramalı lazer oftalmoskopi ve otofloresan kullanılarak iki uyarma dalga boyunda görüntülenir.
Abstract
Optik koherens tomografi (OCT) tabanlı multimodal (MMI) klinik görüntülemeden öğrenilen yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) için bir progresyon sekansı, laboratuvar bulgularına prognostik değer katabilir. Bu çalışmada retina dokusu kesitleme öncesinde insan donör gözlerine ex vivo OCT ve MMI uygulandı. Gözler, ≥80 yaşlarındaki diyabetik olmayan beyaz donörlerden kurtarıldı ve ölümden korunmaya kadar geçen süre (DtoP) ≤6 saatti. Küreler yerinde geri kazanıldı, korneanın çıkarılmasını kolaylaştırmak için 18 mm'lik bir trefin ile puanlandı ve tamponlanmış% 4 paraformaldehit içine daldırıldı. Renkli fundus görüntüleri, ön segment çıkarıldıktan sonra diseksiyon kapsamı ve üç büyütmede trans, epi- ve flaş aydınlatması kullanan bir SLR kamera ile elde edildi. Küreler, 60 diyoptri lense sahip özel tasarlanmış bir oda içindeki bir tampona yerleştirildi. Spektral etki alanı OCT (30° makula küpü, 30 μm aralık, ortalama = 25), yakın kızılötesi yansıma, 488 nm otofloresan ve 787 nm otofloresan ile görüntülendi. AMD gözleri, retinal pigment epitelinde (RPE), drusen veya subretinal drusenoid birikintileri (SDD'ler), neovaskülarizasyon olsun veya olmasın ve başka nedenlere dair kanıt olmadan bir değişiklik gösterdi. Haziran 2016 ile Eylül 2017 arasında 94 sağ göz ve 90 sol göz iyileşti (DtoP: 3.9 ± 1.0 saat). 184 gözün %40.2'sinde erken intermediate (%22.8), atrofik (%7.6) ve neovasküler (%9.8) AMD dahil olmak üzere AMD vardı ve %39.7'sinde dikkat çekici olmayan makulalar vardı. Drusen, SDD'ler, hiper-reflektif odaklar, atrofi ve fibrovasküler skarlar OCT kullanılarak tanımlandı. artefaktlar arasında doku opaklaşması, dekolmanları (basiller, retinal, RPE, koroidal), foveal kistik değişiklik, dalgalı bir RPE ve mekanik hasar vardı. Kriyo-kesitlemeyi yönlendirmek için, fovea ve optik sinir başı yer işaretlerini ve spesifik patolojileri bulmak için OCT hacimleri kullanıldı. Ex vivo hacimler, göz izleme için referans fonksiyonu seçilerek in vivo hacimlere kaydedildi. İn vivo görülen patolojinin ex vivo görünürlüğü koruma kalitesine bağlıdır. 16 ay içinde, AMD'nin tüm aşamalarında 75 hızlı DtoP donör gözü iyileşti ve klinik MMI yöntemleri kullanılarak evrelendirildi.
Introduction
Optik koherens tomografi (OKT) rehberliğinde anti-VEGF tedavisi ile neovasküler yaşa bağlı makula dejenerasyonunun (AMD) on beş yıldır yönetilmesi, görme kaybının bu yaygın nedeninin progresyon sekansı ve mikromimarisi hakkında yeni bilgiler sunmuştur. Önemli bir tanıma, AMD'nin nörosensoriyel retina, retinal pigment epiteli (RPE) ve koroidi içeren üç boyutlu bir hastalık olmasıdır. Deneme hastalarının ve tedavi edilen klinik hastaların diğer gözlerinin OCT görüntülemesinin bir sonucu olarak, onlarca yıldır klinik bir standart olan renkli fundus fotoğrafçılığı tarafından görülenlerin ötesinde patolojinin özellikleri artık tanınmaktadır. Bunlar arasında intraretinal neovaskülarizasyon (tip 3 maküler neovaskülarizasyon1, eski adıyla anjiyomatöz proliferasyon), subretinal drusenoid birikintileri (SDD'ler, retiküler psödodrüzen olarak da adlandırılır)2, RPE kaderinin çoklu yolları 3,4 ve atrofi 5,6'da yoğun gliotik Müller hücreleri bulunur.
Makulalardan (hücreler ve hayvanlar) yoksun model sistemler bu karmaşık hastalığın bazı dilimlerini yeniden oluşturur 7,8,9. AMD'nin yükünü iyileştirmede daha fazla başarı, insan gözünde birincil patolojinin keşfi ve araştırılması, makulanın benzersiz hücresel bileşiminin anlaşılması ve ardından model sistemlere çevrilmesinden kaynaklanabilir. Bu rapor, bir akademik araştırma laboratuvarı ile bir göz bankası arasındaki otuz yıllık işbirliğini göstermektedir. Burada açıklanan doku karakterizasyon yöntemlerinin amaçları iki yönlüdür: 1) mikroskopi ile fundus görünümünün ve görüntüleme sinyal kaynaklarının temelini göstererek gelişen tanı teknolojisini bilgilendirmek ve 2) AMD örneklerini sadece koni foveasını ve çubuk bakımından zengin para- ve perifoveayı koruyan hedefli (immünohistokimya) ve hedefsiz moleküler keşif teknikleri (görüntüleme kütle spektrometrisi, IMS ve mekansal transkriptomikler) için sınıflandırmak. Bu tür çalışmalar, göz takibi yoluyla bir progresyon dizisi ve uzunlamasına takibin mümkün olduğu klinik OCT'ye translasyonu hızlandırabilir. Tedavi etkilerini izlemek için tasarlanan bu teknoloji, retina damarlarını kullanarak taramaları bir klinik ziyaretinden diğerine kaydeder. Göz izlemeli OKT'nin yıkıcı tekniklerle elde edilen laboratuvar sonuçlarına bağlanması, moleküler bulgulara yeni bir prognostik değer düzeyi sağlayabilir.
1993 yılında araştırma laboratuvarı, film10'da postmortem fundusun renkli fotoğraflarını çekti. Bu çaba, Foos ve meslektaşları 11,12,13 tarafından insan periferik retinasının mükemmel fotomikroskopisi ve histolojisinden ve Sarks ve ark.14,15'in kapsamlı AMD klinikopatolojik korelasyonlarından esinlenmiştir. 2009 yılından itibaren spektral etki OKT'ye bağlı ex vivo multimodal görüntüleme (MMI) benimsenmiştir. Bu geçiş, diğerlerinin benzer çabalarından esinlenmiştir 16,17 ve özellikle Sarklar tarafından tarif edilen ultrayapının çoğunun zaman içinde klinikte üç boyutlu olarak mevcut olduğunun farkına varılması 18,19. Amaç, retina, RPE ve koroiddeki hücresel düzeyde fenotiplerin iyi güçlendirilmiş çalışmaları için makul bir zaman diliminde bağlı makulaları olan gözler elde etmekti. Amaç, "göz başına" istatistiklerin ötesinde, kardiyovasküler hastalıktan20,21 "savunmasız plak" kavramlarından etkilenen bir standart olan "lezyon tipi başına" geçmekti.
Bu rapordaki protokol, çeşitli akışlarda katılan yaklaşık 400 çift donör gözü ile ilgili deneyimleri yansıtmaktadır. 2011-2014 yıllarında, 142 arşivlenmiş örnekten katman kalınlıkları ve ek açıklamalar içeren AMD histopatolojisinin MACULA Projesi web sitesi oluşturuldu. Bu gözler 1996-2012 yılları arasında yüksek çözünürlüklü epoksi-reçine histolojisi ve elektron mikroskobu için glutaraldehit-paraformaldehit fiksatif olarak korunmuştur. Tüm fundiler alındığında renkli olarak fotoğraflandı ve histolojiden hemen önce OCT tarafından yeniden görüntülendi. Başlangıçta optik sinir çalışmaları için tasarlanmış bir göz tutucu22, fovea üzerinde ortalanmış 8 mm çapında tam kalınlıkta bir doku zımbasını yerleştirmek için kullanıldı. Foveal merkezden OCT B-taramaları ve aynı seviyelerde histolojiye karşılık gelen 2 mm üstünlük bir site ve ayrıca renkli bir fundus fotoğrafı web sitesine yüklendi. OCT düzlemlerinin seçimi, fovea23 altında AMD patolojisinin belirginliği ve SDD'lerin fovea24,25'ten daha üstün çubuk bakımından zengin alanlarda öne çıkması ile belirlendi.
2013 yılından itibaren, yaşam boyunca OCT-implante MMI ile görüntülenen gözler doğrudan klinikopatolojik korelasyonlar için mevcuttu. Çoğu (10 donörden 7'si), araştırma amacıyla ölümden sonra gözlerini bağışlamak isteyen hastalar için gelişmiş bir direktif kaydı sunan bir retina sevk uygulamasındaki hastaları (yazar: KBF) içeriyordu. Gözler yerel göz bankası tarafından kurtarıldı ve korundu, laboratuvara transfer edildi ve MACULA Projesi gözleriyle aynı şekilde hazırlandı. Pre-mortem klinik OKT hacimleri laboratuvarda sorunsuz bir şekilde okundu, böylece yaşam boyunca görülen patoloji özellikleri mikroskop altında görülen özelliklerle uyumlu hale getirildi26.
2014 yılından itibaren, prospektif göz toplama, klinik öyküsü olmayan ancak belirli bir zaman sınırı (6 saat) boyunca korunan donör gözlerinde AMD taraması ile başladı. Bu amaçla, göz tutucu bütün bir küreyi barındıracak şekilde değiştirildi. Bu, daha önce kullanılan 8 mm'lik zımbanın kesilmiş kenarları etrafında ayrılma şansını azalttı. Gözler immünohistokimya için %4 tamponlu paraformaldehit içinde korundu ve ertesi gün uzun süreli depolama için %1'e transfer edildi. 2016-2017'de (pandemi öncesi), 90 donörden 184 göz kurtarıldı. Bu rapordaki istatistikler ve resimler bu seriden oluşturulmuştur. Pandemi döneminde (2020 kilitlenmeleri ve sonrası), transkriptomik ve IMS işbirlikleri için ileriye dönük koleksiyonlar, esasen 2014 yöntemlerini kullanarak, düşük bir hızda devam etti.
Donör göz değerlendirmesi için başka yöntemler de mevcuttur. Minnesota Derecelendirme Sistemi (MGS)27,28, renkli fundus fotoğrafçılığı için AREDS klinik sistemine dayanmaktadır 29. Bu yöntemin sınırlamaları, atrofik ve neovasküler AMD'nin "geç AMD" nin bir aşamasında birleştirilmesini içerir. Ayrıca, MGS, RPE koroidinin foto-dokümantasyonundan önce nörosensoriyel retinanın çıkarılmasını gerektirir. Bu adım, SDD'leri değişen derecelerde30,31'e çıkarır ve dış retinanın ve destek sisteminin uzamsal yazışmalarını ortadan kaldırır. Bu nedenle, metabolik talebi ve retinadan gelen sinyallemeyi RPE-koroiddeki patolojiye bağlama çabaları engellenebilir. Utah Sistemi, diseksiyona yönelik gözleri RNA ve protein ekstraksiyonları için bölgelere ayırmak için ex vivo renkli fotoğrafçılık ve OCT kullanarak MMI uyguladı32. Tüm vizör adaptörü ekstraksiyonlarına tercih edilmesine rağmen, AMD ilerlemesi için en yüksek risk altındaki 3 mm çaplı alan33,34, 6 mm çapında fovea merkezli bir zımbanın sadece% 25'ini temsil eder. Bu nedenle, immünohistokimya için seri kesitleme gibi foveaya referansla bulguları lokalize edebilen teknikler avantajlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Birmingham'daki Alabama Üniversitesi'ndeki kurumsal inceleme kurulu, İyi Laboratuvar Uygulamaları ve Biyogüvenlik Seviyesi 2/2+'ya bağlı kalan laboratuvar çalışmalarını onayladı. Tüm ABD göz bankaları 2006 Tekdüzen Anatomik Hediyeler Yasası ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi'ne uygundur. Advancing Sight Network de dahil olmak üzere çoğu ABD göz bankası, Amerika Göz Bankası Birliği'nin tıbbi standartlarına uygundur.
Malzeme Tablosu malzemeleri ve ekipmanları listeler. Ek Materyal 1, diseksiyon, renkli fundus fotoğrafçılığı ve OCT tabanlı MMI'ye genel bir bakış sağlar. Ek Materyal 2, OCT tabanlı MMI'nin ayrıntılarını sağlar.
1. Doku toplama kriterleri
- Belgesiz donörlerin ekranında AMD gözlerinin verimini en üst düzeye çıkarmak için, kabul edilebilir donörler için aşağıdaki kriterleri belirleyin: yaş ≥80, beyaz, diyabetik olmayan ve ≤6 saat ölümden korunmaya (DtoP).
NOT: DtoP, ölüm ile gözün hastanede veya laboratuvarda sağlanan bir koruyucuya yerleştirilmesi arasındaki süre olarak tanımlanır.
2. Koruma ortamı ve diğer preparatlar (laboratuvar)
- % 20 stoktan% 4 fosfat tamponlu paraformaldehit yapın (satın alınan). 0.1 M Sorenson fosfat tamponunun 800 mL'sine 200 mL% 20 paraformaldehit (seyreltme faktörü 5) ekleyerek 1 L hazırlayın. Gerekirse pH'ın 7.2 olduğundan emin olmak için test edin ve ayarlayın. 4 °C'de saklayın.
- 40 mL kavanozlara 30 mL% 4 fosfat tamponlu paraformaldehit dağıtın.
- Göz bankasında 40 mL'lik koruyucu kaplar etiketlenmiştir, böylece doku herhangi bir zamanda ve herhangi bir günde geri kazanılabilir.
- Korunmuş gözlerin depolanması için,% 4'lük çözeltiden% 1 paraformaldehit yapın. 750 mL 0.1 M Sorenson fosfat tamponuna 250 mL% 4 paraformaldehit (4 seyreltme faktörü) ekleyerek 1 L hazırlayın. Gerekirse pH'ı test edin ve ayarlayın. 4 °C'de saklayın.
- 500 mL damıtılmış su ve 500 mL Sorenson tamponunu birleştirerek Sorenson'un fosfat tamponunun 0,2 M çözeltisi pH 7,2'den 1 L 0,1 M'lik bir çözelti hazırlayın.
- pH düşüşünü 1 N hidroklorik asit veya 1 N sodyum hidroksit kullanarak damla damla ayarlayın. 4 °C'de saklayın.
- Diseksiyon sırasında gözleri stabilize etmek için bir tutucu oluşturun. Bir Petri kabını sıvıya kadar ısıtılmış diş balmumu ile doldurun. Biraz serin olduğunda, büyük bir bilyalı rulman ile içinde yarım küre bir izlenim bırakın ve ardından bilyalı yatağın çıkarılmasını kolaylaştırmak için çanağı dondurun.
3. Göz bankası yöntemleri
- Araştırma dokularının hızlı bir şekilde iyileşmesini sağlamak için, nakil amaçlı olanlar da dahil olmak üzere tüm dokuları hızla geri kazanın.
- Yasaların gerektirdiği şekilde, ölümden sonraki 1 saat içinde ölüm sevklerini alın ve her donörü dokuyu takip eden bir sevk sıra numarasıyla izleyin.
- Potansiyel klinik dokümantasyona sahip vakaları bulmak için, araştırma Donör Risk Değerlendirme Görüşmesinde AMD ve göz hastalığına özgü sorular sorun.
- Seyahat süresini en aza indirmek için, kompakt bir alanda (yani, şehir ve bitişik banliyö ilçesi) tüm küreleri (transplantasyon için sadece kornealardan farklı olarak) kurtarın.
- Doku iyileşmesi için iki kavanoz koruyucu (tamponlanmış% 4 paraformaldehit) aldatanın hastane odasına getirin (vücudun morg'a taşınmasını beklemek yerine).
- İyileşmeden önce ve iyileşme sırasında, teslimatı ve zamanlamayı onaylamak için araştırmacılarla iletişim kurun.
- Küreleri hastanede yerinde kurtarın, tutarlı taşıma yöntemleriyle açın ve açılan gözü koruyucu maddeye daldırın (Şekil 1).
- Eksize edilen donör gözünü, bir hemostat tarafından stabilize edilmiş bir gazlı bez kılıfı kullanarak yerinde tutun.
- Korneanın 2 mm genişliğinde bir sklera kenarı ile çıkarılmasını kolaylaştırmak için, dünyayı puanlamak için 18 mm çapında bir trefin kullanın.
- Korneayı eşlik eden bir sklera kenarı ile serbest bırakmak için, dünyayı hemostat kırpılmış gazlı bezle stabilize ederken, kavisli uçlu yaylı makas kullanarak skorlanan daire boyunca kesin.
- Korneayı skleradan kaldırın, iris ve siliyer gövdeyi açığa çıkarın.
- Koruyucunun vitreus odasına nüfuz etmesini kolaylaştırmak için, iriste pupilla kenarına dik 2 mm uzunluğunda bir yarık açın. Gözleri 4 °C'de 30 mL koruyucu içeren numune kavanozlarına yerleştirin ve ıslak buz üzerinde laboratuvara aktarın.
- Kimliksizleştirilmiş donör bilgilerini göz bankasından araştırma laboratuvarı veri tabanına elektronik olarak iletin.
NOT: Veri tabanında sevk numarası, göz bankası doku numarası, izleme için laboratuvar kimlik numarası ve diğer ilgili bilgiler bulunur.
4. Ex vivo renkli fundus fotoğrafçılığı için doku hazırlama
- Biri diseksiyon ve diğeri renkli fundus fotoğrafçılığı için olmak üzere iki stereo mikroskop kullanın.
NOT: Transillüminasyonun pigmenter değişiklikleri görselleştirmesi için, karanlık alan mikroskobu için bir taban kullanın. - Ön segment kalıntılarını (iris ve lens) çıkarın. Diseksiyon sırasında gözü stabilize etmek için, balmumu ile doldurulmuş Petri kabına yerleştirin (Ek Materyal 1, slaytlar 7-8). Siliyer gövdenin ve bağlı retinanın vitreus boşluğuna çökmesini önlemek için, siliyer gövdeye (vitreus tabanı) bağlı kalın vitreus halkasının bozulmasını en aza indirin.
- Oryantasyon için üst kutbu işaretleyin. Küreyi ön tarafı çanağa yerleştirin. Üstün rektus ve üstün eğik kasların yerleştirme tendonlarını bulun. Ahşap bir aplikatör kullanarak, 10 mm'lik bir çizgide bir ön taraftan arka yöne (yani, üstün rektus kasının tendinöz yerleştirilmesine dik olarak) bir işaretleme mürekkebi uygulayın.
- Fotoğraftan önce, fundusu soğuk Sorensen'in fosfat tamponu ile doldurun.
- Her resimde görünmesi için fundusa iç ölçek çubuğu olarak 1 mm'lik bir yakut boncuk yerleştirin27.
- Halka flaşlı stereo mikroskopa monte edilmiş tek lensli refleks kamera ile renkli görüntüler elde edin. Belirli alanları vurgulamayı amaçlayan görüntüleri yakalamak için üç standart büyütmenin her birinde trans, epi- ve flaş aydınlatması kullanın (Ek Materyal 1, slayt 11): 1) ekvatora fundus, 2) arka kutup (vasküler pasajlar, optik sinir başı, fovea) ve 3) maküla lutea içindeki fovea (sarı nokta).
5. Ex vivo renkli fundus fotoğrafçılığı için hazırlık
- Fotoğraf makinesini ve monitörü açın. Uzaktan kumandalı deklanşörü takın ve aktüatörü yüksek çözünürlüklü multimedya arabirimi (HDMI) kamera/televizyon (TV) monitöründe ve ekran kablosunda serbest bırakın.
- Fotoğraf makinesi ayarlarını manuel ISO işlevine ve ayna kilitleme konumuna (titreşimi azaltmak için yerine kilitlenmiş) ayarlayın.
NOT: Kullanılan fotoğraf makinesindeki ayarlar için üreticinin kullanım kılavuzuna bakın. Fotoğraf makinesi ekranından histogram ve pozlama okumalarına göre üst/az pozlama ayarlarını öğrenin. - Mikroskop aşamasındaki dört kardinal yönde aydınlatma için her biri birbirine dik olarak yerleştirilmiş iki esnek ışık kılavuzuna sahip iki ışık kaynağı düzenleyin (Ek Malzeme 1, sayfa 10).
- Epi-aydınlatma ışık kaynaklarını tam güce getirin.
NOT: Fotoğrafçının ışık/flaş dağılımını sınırlamak için sahnenin etrafında siyah keçe bir örtü olması yararlıdır ancak gerekli değildir. - Diseksiyon mikroskobunda, arka kutbu tamponla dolu 30 mL'lik bir kuvars potaya yerleştirmek için forseps kullanın. Dokunun dibe batmasına izin verin. Hareketi önlemek için göz ile potanın duvarı arasına doku süngeri gibi bir destek yerleştirin. 1 mm'lik yakut boncuğu arka direğe yerleştirin.
NOT: Boncuk optik sinir kabına düşebilir. - Dünyayı dikkatlice potaya stereo mikroskop aşamasına yerleştirin ve mikroskop göz merceklerinden iç oküler fundusu gözlemleyin. En düşük büyütmeyi kullanarak, saat 12 pozisyonundaki doku işaretini, optik sinir kafasını (ONH) ve ONH'nin 5 ° altındaki foveayı tanımlayarak gözü yönlendirin. Fovea, ONH boyunca bir çizginin altına 5 ° düşecek şekilde gözü döndürün.
NOT: Eğer sağ göz ise, ONH mikroskopun okülerlerinden görüldüğü gibi foveanın sağındadır. Sol göz ise, ONH foveanın solundadır. - Fotoğraf makinesinden uzaktan monitör görüntülemeyi açın. Mikroskop ışın ayırıcı kaydırıcısının, oküler bağlantı noktasından değil, fotoğraf bağlantı noktasından gözlemleyecek şekilde ayarlandığından emin olun. Işık ve ayna yoluna bağlı olarak, doğru yönlendirme için dokuyu sahnede 180 ° döndürmeye hazır olun.
6. Ex vivo renkli fundus fotoğrafçılığı kullanarak görüntü toplama
- Epi-aydınlatma açıkken, büyütmeyi 18 mm'lik trefin insizyonunun tamamı tüm görüş alanını kaplayacak şekilde ayarlayın. Foveal çukurun dibine odaklanmak mümkün olacak şekilde büyütmeyi artırın. Büyütme oranını önceki ayara düşürün.
- ISO ayarlarını 1.600-3.000 aralığında ayarlayın, böylece pozlama süreleri fotoğraf makinesindeki ölçüm cihazının merkez aralığına düşer.
- Uzaktan deklanşör tetiğine basın. Aynanın yukarı konumda kilitlenmesini dinleyin. Pozlama için tetiğe tekrar basın.
- Doğru pozlama için kırmızı, yeşil, mavi (RGB) ve renkli histogramı gösteren önceden ayarlanmış meta verilerle monitördeki görüntüyü gözlemleyin. Maruz kalma kabul edilebilirse, devam edin; değilse, parametreleri silin, yeniden değerlendirin ve yeniden görüntüleyin.
- Drusen'i vurgulamak için epi-aydınlatma için kaz boynu lambalarını kapatın ve 1/4 s pozlama, 1/250 s kamera deklanşör hızı ve 100-320 ISO ile flaşı açın. Flaş hızını varsayılana ayarlayın veya fotoğraf makinesinin ilk kurulumu sırasında değiştirin. Bir görüntü elde edin ve doğru pozlama için histogramı kontrol edin.
- Flaşı kapatın ve trans aydınlatma ışık kaynağını açın. ISO'yu 5.000'in üzerine sıfırlayın ve fotoğraf sistemindeki potansiyel titreşim nedeniyle pozlama süresinin 1/30 s'nin altına düşmediğinden emin olun. Bir görüntü elde edin ve doğru pozlama için histogramı kontrol edin.
- Hem ONH hem de fovea'yı görüş alanında görüntülemek için büyütmeyi artırın. Epi-aydınlatma lambalarını açın. ISO aralığını 1.600-3.000 olarak ayarlayın. Pozlama sürelerinin kameranın merkez aralığına düştüğünden emin olun.
- Epi-aydınlatma lambalarını kapatın ve 1/4 s pozlama, önceden ayarlanmış kamera deklanşör hızı 1/250 s ve ISO 400-800 olarak ayarlanmış olarak flaşı açın. Bir görüntü elde edin ve doğru pozlama için histogramı kontrol edin.
- Flaşı kapatın ve karanlık alan tabanını kullanarak trans aydınlatmayı açın. ISO'yu 5.000'in üzerine sıfırlayın. Fotoğraf sistemindeki potansiyel titreşim nedeniyle pozlama süresinin 1/30 sn'den daha yavaş olmadığından emin olun. Bir görüntü edinin ve uygun bir histogram olup olmadığını kontrol edin.
- Trans illumination'ı kapatın ve epi-aydınlatma lambalarını tekrar açın.
- Büyütme oranını adım 6.7'de kullanılana yükseltin. Gerekirse yeniden odaklanın.
- ISO'yu 3.000-6.000 aralığında artırın ve pozlama süresini kameranın uygun pozlama aralığına düşecek şekilde ayarlayın. Bir görüntü edinin.
NOT: Yakut boncuk artık görüş alanında görünmeyebilir. Öyleyse, referans için boncuğun ayrı görüntülerini bu büyütmede yakalayın. - Epi aydınlatma lambalarını kapatın. Flaşı 1/4 s pozlama ve fotoğraf makinesi deklanşör hızı 1/250 s olacak şekilde açın. Flaş hızını varsayılana ayarlayın veya fotoğraf makinesinin ilk kurulumu sırasında değiştirin ve ISO'yu 500-1.000 olarak ayarlayın. Görüntüyü alın. Doğru pozlama için histogramı kontrol edin.
- Flaşı kapatın ve trans aydınlatma lambalarını açın. Daha hassas bir görüntü sensörüyle daha hızlı pozlama süresi sağlamak için ISO'yu 8.000'in üzerine sıfırlayın. Fotoğraf sistemindeki potansiyel titreşim nedeniyle pozlama süresinin 1/30 s'nin altına düşmediğinden emin olun. Bir görüntü edinin.
- Görüntüleri fotoğraf makinesinden bilgisayara aktarın. Bazılarının tekrar yakalanması gerekebileceği ihtimaline karşı örneği mikroskop aşamasından çıkarmadan önce görüntüleri gözden geçirin.
7. Ex vivo OCT ve taramalı lazer oftalmoskopi (SLO) için görüntü alımına genel bakış
- Spektral alan OCT için, küreleri fosfat tamponuna, 60 diyoptri lensli35 odacıklı özel bir göz tutucuya yerleştirin. Göz tutucuyu klinik OCT görüntüleme cihazındaki bir brakete monte edin ve hastanın alnını dinlendireceği yere takın. OCT aygıtı her görüntüye otomatik olarak bir ölçek çubuğu ekler.
- Aynı zamanda, aynı cihazı kullanarak ve göz hala tutucudayken, yakın kızılötesi yansıma (NIR, yerleşik yazılım tarafından bir konumlandırıcı görüntü olarak kullanılır), 488 nm uyarma fundus otofloresansı (FAF) ve kırmızısız (RF) yansıma kullanarak bir tarama lazer oftalmoskop (SLO) ile küreleri görüntüleyin.
NOT: Bu cihazdaki 787 nm uyarma FAF'ı sadece ara sıra uygundur, çünkü bir ışın ayırıcı SLO'ya ışık geçirgenliğini azaltır. Bu nedenle, 787 nm FAF görüntüleri için ikinci bir cihaz kullanılır (bir sonraki noktaya bakın). - Ayrı olarak, ancak göz hala göz tutucudayken, bu modaliteyi iyi gösteren ayrı bir cihaz kullanarak RPE bozukluğu36'yı tespit etmek için küreleri 787 nm FAF ile görüntüleyin.
8. Ex vivo OCT / SLO için görüntü toplama protokolü (Ek Materyal 2'deki slaytlara bakınız)
- Üstün rektus kasını doku işaretleme boyası ile belirtin. Lazeri açın (mavi ok, Ek Malzeme 2, sayfa 1).
- Ek Materyal 2'nin 2. sayfasına atıfta bulunarak, tüm üniteyi tabana göre iki eksende hareket ettirerek (yeşil ok) ve ardından joystick'i saat yönünde / saat yönünün tersine döndürerek yüksekliği (y) yükselterek OCT kafasını konumlandırın (cw / ccw, mavi oklar). Siyah kol R (*) konumunda olacak şekilde düğmeyi (turuncu ok) döndürerek görüntüye odaklanın. Başparmak vidasını (mor ok) sabitleyerek üniteyi kilitleyin.
- Gözü tutucuya yerleştirin ve ara parçalarla arka yönden stabilize edin (Ek Materyal 1, sayfa 13). Skleranın çentiklenmesini önlemek için mümkün olduğunca az basınç uygulayın. Üstün rektus kası için doku işareti yukarı bakacak şekilde yönlendirin.
NOT: Göz tutucunun önünden OCT cihazına olan yaklaşık mesafe 25 mm'dir. - OCT cihazı için tescilli görselleştirme ve analiz yazılımını açın. Sol sütunda bir hasta listesi görünecektir. Bir iç kod numarası ile endekslenen göz donörleri "hastalar" dır. Üreticinin kullanım kılavuzuna bakın.
- Yeni Hasta simgesini seçin. Hasta veri bilgilerini gerektiği gibi doldurun. Tamam'ı seçin. Tek tek gözler için YYYYNNNL,R_agesex gibi mantıksal olarak sıralanmış bir numaralandırma sistemi kullanın. Örneğin, bu 2017016R_97F olabilir.
- Aşağıdaki pencerede veri girişine devam ettikten sonra OK tuşuna basın. Açılır menüden operatörü seçin ve etüt edin.
NOT: Girilen bilgiler dışa aktarılabilir meta verilerde görünür. - Boş bir ekran görüntüledikten sonra, görüntü yakalamayı başlatmak için sarı düğmeye dokunun.
- IR + OCT tuşlarına basın (kızılötesi yansıtma + OCT'ye yakın). Lazerin fundus ve OCT B-scan'in canlı bir SLO görüntüsünü almasına izin verin.
- ONH ve foveaya göre doğru anatomik pozisyonu sonlandırın ve tutucudaki göz pozisyonunu ayarlamak için ahşap bir aplikatör kullanın. Kontrol panelinde, yoğunluğu ayarlamak için siyah yuvarlak düğmeyi döndürün.
- Ortalama 9-100 kare için aynı düğmeye basın (kırmızı oklar; 9 yeterlidir, 100 kremsi görünür). Ünite doğru yönlendirilmişse, fundus odakta olmalı ve OCT B-taraması ekranın üst üçte birinde görünmelidir (Ek Materyal 2, sayfa 9, çift kırmızı ok).
- Fundus görüntüsünde, foveayı ortalamak üzere mavi çizgiyi hareket ettirmek için imleci kullanın (Ek Materyal 2, sayfa 9, beyaz ok). Acquire (Al) düğmesine basın.
NOT: Diğer varsayılan düğmeler Retina, EDI (kapalı) ve Çizgi Tarama'dır.
- Bir sonraki alma işlemi için RF + OCT tuşlarına basın. Görüntünün hareket etmediğinden veya bozulmadığından emin olmak için konumu yeniden kontrol edin. Ortalama almak için siyah düğmesine basın. Acquire (Al) düğmesine basın.
- Otofloresan görüntüleme için dahili küpü 488 nm ve 787 nm uyarma dalga boylarına geçirin (Ek Materyal 2, sayfa 10).
NOT: Anahtardan sonraki küp konumu gösterilir. - Otomatik floresan modu'nu seçin. Hizalamayı yeniden kontrol edin. Acquire (Al) düğmesine basın.
- Şüpheli RPE bozulması ve atrofisi vakaları için, 787 nm otofloresan için ICGA'yı (indosiyanin yeşil anjiyografi) seçin. Göz pozisyonunu yeniden denetleyin ve ardından Al tuşuna basın.
NOT: Bir fundus görüntüsü genellikle bu modalitede görünmez, çünkü iç küp ışını zayıflatır. - IR için dahili küpü tekrar R'ye ve birim alımı için kırmızısız görüntülemeye geçirin.
NOT: Anahtardan sonraki küp konumu, Ek Malzeme 2'nin 13. sayfasında gösterilmiştir. - OCT birimlerini edinmek için IR'yi ve ses düzeyi ayarını seçin. Kontrol modülündeki uygun düğmeleri değiştirerek Ek Materyal 2'nin 14. sayfasındaki tüm ayarları eşleştirin (30° makula küpü, 30 μm aralık, deneysel gereksinimlere bağlı olarak ortalama).
- Yakın kızılötesi yansıtma fundus görünümünün mavi B tarama çizgileriyle kaplı olduğuna dikkat edin. Sağ pencerenin üst üçte birindeki OCT konumunu tekrar kontrol edin. Kontrol Modülü'nde Acquire tuşuna basın ve ses düzeyi taramasının tamamlanması için 5 dakika bekleyin. Görüntüleme alımı tamamlandığında EXITöğesini seçin. Görüntüler kaydedilecektir (kırmızı ok).
NOT: Mavi çizgiler, önceki görünümde gösterilen mesafeleri mikrometre cinsinden sınırlar. Taramalar numaralandırmaya alttan (aşağı) başlar ve yukarı doğru ilerler. Kırmızı çizgi ilerlemesine dikkat edin. - Bilgisayarın ekranda görünecek olan edinilen görüntüleri işlemesine izin verin (Ek Materyal 2, sayfa 16).
- Bir donörün diğer gözlerini görüntülerken, gözler arasındaki montaj braketinin konumunu değiştirmeyin. Önce sol göz görüntülenirse, sonuçlar OD (sağ göz) sütununda gösterilir. Tüm görüntüleri seçmek için sağ tıklatın ve sonra Exchange OS/OD seçin. Görüntüler işletim sistemi sütununa kaydırılır.
- Veritabanı > > pencere seç'e basın. Ekran varsayılan olarak sağ sütunda görüntülenen donör gözünün eklenmesiyle panel 6'ya ayarlanır (Ek Materyal 2, sayfa 18). Açılır menüde hastaya sağ tıklayın, Toplu İşlem'i seçin ve E2E dosyasını dışa aktarın.
- Dosya aktarımları için masaüstünde oluşturulan önceden belirlenmiş klasöre göz atın. Tamam'ı seçin. Klasör, harici bir sabit sürücüye kopyalanacak ve arşivlenecek E2E dosyalarını içerir.
- Gözünü tutucusuna, esas olarak 787 nm otofloresan için kullanılan taramalı lazer oftalmoskopa getirin.
NOT: Görüntülerin alınması ve arşivlenmesi için üreticinin kullanım kılavuzuna bakın. - Bilgisayarı ve lazeri açın.
- Yeni Hasta simgesini seçin. Hasta verilerini gerektiği gibi tamamlayın.
- Göz veri sayfasını aynı tutmak için Tamam'a basın. C eğrisi aynı kaldığından, Devam'a basın.
- Çalışma modu'nu seçin ve gerekirse parolayı girin. C eğrisini 7,7 mm'de tutun.
- C eğrisini doğrulamak için Devam'ı seçin. Fotoğraf makinesini başlatmak için sarı göstergeyi seçin.
- R konumunu seçin. Dünyayı hizalayın ve yönlendirin. Yukarıdaki gibi odaklanmak ve yönlendirmek için IR modunu seçin.
- Tüm üniteyi tabana göre iki eksende hareket ettirerek (Ek Materyal 2, sayfa 28, yeşil ok) ve ardından ünitenin yüksekliğini (y) yükselterek (mavi oklar) kamera kafasını yönlendirin. Düğmeyi döndürerek görüntüye odaklanın (turuncu ok). Siyah kol R (*) konumundadır. Bu kafa yerine oturduktan sonra, başparmak vidasını (mor ok) çevirerek üniteyi kilitleyin.
- Ekranın Ek Materyal 2'nin 29. sayfasında gösterildiği gibi göründüğünü unutmayın.
- Seçici düğmeyi R'den A'ya taşıyın. ICGA'yı (787 nm otofloresan elde etmek için) mavi, %100 yoğunluk, 30° görüş alanı ve tek fazlı görüntüleme seçenekleriyle seçin.
NOT: Boya indosiyanin yeşili gibi, melanin de 787 nm dalga boyu ışığı ile uyarılır. - Ekranın Ek Materyal 2'nin 31. sayfasında gösterildiği gibi göründüğünü unutmayın. Ortalama almak için siyah diske basın ve ardından Al'ı seçin.
- Pencere > Veritabanı'nı seçin. SLO cihazından E2E dosyalarını içe aktar'ı seçin; Bu dosyalar harici bir sabit sürücüde saklanır ve masaüstüne yüklenir.
- Aç'ı seçin. İşaretlerin varsayılan olduğunu kontrol edin ve Tamam'ı seçin.
- Hastanın artık iki sekmesi olduğunu unutmayın: biri SLO'dan alınan görüntüleri (mavi ok) ve OCT cihazından alınan görüntüleri gösteren diğer sekme (kırmızı ok) (Ek Materyal 2, sayfa 34).
- 786 nm (ICGA) görüntüye sağ tıklayın ve resmi masaüstünde SLO 786 etiketli bir dosyaya dışa aktarın.
- 786 nm otomatik floresan SLO görüntüsünü kaydetmek için hastayı seçin ve görüntüleri masaüstündeki bir klasöre RAW dosyaları (.vol dosyaları için) olarak dışa aktarmak için sağ tıklatın.
- OCT cihazındaki görüntüleri arşiv bilgisayarına aktarmak üzere dışa aktarmak için RAWEXPORT uygulamasından kopyalayıp RAW etiketli bir klasöre yapıştırın.
9. Görüntüleme incelemesi
- Görüntüleri (renk, .vol dosyası, SLO görüntüleri) her bir göz için alt klasörlerle her donör için klasörler halinde birleştirin ve klasörleri laboratuvar kimliğine göre ardışık olarak dizine ekleyin.
- Standart bir rapor için doku gösterimlerini (kalite, patoloji) bir veritabanına kaydedin.
- Dışa aktarılan OCT birimlerini şirket içi bir ImageJ eklentisiyle inceleyin.
- Foveal daldırmanın merkezi, dış retina bantlarının içe doğru yükselişi veya en ince nokta tarafından tanınabilen fovea merkezini bulun. Çoğu durumda, bunlar çakışacaktır, ancak her zaman değil, çünkü bu foveal korumaya, bireysel değişkenliğe ve patolojinin varlığına bağlıdır.
- Üstün perifoveada standart bir tarama bulun (2 mm/67 B-taramaları üstün yönde yapar; yani, tarama sayılarını arttırır).
- Gelecekte hızlı başvuru için tüm birimin .tif bir yığınını kaydedin.
- Özelliklerin tanındığı tarama numaralarını kaydederken, tarama 1'den (alt) başlayarak OCT ses düzeyinin tamamında ilerleyin.
- Makulaya ek olarak peripapiller bölgeyi de kontrol edin.
NOT: Yaşlı gözlerde peripapiller koryoretinal atrofi, belirgin bir bazal laminer tortu ve neovaskülarizasyon içerir. Bu, miyop gözlerde ve glokomda, ayrıca yaşlanmada ve AMD37'de pigmenter değişimin yaygın bir alanıdır.
- Renkli fotoğrafları inceleyin ve mümkünse bulguları OCT tarafından görülenlerle ilişkilendirin.
NOT: Genel olarak, çoğu bulguyu önce OCT'ye kadar görmek daha kolaydır. Renkli fotoğraflar, SLO'daki alanın dışındaki alanın geniş bir görünümünü, nevüs dahil koroidal pigmentasyonu, heme ve sert eksüdaların varlığını ve neovasküler AMD'de siyah pigmenti sağlar. Foveadaki koyu pigment, ön segmentteki gevşek melanozomları temsil edebilir ve bir pipet kullanılarak tamponla nazikçe yıkanmalıdır. - SLO görüntülerini inceleyin ve mümkünse herhangi bir bulguyu OCT tarafından görülenlerle ilişkilendirin.
- Fovea ve perifoveadaki standart B-taramalarını, kayda değer patoloji veya diğer özelliklere sahip ekstra B-taramalarını ve SLO görüntülerini bir patoloji raporuna kaydedin.
- Gözleri şu şekilde kategorize edin: Dikkat Çekici, Sorgulanabilir, Erken-Orta AMD, Atrofik AMD, Neovasküler AMD, Diğer, Bilinmeyen, Derecelendirilemez, Kaydedilmemiş. "Sorgulanabilir", değişikliklerin başka bir kategorizasyon için yeterince ciddi olup olmadığı açık değilse kullanılır. "Not Gradable", ciddi şekilde ayrılmış retinaları olanlar gibi yararlı OCT taramaları olmayan gözler için ayrılmıştır. "Kaydedilmedi", fotoğraf çekmeden alındıktan hemen sonra işlenen gözler için ayrılmıştır.
- AMD için bu kriterleri kullanın: drusen veya subretinal drusenoid birikintileri ile, sıvı veya fibroz gibi neovaskülarizasyon belirtileri olsun veya olmasın ve başka nedenlere dair kanıt olmadan (SDD'leri barındırmak için Curcio ve ark.10'dan güncellenmiştir) ciddi RPE değişikliği.
NOT: Kesin tanı histolojik analiz ile doğrulanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tablo 1, 2016-2017 yılları arasında, diyabetik olmayan 94 beyaz donörden >80 yaş arası 184 gözün iyileştiğini göstermektedir. Ortalama ölüm-korunma süresi 3.9 saat (dağılım: 2.0-6.4 saat) idi. İncelenen 184 gözün 75'inde (%40.2) belirli AMD vardı. Aşağıdaki kategoriler belirlendi: Dikkat Çekici Olmayan (%39,7), Şüpheli (%11,4), Erken-Orta AMD (%22,8), Atrofik (%7,6), Neovasküler (%9,8), Diğer (%8,7) ve Bilinmeyen/Kaydedilmeyen/Derecelendirilemeyen (%<1). Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5, bu seriden son derece iyi korunmuş gözlerin çok ölçekli, multimodal ex vivo görüntülemesini göstermektedir. Gözler, retina hastalığı (J.A.K.) konusunda uzmanlaşmış bir göz doktoru ile işbirliği içinde gözden geçirildi. Bazı gözler bireysel özellikleri diğerlerinden daha iyi gösterirken, bu kılıflar her yönüyle yüksek kalite için seçildi.
38'de açıklandığı gibi, ex vivo renkli fotoğrafçılık, karşılık gelen in vivo fotoğrafçılıktan farklıdır. Retina ödemi ve/veya dekolmanı arka pigmentli dokuların görünürlüğünü azaltabilir. Taze gözlerdeki gözlemler, bu değişikliklerin ölüm sonrası meydana geldiğini ve hızlı fiksasyonla belirgin şekilde kötüleşmediğini göstermektedir. Ek olarak, koroid damarları ölümden sonra boşalır. Soluk damarların ve koyu interstisyel dokunun dalgalı bir arka planı nedeniyle, RPE düzlemindeki pigmenter varyasyonların değerlendirilmesi renk dışındaki modalitelerle desteklenmelidir. In ex vivo OCT, renkli fotoğrafçılıktan daha fazla bilgi mevcuttur. Ex vivo OCT ayrıca in vivo OCT'den önemli ölçüde farklıdır. Başlıca farklılıklar arasında, özellikle iç retinada dokunun genel olarak artan yansıtıcılığı, bazı bantların (sinir lifi tabakası, iç ve dış pleksiform tabaka, RPE) tutarlı yansıtıcılığı, özellikle ödemli retina altında koroid detaylarının daha düşük görünürlüğü ve doku tabakası dekolmanlarının görünürlüğü sayılabilir (aşağıya bakınız). Fotoreseptörleri ve RPE'yi (elipsoid zon, EZ; interdijitasyon bölgesi, IZ) içeren dış retinal hiperreflektif bantlar tutarsız bir şekilde ex vivo olarak görülebilir ve bu bağlamda yer işaretleri olarak kullanılmaz. Spektral alan OCT için klinik fikir birliği, RPE-Bruch membran (BrM) bandı terimini kullanır. Bununla birlikte, RPE-bazal lamina (BL)-BrM bandı terimi, AMD24'te bazal laminer birikintilerin görünümünü barındırdığı için tercih edilmektedir.
Şekil 2'de dikkat çekici olmayan bir makula ve hiporeflektif büyük koroid damarları, ikisi arasında yansıtıcı bir RPE-BL-BrM bandı görülmektedir. İç retinadaki büyük bir damar arka tabakalara gölge düşürür. IPL ve OPL orta derecede yansıtıcıdır. NIR SLO'da hem retinal hem de koroidal vaskülatürler görülebilir. Kırmızısız yansıtma SLO'su, iç retina ve kavisli lifler ve NFL'nin papillomaküler demeti gibi vitreoretinal arayüzlerin özellikleri için en iyi şekilde çalışır. Normal gözlerde, 488 nm otofloresan SLO, kalınlaşmış parafovea ve bazı durumlarda sarı ksantofil pigmenti tarafından emilimin yanı sıra bağ dokusu kılıflarını düşündüren büyük retinal damarları kaplayan hiperotofloresan nedeniyle merkezi makulada genel olarak azalmış sinyal alanı gösterir. 787 nm'deki otofloresan, RPE'den merkezi makulada küçük bir artmış sinyal bölgesini, koroidal stromada bir sinyali ve koroidal damarlara karşılık gelen hipootofloresan çizgileri gösterir.
Şekil 3 , erken orta AMD'li bir makulayı göstermektedir. Görünür özellikler arasında yumuşak bir drusen (fovea yakınında kubbe şeklinde RPE yükselmesi), SDD'ler (RPE-BL-BrM bandına iç dentat görünümlü aralıklı yansıtıcılık), hiper-yansıtıcı odaklar (HRF, retinada bulunan katman içi RPE ile aynı yansıtıcılığa sahip yansıtıcı malzeme) ve vitelliform değişim (RPE organellerinin hem hücre içi hem de hücre dışı bir şekilde içe doğru genişlemesi), bazal laminer birikintileri ile birlikte39). Renkli fotoğraf, azaltılmış pigmentasyon ile çevrili vitelliform lezyona karşılık gelen güçlü pigmentasyonu gösterir. Ne drusen ne de SDD'ler renkle açıkça görülemez. NIR yansıması foveadaki yansıtıcılığı gösterir. 488 nm uyarımdaki otofloresan, foveada benekli bir sinyal gösterir. SDD'ler SLO modalitelerinde zaman zaman ortaya çıkar; SDD'ler bol ise ve SDD'ler en kolay şekilde düzenli aralıklarla yerleştirilmiş bir noktalama paterni olarak görülüyorsa bu daha olasıdır (bkz. Spaide ve Curcio19, Şekil 6). Şekil 3I'deki foveadan üstün ve zamansal desen SDD değildir, çünkü düzensizdir ve yüzeysel bir odak düzlemine lokalize edilmiştir. Tüm en yüz modaliteleri foveadan yayılan ince kıvrımlar gösterir. Daha az korunmuş gözlerde, benzer kıvrımlar en düşük görüntüleme büyütmelerinde görülebilecek kadar büyük olabilir.
Şekil 4'te atrofik AMD'li bir makula görülmektedir. Renkli fundus fotoğrafçılığı, parafoveadaki dairesel atrofik alanları, merkezi hiperpigmentasyonu ve OCT'de Henle fiber tabakası-dış nükleer tabaka (HFL-ONL) seviyesinde HRF'ye karşılık gelen küçük hiperpigmente noktaları gösterir. Ek olarak, OCT'de, düşük düz RPE yüksekliği bazal laminer birikinti, eksüdatif olmayan tip 1 neovaskülarizasyon veya her ikisini de temsil edebilir. Foveal B-taramasındaki atrofi, HFL-ONL'nin çökmesi, bir hipertransmisyon alanı (koroide parlayan ışık), foveal merkezde artan gölgelenme ile vitelliform bir değişiklik ve gölge oluşturan HRF ile tanınabilir. Bu gözde, NIR yansıması foveada hiper-yansıtıcı noktalar gösterir. 787 nm uyarımdaki otofloresan, foveal hiperpigmentasyona ve dairesel atrofik alanlarda bir sinyalin yokluğuna karşılık gelen bir sinyali etkili bir şekilde gösterir. Kırmızısız ve 488 nm otofloresan iç retinal özellikleri gösterir.
Şekil 5'te neovasküler AMD'ye sekonder makula atrofisi olan bir makula görülmektedir. Renkli fundus fotoğrafı, atrofik bölgede siyah pigmentasyonu gösterir. OKT, HFL-ONL'nin sarkması (subsidans) ve artmış hipertransmisyon ile atrofi gösterir. Foveal B-taraması, subfoveal hiperreflektif materyal ve intraretinal kistlerden oluşan bir höyüğü gösterir. Yakın kızılötesi yansıma, RPE ve koroidal damarların kaybına bağlı olarak atrofik bölgede yansıtıcılık gösterir. Foveadaki küçük, yoğun yansıtıcı bir alan renk üzerinde görünmez. Kırmızısız yansıma retinal damarları ve dairesel bir bölge içinde koroidal damarları gösterir. Otofloresan (488 nm), kabaca dairesel bir atrofik sınır ve yeni başlayan atrofi adalarını açıkça göstermektedir. Sinyalden yoksun merkezi bir alan, orta derecede sinyal ve görünür koroid damarlarından oluşan bir anulus ile çevrilidir.
Şekil 6, ex vivo OCT görüntülemede yaygın yapıları göstermektedir. Ödem iç retinada belirgin olabilir, fovea boyunca şişkinlikler ve kıvrımlar oluşturabilir (Şekil 6A, I). Mekanik hasar, vitreus üzerindeki traksiyonla veya retinanın diseksiyon aletleriyle doğrudan teması ile ortaya çıkabilir, bu da malzemenin yerinden çıkmasına ve bazen de bu malzemenin kaybına neden olur (Şekil 6F, G). Dekolmanlar çoklu doku düzlemleri boyunca meydana gelebilir ve in vivo olarak da meydana gelen katmanlar arasındaki göreceli gerilme kuvvetlerini temsil edebilir. Herhangi bir ayrılma, sonraki işlemlerden sonra daha da genişleyebilir. En sık görülen ayrılma retinaldır (yani fotoreseptör dış segmentleri ile RPE'nin apikal süreçleri arasında) (Şekil 6B-D, F-I). Apikal süreçler ya dış segmentlerden ayrılabilir ya da histoloji tarafından belirlendiği gibi RPE hücre gövdelerinde kalabilir. Retina dekolmanları büyük ve kabarık (Şekil 6 B,D,I) veya dar ve zar zor fark edilebilir (Şekil 6C,F,G) olabilir. Basiller tabaka dekolmanı (BALAD40) ilk olarak laboratuarda görülmüş ve daha sonra klinik OKT'de bulunmuştur. BALAD, fotoreseptör iç segmentlerinin miyoid kısmından bir bölünmeye atfedilir, bu da iç segmentin elipsoid kısmını ve RPE'ye bağlı dış segmenti bırakır (Şekil 6A, D, I). BALAD, ex vivo OCT'de SDD ile karıştırılmamalıdır. Üçüncü bir ayrılma düzlemi iç sınırlayıcı membrandır (ILM) ve ILM ile kalan retina tabakaları arasında sıklıkla rezidüel yansıtıcı sıvı bulunur (Şekil 6A, B, I). En az görülen ayrılma koroid ve sklera arasındadır (Şekil 6C). Fovea sıklıkla neovaskülarizasyon belirtileri gibi destekleyici kanıtlar olmadan patolojik olarak kabul edilmemesi gereken kistoid boşluklar sergiler (Şekil 6H). Tek B taramalarında, RPE'nin dalgalanmaları drusen izlenimi verebilir. Bir OCT hacminin 3D görünümü, bunların koroidal damarlar boyunca hareket ettiğini açıklığa kavuşturur (Şekil 6E, J). Dalgalanmalar, damarlar arasındaki diferansiyel hacim değişikliklerine ve ölümden sonra ve fiksasyon sırasında araya giren stromaya bağlı olabilir.
Kalite beklentilerini kalibre etmek ve ex vivo OCT'nin sınırlamalarını araştırmak için, Şekil 7, klinik olarak belgelenmiş üç gözün in vivo görüntüleme, ex vivo görüntüleme ve histolojisini AMD ile karşılaştırmaktadır. Bu üç göz, Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5'tekilerden farklı olarak korunmuştur. Subselüler41 olan yapısal OKT yansıtıcılık kaynaklarını doğrulamak için, Şekil 7'deki gözler, yüksek çözünürlüklü epoksi reçine histolojisine ve korelasyonlu elektron mikroskobuna izin vermek için% 2.5 glutaraldehit ve% 1 glutaraldehit içinde korunmuştur. Glutaraldehit, bu örneklere Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5'tekilere göre opaklık ekler. Daha kısa ve daha uzun bir DtoP'nin etkisi açıktır (Şekil 7A-F, 2.1 saat ve Şekil 7G-I, 8.9 h). Daha uzun DtoP'lu gözde postmortem ödem retina konturunu değiştirdi ve ILM ayrıldı. İlgilenilen patoloji (dış retina tübülatı) ex vivo görüntülemede incelikliydi. Göz izlenen in vivo OCT, ilgili B-taramasını tam olarak belirlediği ve koroid damarlarının eşleştirilebildiği için bulundu. Daha kısa DtoP'li iki gözde bazı majör patolojiler (tip 3 maküler neovaskülarizasyon) hemen belirgindi (Şekil 7A-C). Diğerleri göz izlemenin yardımıyla bulundu (Şekil 7D-F).
Şekil 1: Retinanın daldırma fiksasyonu için insan donör gözünden kornea eksizyonu. Sol üstte, eksize edilen donör gözü, bir hemostat tarafından stabilize edilmiş bir gazlı bez kılıfı tarafından yerinde tutulur; sağ üstte, kornea ve 2 mm genişliğinde bir sklera kenarı dahil olmak üzere dairesel bir skor yapmak için 18 mm'lik bir trefin kullanılır; ortada, puanlanan daire, küre stabilize edilirken, yaylı kavisli uçlu makaslı bir kesimle tamamlanır; sol altta, kornea ve skleral jant kaldırılır, iris (mavi) ve siliyer gövdeyi (tan-kahverengi) açığa çıkarır; alt orta, jantlı kornea tamamen kaldırılır; Sağ altta, iris, koruyucunun vitreus odasına nüfuz etmesini kolaylaştırmak için pupilla kenarına dik olarak kesilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Dikkat çekici olmayan bir makulanın multimodal ex vivo görüntülemesi. 82 yaşında bir kadın donörden alınan ve 1.97 saatlik bir ölüm koruma aralığına sahip bir makula. (A) Ön segment çıkarılarak görüntülenen sağ gözün fundusu (epi-aydınlatma). (B) Makülanın yakın çekimi (epi-aydınlatma). (C) Foveanın yakından görünümü (epi-aydınlatma). Yeşil çizgiler, OCT B taramalarının D ve E panellerindeki yerlerini gösterir. (D,E) OCT B-(D) superior perifovea (E) ve fovea boyunca tarama yapar. Retina ( R ), hiporeflektif büyük damarları olan koroid (C) ve araya giren hiper-reflektif RPE-BL-BrM bandı görülebilir. Bu son derece iyi korunmuş gözde, orta derecede yansıtıcı IPL ve OPL de görülebilir. (D) İç retinadaki büyük bir damar arka tabakalara gölge düşürür. (E) Panel E'de (sarı ok ucu) retina ve RPE arasındaki ayrım yapaydır. (F) Yakın kızılötesi yansıma hem retinal hem de koroidal vaskülatürlerin detaylarını gösterir. (G) Kırmızı-serbest yansıma, sinir lifi tabakasının kavisli liflerini (sol yeşil kavisli ok) ve papillomaküler demetini (yeşil ok) gösterir. (H) 488 nm dalga boyundaki otofloresan, kalınlaşmış ödemli parafovea, halkalar ve foveal merkezde düşük sinyal noktası ve büyük retinal damarları kaplayan hiperotofloresan nedeniyle merkezi makulada genel olarak azalmış sinyal alanını gösterir ve bu da bağ dokusu kılıflarını düşündürür. (I) 787 nm'deki otofloresan, RPE'den merkezi makulada küçük bir artmış sinyal bölgesini, koroidal stromada bir sinyali ve koroidal damarlara karşılık gelen hipootofloresan çizgileri gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Erken ara AMD ile donör gözün multimodal ex vivo görüntülemesi. Ölüm-koruma aralığı 3.1 saat olan 97 yaşındaki bir kadın donörden donör gözü. (A) Ön segment çıkarılmış olarak görülen sağ gözün fundusu (epi-aydınlatma). (B) Makülanın yakın çekimi (epi-aydınlatma). Yeşil çizgiler, OCT B taramalarının D, E ve F panellerindeki konumlarını gösterir. (C) Hiperpigmentasyonu gösteren foveanın yakından görünümü (ok, flaş aydınlatması). (D) Süperior perifoveada (turuncu oklar) SDD Ekim ayında görülür. I Vitelliform fovea (beyaz oklar) altındaki RPE'de değişim. (F) Fovea'nın aşağısında, tabanda hiporeflektif bir çizgi (sarı ok) ve yukarıda hiper-yansıtıcı bir odak (açık mavi ok) bulunan yumuşak bir drusen bulunur. (G-I) Taramalı lazer oftalmoskop görüntüleri, foveada çok ince yıldız kıvrımları gösterir (C'de de görülür). (G) Yakın kızılötesi yansıma, kısmen vitelliform malzemeye karşılık gelen foveadaki yansıtıcılık malzemesini gösterir. (H) Kırmızısız yansıma retina yüzeyini gösterir. (I) 488 nm dalga boyu otofloresansı, hafifçe kalınlaşmış bir parafovea nedeniyle merkezi makulada genel olarak azalmış bir sinyal alanı gösterir. SDD'ler açıkça görülemez. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yaşa bağlı makula dejenerasyonunda tam RPE ve retina atrofisinin multimodal ex vivo görüntülemesi. 97 yaşında bir kadından ölüm-koruma aralığı 2.33 saat olan donör gözü. (A) Sol gözün fundusu trans-aydınlatma ile görüntülendi. (B) Makülanın yakın çekimi (epi-aydınlatma). Yeşil çizgiler, OCT B taramalarının D ve E panellerindeki yerlerini gösterir. (C) Merkezi hiperpigmentasyon (yeşil ok ucu) ve küçük hiperpigmente noktaları (sarı ok uçları) gösteren foveanın yakın çekimi (epi-aydınlatma). Merkezi nokta yoğun kahverengidir çünkü üstteki retina çok incedir. Noktalar doymamış görünüyor çünkü üstteki retina kalın. Dairesel atrofik alanlar belirtilmiştir (beyaz ok uçları). (D,E) OCT B-(D) perifovea (E) ve fovea boyunca tarar. Retina ( R ) ve ince koroid (C) görülebilir durumdadır. (D) HFL-ONL seviyesindeki hiper-reflektif odaklar (sarı ok uçları), C'deki hiperpigmente noktalara karşılık gelir. Altlarındaki düşük düz RPE yüksekliği bazal laminer birikintiyi, eksüdatif olmayan tip 1 neovaskülarizasyonu veya her ikisini birden temsil edebilir. (E) Fovea boyunca B-taraması, HFL-ONL'nin (kırmızı ok ucu) çökmesi, bir hipertransmisyon alanı, foveal merkezde artan gölgelenme ile vitelliform bir değişiklik (yeşil yıldız) ve gölgeleme ile hiper-yansıtıcı odakların (deniz mavisi ok ucu) çökmesiyle tanınabilen atrofi gösterir. Retina ve RPE bandı arasındaki hiporeflektif boşluk subretinal sıvıyı temsil edebilir. (F) Yakın kızılötesi yansıma, foveadaki hiper-yansıtıcı noktaları gösterir. (G) Kırmızısız görüntü, NFL'nin kavisli liflerini ve retina yüzeyindeki yansıtıcı çiçekleri gösterir. (H) Retinaya odaklanmış 488 nm otofloresan, retina damarlarıyla ilişkili bir sinyal gösterir, RPE ile ilişkili sinyal yoktur ve merkezi makula bölgesinde soluk otofloresan lekeler gösterir. (I) 787 nm otofloresan, C'deki pigmentasyona karşılık gelen bir sinyal gösterir. Dairesel atrofik alanlar belirgindir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Yaşa bağlı makula dejenerasyonunda tip 1 neovaskülarizasyon ve makula atrofisinin multimodal ex vivo görüntülemesi. 86 yaşında bir kadın donörden ölüm-koruma aralığı 3.5 saat olan bir donör gözü. (A) Sol gözün fundusu, ön segment çıkarılmış olarak görüntülendi (trans-aydınlatma). (B) Atrofik sınırları detaylandıran makulanın yakın çekimi (sarı ok uçları). Yeşil çizgiler, OCT B taramalarının D ve E panellerindeki yerlerini gösterir. (C) Foveanın yakın çekimi, atrofik bölgede siyah pigmentasyon (yeşil ok uçları) gösterir. (D,E) OCT B-(D) perifovea (E) ve fovea boyunca tarar. Retina I ve ince koroid (C) görülebilir. Bu son derece iyi korunmuş gözde, orta derecede yansıtıcı IPL ve OPL de görülebilir. (D) Perifovéal B-taraması, atrofik alanın üstün kenarını sıyırır. Atrofi, HFL-ONL'nin sarkması ve hipertransmisyonun artması (kırmızı ok uçları) ile kanıtlanır. Olası subretinal drusenoid birikintileri belirtilir (fuşya ok uçları). (E) Foveal B-taraması, subfoveal hiper-reflektif materyal ve intraretinal kistlerden (yıldız işareti) oluşan bir höyüğü gösterir. O = optik sinir başı. (F) Yakın kızılötesi yansıma, merkezi makulada (turuncu ok ucu) renkli görüntüleme ile görülemeyen küçük bir yoğun alan da dahil olmak üzere, atrofi ve koroid damarlarının (deniz mavisi ok uçları) yansıtıcı bir alanını gösterir. (G) Kırmızısız yansıma retinal damarları ve dairesel bir bölge içinde koroidal damarları gösterir. (H) 488 nm otofloresan, kabaca dairesel bir atrofik sınırı (sarı ok uçları) ve yeni başlayan atrofi adalarını gösterir. Otofloresandan yoksun merkezi bir alan, orta derecede otofloresan ve görünür koroidal damarların (beyaz ok uçları) bir anulusu ile çevrilidir. Bu gözde 787 nm otofloresan mümkün değildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Donör gözlerin ex vivo OCT görüntülemesinde görülen yaygın artefaktlar. Bu gözler 2016-2017 göz serisinden geliyor. Çoğu retina, in vivo olarak görüntülenen retinalara göre hiper-yansıtıcıdır ve iç retina katmanları dış retina katmanlarından daha yansıtıcıdır. Basiller dekolmanı (A, D, G ve I panellerindeki sarı ok uçları), fotoreseptör iç segment miyoidinin seviyesinde, belirgin bir retina içi boşluk40 oluşturan bir bölünme olarak tanımlanır. Retina dekolmanı (B, C, D, F, G ve I panellerindeki yeşil ok uçları), tüm nörosensoriyel retinanın altta yatan RPE42'den ayrılmasını tanımlar. İç sınırlayıcı membranın (ILM) ayrılması, ILM ve sinir lifi tabakasını (A, B ve I panellerindeki kırmızı ok uçları) ayırır. Bir koroid dekolmanı (C panelindeki mavi ok ucu), koroid içinde veya koroid ile sklera arasında bir ayrımdır. Mekanik hasar (F ve G panellerindeki mor ok), eksik malzeme (G panelindeki yeşil ok) ve yerinden çıkmış malzeme (G panelindeki sarı ok) için geçerli olduğu gibi, herhangi bir seviyede ve herhangi bir boyutta görünebilir. Retinal ödem (A ve I panellerindeki mor yıldızlar), retina dokusunun ayrı retina tabakaları arasında kötü tanımlanmış sınırlarla kalınlaşması olarak ortaya çıkar. Dalgalı bir RPE (E ve J panellerindeki mavi oklar) düzensiz, dalgalı bir RPE katmanı olarak görünür. Kistoid lezyonlar (H panelindeki kırmızı kare), retina dokusunda, genellikle foveada bulunan hiporeflektif oda benzeri değişikliklerle ilişkilidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: İn vivo görülen patolojinin ex vivo görünürlüğü koruma kalitesine bağlıdır.(A-Ben) Paneller A, Bve CPanel D, Eve Fve paneller G, Hve Ben Her biri göz izleme ile görülen iki donörden klinik olarak belgelenmiş üç gözü temsil eder in vivo (A1-A2,D1-D2,G1-G2) ve ex vivo (B1-B2,E1-E2,H1-H2) görüntüleme, ardından histoloji (C,F,Ben). Yakın kızılötesi yansıma üzerindeki yeşil çizgiler (NIR, A1,B1,D1,E1,G1,H1) optik koherens tomografi (OCT) B-taramaları ve panoramik histoloji düzeylerini temsil eder. Panel A, Bve C ve paneller D, Eve F, 90'lı yaşlarındaki bir kadın donörün sırasıyla sağ ve sol gözünü sunar. Panel G, Hve Ben 90'lı yaşlarında ikinci bir kadın donörün sağ gözünü gösterin. (A-C) İyi korunmuş oküler doku (DtoP: 2.1 h) majör patolojinin iyi görülebilmesini sağlar. (A) Hiper-reflektif intraretinal makula neovaskülarizasyonu (tip 3 MNV, yeşil ok ucu) ölümden 17 ay önce retina içi sıvı ile çevrilidir (A2). RPE / Bruch'un membran kompleksi hiporeflektif malzeme ile bölünmüştür ve "çift katmanlı" bir işaret olarak görünür (A2). Solda, koroide (turuncu ok ucu) barkod hiperiletimi olan başka bir çift katmanlı işaret vardır. Üzerinde ex vivo EKİM (B2), tip 3 MNV ve barkod hipertransmisyon açıkça görülebilir ve tanımlanmıştır. Retina, beyaz ok ucunun gösterdiği gibi yapay olarak ayrılır. Panoramik histolojide dikey yönelimli tip 3 MNV lezyonu (yeşil ok ucu, C1). Önceki araştırmalara bakın43,44 orijinal davanın ayrıntıları için. (D-F) İyi korunmuş oküler doku (DtoP: 2.1 saat), majör patolojiyi tespit etmek için azalmış ancak yine de yeterli saydamlığa neden olabilir. EKİM (D2), eksüdatif tip 3 MNV için takip edilen bir gözde intraretinal hiper-reflektif odakların (HRF, fuşya ok ucu) bir yığınını gösterir. Ölümden 11 ay önce retinal kist görülmez. Üzerinde ex vivo EKİM (E2), HRF yığını dikey olarak sıkıştırılır (fuşya ok ucu) ancak açıkça tanımlanmıştır. Panoramik histoloji üzerine (F1), retinal pigment epitel kulesi (fuşya ok ucu) yumuşak bir boğulmadan yukarı doğru yükselir. (G-Ben) Daha az korunmuş oküler doku (DtoP: 8.9 saat) majör patolojinin görünürlüğünün azalmasına neden olur. OCT, ölümden 48 ay önce bir dış retina tübülasyonunu (ORT, sarı ok ucu) gösterir (G2). Üzerinde ex vivo Ekim ayında, ORT ince bir rahatsızlık olarak görünür ve bunu önceden bilgi olmadan ayırt etmek zor olurdu (H2). İç sınırlayıcı membran yapay olarak ayrılır (beyaz ok ucu). Ödem retina konturunu bozmuştur. Histolojik analiz, dış sınırlayıcı membran tarafından sınırlandırılmış ORT lümenini ve içine çıkıntı yapan fotoreseptörleri göstermektedir (Ben1). Önceki araştırmalara bakın26,45 orijinal davanın ayrıntıları için. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Sayılar | Yüzde | |||||
| Teşhis kategorisi | Sağ Gözler | Sol Gözler | Toplam | Sağ Gözler | Sol Gözler | Toplam |
| Olağanüstü | 39 | 34 | 73 | 41.50% | 37.80% | 39.70% |
| Şüpheli AMD | 10 | 11 | 21 | 10.60% | 12.20% | 11.40% |
| Erken AMD | 20 | 22 | 42 | 21.30% | 24.40% | 22.80% |
| Atrofik AMD | 6 | 8 | 14 | 6.40% | 8.90% | 7.60% |
| Neovasküler AMD | 11 | 7 | 18 | 11.70% | 7.80% | 9.80% |
| Başka | 7 | 8 | 15 | 7.40% | 8.90% | 8.20% |
| Bilinmeyen | 0 | 0 | 0 | 0.00% | 0.00% | 0.00% |
| Kaydedilmedi | 1 | 0 | 1 | 1.10% | 0.00% | 0.50% |
| Toplam | 94 | 90 | 184 | 100.00% | 100.00% | 100.00% |
| Belirli AMD | 37 | 37 | 75 | 39.40% | 41.10% | 40.20% |
| Olası AMD | 47 | 48 | 95 | 50.00% | 53.30% | 51.60% |
| Gözler 6/17/16 - 9/14/17 döneminde açıldı. Kriterler: ≥ 80 yaş, beyaz, diyabetik olmayan, ≤6 saat ölümden korunmaya. Hedef: 184 göz (90 donörün 180 gözü korunmuş; 4 donörün 4 gözü korunmuş) Ölümden korunmaya kadar geçen süre (ortalama, maksimum, minimum): 3,9 saat, 6,4 saat, 2,0 saat | ||||||
Tablo 1: 2016-2017 yılları arasında donör gözünün iyileşmesi.
Ek Materyal 1: Diseksiyona genel bakış, renkli fundus fotoğrafçılığı ve OCT tabanlı multimodal görüntüleme. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Materyal 2: Bölüm 5-8'deki adımları göstermek için OCT tabanlı multimodal görüntülemenin ayrıntıları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
COVID öncesi dönemde 16 aylık bir dönemde popülasyona dayalı bir tarama yaklaşımı kullanılarak, AMD ile 75 donör gözü temin etmek mümkün olmuştur. Hepsi kısa bir DtoP ile kurtarıldı ve OCT-anchored MMI kullanılarak sahnelendi. Yaş kriteri (>80 yaş), nakledilebilir kornealara yönelik doku geri kazanımları için tipik yaş aralığının dışındadır. İlerlemiş yaşa rağmen, kriterlerimiz AMD'nin tüm aşamalarında gözlerle sonuçlandı. Birçok RPE fenotipi tüm AMD aşamalarında ortaktır ve bazıları neovasküler AMD 3,46'ya özeldir. Ex vivo ve in vivo görüntülemenin doğrudan karşılaştırılması (Şekil 7), kısa DtoP'nin, uzman kullanımı ile birlikte (Şekil 1), üst düzey tanısal sınıflandırma için yeterli olan dış retinanın ex vivo görüntülerini üretmede kritik bir faktör olduğunu ve bu örneklerin bazılarının görüntüleme ile histoloji arasındaki doğrudan korelasyonlar için uygun olduğunu doğrulamıştır4,35, 47. Tüm patolojiler ex vivo olarak görünmez. Bununla birlikte, OCT kullanıldığında, renkli fotoğrafçılığa dayalı yöntemler10'a, özellikle retinayı RPE / koroid27'den ayırmayı içerenlere kıyasla çok daha fazlası görülebilir. Ayrıca, klinik OCT'den göz izleme, dikkati fokal ve bazen küçük özelliklere yönlendirir (Şekil 7).
Bu koruma sistemi, tipik göz bankacılığı prosedürlerini ve kornea çıkarılması için araçları ve ardından açılmış bir gözün önceden sağlanan bir koruyucuya daldırılmasını içerir. Bu sayede göz bankası personeli araştırma dokularını sürekli olarak (7/24) geri kazanabilmektedir. İkinci özellik kritiktir, çünkü acil karmaşık diseksiyonlara yönelik dokular27,32 araştırmacılar, göz bankası veya her ikisi tarafından günün her saatinde personel gerektirir. PAXgene Doku Sistemi ve Hibernate-A gibi herhangi bir saatte doku iyileşmesini sağlayacak diğer stabilizatörler, çalışma saatleri boyunca özel diseksiyon ve ekstraksiyonların ardından, OCT görüntüleme ile uyumluysa, gelecekte yardımcı olabilir.
Bu yaklaşım, RPE'ye büyük ölçüde bağlı kalan ve böylece OCT görüntülemeye çevrilebilir veriler üretebilen retinalar verir. Kesin lokalizasyon esastır çünkü makula küçüktür (retina alanının% <3'ü). Ayrıca, tortu güdümlü AMD ilerlemesi, koni ve çubukların topografyası48 ile uyumludur ve en erken başlangıçlı ve en kalıcı görme kusurları belirli bir yerde (yani, tüm koni foveasının yanındaki çubuk içeren parafovea) meydana gelir49. OCT ile karşılaştırıldığında, kolorimetrik boyalarla immünohistokimya, hem etiketli hem de etiketsiz tüm doku elemanlarını hesaba katmak için kapsamlı mikroskopi (örneğin, parlak alan) ile uyumludur4. Örnekleme dizilerine dayanan hedeflenmemiş moleküler analizler, çözünürlüğü etkili bir şekilde artırmak için dikey olarak bölümlere ayrılmış fotoreseptörlerin ve RPE'nin yatay hizalamasından yararlanabilir. 8 μm çapında ve 10-15 μm aralıklarla iyonlaştırıcı lazer darbeleri ile kütle spektrometresinin görüntülenmesi, düzinelerce lipiti dış retina hücrelerinin hücre altı bölmelerine lokalize edebilir50. Mekansal olarak çözülmüş transkriptomikler, doku kesitlerinin uygulandığı cam slaytlar üzerinde önceden düzenlenmiş bir dizi barkodlu ters transkripsiyon primeri kullanır51. Bu teknoloji şu anda 55 μm çap yakalama ve 100 μm aralık ile sınırlıdır; Bu teknolojiyi AMD araştırmaları için uygun hale getirecek çözünürlükte iyileştirmeler beklenmektedir.
Bu protokolün sınırlamaları vardır. İyileşme kriteri, her iki hastalıkta da koroidin önemi nedeniyle diyabet tanılarını (Alabama'daki Medicare alıcıları arasında% 30)52 atlar. Bu dışlama, genel donör havuzunu azaltır ve bir çalışma için yeterli göz toplamak için gereken süreyi uzatır. Tarihsel nedenlerden dolayı, 2016-2017 kriterleri, şu anda eyalet çapındaki göz bağışçılarının% 14'ünü temsil eden siyah bağışçıları ihmal etti ve siyah bağışçılar şimdi mevcut potansiyel projelere dahil edildi. Göz bağışçısı olmak isteyen kişiler için önceden yönerge kaydı kapsamlıdır, ancak AMD hastalarına bakım veren yerel retina uzmanlık uygulamalarına henüz uygun kayıt içermemektedir; Bu proje şu anda geliştirilme aşamasındadır. Bunun gibi popülasyon bazlı bir tarama sırasında, AMD ile fenotipte örtüşen koşullara sahip gözler görünecek ve gelişen klinik literatüre ve retina hastalıklarında uzmanlaşmış bir göz doktoruna danışılarak tanınmalıdır. Örneğin, bu göz serisi, drusen53'lü nevüs ve bir pakikap (iç koroidde kalın bir damar) üzerinde bir RPE bozukluğu çizgisi içeriyordu54. Son olarak, erken ve orta seviye AMD, Atrofi Sınıflandırması Toplantısıgrup 55 tarafından geliştirilmekte olan AMD için OCT tabanlı bir derecelendirme sisteminin bulunmaması nedeniyle birleştirilmiştir. Bununla birlikte, doku iyileşmesinin optimizasyonu ve OCT tabanlı karakterizasyonu, AMD araştırmalarının, finansman uygulamalarında planlanacak, güçlendirilecek, programlanacak ve bütçelenecek gözle izlenen OCT'ye bağlı MMI'nın zaman unsurundan yararlanmaya odaklanmasına olanak tanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
C.A.C., Heidelberg Engineering'den araştırma desteği alır ve Apellis, Astellas, Boehringer Ingelheim, Character Bioscience ve Osanni'ye danışmanlık yapar. T.A., Novartis'ten araştırma desteği alır ve Roche, Novartis, Bayer, Nidek ve Apellis için danışmanlık yapar. K.B.F. Genentech, Zeiss, Heidelberg Engineering, Allergan, Bayer ve Novartis'in danışmanıdır.
Acknowledgments
Orijinal göz tutucunun enstrümantasyonu ve tasarımı için Heidelberg Engineering'e, OCT tabanlı multimodal görüntülemeye giriş için Richard F. Spaide MD'ye, klinik görüntüleme cihazlarına erişimi kolaylaştırdığı için Christopher Girkin MD'ye ve Şekil 1 için David Fisher'a teşekkür ederiz. Araştırma için insan donör gözlerinin geri kazanılması, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01EY06019 (C.A.C.), P30 EY003039 (Pittler), R01EY015520 (Smith), R01EY027948 (C.A.C., T.A.) hibeleri tarafından desteklenmiştir. R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) ve U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), Alabama EyeSight Vakfı, Uluslararası Retina Araştırma Vakfı (C.A.C.), Arnold ve Mabel Beckman Maküler Araştırma Girişimi (C.A.C.) ve Körlüğü Önleme Araştırmaları AMD Catalyst (Schey).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beakers, 250 mL | Fisher | # 02-540K | |
| Bottles, 1 L, Pyrex | Fisher | # 10-462-719 | storage for preservative |
| Bunsen burner or heat source | Eisco | # 17-12-818 | To melt wax |
| Camera, digital | Nikon D7200 | D7200 | |
| Computer and storage | Apple | iMac Pro; 14 TB external hard drive | Image storage |
| Container, insulated | Fisher | # 02-591-45 | For wet ice |
| Containers, 2 per donor, 40 mL | Fisher | Sameco Bio-Tite 40 mL # 13-711-86 | For preservative |
| Crucible, quartz 30 mL | Fisher | # 08-072D | Hold globe for photography |
| Cylinder, graduate, 250 mL | Fisher | # 08-549G | |
| Disinfectant cleaning supplies | https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html | ||
| Eye holder with lens and mounting bracket | contact J. Messinger | jeffreymessinger@uabmc.edu | custom modification of Heidelberg Engineering original design |
| Face Protection Masks | Fisher | # 19-910-667 | |
| Forceps, Harmon Fix | Roboz | # RS-8247 | |
| Forceps, Micro Adson | Roboz | # RS-5232 | |
| Forceps, Tissue | Roboz | # RS-5172 | |
| Glass petri dish, Kimax | Fisher | # 23064 | |
| Gloves Diamond Grip | Fisher | # MF-300 | |
| Gowns GenPro | Fisher | # 19-166-116 | |
| Image editing software | Adobe | Photoshop 2021, Creative Suite | |
| KimWipes | Fisher | # 06-666 | |
| Lamps, 3 goosenecks | Schott Imaging | # A20800 | |
| Microscope, stereo | Nikon | SMZ 1000 | for dissection |
| Microscope, stereo | Olympus | SZX9 | color fundus photography |
| Paraformaldehyde, 20% | EMS | # 15713-S | for preservative; dilute for storage |
| pH meter | Fisher | # 01-913-806 | |
| Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2 | EMS | # 11600-10 | |
| Ring flash | B & H Photo Video | Sigma EM-140 DG | |
| Ruby bead, 1 mm diameter | Meller Optics | # MRB10MD | |
| Safety Glasses 3M | Fisher | # 19-070-940 | |
| Scanning laser ophthalmoscope | Heidelberg Engineering | HRA2 | |
| Scissors, curved spring | Roboz | # RS-5681 | |
| Sharps container | Fisher | # 1482763 | |
| Shutter cord, remote | Nikon | MC-DC2 | |
| Spectral Domain OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA&OCT | https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf |
| Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter | McMaster-Carr | # 9529K31 | |
| Tissue marking dye, black | Cancer Diagnostics Inc | # 0727-1 | |
| Tissue slicer blades | Thomas Scientific | # 6767C18 | |
| Trephine, 18-mm diameter | Stratis Healthcare | # 6718L | |
| TV monitor (HDMI) and cord for digital camera | B&H Photo Video | BH # COHD18G6PROB | for live viewing and remote camera display features |
| Wax, pink dental | EMS | # 72670 | |
| Wooden applicators | Puritan | # 807-12 |
References
- Spaide, R. F., et al. Consensus nomenclature for reporting neovascular age-related macular degeneration data: Consensus on neovascular age-related macular degeneration nomenclature study group. Ophthalmology. 127 (5), 616-636 (2020).
- Spaide, R. F., Ooto, S., Curcio, C. A. Subretinal drusenoid deposits a.k.a. pseudodrusen. Survey of Ophthalmology. 63 (6), 782-815 (2018).
- Curcio, C. A., Zanzottera, E. C., Ach, T., Balaratnasingam, C., Freund, K. B. Activated retinal pigment epithelium, an optical coherence tomography biomarker for progression in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (6), 211-226 (2017).
- Cao, D., et al. Hyperreflective foci, OCT progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (10), 34 (2021).
- Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, S12-S25 (2016).
- Edwards, M. M., et al. Subretinal glial membranes in eyes with geographic atrophy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1352-1367 (2017).
- Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2 (2022).
- Jiang, M., et al. Microtubule motors transport phagosomes in the RPE, and lack of KLC1 leads to AMD-like pathogenesis. Journal of Cell Biology. 210 (4), 595-611 (2015).
- Collin, G. B., et al. Disruption of murine Adamtsl4 results in zonular fiber detachment from the lens and in retinal pigment epithelium dedifferentiation. Human Molecular Genetics. 24 (24), 6958-6974 (2015).
- Curcio, C. A., Medeiros, N. E., Millican, C. L. The Alabama Age-related Macular Degeneration Grading System for donor eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 39 (7), 1085-1096 (1998).
- Bastek, J. V., Siegel, E. B., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Pigmentary patterns of the peripheral fundus. Ophthalmology. 89 (12), 1455-1463 (1982).
- Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y., Lightfoot, D. O.
- Lewis, H., Straatsma, B. R., Foos, R. Y. Chorioretinal juncture. Multiple extramacular drusen. Ophthalmology. 93 (8), 1098-1112 (1986).
- Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of geographic atrophy of the retinal pigment epithelium. Eye. 2 (5), 552-577 (1988).
- Sarks, J. P., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C. Evolution of soft drusen in age-related macular degeneration. Eye. 8 (3), 269-283 (1994).
- Ghazi, N. G., Dibernardo, C., Ying, H. S., Mori, K., Gehlbach, P. L. Optical coherence tomography of enucleated human eye specimens with histological correlation: Origin of the outer "red line". American Journal of Ophthalmology. 141 (4), 719-726 (2006).
- Brown, N. H., et al. Developing SDOCT to assess donor human eyes prior to tissue sectioning for research. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (8), 1069-1080 (2009).
- Helb, H. M., et al. Clinical evaluation of simultaneous confocal scanning laser ophthalmoscopy imaging combined with high-resolution, spectral-domain optical coherence tomography. Acta Ophthalmologica. 88 (8), 842-849 (2010).
- Spaide, R. F., Curcio, C. A. Drusen characterization with multimodal imaging. Retina. 30 (9), 1441-1454 (2010).
- Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part 1. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
- Garcia-Garcia, H. M., Gonzalo, N., Regar, E., Serruys, P. W. Virtual histology and optical coherence tomography: from research to a broad clinical application. Heart. 95 (16), 1362-1374 (2009).
- Strouthidis, N. G., et al. Comparison of clinical and spectral domain optical coherence tomography optic disc margin anatomy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (10), 4709-4718 (2009).
- Sarks, S. H. Ageing and degeneration in the macular region: A clinico-pathological study. British Journal of Ophthalmology. 60 (5), 324-341 (1976).
- Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (13), 19 (2020).
- Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (1), 33 (2021).
- Litts, K. M., et al. Clinicopathological correlation of outer retinal tubulation in age-related macular degeneration. JAMA Ophthalmology. 133 (5), 609-612 (2015).
- Olsen, T. W., Feng, X. The Minnesota grading system of eye bank eyes for age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4484-4490 (2004).
- Mano, F., Sprehe, N., Olsen, T. W. Association of drusen phenotype in age-related macular degeneration from human eye-bank eyes to disease stage and cause of death. Ophthalmology Retina. 5 (8), 743-749 (2021).
- Age-related eye disease study research group. The Age-Related Eye Disease Study system for classifying age-related macular degeneration from stereoscopic color fundus photographs: The Age-Related Eye Disease Study Report Number 6. American Journal of Ophthalmology. 132 (5), 668-681 (2001).
- Arnold, J. J., Sarks, S. H., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Reticular pseudodrusen. A risk factor in age-related maculopathy. Retina. 15 (3), 183-191 (1995).
- Olsen, T. W., Bottini, A. R., Mendoza, P., Grossniklausk, H. E. The age-related macular degeneration complex: linking epidemiology and histopathology using the Minnesota grading system (the inaugural Frederick C. Blodi Lecture). Transactions of the American Ophthalmological Society. 113, (2015).
- Owen, L. A., et al. The Utah protocol for postmortem eye phenotyping and molecular biochemical analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (4), 1204-1212 (2019).
- Wang, J. J., et al. Ten-year incidence and progression of age-related maculopathy: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 114 (1), 92-98 (2007).
- Joachim, N., Mitchell, P., Burlutsky, G., Kifley, A., Wang, J. J. The incidence and progression of age-related macular degeneration over 15 years: The Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 122 (12), 2482-2489 (2015).
- Pang, C., Messinger, J. D., Zanzottera, E. C., Freund, K. B., Curcio, C. A. The onion sign in neovascular age-related macular degeneration represents cholesterol crystals. Ophthalmology. 122 (11), 2316-2326 (2015).
- Keilhauer, C. N., Delori, F. C. Near-infrared autofluorescence imaging of the fundus: Visualization of ocular melanin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3556-3564 (2006).
- Curcio, C. A., Saunders, P. L., Younger, P. W., Malek, G. Peripapillary chorioretinal atrophy: Bruch's membrane changes and photoreceptor loss. Ophthalmology. 107 (2), 334-343 (2000).
- Curcio, C. A. Imaging maculopathy in the post-mortem human retina. Vision Research. 45 (28), 3496-3503 (2005).
- Brinkmann, M., et al. Histology and clinical lifecycle of acquired vitelliform lesion, a pathway to advanced age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 240, 99-114 (2022).
- Ramtohul, P., et al. Bacillary layer detachment: Multimodal imaging and histologic evidence of a novel optical coherence tomography terminology. Literature review and proposed theory. Retina. 41 (11), 2193-2207 (2021).
- Wilson, J. D., Foster, T. H. Mie theory interpretations of light scattering from intact cells. Optics Letters. 30 (18), 2442-2444 (2005).
- Ghazi, N. G., Green, W. R. Pathology and pathogenesis of retinal detachment. Eye. 16 (4), 411-421 (2002).
- Berlin, A., et al. Correlation of optical coherence tomography angiography of type 3 macular neovascularization with corresponding histology. JAMA Ophthalmology. 140 (6), 628-633 (2022).
- Berlin, A., et al. Histology of type 3 macular neovascularization and microvascular anomalies in anti-VEGF treated age-related macular degeneration. Ophthalmology Science. 3 (3), 100280 (2023).
- Schaal, K. B., et al. Outer retinal tubulation in advanced age-related macular degeneration: optical coherence tomographic findings correspond to histology. Retina. 35 (7), 1339-1350 (2015).
- Chen, L., et al. Histology and clinical imaging lifecycle of black pigment in fibrosis secondary to neovascular age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 214, 108882 (2022).
- Balaratnasingam, C., et al. Histologic and optical coherence tomographic correlations in drusenoid pigment epithelium detachment in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 124 (1), 644-656 (2017).
- Curcio, C. A., et al. Subretinal drusenoid deposits in non-neovascular age-related macular degeneration: Morphology, prevalence, topography, and biogenesis model. Retina. 33 (2), 265-276 (2013).
- Owsley, C., et al. Biologically guided optimization of test target location for rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration: ALSTAR2 baseline. Ophthalmology Science. 3 (2), 100274 (2023).
- Anderson, D. M. G., et al. The molecular landscape of the human retina and supporting tissues by high resolution imaging mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (12), 2426-2436 (2020).
- Lee, J., Yoo, M., Choi, J. Recent advances in spatially resolved transcriptomics: challenges and opportunities. BMB Reports. 55 (3), 113-124 (2022).
- Diabetes. Alabama Public Health. , Available from: https://www.alabamapublichealth.gov/healthrankings/diabetes.html (2022).
- Francis, J. H., et al. Swept-source optical coherence tomography features of choroidal nevi. American Journal of Ophthalmology. 159 (1), 169-176 (2015).
- Inoue, M., Dansingani, K. K., Freund, K. B. Progression of age-related macular degeneration overlying a large choroidal vessel. Retina Cases Brief Reports. 10 (1), 22-25 (2016).
- Jaffe, G. J., et al. Imaging features associated with progression to geographic atrophy in age-related macular degeneration: CAM Report 5. Ophthalmology Retina. 5 (9), 855-867 (2021).
